KR102096263B1 - 자연적으로 발생한 유글레나 그라실리스 돌연변이체를 이용한 파라밀론 생산 - Google Patents

자연적으로 발생한 유글레나 그라실리스 돌연변이체를 이용한 파라밀론 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야생형 대비 증대된 파라밀론 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 돌연변이체 및 이를 이용하여 베타글루칸 중합체인 파라밀론(Paramylon)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 클로로필을 합성하지 않는 유글레나 돌연변이체로서 야생형 대비 월등히 뛰어난 파라밀론 생산능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 신규한 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 이용하는 경우 고부가가치 물질인 파라밀론(베타글루칸 중합체)을 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

자연적으로 발생한 유글레나 그라실리스 돌연변이체를 이용한 파라밀론 생산{Paramylon production through a spontaneous mutant of Euglena gracilis}
본 발명은 야생형 대비 증대된 파라밀론 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 돌연변이체 및 이를 이용하여 베타글루칸 중합체인 파라밀론(Paramylon)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
베타-1, 3-글루칸(β-1, 3-glucan)은 면역력 강화, 항산화 작용, 콜레스테롤과 혈압 수치 조절 등에 도움이 되는 것으로 알려진 물질이다. 이러한 기능 덕분에 화장품, 건강기능식품 등 다양한 곳에 활용되고 있으며, 수요가 증가함에 따라서 베타글루칸 생산 원료에 대한 관심도 증가하고 있는 추세이다. 베타글루칸은 버섯, 곡물, 박테리아 등 다양한 생물에 존재하고 있으나, 이들로부터의 베타글루칸 생산은 효율이 낮거나 추출법이 어려운 실정이다.
유글레나(Euglena)는 일본에 있어서는 「녹색벌레(insect green)」의 일본 명칭으로 널리 알려져 있으며, 일반적으로 늪, 연못, 논 등의 담수에 생식하고 있는 미생물의 학술명이다. 유글레나는 엽록체를 가지고 광합성을 활발하게 수행하는 한편, 편모나 세포수축에 의한 운동성을 가지는 등의 동물적인 특징을 나타내는 것으로부터 분류학상에 있어서, 식물과 동물 양쪽의 분류에 속하는 매우 희귀한 미생물이라고 말할 수 있다. 현재, 유글레나를 함유하는 조류에 의한 유용물질 생산의 가능성에 관해서 각종 산업계가 주목하고 있다. 조류를 건조시킨 것은, 식품으로서의 실용화가 일부에서 이미 수행되고 있으며, 고등식물에 비하여 석유 유래의 화성품 대체원료, 혹은 연료의 원료 등 유용물질을 고수율로서 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문이다. 유글레나는 탄수화물로서 파라밀론(Paramylon)을 세포 내에 축적한다. 파라밀론은 약 700개의 글루코스가 β-1,3- 결합에 의해 중합한 고분자체의 입자이다.
유글레나 그라실리스 야생형의 경우 다른 베타글루칸 생산원(버섯, 효모, 박테리아 등)에 비해 베타글루칸 생산량은 높지만, 최대 건중량의 60%까지 밖에 축적하지 못한다. 따라서 유글레나 야생형으로부터 돌연변이체를 분리하여 파라밀론(베타글루칸) 함량 및 생산량을 증대시키는 기술이 필요하다.
이에 본 발명자는 자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체(유글레나 그라실리스 EK)를 분리하였으며, 분리된 유글레나 돌연변이체의 경우 야생형과 비교하여 파라밀론 생산량이 야생형에 비해서 월등히 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2015-0134350호
따라서 본 발명의 목적은 고부가가치 물질인 파라밀론(베타글루칸)을 효과적으로 생산할 수 있는 신규한 유글레나 돌연변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 유글레나 돌연변이체를 이용하여 파라밀론(베타글루칸)을 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 야생형 대비 증대된 파라밀론 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 클로로필을 형성할 수 없는 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 암조건에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양물은 파라밀론을 4 ~ 6g/L의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 클로로필을 합성하지 않는 유글레나 돌연변이체로서 야생형 대비 월등히 뛰어난 파라밀론 생산능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 신규한 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 이용하는 경우 고부가가치 물질인 파라밀론(베타글루칸 중합체)을 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1은 빛이 있는 곳에서 배양했을 때 야생형과 돌연변이체의 형태적 차이를 나타낸 것이다.
도 2는 암조건에서 당배양시 야생형과 돌연변이체의 건중량과 파라밀론 생산량을 비교한 것이다.
본 발명은 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 제공함에 그 특징이 있다.
본 명세서에서 언급하는 ‘유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)’는 담수에 사는 원생생물 중 하나로, 비타민의 일종인 알파-토코페롤(α-tocopherol), 베타글루칸 중합체인 파라밀론(paramylon), 지질 등 다양한 유용물질을 생산할 수 있다. 특히 암배양 조건에서 당배양을 할 경우 파라밀론 함량이 건중량 대비 60% 이상일 뿐만 아니라 세포벽이 존재하지 않아 파라밀론 추출도 다른 생물에 비해 비교적 쉽다. 또한 파라밀론 구조가 베타-1, 3 결합으로 이루어져 있기 때문에 다른 결합이 섞여 있는 버섯, 곡물로부터 추출한 베타글루칸보다 기능이 뛰어나다고 볼 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 ‘파라밀론(paramylon)’은 유글레나류의 세포 내 저장물질로서 베타글루칸 중합체이다.
본 발명의 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체이다. 변이주(돌연변이체)는 일반적으로 돌연변이원(약제 또는 자외선) 처리를 행하는 것, 계대 배양에 의한 적응 또는 자연 변이에 의해 제작될 수 있다. 본 발명에서는 자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체를 분리하였으며, 이를 계대배양하여 변이주(돌연변이체)를 확립하였다.
본 발명에서는 자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체를 분리하기 위하여 액체 배양한 야생형 균주(wild-type)를 고체 한천배지에 도말후 광량 150 umol·m-2·s-1, 온도 28℃에서 콜로니(colony)가 형성될때까지 배양하였으며, 나타난 콜로니 중 초록색이 아닌 하얗게 나타난 콜로니만 선별하여 새로운 고체 한천배지에 분리하여 계대배양하였다.
이렇게 분리한 돌연변이체는 ‘유글레나 그라실리스 EK’라 명명하고, 2018년 11월 20일자로 기관에 기탁하였으며, 기탁기관으로부터 2018년 12월 4일자 기탁번호 KCTC18746P를 부여받았다.
본 발명의 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 클로로필을 형성할 수 없는 특징을 가진다. 야생형 유글레나속 미세 조류는 세포 내에 엽록체를 가지므로, 광합성에 의해 증식할 수 있는 광 독립영양 생물이다. 그러나 본 발명의 자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체인 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)는 엽록소를 형성할 수 없으며, 광 조건이 아닌 암조건에서 증식할 수 있는 특징을 가진다.
본 발명에서는 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)와 야생형간 파라밀론 생산능을 비교하였으며, 그 결과 본 발명의 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)의 건중량과 파라밀론 생산량이 야생형에 비해 월등히 뛰어남을 확인하였다.
따라서 본 발명은 야생형 대비 증대된 파라밀론 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC KCTC18746P)를 암조건에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 배양물은 파라밀론을 4 ~ 6g/L의 농도로 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
유글레나 배양 및 성장, 파라밀론 측정
본 발명에서는 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis) 종을 이용하였다. 위 미세조류는 Culture Collection of Autotrophic Organisms at the Institute of Botany of the Academy of Sciences of the Czech Republic에서 구매하였다. 배양 배지는 Modified Hutner’s medium을 이용하였으며, 1L 3차 증류수에 (단위: g) glucose, 20; glutamic acid, 5; malic acid, 5; glycine, 2.5; asparagine, 2; urea, 0.4; succinic acid, 0.1; KH2PO4,0.4; MgSO4 ㆍ7H2O,0.14; MgCO3,0.4; CaCO3,0.1; trace elements solution, 10mL/L; vitamin solution, 10mL/L 와 H3BO3 solution, 10ml/L를 첨가하였다. Trace elements solution은 1L 3차 증류수에 (단위: g) (NH4)2Fe(SO4)2 ㆍ6H2O, 2.1; ZnSO4 ㆍ7H2O, 1.1; MnSO4 ㆍH2O, 0.58; (NH4)5Mo7O24 ㆍ4H2O, 0.18; CoSO4 ㆍ7H2O, 0.024; CuSO4 ㆍ5H2O, 0.077 와 NaNO3 ㆍ4H2O, 0.074를 첨가하여 제조하였다. Vitamin solution은 thiamin, 0.06 g and cyanocobalamin 0.005 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었으며, H3BO3 solution은 0.029 g를 1L 3차 증류수에 첨가하여 만들었다. 한천 배지(agar plate)를 만들기 위해서는 1L의 배지에 15 g의 한천을 넣어주었다. 배지는 121℃에서 20분간 멸균을 한 후 사용하였다. 500 mL 삼각플라스크(DURAN 제조)에 250mL의 배지를 넣어 시드 배양(seed cultivation)을 하였으며, 배양 온도는 28℃ 였으며, 암조건에서 150 rpm 으로 교반해주었다.
유글레나 건중량은 1.45um 공극 크기를 가진 필터를 이용하여 측정하였다.
파라밀론 추출을 위하여 유글레나 세포를 초음파파쇄기(ultrasonicator)를 이용하여 세포를 파쇄한 다음 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 다음으로 도데실 황산나트륨 용액(2 g/L)을 넣어 섞어준 후 37℃에서 하루 동안 보관하였다. 그 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 3차 증류수로 2번 헹궈준 다음 건조 오븐에서 하루 이상 말려 무게를 측정하였다.
< 실시예 2>
유글레나 돌연변이체 분리
자연적으로 발생한 유글레나 돌연변이체를 분리하기 위하여 액체 배양한 야생형 균주(wild-type)를 고체 한천배지에 도말(streaking)하였다. 도말한 고체 한천배지를 광량 150 umol·m-2·s-1, 온도 28℃에서 콜로니(colony)가 뜰 때까지 배양하였다. 나타난 콜로니 중 초록색이 아닌 하얗게 나타난 콜로니만 새로운 고체 한천배지에 분리하여 계대배양한 후 야생형과 비교하였다. 이렇게 분리한 돌연변이체를 ‘EK’라 명명하였다. 도 1은 야생형과 분리해낸 돌연변이체간 빛이 있는 조건에서 형태의 차이를 비교한 것이다. 야생형은 빛이 있는 조건에서 클로로필을 형성하여 초록색을 나타낸 반면에 돌연변이형은 하얀색을 나타내었다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 방법으로 분리해낸 돌연변이체가 클로로필을 형성할 수 없음을 시사한다.
< 실시예 3>
유글레나 돌연변이체와 야생형간 파라밀론 생산 비교
유글레나 돌연변이체와 야생형의 파라밀론 생산량 차이를 확인하기 위하여 암조건에서 당배양을 진행하였다.
도 2는 분리해낸 돌연변이체(EK)와 야생형의 건중량과 파라밀론 생산량을 비교한 것이다. 도 2에 나타난 것과 같이 돌연변이체(EK)의 건중량과 파라밀론 생산량이 야생형에 비해서 월등히 뛰어남을 확인하였다. 이러한 결과는 유글레나를 이용하여 파라밀론(베타글루칸)을 생산하는데 큰 도움이 될 것을 시사한다.
본 발명의 유글레나 돌연변이체와 야생형간 건중량 및 파라밀론 생산 비교 (단위: g/L)
항목 야생형 돌연변이체
건중량 9.76 (± 0.88) 11.74 (± 0.1)
파라밀론 생산량 3.62 (± 0.17) 5.27 (± 0.42)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18746P 20181120

Claims (4)

  1. 야생형 대비 증대된 파라밀론 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유글레나 그라실리스 EK는 클로로필을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P).
  3. 유글레나 그라실리스 EK(기탁번호: KCTC18746P)를 암조건에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 파라밀론의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배양물은 파라밀론을 4 ~ 6g/L의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 파라밀론의 생산방법.
KR1020180159759A 2018-12-12 2018-12-12 자연적으로 발생한 유글레나 그라실리스 돌연변이체를 이용한 파라밀론 생산 KR102096263B1 (ko)

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