CN101906127A - 一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法 - Google Patents
一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从北冬虫夏草固体培养基残基中同时提取虫草素和虫草多糖的方法,是利用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基中的虫草素和虫草多糖进行提取,同时使提取液经大孔树脂吸附后再次对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取和吸附;再将吸附在大孔树脂上的虫草素和虫草多糖洗脱下来,洗脱液浓缩干燥后得到的产品中含有虫草素和虫草多糖。本方法能从北冬虫夏草固体培养基残基中同时提取虫草素和虫草多糖,而且活性成分含量高;树脂不需经过酸碱再生可以重复使用,环保,成本低,工艺和设备简单,可实现连续提取。
Description
技术领域
本发明涉及医药化工领域,具体为一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法。
背景技术
北冬虫夏草(北虫草),又名蛹虫草(Cordyceps militaris),属子囊菌亚门、麦角菌科、虫草属,是一种珍贵的药用菌。近年来,由于天然冬虫夏草(Cordyceps sinensis)需求不断增长,有限的资源日益枯竭,目前尚未人工规模化栽培。于是人们开始培育生产周期短,与天然冬虫夏草有相似医疗保健功效的北冬虫夏草满足消费需求,替代天然冬虫夏草的不足,为人工规模化培育的北冬虫夏草的发展提供了广阔的市场和良好的发展机遇。
虫草素和虫草多糖是天然冬虫夏草、人工培育北冬虫夏草中重要的生理活性成份,大量的药理学试验结果表明,虫草素具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基、减肥、提高性功能等作用;虫草多糖能促进淋巴细胞转化,提高血清lgG抗体含量和机体的免疫功能,增强机体自身抗癌抑癌的能力,两者均表现出良好的临床应用前景。
人工培育的北冬虫夏草培养基中含有虫草素、虫草多糖等生理活性成份,从残余培养基中提取虫草素、虫草多糖等保健食品或医药中间体,将能变废为宝,提高企业经济效益。
目前,据国内外公开报道的有关北冬虫夏草或其培养基中虫草素和多糖的提取专利文献,提取技术都是单一成份分步提取,即使大规模生产,往往需要多套设备系统进行非连续性提取,分离步骤多,投资大,生产成本高。比如,有些专利中利用离子交换树脂分步提取,树脂再生时需用大量的酸碱等化学试剂,对大规模生产的设备要求较高,并且带来废气废水,造成环境污染。另外,有些专利中报道采用大孔树脂,但是不能同时提取虫草素和虫草多糖。
发明内容
本发明旨在提供一种从北冬虫夏草固体培养基残基中同时提取虫草素和虫草多糖的方法。
一种从北冬虫夏草固体培养基残基中同时提取虫草素和虫草多糖的方法,是利用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基中的虫草素和虫草多糖进行提取,同时使提取液流经大孔树脂后再次对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取;将吸附在大孔树脂上的虫草素和虫草多糖洗脱下来,洗脱液浓缩干燥后得到的产品中含有虫草素和虫草多糖。
具体包括如下步骤:
(1) 将北冬虫夏草固体培养基残基粉碎后置于容器内,用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取;提取液流出后用大孔树脂进行吸附,然后流回装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器循环提取;提取时间为10~20hr;大孔树脂为非极性树脂,可以用H-01、H-10或H-20树脂,优选为H-20树脂;
北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg:1~20L:0.3~0.5L;优选为1kg:2~10L:0.3~0.5L;提取剂为水;
(2) 用洗脱剂洗脱大孔树脂,得到洗脱液;洗脱速度为0.5~2BV/hr;
北冬虫夏草固体培养基残基与洗脱剂的用量比为1kg:1~2L;
洗脱剂优选为10~50%体积浓度的乙醇水溶液;
(3) 取洗脱液浓缩和干燥,得到含有虫草素和虫草多糖的固体。
步骤(1)中,将粉碎的北冬虫夏草固体培养基残基过10~20mm筛。
步骤(1)中,装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器上部出水口连接到装有大孔树脂的吸附柱的底部入水口,吸附柱上部出水口接到流到装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器底部的入水口,提取液的流动方向为:容器底部入水口——容器上部出水口——吸附柱底部入水口——吸附柱上部水口——容器底部入水口。
步骤(3)中所述的浓缩和干燥方法为:将洗脱液浓缩至比重为1.05~1.1,在80~100℃下加热烘干,或-50~-10℃下低温冷冻干燥,或者真空低温干燥;真空低温干燥的条件为:真空度-0.09~-0.1Mpa,温度范围30~50℃。
本发明克服了现有技术中虫草素和虫草多糖提取技术的不足,能从北冬虫夏草固体培养基残基中同时提取虫草素和虫草多糖,变废为宝;所得产品活性成分含量高;以水为提取剂,所涉及的工艺和设备简单,可实现在常温下连续动态地提取和吸附分离。所用树脂不需经过酸碱再生可以重复使用,降低投资和运行成本,环保节能,适合大规模工业化生产。而且北冬虫夏草培养基残基中生理活性成份虫草素和虫草多糖的提取得率高,产品中虫草素含量可达15~35%,虫草多糖含量10~35%。
具体实施方式
用滚轴式不锈钢刀片粉碎机将块状的北冬虫夏草固体培养基的残基进行粉碎,主轴转速为400~600r/min,筛网孔径为10~20mm,得到北冬虫夏草培养基残基颗粒。所得产品中虫草素和虫草多糖的检测方法为:
虫草素含量的测定(高效液相色谱法)
(1)标准品溶液的配制
准确称取2.5毫克虫草素标准品,用纯净水加热溶解后定容到10毫升,冷却至室温备用。
(2)色谱条件
C18色谱柱(150mm*4.6mm);流动相为甲醇∶水=15∶85;流速1.0ml/min;柱温40℃;检测波长258nm。
(3)样品含量测定
准确称取0.25克样品,用纯净水加热溶解后定容到25毫升,冷却至室温,摇匀,4000rpm离心10min,上清液过0.22цm滤膜过滤,20цL进样,通过样品与标准品的峰面积来计算虫草素的含量。
虫草多糖含量的测定(苯酚-硫酸法)
(1)标准品溶液的配制
准确称取在105℃烘至恒重的葡聚糖20.00mg,加水溶解并稀释至100ml。摇匀备用,此液浓度为200μg/ml。
(2)葡聚糖吸收常数的测定
准确吸取上述葡聚糖标准液0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,0.80和1.00ml置于25ml比色管中,葡聚糖的重量依次为0,20,40,60,80,120,160和200微克,各管补加水至2.00ml,各管再准确加入5%苯酚液1.0ml,再在不断摇动下,小心而缓慢的加入10ml硫酸,立即置于沸水浴中加热2分钟,取出,冷却至室温后,用分光光度计在最大吸收波长处(约483-485nm),以不加葡聚糖的空白溶液(即第一管)为参比液,使用1cm比色皿,测定各管的吸光度,计算吸收常数。
(3)样品的测定
称取已磨细过筛(40目或60目)的样品粉末,约0.25克,称准至0.0001克,置于25ml容量瓶内,加入水约20ml,摇匀后置于沸水浴中加热提取约1小时,并不时摇动瓶内液体,当粉末不再浮上液面全部沉在瓶底时,即可停止加热取出,冷至室温,补加水至刻度,摇匀。于离心机内离心不少于10分钟(转速为4000转/分钟)取上清液备用。
吸取上述备用液,加入6倍的95%乙醇或5倍的无水乙醇,边加边摇,加盖后,冰箱内冷藏过夜,取出,离心20分钟,转速不少于4000转/分钟。小心弃去上清液,沉淀用少量水溶解,转移至另一25ml容量瓶内,洗涤液也并入瓶内,再加水至刻度,摇匀备用。
吸取上述溶液一定体积(吸取体积以使配制后的液体光吸收值介于0.2-0.8之间为合适),补加水至2.0ml,加入5%苯酚液1.0ml,摇匀后,在不断摇动下,小心而缓慢的加入硫酸10ml,立即置于沸水浴中加热2分钟,取出,冷至室温后,用分光光度计进行比色,空白试验为参比值,使用1cm的比色皿.使用波长应为最大光吸收处的波长(约为483-485nm),记下样品测定液的光吸收值A,根据标准葡聚糖吸收常数计算样品中虫草多糖的含量。
实施例1
将250克粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ5.0×40cm PVC管中,装填要均匀,不挤压,用盖子将PVC管盖紧。
用蠕动泵将2500ml饮用水从PVC管底端泵入,PVC管上端出来的水提液从下端流入装有100ml H-20大孔树脂的玻璃柱(φ2.5×50cm)中,玻璃柱上端的流出液继续用蠕动泵泵入PVC管底端,进行水循环提取;蠕动泵开启时间即提取时间为16小时。
用400ml 30%(V/V)乙醇水溶液为洗脱剂,用高压隔膜泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的玻璃柱进行洗脱,流速为1BV/h。
洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩,浓缩液比重为1.05时停止浓缩。浓缩液用80~100℃热风循环烘箱干燥,得干粉0.85克。干粉中虫草素含量34.7%,虫草多糖含量15.66%。
实施例2
将250克粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ5.0×40cm PVC管中,用蠕动泵将500ml饮用水从PVC管底端泵入,PVC管上端出来的水提液从下端流入装有100ml H-20大孔树脂的玻璃柱(φ2.5×50cm)中,玻璃柱上端的流出液继续用蠕动泵泵入PVC管底端,进行水循环提取,蠕动泵开启时间即提取时间为16h。
用400ml 10%(V/V)乙醇水溶液为洗脱剂,用高压隔膜泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的玻璃柱进行洗脱,流速为1BV/h。
洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩,浓缩液比重为1.07时停止浓缩。浓缩液在-50~-10℃下低温冷冻干燥,得干粉1.24克。干粉中虫草素含量24.8%,虫草多糖含量11.29%。
实施例3
将24.32公斤粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ30×60cm不锈钢桶中,装填要均匀,不挤压,用盖子将桶盖紧。
用高压隔膜泵将50升饮用水从不锈钢桶底端泵入,不锈钢桶上端出来的水提液从下端流入装有9升H-20大孔树脂的不锈钢柱(φ10×120cm)中,不锈钢柱上端的流出液继续用高压隔膜泵泵入不锈钢桶底端,进行水循环提取,高压隔膜泵开启时间即提取时间为16h。
用30升20%(V/V)乙醇水溶液为洗脱剂,用高压隔膜泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的不锈钢柱进行洗脱,流速为1BV/h。
洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩,浓缩液比重为1.07时停止浓缩。浓缩液用80~100℃热风循环烘箱干燥,得干粉94.7克。干粉中虫草素含量18.17%,虫草多糖含量32.58%。
实施例4
将24.89公斤粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ30×60cm不锈钢桶中,装填要均匀,不挤压,用盖子将桶盖紧。
用高压隔膜泵将50升饮用水从不锈钢桶底端泵入,不锈钢桶上端出来的水提液从下端流入装有9升H-20大孔树脂的不锈钢柱(φ10×120cm)中,不锈钢柱上端的流出液继续用高压隔膜泵泵入不锈钢桶底端,进行水循环提取,高压隔膜泵开启时间即提取时间为16h。
用30升50%(V/V)乙醇水溶液为洗脱剂,用高压隔膜泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的不锈钢柱进行洗脱,流速1BV/h。
洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩,浓缩液比重为1.09时停止浓缩。
浓缩液在真空度-0.09~-0.1Mpa、30~50℃条件下真空低温干燥,得干粉110.65克。干粉中虫草素含量28.1%,虫草多糖含量14.43%。
Claims (8)
1.一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1) 将北冬虫夏草固体培养基残基粉碎后置于容器内,用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取;提取剂流出后用大孔树脂进行吸附,然后流回装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器循环提取;提取时间为10~20hr;
北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg:1~20L:0.3~0.5L;提取剂为水;
(2) 用洗脱剂洗脱大孔树脂,得到洗脱液;洗脱速度为0.5~2BV/hr;
北冬虫夏草固体培养基残基与洗脱剂的用量比为1kg:1~2L;
洗脱剂为10~50%体积浓度的乙醇水溶液;
(3) 取洗脱液浓缩和干燥,得到含有虫草素和虫草多糖的固体。
2.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,将粉碎的北冬虫夏草固体培养基残基过10~20mm筛。
3.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器上部出水口连接到装有大孔树脂的吸附柱的底部入水口,吸附柱上部出水口接到流到装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器底部的入水口,提取液的流动方向为:容器底部口——容器上部出水口——吸附柱底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。
4.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg:2~10L:0.3~0.5L。
5.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的大孔树脂为非极性大孔树脂。
6.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的大孔树脂为H-20型、H-01型或H-10型大孔树脂。
7.权利要求1所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的浓缩和干燥方法为:将洗脱液浓缩至比重为1.05~1.1,在80~100℃下加热烘干,或-50~-10℃下低温冷冻干燥,或者真空低温干燥。
8.权利要求7所述一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法,其特征在于,所述真空低温干燥的条件为:真空度-0.09~-0.1Mpa,温度范围30~50℃。
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