JP2009034045A - 冬虫夏草の突然変異体及びその変異体の培養法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】冬虫夏草の菌糸体に高エネルギーのイオンビームを照射し、当該照射処理を行った菌糸体の中から親株と菌学的性質、特に生理活性物質の生産能の異なる変異株を選抜する。さらにその中から、有効成分コルジセピンを高効率で生産する変異株を選抜し、得られた高生産株を、最適条件下で培養することで、コルジセピンの高生産を可能とする方法。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下の通りである:
〔1〕冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜することを含む、冬虫夏草の突然変異株の製造方法。
〔2〕冬虫夏草の生理活性物質高生産株を選抜することを含む、〔1〕の方法。
〔3〕該生理活性物質がコルジセピンである、〔2〕の方法。
〔4〕前記イオンビームの照射線量が200〜2000Gyの範囲である、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕
前記イオンビームを、照射後の菌糸体の成長速度が照射前の20〜60%に減少する線量で照射することを特徴とする〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法によって製造される、冬虫夏草の突然変異株。
〔7〕アデニン及び/又はグアニンのアナログ存在下で生存可能である、〔6〕の突然変異株。
〔8〕アデニン及び/又はグアニンのアナログが、8−アザアデニン又は8−アザグアニンである、〔7〕の突然変異株。
〔9〕コルジセピン高生産能を有する、受領番号がFERM AP−21315である、冬虫夏草(Cordyceps militaris)NBRC 9787の変異株。
〔10〕受領番号がFERM AP−21315である冬虫夏草を好気的に培養する工程を含む、コルジセピンの生産方法。
〔11〕該冬虫夏草を、酵母エキスを含む培地中で培養することを含む、〔10〕の方法。
〔12〕全培地重量に対し、0.25〜14重量%の酵母エキスを含む培地中で培養することを含む、〔11〕の方法。
成分の配合量としては、例えば炭素源は、水を含む培地全重量の1〜10重量%、好ましくは2〜8重量%であり、窒素源は培地全重量の0.25〜14重量%、好ましくは0.5〜10重量%である。アミノ酸を添加する場合は、その配合量は培地全重量の0.5〜5重量%、好ましくは1〜3重量%であり、核酸関連物質を添加する場合は、その配合量は培地全重量の0.05〜0.6重量%、好ましくは0.1〜0.4重量%である。また、固体培地である場合には、培地全重量の1〜2重量%、好ましくは1.2〜1.8重量%の寒天を含み得る。
具体的には、例えばポテトデキストロース寒天プレート上、又はグルコース 20g/l、ペプトン 2.5g/l、及び酵母エキス 7.5g/l含有寒天培地のプレートで培養可能である。ほかに、グルコース 60g/l、酵母エキス 85g/lからなる液体培地中において、好気性条件下で培養することもできる。さらに、本発明の冬虫夏草はイオンビームで照射後の菌糸体膜の中心から白金耳にてポテトデキストロース寒天プレートの中心に接種し、菌糸体膜がプレート全体に広がるまで5〜35℃、好ましくは20〜30℃、にて培養することができる。
菌株としては、Cordyceps militaris NBRC 9787をポテトデキストロース寒天スラント上、5℃で保存していたものを用いた。イオンビーム照射用のプレートを作成するため、保存菌株から一白金耳掻き取り、直径3.5cmのポテトデキストロース寒天プレートの中心へ接種し、25℃で10日間培養した。
菌糸体膜のプレートに、若狭湾エネルギー研究センターの多目的シンクロトロン・タンデム加速器(日立製作所 特注品(型番なし))により発生する200MeVのプロトンビームを線量800Gyで照射した。プロトンビーム照射後の菌糸体膜の中心から一白金耳掻き取り、ポテトデキストロース寒天プレートの中心に接種した。経時的に、成長した菌糸体膜の直径を測定し、成長速度(cm/day)を非照射のものと比較し、成長速度が50%に低下したものを選択した。
2−1.8−アザグアニン耐性株のスクリーニング
実施例1において成長速度比較によって選択された菌糸体膜の1/4量を掻き取り、これを5mlの生理食塩水に懸濁し、二重ガーゼとナイロンメッシュで濾過した。濾液そのもの及び10倍希釈液をそれぞれ0.1mlずつ取り、200mg/lの8−アザグアニン含有寒天培地のプレートに塗布した。8−アザグアニンに耐性を示し、生育した28個のコロニーを選抜し、それぞれ新しいスラントに移植した。
コルジセピン高生産株のスクリーニング
冬虫夏草によって生産されたコルジセピンは、Bacillus subtilisの生育を阻止するため、阻止円の大きさで変異体のコルジセピン生産能を評価し、コルジセピン高生産菌株を選抜した。
実施例2−1で得られた28種の8−アザグアニン耐性菌株のスラントからそれぞれ一白金耳掻き取り、グルコース20g/l、ペプトン2.5g/l、酵母エキス7.5g/l含有寒天培地のプレートの中心に接種し、25℃で30日間培養した。30日間の培養後、プレート上に広がった8−アザグアニン耐性菌の菌糸体膜の中心を、直径8mmの円筒形カッターでくり抜き、それをBacillus subtilis培養液(8−アザグアニン耐性菌プレート培養の29日目に、Bacillus subtilis NBRC 3134を(NH4)2SO4 2g/l、K2HPO4 14g/l、KH2PO4 6g/l、クエン酸三ナトリウム・2H2O 1g/l、MgSO4・7H2O 0.25g/l、グルコース 5g/l、カザミノ酸 5g/lからなる培地中、30℃、150rpmで24時間振盪培養したもの)を適切な濃度(OD 660nm=0.0005)となるように生理食塩水で希釈し、希釈液0.1mlを(NH4)2SO4 2g/l、K2HPO4 14g/l、KH2PO4 6g/l、クエン酸三ナトリウム・2H2O 1g/l、MgSO4・7H2O 0.25g/l、グルコース 5g/l、カザミノ酸 5g/l、寒天 15g/lからなるプレートに塗布したものの中心に置き、30℃で24時間培養した。
Bacillus subtilisに対する阻止円の大きさで変異体のコルジセピン生産能を評価し、最も有望なコルジセピン高生産菌株としてG81−3を選抜した。この突然変異体は、産総研特許生物寄託センターに寄託申請した(受領番号FERM AP−21315)。本変異体の形態的、生理学的特徴としては、親株と比較して色調が黄色っぽい(親株は白色)、菌糸体膜の隆起が激しい、暗条件での生育が速い点等が挙げられる。
Cordyceps militarisの突然変異体G81−3と野生株NBRC 9787をそれぞれポテトデキストロース寒天スラント上で活性化させ、次いでポテトデキストロース寒天プレート上にて、25℃で13日間前培養を行い、種菌を作成した。
下記に示す本培養の各培地100mlを静置培養用の容器(容量500ml)に入れ、次に、上記前培養で直径3.5〜4.5cmに成長した菌糸体を滅菌済み円筒形カッター(1cm)でくり抜き、本培養培地上に浮かべ、静置培養を行った。
培養液を経時的にサンプリングし、孔径0.45μmのフィルターで濾過し、濾液のコルジセピン濃度、グルコース濃度、pHを測定した。コルジセピン濃度はHPLCを用いて測定した。グルコースが完全に消費された時点で本培養を終了し、培地と菌体に分けて回収した。菌体は十分水洗し、100℃で24時間乾燥し乾燥菌体重量を測定した。本実施例においては、培養期間は20から30日であった。尚、予備実験において、培養終了時の菌体内コルジセピン量は菌体外のコルジセピン量の2%程度であることが確認されているため、菌体内のコルジセピンは定量しなかった。
HPLCの条件は、カラムとしてTSK−GEL ODS−80Ts(4.6mm ID×15.0cmL)、移動相として0.1%リン酸/メタノール=98/2(v/v)を用い、流速1.0ml/min、カラム温度40℃、検出波長260nmで行った。上記の測定は、一種類の培地につき、少なくとも2回の実験を行い、その平均値をその培地における値とした。
本培養の培地は、表1に示すような濃度のグルコースと酵母エキス、さらに、微量元素として0.028g クエン酸三ナトリウム・2H2O、0.02g NH4NO3、0.05g KH2PO4、0.002g MgSO4・7H2O、0.001g CaCl2・2H2O、4.6×10−5g クエン酸、5.0×10−5g ZnSO4・7H2O、1.0×10−5g Fe(NH4)2SO4・6H2O、2.5×10−6g CuSO4・5H2O、5.0×10−7g MnSO4・4〜5H2O、5.0×10−7g H3BO3、5.0×10−7g Na2MoO4・2H2Oを含有する溶液100mlを用いた。それぞれの培地で培養を行い、終了時の培地中のコルジセピン濃度(g/l)と乾燥菌体1gあたりのコルジセピン生産量(g/g)を測定し、結果を表1に示した。また、表中、試験例5及び試験例6について培養の経時変化を図1に示した。
図1 黒丸 試験例6の結果
図2 白三角 試験例5の結果
図2 黒三角 試験例6の結果
Claims (12)
- 冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜することを含む、冬虫夏草の突然変異株の製造方法。
- 冬虫夏草の生理活性物質高生産株を選抜することを含む、請求項1記載の方法。
- 該生理活性物質がコルジセピンである、請求項2記載の方法。
- 前記イオンビームの照射線量が200〜2000Gyの範囲である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオンビームを、照射後の菌糸体の成長速度が照射前の20〜60%に減少する線量で照射することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法によって製造される、冬虫夏草の突然変異株。
- アデニン及び/又はグアニンのアナログ存在下で生存可能である、請求項6記載の突然変異株。
- アデニン及び/又はグアニンのアナログが、8−アザアデニン又は8−アザグアニンである、請求項7記載の突然変異株。
- コルジセピン高生産能を有する、受領番号がFERM AP−21315である、冬虫夏草(Cordyceps militaris)NBRC 9787の変異株。
- 受領番号がFERM AP−21315である冬虫夏草を好気的に培養する工程を含む、コルジセピンの生産方法。
- 該冬虫夏草を、酵母エキスを含む培地中で培養することを含む、請求項10記載の方法。
- 全培地重量に対し、0.25〜14重量%の酵母エキスを含む培地中で培養することを含む、請求項11記載の方法。
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