CN116836807A - 一株高葡聚糖含量的微藻突变株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高葡聚糖含量的微藻突变株及其应用，属于微藻培养技术领域；所述微藻突变株ZWang109，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.40684。本发明的微藻突变株显著提高了β‑葡聚糖的含量，减低了生产成本；所述微藻突变株ZWang109相对于野生型微藻E.gracilis 1224/5Z葡聚糖含量增加了60％～80％。同时，本发明的微藻突变株ZWang109中的β‑葡聚糖是以游离的颗粒状存在，分离纯化简单，生产成本低，可单独食用也可作为营养增补剂。
Description
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及一株高葡聚糖含量的微藻突变株及其应用。
背景技术
纤细裸藻(Euglena gracilis)是一种介于动、植物两者之间的中间性生物，具有动、植物性质的蛋白质组成。相比较其他藻类，纤细裸藻没有细胞壁，其所产生的生物活性物质可利用率高，细胞内能够积累丰富的β-(1,3)-葡聚糖(Paramylon)、多不饱和脂肪酸、蛋白质以及多种维生素等促进人体生长发育的关键营养物质，因此在健康维护和高营养食品添加剂方面具有极大的应用潜力。
纤细裸藻可进行光合作用积累多糖，与淀粉典型的α-(1,6)-葡聚糖结构不同，裸藻多糖结构为β-(1,3)-葡聚糖，外观为由膜包被的颗粒状聚合物，占裸藻细胞干重的30％～40％，是细胞内重要的储能物质。动物实验表明，来源于纤细裸藻的葡聚糖表现出抗菌、抗病毒、抗肿瘤和炎症活性。目前针对葡聚糖的研究主要集中在以下几个方面：
(1)调节免疫反应。Ahmad等人的研究发现，β-1,3-葡聚糖在实验动物和过敏性鼻炎患者中能够调节Th1、Th2细胞反应。
(2)抗肿瘤活性。Watanabe等人研究发现，在治疗小鼠结肠癌前异常隐窝病灶时，在其饮食中加入2％(w/w)的β-1,3-葡聚糖，能够将结肠癌的发生机率减少50％，Watanabe等人认为β-1,3-葡聚糖的作用类似于益生元，可以影响小鼠的肠道微生物。此外，有研究表明葡聚糖可降低胆固醇、血糖水平，预防高血压、高血糖和痛风等疾病。
虽然纤细裸藻拥有多种优点，具有极大的产业化潜力，但是在实际生产过程中仍会面临许多关键问题。最显著的问题是目前微藻大规模培养成本较高，因此在产业化中过程中，如何实现大规模发酵培养是急需解决的问题之一。对微藻产业化进程而言，最主要的解决方式为选育优良性状的藻种，其特性会对产业化的多个环节产生影响，比如营养物质积累及提取等。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高葡聚糖含量的微藻突变株及其应用，本发明的微藻突变株显著提高了β-葡聚糖的含量。
本发明提供了一株高葡聚糖含量的纤细裸藻突变株(Euglena gracilis)ZWang109，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.40684。
优选的，所述微藻突变株ZWang109相对于野生型纤细裸藻E.gracilis1224/5Z，葡聚糖含量增加了60％～80％。
优选的，所述葡聚糖包括β-葡聚糖。
优选的，所述β-葡聚糖以游离的颗粒状存在。
本发明还提供了一种生产葡聚糖的方法，包括培养上述方案所述的纤细裸藻突变株ZWang109的步骤。
优选的，所述葡聚糖包括Beta-1,3-葡聚糖。
本发明还提供了一种食品或营养增补剂，包含上述方案所述的纤细裸藻突变株ZWang109。
本发明还提供了上述方案所述的纤细裸藻突变株ZWang109在制备食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的应用。
优选的，所述食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的活性成分包括葡聚糖。
本发明提供了一株高葡聚糖含量的细小裸藻(Euglena gracilis)突变株ZWang109，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.40684。本发明的微藻突变株显著提高了β-葡聚糖的含量，减低了生产成本；所述微藻突变株ZWang109相对于野生型微藻E.gracilis 1224/5Z葡聚糖含量增加了60％～80％。同时，本发明的微藻突变株ZWang109中的β-葡聚糖是以游离的颗粒状存在，分离纯化简单，生产成本低，可单独食用也可作为营养增补剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为诱变及筛选的流程图；
图2为显微镜下野生型和突变株ZWang109的形态比较；
图3为突变株和野生型副淀粉含量比较；
图4为野生型(WT)和突变株ZWang109、M2在光照(L)和黑暗(D)培养条件下的裸藻葡聚糖含量(％干重)；
图5为野生型(WT)和突变株ZWang109在黑暗培养条件下的裸藻OD750比较。
生物保藏说明
细小裸藻(Euglenagracilis)突变株ZWang109，于2023年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.40684。
具体实施方式
本发明提供了一株高葡聚糖(副淀粉)含量的纤细裸藻(Euglenagracilis)突变株ZWang109，又名M1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.40684。
在本发明中，纤细裸藻即为细小裸藻。
在本发明中，副淀粉是裸藻葡聚糖的专用名词。在裸藻领域，副淀粉和葡聚糖是同义词。
在本发明中，所述葡聚糖优选的包括Beta-1,3-葡聚糖。
在本发明中，所述纤细裸藻突变株ZWang109(又名微藻突变株ZWang109、突变株ARNOM1、突变株M1)是以纤细裸藻藻株E.gracilis 1224/5Z为野生型，经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变得到。在本发明中，所述诱变的方法优选的包括以下步骤：将野生型微藻藻液和甲基磺酸乙酯混合，进行诱变，得到纤细裸藻突变株。
在本发明中，所述甲基磺酸乙酯的工作浓度优选为质量浓度5％；所述诱变的时间优选的包括90～240min，更优选的包括120～240min。
在本发明中，所述纤细裸藻E.gracilis 1224/5Z购自于CCAP或中科院水生所。
本发明通过上述方案所述诱变方法，能够获得快速生长而且葡聚糖积累高的微藻突变株，最终显著降低裸藻规模化生产的成本。同时，本发明是以活藻株为野生型藻株，基于化学诱导基因突变，无任何转基因成分。
通过18s rDNA和ITS1的测序，结果DNA片段的序列显示突变株依然是纤细裸藻(即细小裸藻)E.gracilis 1224/5Z。
在本发明中，所述微藻突变株ZWang109相对于野生型纤细裸藻E.gracilis1224/5Z，葡聚糖含量增加了60％～80％，光照和黑暗条件下，野生型纤细裸藻副淀粉含量约为35.7％，40.3％，相同培养条件下，突变株副淀粉含量为56.8％，65.3％。在本发明中，所述葡聚糖优选的包括β-葡聚糖。在本发明中，所述β-葡聚糖以游离的颗粒状存在。
本发明的微藻突变株ZWang109的生长表型不同于野生型，生长初期(2～5天时)生长速度快于野生型，生长后期(6天之后)与野生型没明显差别，突变株ZWang109的生物量不亚于野生型。
本发明还提供了一种生产葡聚糖的方法，包括培养上述方案所述的微藻突变株ZWang109的步骤。
本发明还提供了一种食品或营养增补剂，包含上述方案所述的微藻突变株ZWang109。
本发明还提供了上述方案所述的微藻突变株ZWang109在制备食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的应用。
在本发明中，所述食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的活性成分优选的包括葡聚糖。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株高葡聚糖含量的微藻突变株及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1诱变及筛选
流程图参见图1。
本实施例所用野生型为纤细裸藻藻株为E.gracilis 1224/5Z，来源于CCAP(或中科院水生所)，使用Cramer-Myers(CM)培养基进行光合自养培养，培养基主要成分如表1。
表1CM培养基配方
使用白色LED灯带作为光源，光照强度为40μmol·m-2s-1。三角锥瓶静置在普通光照培养箱里培养。待裸藻生长到第三天，进行诱变和筛选，具体流程如下：
EMS诱变：1.取1mL藻液，加入5μL EMS；2.锡纸包裹，避光诱导4h(防止光修复)；3.1500g离心5min；4.去掉上清液加入1mL 10％(w/v)的Na2S2O3终止诱变；5.用培养基洗涤2次，后离心收集沉淀；6.最终稀释藻液至104cells mL-1；7.取诱导结束藻液100μL涂板(EMG固体培养基)，室温下避光培养1月。
筛选：挑取较大的单克隆藻落，置于有CM培养液的96孔板，光照下生长3天后，进行显微镜观察，显微镜下野生型和突变株ZWang109(M1)的形态比较结果参见图2。细胞内明显葡聚糖颗粒增多增大的单克隆藻落被采纳，进入下一轮的扩培养，转接入5mL、100mL培养液，检测生物量和葡聚糖含量。
选取不同突变株，100mL培养液培养之后，取对数期细胞，离心，冷冻干燥后测定其葡聚糖含量，具体流程如下：
1.取0.1g的藻粉，加1mL乙醇研磨成匀浆，转移到15mL离心管中；
2.补足15mL乙醇，4℃提取30min，裂解细胞，去除色素；
3.离心5000rpm，2min，去上清(色素未除净可添加乙醇重复步骤2，直至沉淀变成黄白色)；
4.加入15mL的1％SDS(W/V)，85℃30min；
5.离心5000rpm，2min，小心去上清(吸弃)，用去离子水清洗沉淀；
6.用少量去离子水重悬，抽滤，转移到预先称重的0.45μm滤膜(15mL离心管)上；
7.烘箱50℃烘干，称重。
突变株和野生型副淀粉含量比较结果参见图3和表2，其中，L：光照培养；D黑暗培养。WT，野生型；M1，M2突变株1，2。可以看出，突变株M1具有比野生型的葡聚糖含量显著提高。
表2突变株和野生型副淀粉含量比较
实施例2：EMS处理浓度和时间的确定
本实施例比较了不同浓度(0.1％～0.9％)EMS处理裸藻野生型细胞不同时间后，培养液里的细胞数，结果参见表3。
表3不同浓度(0.1％～0.9％)EMS处理裸藻野生型细胞，30，60，90，120，240min后，培养液里的细胞数(单位是1.0×105cells/mL)
根据表3的结果，最终选定了0.5％EMS处理240min的诱变方案，在这个条件下，没有发生突变的细胞会大部分死亡，但存活了部分发生了突变的细胞。后续结果表明这是一个比较理想的处理方案。
实施例3
在KH培养基中，在25℃，光照(L)和黑暗(D)条件下，培养7天，2个裸藻突变株(M1，M2)的葡聚糖(Beta-1,3-葡聚糖，即副淀粉)含量比较。KH培养基配方如表4所示。
表4KH培养基配方
pH＝3.5or 5.5
培养结果参见图4，结果显示：野生型在黑暗条件下，裸藻葡聚糖的含量，比光照条件下高10％，但M1光照下M1(L)和黑暗M1(D)中的葡聚糖都显著高于野生型(p<0.01)，超过60％和80％的增加；而M2突变株在相同的情况下，M2(L)和M2(D)并没有多糖的增加。
实施例4
为探究裸藻突变株M1在相同培养基条件下的生长是否存在与野生型有差异，本实施例研究了突变株M1在KH培养基、黑暗条件下的生长曲线。使用KH培养基，将野生型纤细裸藻与突变株M1置于25℃下，黑暗培养7天。结果参见图5和表5。
表5野生型(WT)和突变株M1在黑暗培养条件下的裸藻OD750比较
结果表明，突变株M1的生长表型略不同于野生型，生长初期(2-5天时)生长速度快于野生型，生长后期(6天之后)与野生型没明显差别，说明突变株的生物量不亚于野生型。
比较例
取第7天的4组藻液(野生型光照组、野生型黑暗组、光照组、M2黑暗组)，利用离心机5000rpm/min离心5分钟收集藻细胞，利用真空冷冻干燥机冻干成藻粉。取冻干藻粉0.1g，加15mL 95％的乙醇，后置于摇床中震荡1h。离心机转速5000rpm/min离心2min，吸弃上清去除色素。加入15mL的1％SDS(W/V)，85℃水浴30min，使蛋白质变性溶解于SDS溶液中，离心机转速5000rpm/min离心2min，吸弃上清去除蛋白质，转移到预先称重的15mL离心管中，50℃烘干至恒重并称重，得出4组藻细胞副淀粉的含量。，野生型纤细裸藻副淀粉含量约为35.7％，40.3％，相同培养条件下，突变株副淀粉含量为56.8％，65.3％。我们的突变株葡聚糖含量增加了60％～80％(图3，4)。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一株高葡聚糖含量的纤细裸藻突变株(Euglena gracilis)ZWang109，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.40684。
2.根据权利要求1所述的纤细裸藻突变株ZWang109，其特征在于，所述微藻突变株ZWang109相对于野生型纤细裸藻E.gracilis 1224/5Z，葡聚糖含量增加了60％～80％。
3.根据权利要求1所述的纤细裸藻突变株ZWang109，其特征在于，所述葡聚糖包括β-葡聚糖。
4.根据权利要求3所述的纤细裸藻突变株ZWang109，其特征在于，所述β-葡聚糖以游离的颗粒状存在。
5.一种生产葡聚糖的方法，其特征在于，包括培养权利要求1～4任意一项所述的纤细裸藻突变株ZWang109的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述葡聚糖包括Beta-1,3-葡聚糖。
7.一种食品或营养增补剂，其特征在于，包含权利要求1～4任意一项所述的纤细裸藻突变株ZWang109。
8.权利要求1～4任意一项所述的纤细裸藻突变株ZWang109在制备食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品、保健品、饲料添加剂或饲料中的活性成分包括葡聚糖。
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