KR102083165B1 - 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주 및 이를 이용한 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법 - Google Patents

베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주 및 이를 이용한 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주, 즉 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체를 회수하는 단계를 포함하는, 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법을 제공한다.

Description

베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주 및 이를 이용한 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법{Novel microorganism of the Genus Euglena having beta-1,3-glucan-producing activity and process for producing Euglena-biomass containing beta-1,3-glucan using the same}
본 발명은 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주 및 이를 이용한 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법에 관한 것이다.
베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)은 파라밀론(paramylon)으로도 지칭되며, 세포벽 내에 천연으로 생성되는 β-D-글루코오스 폴리사카라이드이다. 베타-1,3-글루칸은 면역 조절제로서 기능할 수 있으며, 미세조류의 일종인 유글레나는 베타-1,3-글루칸을 함유하는 것으로 알려져 있다. 미국특허 제9574217호는 유글레나(Euglena) 속 균주를 배양하는 방법 및 상기 배양방법으로 얻어지는 베타-1,3-글루칸을 개시한 바 있다. 미국특허 제9574217호에 개시된 배양 방법은 반연속식 배양(repeated-batch)을 통한 베타-1,3-글루칸 함유 유글레나의 배양방법이다.
유글레나는 흡수한 무기/유기 탄소원을 베타-1,3-글루칸으로 전환시켜 세포 내에 저장하며, 독립영양성장보다 종속영양성장에서 그 함량과 생산성이 우수한 것으로 알려져 있다. 유글레나는 특정 화학적/물리적 환경에 노출될 경우, 환경에 저항하기 위해 이 저장물질을 에너지원으로 소진하게 되어 세포 내 다당류의 농도가 감소되는 특징이 있다. 특히, 유글레나는 빛 및/또는 유기당의 존재 혹은 좋지 않은 환경에 노출되었을 때, 축적했던 파라밀론이 탄소원으로 강등되면서 광합성이나 기타 대사로 소비되는 특성을 갖는다. 따라서, 유글레나를 배양하게 되면 녹색으로의 색전환 현상이 자주 발생하게 될 뿐만 아니라, 대수 증식기를 지나 유지기에 접어들면서 다당류의 농도가 빠르게 감소하는 현상이 보이며 배양시간이 길어질수록 베타-1,3-글루칸의 생산성은 감소하게 된다.
본 발명자들은 높은 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 균주를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 전국 각지의 담수로부터 유글레나 속 균주와 유사한 형태를 나타내는 균주들을 분리하고, 특정 조건에 적응한 균주를 얻기 위하여, 독립영양성장 조건에서 반복적인 계대배양 및 종속영양성장 조건에서의 암소 진탕 배양을 수행하였으며, 배양 패턴 및 베타-1,3-글루칸 생성능이 우수한 균주를 선별하여, 18s rRNA 서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 선별된 특정 균주가 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)에 속하는 신규의 균주로서, 배양 중 녹색으로의 색 전환이 현상이 발생하지 않고, 또한 유기당이 간헐적으로 추가로 주입되는 유가식 배양(Fed-batch)을 통하여, 성장저해 없이 성장하고 높은 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 선별된 유글레나 속 균주 즉, 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 유글레나 속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 유글레나 속 균주를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체를 회수하는 것을 포함하는 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체를 회수하는 단계를 포함하는, 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따라 얻어진 새로운 균주, 즉 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)는 자발적 돌연변이(spontaneously mutation) 조건 아래 탈색된 흰색의 신규의 균주로서, 유전적으로 조작된 결과물이 아닌 특정 조건에 적응된 균주이다. 상기 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)는 배양 중 녹색으로의 색 전환이 현상이 발생하지 않고, 또한 유기당이 간헐적으로 추가로 주입되는 유가식 배양(Fed-batch)을 통하여, 성장저해 없이 성장하는 특성을 갖는다. 특히, 상기 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)는 높은 베타-1,3-글루칸 생산능을 가지며, 따라서 상기 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 배양함으로써 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체를 효과적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의해 분리된 야생형 콜로니 및 양질의 콜로니를 현미경으로 관찰한 대표적인 예를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의해 선별된 야생셩 균주, #1, #2, 및 #13 균주를 5ℓ jar fermenter에서 유가식 배양을 수행 균주의 성장 패턴을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에 의해 선별된 균주의 종 확인을 위한 계통수(phylogeny tree)이다.
본 명세서에서 "베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는" 균주라 함은 해당 균주의 배양액으로부터 회수한 균체 중 베타-1,3-글루칸의 생산성이 0.2 g/L/h 이상, 바람직하게는 0.25 g/L/h 이상인 균주를 의미한다.
본 발명은 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 제공한다.
본 발명자들은 강원도 태백시 황지연못에서 담수로부터 유글레나 속 균주와 유사한 형태를 나타내는 균주들을 분리하고, 특정 조건에 적응한 균주를 얻기 위하여, 채취한 균주들을 독립영양성장 조건에서 반복적인 계대배양을 수행하여 독립영양성장 조건에 적응한 균주로서 녹색으로 전환되지 않은 균주들을 수득하였다. 수득한 균주들에 대하여 종균배양 및 종속영양성장 조건에서의 암소 진탕 배양을 실시하고, 세포건조중량, 잔여당, 베타-1,3-글루칸 함량을 측정하여 성장이 우수하고 베타-1,3-글루칸 함량이 높은 균주 3종, 즉, #1, #2, 및 #13을 선별하였다. 선별된 균주들을 5ℓ jar fermenter에서 유가식(Fed-batch) 배양을 수행하여, 성장 패턴, 세포건조중량, 잔여당, 베타-1,3-글루칸 함량, 및 베타-1,3-글루칸 생산성을 측정한 결과, #1 균주가 가장 높은 베타-1,3-글루칸 생산성을 나타내었으며, 성장 패턴도 우수하였다. 선별된 #1 균주에 대하여 18s rRNA 서열 분석 및 염기서열 분석을 수행한 결과, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)에 속하는 신규의 균주임을 확인하였다. 선별된 #1 균주를 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)로 명명하였으며, 이를 2019년 8월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 13930BP의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 또한 상기 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체를 회수하는 단계를 포함하는, 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법을 제공한다.
상기 배양은 유가식 배양방법(Fed-batch)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 물(예를 들어, 정제수 등) 중에 당원으로서 포도당(Glucose), 인산염(KH2PO4, K2HPO4 등), 금속염(MgSO4, ZnSO4, CuSO4, FeSO4, NaMoO4, MnCl2 등), 붕산, 비타민 B1, B12 등을 포함하는 배지 중에서 수행될 수 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 배지는 소포제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 배지 중에서의 균주의 배양은 통상의 배양방법, 예를 들어 무균 탱크에서 무균적, 유기종속적(예를 들어, 당원으로서 포도당을 사용하여)으로 수행될 수 있으며, 공기를 0.3∼1.0vvm, 교반을 200∼500rpm, pH는 3.0~6.8로 조절하여 유가식으로 수행될 수 있다.
상기 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체의 회수는 배양액을 예를 들어 원심분리 등에 의해 균체를 회수함으로써 수행될 수 있다. 얻어진 균체는 필요에 따라 복수의 농축과 수세 단계를 거쳐 적절한 농도로 농축하고, 통상의 방법, 예를 들어 분무건조 또는 드럼건조를 통해 베타글루칸을 함유하는 유글레나 균체를 분말 형태로 수득할 수 있다
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
2015년 1월경 강원도 태백시 황지연못에서 담수를 채취하여 필터(Advantec filter)를 이용해 담수를 통과시켜 샘플링을 진행하였다. 멸균된 0.9% 생리식염수로 필터를 세척한 후, 현탁액을 회수하였다. 얻어진 현탁액을 포도당-비함유 광독립영양성장 플레이트(정제수 중에 (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, 구연산나트륨, Fe2(SO4)3, MnCl2, CoSO4, ZnSO4, Na2MoO4, CuSO4, H3BO3, 비타민 B1, 및 비타민 B12를 함유)에 도말한 후 28℃에서 2,500∼3,000 lux 하에서 5-10일간 정치 배양하였다. 생성된 다수의 단일 콜로니들을 상기와 동일한 포도당-비함유 광독립영양성장 플레이트에서 계대배양한 후, 현미경 관찰을 통하여 유글레나 균주와 유사한 형태(형태학적으로 다른 녹색 미세조류(예를 들면 클로렐라)에 비하여 약 20∼200배의 크기를 갖고, 편모를 가지며 녹색을 띄는 원통모양의 형태; 및 길쭉한 방추형의 형태로 늘어났다가 다시 작은 타원형으로 작아지는 운동을 반복적으로 하고, 때로는 유영을 하며 세포 중 편모가 있는 부분에 빨간 안점을 갖는 형태)를 갖는 야생형(wild-type) 콜로니들을 얻었다. 얻어진 야생형 콜로니들을 2% 글루코오스를 함유하는 혼합영양성장 액상 배지(enrichment broth medium)(정제수 중에 포도당, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, 구연산나트륨, Fe2(SO4)3, MnCl2, CoSO4, ZnSO4, Na2MoO4, CuSO4, H3BO3, 비타민 B1, 및 비타민 B12를 함유)에서 증균배양을 실시하였다. 배양액 일부를 취하여 상기와 동일한 포도당-비함유 광독립영양성장 플레이트에 도말한 후 28℃에서 2,500∼3,000 lux 하에서 5-10일간 정치 배양하였다. 생성된 균체 중 흰색 콜로니들만을 취하여 상기와 동일한 포도당-비함유 광독립영양성장 플레이트에서 재배양한 다음, 녹색으로 전환되지 않은 양질의 콜로니들(즉, 양질의 균주 14종)을 수득하였다. 도 1은 야생형 콜로니 및 양질의 콜로니를 현미경으로 관찰한 대표적인 예를 나타낸다.
실시예 2. 균주의 배양 패턴 및 베타-1,3-글루칸 함량 비교 (플라스크 배양)
1차 선별된 균주(야생형 균주 및 양질의 균주 14종)에 대하여 500 ml 플라스크 배양을 실시하여 균주의 배양 패턴 및 베타-1,3-글루칸 함량을 확인하였다. 각각의 균주를 2% 글루코오스를 함유하는 종속영양성장배지(정제수 중에 포도당, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, 구연산나트륨, Fe2(SO4)3, MnCl2, CoSO4, ZnSO4, Na2MoO4, CuSO4, H3BO3, 비타민 B1, 및 비타민 B12를 함유)에서 증균배양한 다음, 상기와 동일한 2% 글루코오스를 함유하는 종속영양성장 배지 100 ml에 각각 접종한 후, 28℃, 암소에서 100 RPM의 조건으로 교반하며 배양하였다. 배양 72시간 후, 배양액을 채취하여 세포건조중량(DCW), 잔여당(RS), 베타-1,3-글루칸 함량을 측정한 결과는 다음 표 1과 같다.
균주 DCW (g/L) 베타-1,3-글루칸 (%) △RS (%)
야생형 10.9 53.21 1.4
#1 16.3 63.80 1.61
#2 13.9 58.27 1.48
#3 8 52.50 0.66
#4 12.8 55.47 1.28
#5 13.6 58.82 1.44
#6 13.3 55.64 1.32
#7 13.3 52.63 1.26
#8 3.3 57.58 0.30
#9 12.3 55.28 1.41
#10 12.3 57.72 1.45
#11 13.6 53.68 1.21
#12 9.7 52.58 0.91
#13 15.8 58.23 1.58
#14 10.7 52.34 1.41
상기 표 1의 결과로부터 성장이 우수하고 베타-1,3-글루칸 함량이 높은 균주 3종, 즉, #1, #2, 및 #13을 선별하였다.
실시예 3. 선별 균주의 배양 패턴 및 베타-1,3-글루칸 함량 확인 ( 5 ℓ Jar fetmenter)
성장이 우수하고 베타-1,3-글루칸 함량이 높은 균주 3종, 즉, #1, #2, 및 #13을 유가식 배양에 적용하여 성장 패턴 및 베타-1,3-글루칸 함량을 비교하였다. 야생형 균주, #1, #2, 및 #13 균주를 하기 표 2의 조건으로 5ℓ jar fermenter에서 유가식(Fed-batch) 배양을 수행하였다.
조건
온도 25-30 ℃
RPM 50-150
통기량 0.1-1 vvm
Vi 1-3 L
초기당 농도 0.5-3.0 %
최종 주입 당농도 6-12 %
상기와 같이 배양을 수행하였을 때 얻어진 각각의 균주의 성장 패턴은 도 2와 같다. 또한, 배양 종료 후 일정량을 채취하여, 세포건조중량(DCW), 소비당, 베타-1,3-글루칸 함량, 및 베타-1,3-글루칸 생산성을 측정 및 비교한 결과는 다음 표 3과 같다.
균주 DCW (g/L) 베타-1,3-글루칸 (%) 수율 (%) 소비당 (%) 베타-1,3-글루칸 생산성 (g/L/h) 배양시간 (hrs)
야생형 28.7 56.4 66.3 4.33 0.131 124
#1 53.45 73.5 72.5 7.37 0.271 145
#2 45.9 66.4 78.3 5.87 0.219 139
#13 33.4 71.3 74.2 4.5 0.171 139
상기 표 3의 결과로부터 #1 균주가 가장 높은 베타-1,3-글루칸 생산성을 나타내었으며, 성장 패턴도 우수한 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 균주 동정
#1 균주의 종 확인을 위하여 하기 표 4의 프라이머쌍을 사용하여 18s rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.
서열번호 염기서열
18s-SF 1 AAYTGGTTGATCCTGCCAGY
18s-SR 2 TGATCCTSTGCAGGTTCACC
수득한 #1 균주의 18s rRNA 염기서열 분석을 위해 5L-JF에서 배양된 균체를 농축, 수세 후 분무건조하여 균체분말을 수득하였다. 균체분말을 사용하여 전체 DNA를 추출한 후 18S 부분을 상기 표 4의 유글레나 그라실리스 18s rRNA 프라이머쌍을 사용하여 PCR 반응(총 부피 20㎕, 98℃ 30초 1사이클 후, 98℃에서 10초, 53℃에서 10초, 72℃에서 1분15초, 총 34 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 증폭된 단편을 얻은 다음, 18s rRNA 염기서열 분석을 실시하였다. 상기 PCR 단편 및 #1 균주의 염기서열 분석을 마크로젠에 의뢰하였으며, 도 3의 계통수(phylogeny tree)를 분석한 결과, 상기 #1 균주는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)에 속하는 신규의 균주로 확인되었다. 상기 #1 균주를 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)로 명명하였으며, 이를 2019년 8월 28일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 13930BP의 수탁번호를 부여받았다.
<110> DAESANG CORPORATION <120> Novel microorganism of the Genus Euglena having beta-1,3-glucan-producing activity and process for producing Euglena-biomass containing beta-1,3-glucan using the same <130> PN0901 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aaytggttga tcctgccagy 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tgatcctstg caggttcacc 20

Claims (2)

  1. 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP).
  2. 유글레나 그라실리스 DSW 1(Euglena gracilis DSW 1)(KCTC 13930BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 베타-1,3-글루칸을 함유하는 균체를 회수하는 단계를 포함하는, 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법.
KR1020190114831A 2019-09-18 2019-09-18 베타-1,3-글루칸 생산능을 갖는 신규의 유글레나 속 균주 및 이를 이용한 베타-1,3-글루칸을 함유하는 유글레나 균체의 제조방법 KR102083165B1 (ko)

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