KR20190008422A - 유글레나 용해물 조성물과 상기 조성물 및 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법 - Google Patents

유글레나 용해물 조성물과 상기 조성물 및 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법 Download PDF

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데렉 잠록
킵 주르처
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에프3 플랫폼 바이오로직스, 인크.
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Abstract

조성물은 유글레나(Euglena) 용해물 및 세포 성분 및 유글레나 용해물과 유글레나 바이오매스를 생성한 발효 공정에서 남은 잔존 매질을 포함한다. 세포 성분은 1.2∼580 킬로달톤(kDa)의 분자량을 갖는 하나 이상의 베타-글루칸 중합체쇄를 포함할 수 있다. 유글레나 용해물의 제조 방법은, 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계, 바이오매스를 용해시키는 단계, 및 용해된 바이오매스를 건조시켜 유글레나 용해물을 형성하는 단계를 포함한다. 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법은 바이오매스를 성장시키는 단계, 이것을 용해하는 단계, 세정 및 탈수 및 건조하는 단계를 포함한다.

Description

유글레나 용해물 조성물과 상기 조성물 및 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법
관련 출원(들)
이 PCT 출원은 2016년 6월 9일자 출원된 미국 출원 15/177,368호; 및 2016년 6월 9일자 출원된 미국 출원 15/177,376호; 및 2016년 6월 9일자 출원된 미국 출원 15/177,383호를 기초 출원으로 하며; 이들 문헌의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
발명 분야
본 발명은 유글레나속 유기체 분야에 관한 것이고, 더 구체적으로 본 발명은 유글레나 용해물 조성물 및 유글레나 용해물의 제조 및 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법에 관한 것이다.
베타-글루칸은 세균, 효모, 조류, 진균에 의해 그리고 곡물에서 생성되는 β-D-글루코스 다당류의 일 군이다. 베타-글루칸의 특성은 공급원에 따라, 예를 들어, 세균, 조류, 효모 또는 다른 공급원에서 유래하는지에 따라 달라진다. 통상적으로 베타-글루칸은 1,3 베타-글리코시드 결합을 갖는 선형 주쇄를 형성한다. 베타-글루칸을 인간 또는 동물의 음식에 혼입하는 것이 유리하다고 알려져 있다. 일부 베타-글루칸은 면역 조절을 돕고 포화 지방의 수준을 감소시키며 심장병의 위험을 낮출 수 있다. 또한, 상이한 유형의 베타-글루칸은 인간 생리에 상이한 영향을 준다고 알려져 있다. 예를 들어, 곡물 베타-글루칸은 고콜레스테롤혈증을 갖는 사람들에서 혈당 조절에 영향을 미칠 수 있고, 한편 버섯 베타-글루칸은 면역계에서 생물학적 반응 조절제로서 작용할 수 있다. 몇몇 증례에서, 효모 베타-글루칸은, 알레르기성 비염과 관련이 있고 IL12의 수준을 증가시키는 IL4 및 IL5 시토카인의 수준을 감소시킬 수 있다고 발견되었다.
또한, 파라밀론(베타-1,3-글루칸)을 함유하는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 바이오매스는 개인의 면역 기능을 증대시킬 수 있다는 것이 판명되었다. 파라밀론은 고분자량을 갖는 선형 (비분지형) 베타-1,3-글루칸 다당류 중합체이다. 이 비분지형 중합체는 효모 및 곡류, 예컨대, 귀리 및 보리의 세포벽에서 유래하는 분지형 베타-(1,3; 1,6)-글루칸 및 버섯에서 발견되는 것과 같은 다당류 측쇄를 형성하는 베타-(1,4)-글리코시드 결합을 갖는 분지형 베타-1,3-글루칸과 같은 다른 베타-글루칸과 구분된다.
유글레나 유래 베타-글루칸의 이점은, 베타-(1,6), 베타(1,4), 및 베타(1,2) 결합 및 임의의 사이드 분지 구조가 없다는 것이다. 분지를 갖는 일부 다른 글루칸과 유사한 분자로서, 이 선형 베타-글루칸은 불용성이고, 면역 반응에 관여하는 수용체에 대한 결합 친화도 및 편재화가 함께 더 높고 균질하다고 여겨진다. 파라밀론은, 원생생물 유기체이고 유글레나 패밀리내 미세 조류 분류 유글레나조강의 일원인 유글레나 그라실리스 조류로부터 얻어질 수 있으며, 또한 파라밀론을 생성할 수 있는 다수의 상이한 독립영양 및 종속영양 종을 포함한다. 이들 원생생물은 얕은 물, 강, 호수 및 연못과 같은 풍부한 담수에서 발견될 수 있다. 파라밀론은 유글레나류의 에너지-저장 화합물이며 다른 조류의 전분 또는 유지에 필적하는 것이다. 파라밀론은 피레노이드에서 생성되고 세포질에서 과립으로서 저장된다. 유글레나 그라실리스 중의 파라밀론 과립은 장방형이고 직경이 약 0.5-2 마이크로미터(㎛)이다. 유글레나 그라실리스 보존 배양은 보통 제어된 실험실 조건에서 유지되고 최초 접종원으로서 사용된다. 유글레나 그라실리스는 밀폐된 살균가능한 생물반응기에서 무균 제조될 수 있다. 유글레나 그라실리스 접종원을 시드 생물반응기로 옮겨 더 많은 양의 바이오매스를 축적한 다음 필요에 따라 더 큰 생물반응기로 계대배양할 수 있다.
개선된 발효 기술을 이용하여 유글레나속 유기체, 더 구체적으로는 유글레나 그라실리스로부터 이러한 선형 비분지형 베타-1,3-글루칸의 생성을 늘리는 것이 바람직하다. 유글레나 그라실리스 유래 베타-글루칸은 면역 반응 증대를 비롯한 인간 및 다른 동물 건강에 유리한 특성 및 다른 건강 증진 특성을 부여할 수 있다. 면역 조절 개선 및 다른 용도를 위한 증대된 특성을 갖는 베타-글루칸 조성물을 형성하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
이 요약은 이하 상세한 설명에서 더 설명되는 개념 선택을 도입하기 위하여 제공되는 것이다. 이 요약은 청구되는 발명 대상의 주요 또는 필수 특징들을 규정하기 위한 것도 아니고, 청구되는 발명 대상의 범위를 한정함에 있어서의 보조로서 이용하기 위한 것도 아니다.
조성물은 유글레나 용해물 및 유글레나 바이오매스와 유글레나 용해물을 생성한 발효 공정에서 남은 잔존 매질과 세포 성분을 포함한다. 이 조성물은 아연을 비롯한 금속을 포함할 수 있고, 단회 복용량 캡슐로 또는 영양 보조식품으로서 첨가되도록 제형화될 수 있다.
잔존 매질은 무기질 및 비타민 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 한 예에서, 무기질 및 비타민은 비오틴, 칼슘, 구리, 엽산, 철, 마그네슘, 망간, 니아신, 인, 칼륨, 나트륨, 아연 및 비타민 B1, B2, B6, B12, C, D, E, K1 또는 이의 염으로 이루어지는 군에서 선택된다. 세포 성분은 지질, 단백질 및 아미노산을 포함할 수 있다. 한 예에서, 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 군에서 선택된다. 지질은 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 지방, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산, 팔미톨레산, 및 판토텐산으로 이루어지는 군에서 선택된다. 조성물은 알파- 및 베타-카로텐, 아스타잔틴, 루테인 및 제아잔틴을 비롯한 카로티노이드를 더 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 유글레나 용해물 및 유글레나 바이오매스와 유글레나 용해물을 생성한 발효 공정에서 남은 잔존 매질과 세포 성분을 포함할 수 있다. 세포 성분은 1.2∼580 킬로달톤(kDa)의 분자량을 갖는 하나 이상의 베타-글루칸 중합체쇄를 포함할 수 있다. 베타-글루칸 중합체쇄는 7∼3,400 글루코스 단위의 중합체 길이를 가질 수 있다.
유글레나 용해물의 제조 방법은 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계, 및 비제한적 실시예에서, 성장된 바이오매스를 탈수시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 바이오매스를 용해하는 단계 및 용해된 바이오매스를 건조시켜 유글레나 용해물을 형성하는 단계를 더 포함한다. 유글레나 용해물에 금속이 첨가될 수 있다.
한 예에서, 탈수는 바이오매스의 원심분리 또는 중력 디캔팅을 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 원심분리는 디캔터, 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 및 필러 원심분리로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 용해는 기계적, pH 및 온도 매개 용해로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 기계적 용해는 균질화 또는 비드 밀링을 포함할 수 있다. 바이오매스는 500 barg 초과의 압력에서, 다른 예에서는, 500∼1,900 barg의 압력 범위에서, 또 다른 예에서는, 750∼1,000 barg의 압력 범위에서 균질화될 수 있다.
바이오매스는 7.0 초과의 pH 및 5℃ 초과의 온도에서 용해될 수 있고, 다른 예에서, 바이오매스는 염기로 처리되고 9.0 초과의 pH 및 45℃ 초과의 온도에서 용해된다. 바이오매스는 또한 염기로 처리되고 9.0∼12.5의 pH 및 45∼100℃의 온도에서 용해될 수 있다. 용해된 바이오매스는 분무 건조, 리본 건조, 트레이 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조 및 진공 드럼 건조로 이루어지는 군에서 선택되는 공정에 의해 건조될 수 있다. 성장된 바이오매스는 리터당 50∼350 그램(g/L)의 농도까지 탈수될 수 있다.
또 다른 예에서, 본 방법은 성장된 바이오매스를 탈수하는 것을 포함하지 않는다. 유글레나 용해물의 제조 방법은 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계, 바이오매스를 용해시키는 단계, 및 용해된 바이오매스를 건조시켜 유글레나 용해물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법은, 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계, 비제한적 실시예에서, 성장된 바이오매스를 탈수하는 단계를 포함한다. 본 방법은, 바이오매스를 용해하여 용해된 바이오매스를 형성하고, 용해된 바이오매스를 세정 및 탈수하여 베타-1,3-글루칸을 생성하고, 베타-1,3-글루칸을 건조시켜 정제된 베타-1,3-글루칸을 생성하는 것을 더 포함한다. 본 방법은 용해된 바이오매스를 복수회 세정 및 탈수하는 것을 포함할 수 있다. 탈수는 바이오매스를 원심분리하거나 중력 디캔팅하는 것을 포함할 수 있다. 원심분리의 예는 디캔터, 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 및 필러 원심분리로 이루어지는 군에서 선택된다.
용해는 기계적, pH 및 온도 매개, 계면활성제, 및 효소 용해로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 기계적 용해는 바이오매스를 균질화하거나 또는 비드 밀링하는 것, 예를 들어, 500 barg 초과의 압력, 500∼1,900 barg의 압력 범위, 다른 예에서는, 750∼1,000 barg의 압력 범위에서 바이오매스를 균질화하는 것을 포함할 수 있다. 바이오매스는 7.0 초과의 pH 및 5℃ 초과의 온도에서 용해될 수 있다. 바이오매스를 염기로 처리하고 7.0 초과의 pH 및 45℃ 초과의 온도에서 바이오매스를 용해시키는 것도 가능하다. 바이오매스는 염기로 처리되고 7.0∼12.5의 pH 및 45∼100℃의 온도에서 용해될 수 있다. 바이오매스는 리터당 3∼350 그램(g/L), 더 바람직하게는 50∼175 g/L의 농도를 갖는 슬러리로서 형성될 수 있다.
용해는, 코코넛유, 팜유, 팜핵유, 및 필루(pilu) 오일 중 적어도 하나를 포함하고 지방산에서 유도되는 계면활성제로 바이오매스를 처리하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용해는, 코코넛유, 팜유, 팜핵유, 및 필루 오일 중 적어도 하나를 포함하고 지방산에서 유도되는 아실-아미노 계면활성제로 바이오매스를 처리하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 용해 또는 용해후 세포 단편을 더 세정하기 쉽게 하는 처리는 리소자임, 단백질, 리파아제, 또는 조합 중 하나 이상으로 바이오매스를 처리하는 것을 포함할 수 있다. 용해된 바이오매스를 물, 산, 염기, 에탄올, 또는 조합 중 하나 이상으로 처리함으로써, 용해된 바이오매스를 세정할 수 있다. 건조는 분무 건조, 리본 건조, 트레이 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조 및 진공 드럼 건조로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
다른 예에서, 성장된 바이오매스는 용해 전 탈수되어야 하거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법은, 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계, 바이오매스를 용해시켜 용해된 바이오매스를 형성하는 단계, 용해된 바이오매스를 세정하고 탈수하여 베타-1,3-글루칸을 생성하는 단계, 및 베타-1,3-글루칸을 건조하여 정제된 베타-1,3-글루칸을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
첨부 도면에 비추어 검토할 때, 후속되는 본 발명의 상세한 설명으로부터 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점이 명백해질 것이다:
도 1은 비제한적 실시예에 따라 반복 공급 회분 발효를 이용하는 바람직한 베타-글루칸 제조 공정을 나타내는 하이-레벨 흐름도이다.
도 2는 비제한적 실시예에 따라 연속 발효를 이용하는 베타-글루칸 제조 공정을 나타내는 다른 하이-레벨 흐름도이다.
도 3은 비제한적 실시예에 따라 정제된 베타-글루칸을 제조하기 위한 다운스트림 프로세싱의 한 예를 나타내는 하이-레벨 흐름도이다.
도 4는 비제한적 실시예에 따라 베타-글루칸 용해물을 제조하기 위한 다운스트림 프로세싱의 한 예를 나타내는 하이-레벨 흐름도이다.
도 5는 비제한적 실시예에 따라 전세포 유글레나 그라실리스의 제조를 위한 다운스트림 프로세싱의 한 예를 나타내는 하이-레벨 흐름도이다.
도 6은 비제한적 실시예에 따라 독립영양, 혼합영양 및 종속영양의 조합을 이용하는 베타-글루칸 제조 공정의 하이-레벨 흐름도이다.
도 7은 비제한적 실시예에 따라 도 1의 유글레나 그라실리스 프로세싱의 한 예로부터 형성된 조성물을 함유하는 캡슐의 한 예이다.
상세한 설명
이제, 이하에서 바람직한 실시양태들을 나타낸 첨부 도면을 참조하여 상이한 실시양태들을 더 완전히 설명하기로 한다. 다수의 상이한 형태가 기재될 수 있는데 개시되는 실시양태들은 본원에 기재된 실시양태들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이들 실시양태는 본 개시내용이 철저하고 완전하도록 그리고 당업자에게 범위를 완전히 전달하도록 제공되는 것이다.
유글레나 그라실리스 유래 베타-글루칸은 베타-1,3-글루칸, 베타-1,3-D-글루칸, 파라밀론, 조류 베타-글루칸 또는 유글레나 베타-글루칸으로서도 당업자에 의해 공지되어 있다. 보통 50∼75 중량%의 베타-글루칸을 생성하고 세포내 결정 과립으로서 저장되는, 유글레나 그라실리스로서 공지된 원생생물 유기체의 발효를 이용한 스케일-업 프로세싱 방법의 상세를 이하 나타낸다. 베타-글루칸은 글루코스 중합체이고 유글레나 그라실리스에 의해 생성되는 베타-글루칸내 글루코스 결합은 주로 1,3이다(>99%). 베타-글루칸의 다른 공급원은, 예를 들어, 유글레나 그라실리스로부터 생성된 베타-글루칸과 비교하여 효모로부터 생성된 베타-글루칸은 상이한 비율의 1,3, 1,4, 1,6, 2,3 및 3,6 결합을 갖고, 분지 및 상이한 중합체 길이를 가진다. 다른 베타-글루칸 공급원과의 이들 구조적 차이가 생체내 동물 시험에서 상이한 반응을 유도하는 것으로 생각된다. 아실화, 술폰화, 니트로화, 인산화 또는 카르복시메틸화와 같은 비제한적 작용기 치환을 갖는 자생 베타-1,3-글루칸 구조로의 변경은 용도에 따라 글루칸의 물리화학적 특성을 유리하게 변경할 수 있는데, 예를 들어, 용해도, 생성물 편재화 또는 결합 부위 친화도를 개선할 수 있다.
이제 도 1을 참조하면, 비제한적 실시예에 따라 베타-글루칸의 제조에 사용될 수 있는 프로세싱 단계의 시퀀스가 20에 일반적으로 도시되어 있다. 이 공정은 반복-공급 회분 발효라 일컬어지는 것을 이용하며 조성물을 정제된 베타-글루칸, 유글레나 그라실리스 용해물 또는 건조된 유글레나 바이오매스로서 생성한다.
이 공정은, 스타터 시드 트레인(블록 22), 페른바흐 플라스크, 예를 들어, 당업자에게 공지된 표준 크기 플라스크에서 종속영양으로 배양물을 성장시키는 것(블록 24)으로 개시된다(블록 21), 계대배양 부분을 피드백하면서 다른 부분은 시드 용기 또는 탱크(블록 26)로 이동시키고, 이후 발효 탱크로 이동시킨다. 이 때, 발효는 살균된 공급물(블록 30)을 이용하여 이하에서 더 상세히 설명하는 바와 같이 반복-공급 회분 발효 공정(블록 28)으로 계속된다.
조작에 있어서, 발효 공정은 23∼32℃로 온도를 제어하고 3∼5의 pH를 가지며, 공기 또는 산소의 전달 및 교반에 의해 제공되는 진탕과 더불어 또는 이러한 진탕 없이 10∼40%의 용존 산소 함량을 가진다. 영양원은 탄소 공급원으로서 글루코스 및 다른 당 또는 단쇄 지방산, 질소를 위해 아미노산 또는 암모니아 및 이의 염, 및 미량의 금속 성분 및 비타민을 포함할 수 있다. 종래 및 신규 발효 성장 성분 중 적어도 하나가 발효 동안 발효 회분에 첨가될 수 있고, 발효 회분의 적어도 일부를 수확하여 바이오매스를 생성할 수 있다.
발효 요건 및 조작 파라미터에 따라 회분의 대략 5% 내지 약 95%가 수확되고(블록 32), 잔존 배지는 다음 회분을 위한 접종물이다. 이 과정은 "반복" 또는 "배출 및 주입" 공정에 해당한다. 이 때, 회분의 약 5% 내지 약 95%의 수확으로부터의 유출물은 원심분리되어 농축 슬러리 또는 습 케이크를 형성하고, 이 비제한적 실시예에서는 원하는 생성물 유형에 따라 각 블록 34, 36 및 38에 나타낸 바람직한 디캔터 원심분리로 시작되는 세 프로세싱 단계를 거친다. 디캔터 원심분리는 원심분리력을 이용하여 슬러리 중의 액체로부터 고체 물질을 분리하는 것으로 이해되어야 한다. 디캔터 원심분리 대신에, 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 다른 원심분리 기술들이 탈수에 이용될 수 있다. 이들은 대규모 프로세싱을 위해 설계된 것이다. 여과와 같은 다른 농축 기술에 더하여 중력 디캔팅 및 다른 원심분리 기술을 사용하여 바이오매스를 탈수시킬 수 있다.
원심분리 후 제1 시퀀스에서는, 오직 초회 패스로 바이오매스를 용해한다(블록 40). 이것은 또한 이를테면 원심분리 동안 세정되고(블록 42), 용해 및 세정 후, 한 예로서 분무 건조되고(블록 44), 세정으로부터 얻어진 정제된 베타-글루칸으로서 포장된다(블록 46). 세정 과정은 이하 개시되며 사용되는 세포 용해 기술에 따라 달라질 수 있다. 세포를 용해하기 위하여, 각종 기계적 파쇄 장비, 화학물질 또는 다른 특별한 용해 조작이 이용될 수 있다. 제2의 가능한 시퀀스에서는, 원심분리(블록 36) 후, 바이오매스가 용해되고(블록 48), 분무 건조되어(블록 50) 유글레나 그라실리스 용해물로 포장된다(블록 52). 제3의 가능한 시퀀스에서는, 원심분리(블록 38) 후, 분무 건조되고(블록 54) 건조된 유글레나 그라실리스 바이오매스로서 포장된다(블록 56).
이하 더 상세히 설명되는 바와 같이, 용해물 또는 전세포 물질 조성물은, 발효기 내에 존재하고 형성된 그대로 조성물 중에 포함되는 조류 세포 외부의 성분들을 포함하는 발효 물질을 포함할 수 있다. 많은 성분들이 발효 공정 동안 소모되었을 수 있어도 조성물은 일부 매질 및 비타민을 포함할 수 있다. 이것은 금속 및 베타 글루칸을 포함하는 조성물을 포함할 수 있고, 금속은 아연일 수 있다. 조성물은 단백질 및 아미노산, 지질, 아연과 같은 무기질, 대사산물, 비타민, 및 베타-글루칸을 갖는 바이오매스 용해물을 포함할 수 있다. 세포 단편 및 다른 성분들의 이 조합은 최종 생성물에 추가의 유리한 특성을 부여할 수 있다. 발효기 내에 있는 바이오매스 외부의 성분들은 용해물 생성물 및 조성물의 일부가 되어 다양하고 가능한 식품, 의약품 및 화장품 용도에서 유리하고 유용한 이익이 될 수 있다.
종속영양 배양의 개시에 있어 제1 단계는 매질을 준비하는 것이라는 이해하에, 이제 스타터 시드 트레인(블록 22)을 설명한다. 시드 트레인은 슬랜트(slant), 플레이트, 동결 배양 또는 다른 배양 저장 메카니즘으로부터 개시될 수 있다. 50 밀리리터에서부터 3 리터 이상에 이르는 플라스크 내에서의 다회 계대배양을 이용하여, 시드 용기(들) 및 스타터 시드 트레인을 위한 배양을 준비한다.
시드 트레인 프로세싱이 완료된 때, 시드 발효가 일어날 수 있다. 생산 스케일 환경에서, 최대 생산 발효 장비를 이용하기 전에, 점점 더 큰 시드 용기로 계대배양되는 배양물을 포함하는 하나 이상의 시드 용기를 갖는 것이 일반적이다. 시드 용기(들)의 목적은 시드 트레인과 동일하게 바이오매스 축적을 최대화하는 것이다. 시드 용기 공정은 일반적으로 회분 발효 공정이지만, 한 예에서는 일부 또는 모든 매질 성분들을 위한 살균 공급물을 포함한다. 바이오매스 침강을 방지하기 위하여 폭기 및 약간의 혼합물을 필요로 할 수 있다.
생산 스케일 환경에서, 최종 발효 탱크는 보통 최대 용기이고 전체 시설 생산량에 있어 제한 단계일 수 있다. 생산 목적에서 발효 용기는 가치 있는 분자(들)를 발생시키는 것이다. 이 단계에서 사용되는 매질은 상이한 성분들을 포함할 수 있으며, 매질에 대한 추가의 변경 및 대체가 개발될 수 있다. 시드 트레인 및 전체 시드 발효에 비하여, 공정의 이 단계는 추가의 바이오매스를 축적할 뿐만 아니라, 파라밀론 생성도 최적화한다. 유글레나 그라실리스 프로세싱을 위한 몇가지 발효 옵션이 존재한다. 이들은 (1) 회분; (2) 공급-회분; (3) 반복-회분; 및 (4) 연속 발효를 포함한다.
1. 회분 발효에서는, 매질이 접종 전에 첨가된다. 회분 발효에 대한 추가 공정은 폭기, 혼합, 온도 제어 및 pH 제어를 위한 산/염기 성분일 수 있다.
2. 공급-회분 발효에서는, 추가의 매질이 연속적으로 또는 별개의 시점에 발효 회분에 첨가될 수 있다. 공급물 물질은 전체 매질 처방, 선택된 성분들 또는 출발 회분 매질에 포함되지 않은 새로운 성분들일 수 있다. 발효 동안 임의의 시점에서 시작, 중단 및 가변적 주입 속도를 가질 수 있는 다수의 공급물이 존재할 수 있다. 공급-회분 발효에 대한 추가 공정은 폭기, 혼합, 온도 제어 및 pH 제어를 위한 산/염기 성분 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
3. 반복-회분(반복-인출) 공정은 회분 발효이다. 그러나, 전체 발효기를 수확하는 표준 회분 발효와 비교하면, 회분의 끝에, 발효의 일부가 수확될 수 있다. 새로운 살균 매질이 발효기 안의 잔존 배양물에 첨가될 수 있다. 반복 회분은 시드 용기에 의해 전달될 수 있는 것보다 더 많은 양의 접종물을 허용할 수 있다. 또한 탱크 턴어라운드 시간(다운타임) 및/또는 비생산 시간이 감소될 수 있다. 시드 용기는 보통 반복-회분 시리즈의 개시에 필요하지만, 매 회분마다 요구되지 않을 수 있어, 시드 트레인의 작업 부하를 낮춘다. 반복-회분 발효에 대한 추가 공정은 폭기, 혼합, 온도 제어 및 pH 제어를 위한 산/염기 성분 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
4. 도 2에 도시된 바와 같은 연속 발효에서, 살균된 매질 성분들 또는 원래 매질로부터 선택된 성분들 또는 원래 매질에 서술되지 않은 성분들의 스트림이 발효 공정에 공급되고, 그 동안 발효기 또는 발효 탱크의 연속 퍼지가 수확된다. 발효가 실용적으로 유지되고 유입 영양분 및 유출 수확 유량 사이에 생물학적 균형이 유지된다. 이 발효 공정은 완전히 수확되지는 않으며, 연속 수확 볼륨 및 최소 탱크 턴어라운드가 가능하다. 연속 발효에 대한 추가 공정은 폭기, 혼합, 온도 제어 및 pH 제어를 위한 산/염기 성분의 사용 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
도 2의 연속 발효 공정은, 반복-공급 회분 발효(도 1의 블록 28) 대신에 연속 발효(블록 28a)가 존재한다는 것을 제외하고, 반복-공급 회분 발효와 유사하다. 또한, 연속 발효가 이용되는 경우, 회분의 5∼95%의 수확(도 1의 블록 32)이 존재하지 않고 대신에 발효기로부터의 연속 배출을 수집하기 위한 수확 보관(블록 32a)이 존재한다.
건조된 바이오매스를 생성하기 위한 기술은 다수 존재한다. 바람직한 기술은 분무 건조가 후속되는 디캔터 원심분리를 통해 기계적으로 탈수하는 것이다. 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 상이한 원심분리 기술이 이용될 수 있다. 분무 건조 단계는 미생물 바이오버든을 감소시키기 위하여 가열될 수 있는 유동성 분말을 생성할 수 있다. 추가적으로, 최종 물질내 미생물 바이오버든을 감소시키기 위하여 분무 건조 전에 바이오매스 슬러리를 가열할 수 있다. 바이오매스는 또한 리본 건조, 트레이 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조, 진공 드럼 건조 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다.
유글레나 바이오매스의 전체 용해물은 증대된 생체이용률 및 다른 기능적 이점을 가질 수 있으므로 조성물에 유리한 것으로 사료되어진다. 건조된 용해물은, 세포막 또는 더 구체적으로 박막이 용해 또는 파쇄된 바람직한 유글레나 그라실리스 바이오매스의 건조된 형태이다. 용해물은 유글레나속의 임의의 종으로부터 유도될 수 있다고 이해하여야 한다. 용해는 기계적 또는 화학적 경로를 통해 일어날 수 있다. 비제한적 실시예에서, 기계적 세포 용해는 500∼1900 barg 및 700∼1000 barg의 표적 범위를 포함하는 500 barg 초과의 압력에서 균질화를 통해 일어날 수 있다. 공업적 규모의 대체 공정은 비드 밀을 이용하여 기계적으로 용해하는 것이다. 화학적 용해의 비제한적 예는 수산화나트륨(NaOH) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 다른 강염기로부터의 용해이다. 한 비제한적 실시예에서는, 세포를 파쇄하기 위하여, 리터당 3∼350 그램(g/L), 더 바람직하게는, 50∼175 g/L의 농도의 바이오매스의 슬러리를 5℃ 초과의 온도에서 7.0 초과의 pH로 또는 약 0.05 내지 약 2 중량% 농도에서 NaOH로 처리할 수 있다. 예시적인 온도 범위는 50∼70℃일 수 있다. 이 온도 및 염기 주입의 조합은 기계적 힘의 필요 없이 세포를 파쇄한다. 전세포 형태에서보다 용해된 형태에서 베타-글루칸 및 다른 대사산물에 대한 생체이용률이 더 클 수 있다. 생성되는 건조된 용해물 물질은 2∼500 마이크로미터의 평균 입도를 가질 수 있다. 더 구체적으로, 평균 입도는 5∼125 마이크로미터일 수 있다.
건조된 바이오매스 용해물을 제조하는 바람직한 기술은 3∼350 g/L 바이오매스, 더 바람직하게는, 50∼175 g/L 바이오매스의 농도에서 배지를 기계적으로 파쇄하는 것이다. 균질화기는 500 barg 초과의 압력으로 사용되는데, 이것은 시험되었고 유리된 베타-글루칸 과립을 균질화 및 생성시키는 데 효과적이라고 나타났다. 바이오매스 용해 공정에 대한 추가의 화학물질 또는 첨가제의 필요 없이, 균질화기의 예시적인 조작 범위는 약 500 내지 1,900 barg, 더 최적으로는, 750∼1,000 barg일 수 있다. 별법으로, 균질화기 대신 비드 밀을 이용하여 바이오매스를 기계적으로 용해시킬 수 있다. 생성되는 용해물 물질은 세정 또는 분리되지 않으며, 모든 존재하는 고체 및 비휘발성 가용성 성분을 보존하기 위하여 분무 건조 공정을 통해 건조된다. 용해물 물질은 또한 분무 건조에 대한 대체로서 리본 건조, 트레이 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조 또는 진공 드럼 건조될 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 건조 기술이 이용될 수 있다. 이 공정은 건강에 이로운 세포 성분들 또는 가치 부가된 세포 생성 물질 외에 바이오매스로부터 유리된 베타-글루칸을 갖는 물질을 생성한다. 이로부터 정제된 파라밀론을 제조하기 위한 상이한 기술 및 옵션이 또한 존재한다.
I. 기계적 파쇄
건조된 정제된 베타-글루칸을 제조하기에 바람직한 기술은 3∼350 g/L 바이오매스, 또는 더 바람직하게는, 50∼175 g/L 바이오매스의 농도에서 배지를 기계적으로 파쇄하는 것이다. 균질화기는 500 barg 초과의 압력에서 사용될 수 있는데, 이것은 시험되었고 유리된 베타-글루칸 과립을 균질화하고 생성하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 바이오매스 용해 공정에 대한 추가의 화학물질 또는 첨가제의 필요 없이, 균질화기의 예시적인 조작 범위는 약 500 내지 1,900 barg, 더 최적으로는, 750∼1,000 barg일 수 있다. 별법으로, 균질화기 대신 비드 밀을 이용하여 바이오매스를 기계적으로 용해시킬 수 있다. 용해된 물질을 수세하여 세포 성분들을 제거할 수 있다. 염기, 산, 물 또는 이의 조합을 이용하여 추가의 세정을 수행할 수 있다. 7.0 초과의 pH로 또는 0.05∼2.0 중량%의 농도에서 염기, 예를 들어, 수산화나트륨(NaOH)을 용해된 슬러리에 첨가할 수 있다. 비제한적 실시예로서 수산화칼륨(KOH) 및 수산화암모늄(NH4OH)과 같은 다른 염기를 사용하는 것이 가능하다. 물 또는 0.05∼2.0 중량%의 가성(NaOH) 용액을 이용한 추가 세정이 보완될 수 있다. 산 세정이 가능하다. 예를 들어, 0.05∼1.0 중량%로 또는 2.0∼10.0, 바람직하게는 3.0∼5.0의 용액 pH까지 황산이 첨가될 수 있다. 산 세정의 후속으로 최종 수세가 실시될 수 있다. 다른 가능한 산은 비제한적 실시예로서 염산(HCl), 인산(H3PO4), 및 시트르산(C6H8O7)을 포함할 수 있다. 세정은 또한 에탄올을 이용하여 그리고 상기 처리의 임의의 조합을 이용하여 실시될 수 있다. 베타-글루칸 슬러리 또는 케이크는 각 세정 단계 사이에 탈수되어야 한다. 탈수는 원심분리 또는 중력 침강 후 디캔팅으로 실시할 수 있다. 생성되는 세정된 베타-글루칸 슬러리 또는 케이크는 분무 건조될 수 있다. 별법으로, 물질은 리본 건조기, 진공 리본 건조기, 드럼 건조기, 트레이 건조기, 동결 건조기, 전열굴절식 건조기, 진공 건조기 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다.
II. 계면활성제
정제된 베타-글루칸을 제조하기 위한 두번째 기술은, 0.2∼2.0 중량% 농도의 황산도데실나트륨(SDS)과 같은 계면활성제를 사용하여, 3∼350 g/L 바이오매스, 더 바람직하게는, 50∼175 g/L 바이오매스의 농도에서 배지를 처리하는 것을 포함한다. 이 용액은 적어도 30분 동안 약 100℃의 온도 타겟을 포함하는 약 50℃ 내지 약 120℃로 가열된다. SDS 존재하의 이 가열 단계는 세포막을 파쇄하고 세포내 파라밀론 결정립을 유리시킨다.
슬러리는 약 4∼24 시간 동안 중력 디캔팅될 수 있고, 그 동안 결정립이 반응기/디캔터 탱크의 바닥에 침강한다. 농축된 찌꺼기는 추가의 가공을 위해 펌핑 분리되고 잔존 액체는 이송되어 폐기된다. 별법으로는, 중력 디캔트 대신 물질을 원심분리하여 벌크 액체를 제거할 수 있다. 스택트 디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 상이한 원심분리 기술이 이용될 수 있다. 20 ppm 초과, 더 구체적으로 200∼400 ppm으로 첨가되는 Tramfloc 1174® 또는 Xiameter 1527®과 같은 식품 등급 실록산계 소포제를 이용하여 SDS에 의해 야기되는 발포를 감소시킬 수 있다. 소포제는 SDS/열처리가 이용되는 경우 이의 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 생성되는 물질은 수세될 수 있다. 생성되는 결정 슬러리 또는 케이크는 분무 건조될 수 있다. 별법으로, 물질은 리본 건조기, 진공 리본 건조기, 드럼 건조기, 트레이 건조기, 동결 건조기, 전열굴절식 건조기, 진공 건조기, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다.
III. 천연 오일 계면활성제
정제된 베타-글루칸을 생성하기 위한 세번째 기술은, 약 0.2 내지 약 5.0 중량%의 양으로 코코넛유 중의 지방산에서 유도되는 나트륨 코코일 글리시네이트 또는 나트륨 N-코코일-L-알라니네이트(Amilite® ACS12)와 같은 천연 오일로부터 생성된 계면활성제를 사용하여, 3∼350 g/L 바이오매스, 더 바람직하게는, 50∼175 g/L 바이오매스 농도에서 배지를 처리하는 것을 포함한다. 이 용액은 적어도 30분 동안 약 100℃의 현 타겟을 포함하는 약 50℃ 내지 약 120℃로 가열된다. 나트륨 N-코코일-L-알라니네이트 또는 나트륨 코코일 글리시네이트 존재하의 이 가열 단계는 세포막을 파쇄하고 세포내 파라밀론 결정립을 유리시킨다. 시간, 온도 및 농도 파라미터는 사용되는 정확한 계면활성제에 따라 개량될 수 있다.
슬러리는 약 4 내지 24 시간 동안 중력 디캔팅되고, 그 동안 결정립이 반응기/디캔터 탱크의 바닥에 침강한다. 농축된 찌꺼기는 추가의 가공을 위해 펌핑될 수 있고 잔존 액체는 이송되어 폐기된다. 별법으로는, 중력 디캔트 대신 물질을 원심분리로 처리하여 벌크 액체를 제거할 수 있다. 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 상이한 원심분리 기술이 이용될 수 있다. 소포제가 첨가될 수 있다. 예시적인 소포제 물질은 예를 들어 Tramfloc 1174® 또는 Xiameter 1527®과 같은 식품 등급 실록산계 소포제이다. 소포제를 이용하여 계면활성제에 의해 야기되는 발포를 감소시킬 수 있다. 소포제는 계면활성제/열처리가 이용되는 경우 이의 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 예시적인 주입 범위는 20 ppm 초과, 더 구체적으로 200∼400 ppm의 양을 포함한다. 생성되는 물질은 수세될 수 있다. 생성되는 결정 슬러리 또는 케이크는 분무 건조될 수 있다. 별법으로, 물질은 리본 건조기, 진공 리본 건조기, 드럼 건조기, 트레이 건조기, 동결 건조기, 전열굴절식 건조기, 진공 건조기, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다.
코코넛유 지방산에서 유도되는 아미노산계 계면활성제는 음이온성이고, 동등하거나 더 큰 세정능도 보이면서 외층 피부 손상에 대한 가능성이 더 낮음을 입증한다. 이 성질들은 "A Novel Glycinate-Based Body Wash"란 제목의 Regan 등의 논문(Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology, June 2013; 6권, 6호, 23-30페이지)에 개시되어 있고, 이 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 나트륨 코코일 글리시네이트(SCG)는, 문헌[National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme, Sodium Cocoyl Glycinate, EX/130 (LTD/1306), August 2010]으로부터의 보고서에 개시된 바와 같이 각각 10, 12, 16, 18:1 및 18:2 그리고 6, 47, 18, 9, 6 및 2의 탄소 길이 및 퍼센트를 갖는 천연 코코넛유 중의 지방산의 스펙트럼을 갖는 N-말단 결합 글리신으로 구성되며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 나트륨 N-코코일-글리시네이트 및 나트륨 N-코코일-L-알라니네이트 둘다 코코넛유에서 유도된 계면활성제의 예이다. C8 내지 C18 크기의 지방산의 분포 및 비율에 기초하여 코코넛유와 유사한, 팜유, 팜핵유, 및 필루 오일에서 유도된 계면활성제를 사용할 수 있다. 코코넛유는 다량의 라우르산(C12)을 함유하지만 유의적인 양의 카프릴산(C8), 데칸산(C10), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16), 및 올레산(C18)도 함유한다. 팜유, 팜핵유, 및 필루 오일은 코코넛유와 유사한 지방산 프로필을 가지는데, 이것은 이들 오일로부터 유도된 계면활성제가 코코넛유 중의 지방산에서 유도된 계면활성제와 동일하게 효과적일 수 있음을 의미한다. 이들은 또한 SDS의 적합한 대체일 수 있다. 천연 유도된 계면활성제에 따라 이들 지방산의 범위 및 함량은 달라질 수 있다.
IV. pH 매개 용해
정제된 베타-글루칸을 제조하기 위한 네번째 기술은 염기를 이용하여 바이오매스를 화학적으로 파쇄하는 것이다. 비제한적 실시예는 수산화나트륨(NaOH) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 다른 염기로부터의 용해이다. 한 비제한적 실시예에서는, 세포를 파쇄하기 위하여, 리터당 3∼350 그램(g/L), 더 바람직하게는, 50∼175 g/L의 농도의 바이오매스의 슬러리를, 5℃ 초과의 온도에서 7.0 초과의 pH로 또는 약 0.05 내지 약 2 중량% 농도에서 NaOH로 처리할 수 있다. 비제한적인 예시적 온도 범위는 45∼70℃일 수 있고, pH 범위는 9.0∼12.5일 수 있다. 이 온도 및 염기 주입의 조합은 기계적인 힘을 필요로 하지 않고 세포를 파쇄한다. 염기를 이용한 제1 처리는 세포를 용해한다. 염기를 너무 적게 가하거나 온도가 너무 낮으면, 세포가 파쇄될 수 없고, 너무 많은 염기를 가하고/가하거나 온도가 너무 높으면, 대부분의 성분들 및 베타-글루칸이 용액이 될 수 있다. 수세를 실시할 수 있다. 산, 염기 및 이어서 물과 같이, 염기, 산 또는 물을 순차적으로 또는 임의의 조합으로 이용하여 추가의 세정을 수행할 수 있다.
7.0 초과의 pH로 또는 물 또는 0.05∼1.0 중량%의 수산화나트륨(NaOH)을 이용하는 추가 세정이 보완될 수 있다. 수산화칼륨(KOH)도 가능하다. 비제한적 실시예로서 다른 가능한 염기는 수산화암모늄(NH4OH)을 포함한다. 산 세정이 보완될 수 있다. 예를 들어, 황산이 0.05∼1.0 중량%로 첨가될 수 있거나 또는 2.0∼10.0, 바람직하게는 3.0∼5.0의 용액 pH까지 보완될 수 있고, 산 세정의 후속으로 최종 수세가 실시될 수 있다. 다른 가능한 산은 비제한적 실시예로서 질산(HNO3), 염산(HCl), 인산(H3PO4), 및 시트르산(C6H8O7)을 포함할 수 있다. 세정은 또한 에탄올을 이용하여 그리고 상기 처리의 임의의 조합을 이용하여 실시될 수 있다. 베타-글루칸 슬러리 또는 케이크는 각 세정 단계 사이에 탈수되어야 한다. 탈수는 원심분리 또는 중력 디캔팅으로 실시할 수 있다. 스택트 디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 상이한 원심분리 기술이 이용될 수 있다. 생성되는 세정된 베타-글루칸 슬러리 또는 케이크는 분무 건조될 수 있다. 별법으로, 물질은 리본 건조기, 진공 리본 건조기, 드럼 건조기, 트레이 건조기, 동결 건조기, 전열굴절식 건조기, 진공 건조기, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다.
V. 효소 처리
정제된 베타-글루칸을 제조하기 위한 다섯번째 기술은 효소 처리에 집중된다. 세포 용해는 기계적 파쇄 또는 상기 개시한 바와 같은 다른 처리를 통해 이루어질 수 있고, 바이오매스는 3∼350 g/L, 더 바람직하게는, 50∼175 g/L의 농도일 수 있다. 처리전 세포 용해가 또한 요구되지 않을 수 있다. 슬러리의 pH 및 온도는 최적 효소 처리에 요구되는 조건에 부합하도록 산 또는 염기 및 에너지로 조절될 수 있다. 비특이적 프로테아제를 이용하여 세포로부터 단백질을 분해할 수 있다. 비제한적 예는 Novozymes사의 Alcalase® 2.4L FG일 수 있다. 효소 처리된 성분들을 제거하기 위하여, 생성된 효소 처리 슬러리를 산, 염기, 에탄올, 또는 물, 또는 이의 임의의 조합으로 세정한 다음 탈수할 수 있다. 탈수는 원심분리 또는 중력 디캔팅으로 실시할 수 있다. 스택트 디스크, 원추판, 푸셔, 또는 필러 원심분리와 같은 상이한 원심분리 기술이 이용될 수 있다. 생성된 베타-글루칸 슬러리 또는 케이크는 분무 건조될 수 있다. 별법으로, 물질은 리본 건조기, 진공 리본 건조기, 드럼 건조기, 트레이 건조기, 동결 건조기, 전열굴절식 건조기, 진공 건조기, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의하여 건조될 수 있다. 프로테아제 외에도 리파아제와 같은 다른 효소가 이용될 수 있다. 다른 예는 단독 또는 조합으로 사용되는 리소자임이다. 또한, 효소 탈활성 단계가 요구될 수 있다. 후 효소 처리 세정의 양은 프로세싱 동안 결정될 수 있지만 상기 요약된 공정을 따를 수 있다.
도 3은 정제된 베타-글루칸의 제조를 위한 다운스트림 공정을 나타내는 흐름도이다. 도 1에서와 같은 흐름 성분들의 일반적인 설명을 참조하여 도 1에 나타낸 것에 상응하는 참조번호가 사용된다. 발효 공정은 유글레나 바이오매스(블록 28)를 생성하고 이것을 탈수하여 바이오매스를 농축한다(블록 34). 탈수는 바람직한 디캔터 원심분리 또는 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 및 필러 원심분리를 비롯한 다른 원심분리 기술에 의한 프로세싱을 포함할 수 있다. 중력 디캔팅을 이용하는 것도 가능하다. 도 1의 원 패스 공정에서, 세포 용해 공정은 세포 박막을 파쇄하고, 상기 개시된 바와 같은 바람직한 균질화기 또는 비드 밀을 포함하는 기계적 용해(블록 40a)를 이용하여 실시될 수 있다. pH 매개 용해(블록 40b)는 대략 50∼70℃에서 바람직한 염기로서 수산화나트륨(NaOH)을 포함할 수 있으며, 다른 가능성 및 추가 프로세싱은 5℃ 초과에서 KOH, 5℃ 초과에서 NH4OH 및 5℃ 초과에서 다른 염기를 포함한다. 다른 예는 효소 용해(블록 40c)를 포함할 수 있고, 프로테아제, 리파아제, 리소자임 또는 이들 프로세스의 조합을 포함할 수 있다. 프로테아제는 물을 사용하여 단백질 및 펩티드 결합을 가수분해하는 단백질분해를 촉매하는 효소이고, 리파아제 효소는 지질의 가수분해를 촉매한다. 리소자임 효소는 일반적으로 글리코시드 가수분해 효소로서 작용한다.
세포 용해 공정의 다른 예는 황산도데실나트륨(SDS)(블록 40e) 또는 나트륨 N-코코일-L-알라니네이트 또는 나트륨 N-코코일-글리시네이트를 비롯한 천연 오일 유도 계면활성제(블록 40f)를 이용하는 것과 같이 계면활성제 용해(블록 40d)를 이용하는 것을 포함한다. 다른 가능한 천연 오일 유도 계면활성제는 팜유 유도체, 팜핵유 유도체, 필루 오일 유도체, 및 코코넛유 유도체를 포함한다. 세정 단계(블록 42)는 베타-글루칸이 아닌 성분들을 씻어내며 세정에 의한 정제(블록 42a)를 포함할 수 있다. 이것은 바람직한 공정을 위해 염기 및 산과 물 그리고 수산화나트륨(NaOH), 뒤이어 황산(H2SO4), 및 물을 포함하는 임의의 조합을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 정제는 프로테아제, 리파아제, 또는 처리시 잠재적 수세와의 조합을 포함하는 효소 처리(블록 42b)에 의해 실시될 수 있다. 정제는 또한 물 및 실록산계 소포제 또는 조합을 사용한 세정(블록 42c)에 의해 실시될 수 있다. 최종 건조 단계(블록 44)는 대안으로서 바람직한 분무 건조 또는 트레이 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조, 동결 건조, 리본 건조, 드럼 건조, 또는 진공 건조, 및 당업자에게 공지된 다른 기술을 포함할 수 있다.
도 4는 베타-글루칸 용해물의 제조를 위한 다운스트림 공정을 나타내는 흐름도이다. 도 1에서와 같은 흐름 성분들의 일반적인 설명을 참조하여 도 1에 나타낸 것에 상응하는 참조번호가 사용된다. 발효 공정은 유글레나 바이오매스를 생성하고(블록 28) 이것을 탈수하여 바이오매스를 농축한다(블록 36). 탈수는 바람직한 디캔터 원심분리 또는 스택트-디스크, 원추판, 푸셔, 및 필러 원심분리를 비롯한 다른 원심분리 기술에 의한 프로세싱을 포함할 수 있다. 중력 디캔팅을 이용하는 것도 가능하다. 세포 용해 공정은 세포 박막을 파쇄하고(블록 48), 상기 개시된 바와 같은 바람직한 균질화기 또는 비드 밀을 포함하는 기계적 용해(블록 48a)를 이용하여 실시될 수 있다. pH 매개 용해(블록 48b)는 대략 50∼70℃에서 바람직한 염기로서 수산화나트륨(NaOH)을 포함할 수 있으며, 다른 가능성 및 추가 프로세싱은 5℃ 초과에서 KOH, 5℃ 초과에서 NH4OH 및 5℃ 초과에서 다른 염기를 포함한다. 다른 예는 효소 용해(블록 48c)를 포함할 수 있고 프로테아제, 리파아제, 리소자임 또는 이들 공정의 조합을 포함할 수 있다. 건조는 바람직한 분무 건조로 실시되며(블록 50), 트레이 건조, 리본 진공 건조, 전열굴절식 건조, 및 동결 건조를 포함할 수 있다.
도 5는 전세포 유글레나 그라실리스의 제조를 위한 다운스트림 공정을 나타내는 흐름도이다. 다시, 도 1에서와 같은 흐름 성분들의 일반적인 설명을 참조하여 도 1에 나타낸 것에 상응하는 참조번호가 사용된다. 발효 공정은 유글레나 바이오매스를 생성하고(블록 38) 이것을 탈수하여 바이오매스를 농축한다(블록 38). 다시, 디캔터 원심분리가 바람직한 조작이고 도 4에 대하여 개시된 바와 같은 다른 공정도 이용될 수 있다. 건조는 바람직하게는 분무 건조에 의해 그리고 도 4를 참조하여 개시된 바와 같은 적용가능한 다른 건조 기술에 의해 실시된다(블록 54).
베타-글루칸 제조 공정의 다른 예가 도 6에 100으로 나타나 있는데, 이것은 독립영양, 혼합영양 및 종속영양 성장 기술의 조합을 이용한 베타-1,3-글루칸의 제조 방법을 나타낸다. 고수준의 설명으로서, 베타-1,3-글루칸은 유글레나 그라실리스를 배양함으로써 생성된다. 그 공정을 위한 출발 배양은 스타터 슬랜트 또는 다른 보관된 배양원으로부터 개시될 수 있다. 이후 이것은 독립영양으로 성장된다. 이에 후속하여 글루코스의 첨가에 의해 회분을 혼합영양 성장으로 전환시킨다. 이후, 종속영양으로 조작되는 유글레나 그라실리스 발효의 접종을 위해 혼합영양 물질을 이용한다.
도 6의 흐름도에서 더 설명되는 바와 같이, 공정(블록 100)이 개시되고(블록 101) 스타터 슬랜트가 준비된다(블록 102). 유글레나 그라실리스 시드 배양이 시드 카보이(블록 106)에서 독립영양으로 성장되고 계대배양 부분은 새로운 카보이로 회송 공급된다.
유글레나 그라실리스 시드 배양은 독립영양으로 성장된 후, 살균된 글루코스를 공급받아(블록 118), 혼합영양 시드 카보이로 전환된다(블록 120). 독립영양으로 성장된 유글레나 그라실리스 시드 배양은 이제 약 7일 내지 약 30일 동안 혼합영양으로 성장된 후 발효 탱크의 접종에 이용되고, 여기서 종속영양 발효가 약 4일 내지 약 7일 동안 일어난다(블록 122). 이 종속영양 발효 공정이 약 4일 내지 약 7일 동안 일어나 베타-글루칸이 풍부한 유글레나 그라실리스를 생성한다. 유글레나 그라실리스 바이오매스를 제거하여 원심분리로 탈수(블록 128)한 다음 오븐에서 건조한다(블록 130). 바이오매스 케이크를 약 80℃ 내지 120℃에서 건조시킨다. 건조가 되었으면, 물질을 분쇄 및 밀링하고(블록 132), 이어서 선별 및 진공 포장하고(블록 134), 이어서 살균한다(블록 136). 살균 온도 범위는 달라질 수 있는데, 한 실시예에서는 약 160℃일 수 있으며, 2 시간 이상 동안 실행될 수 있다. 살균 후, 생성물을 인간 또는 동물용으로 포장할 수 있다(블록 138). 또한, 물과 같은 원심분리물(블록 140)은 폐기물로서 처리된다(블록 142).
이제 도 7을 참조하면, 용해물 조성물 전달 시스템(200)은 도 1에 개시된 바와 같은 공정으로부터 생성된 용해물(216)과 같은 최종 생성물을 함유하는 캡슐(214)을 포함한다. 캡슐(200)은 종래의 상부 및 하부 캡슐 섹션(214a 및 214b)으로부터 형성될 수 있다. 그러나, 정제, 산제, 로션, 젤, 액상 용액 및 액상 현탁액과 같은 다른 전달 메카니즘도 가능하다.
캡슐내 물질로부터 취해지는 용해물(216)과 같은 최종 생성물의 확대 단면에 의해 나타내어지는 바와 같이, 캡슐 물질(216)은 선형 비분지형 베타-글루칸(220) 뿐만 아니라 증대된 조성물을 생성하는 발효기로부터의 다른 물질도 함유한다. 이들 성분은 지질(222), 단백질 및 아미노산(224), 대사산물(226), 아연과 같은 무기질(228) 및 비타민(230), 다른 가치 부가된 세포 생성 성분 및 세포 물질을 포함할 수 있다. 따라서, 이 조성물은 한 실시예에서 세포 성분 및 아연과 같은 유글레나 용해물을 생성한 발효 회분에서 남은 잔존 매질을 추가로 포함하는 유글레나 용해물을 포함한다. 조성물은 또한 아연과 같은 각종 첨가제 금속 성분을 포함한다. 아연을 비롯한 금속 성분의 예시적 범위는 0.1∼10 중량%이다.
한 예에서, 조성물은 단회 복용량 캡슐로 전달된다. 베타-글루칸 성분의 일부는 하나 이상의 베타-글루칸 중합체쇄를 포함할 수 있고 낮게는 1.2 kDa부터 높게는 580 kDa까지 분자량이 달라질 수 있으며 하나 이상의 중합체쇄로서 낮게는 7개부터 높게는 3,400개 글루코스 단량체 범위의 중합체 길이를 가진다. 베타-글루칸 중합체는 개별적으로 또는 삼중 나선과 같은 더 고차의 독립체 및 발효 또는 프로세싱 조건에 따라 다른 분자간 결합 구조로 존재할 수 있다. 예시적 평균 입도 범위는 개시된 바와 같은 공정에 의해 제조된 용해물의 경우 2.0 내지 500 마이크로미터(미크론)일 수 있다. 더 구체적으로, 평균 입도는 5∼125 마이크로미터일 수 있다, 이 범위는 사용된 프로세싱 파라미터 및 건조 기술에 따라 달라질 수 있다. 용해물 조성물에 포함될 수 있는 다른 성분들은 알파- 및 베타-카로텐, 아스타잔틴, 루테인, 및 제아잔틴과 같은 카로티노이드를 포함한다. 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린과 같은 아미노산이 포함될 수 있다. 다른 지질, 비타민 및 무기질은 아라키돈산, 비오틴, 칼슘, 구리, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 지방, 엽산, 철, 리놀레산, 리놀렌산, 마그네슘, 망간, 니아신, 올레산, 팔미톨레산, 판토텐산, 인, 칼륨, 단백질, 나트륨, 비타민 B1, B2, B6, B12, C, D, E, K1, 아연 또는 이의 염, 및 상기 열거하지 않은 다른 세포 성분 및 발효로부터 얻어진 첨가 매질을 비롯한 유글레나 조류로부터의 잔재물 성분을 포함한다.
보충 범위는 달라질 수 있다. 예를 들어, 인간이 소비하기 위한 식이보충제 조성물로서, 조성물은 식품 킬로그램당 50∼6,000 mg 범위 또는 캡슐 복용량으로서 약 50 mg 내지 2,000 mg 범위일 수 있다. 이들 양은 최종 용도에 따라 달라질 수 있고 다른 용도로 사용될 때 더 달라질 수 있다. 특정 실시예에서, 이것은 동물 용도를 포함할 수 있다.
이제 용해물의 상이한 성분들에 대한 범위 목록을 이하에 나타낸다. 이들 범위는 생성된 바와 같은 용해물에 대한 것이고 용해물에 첨가되는 다른 성분들, 예컨대 아연을 포함하지 않는다. 이들 비제한적 예는 유글레나 용해물에서 확인된 성분들 또는 화합물에 대한 대략적인 중량 퍼센트이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
글루칸 보충으로부터 원하는 반응은 다를 수 있다. 예를 들어, 가용성 입상 베타-글루칸은 면역 조절을 넘는 생물학적 효과를 유도하였다. 항균, 항바이러스, 항종양, 항섬유증, 항당뇨병 및 항염증 반응 그리고 프리바이오틱, 간보호제, 혈당저하제의 형태로, 마이크로바이옴 자양물 유발, 콜레스테롤 저하, 상처 치유, 골수 외상 및 방사선 및 비염 경감 효과에 대한 증거 있는 근거가 있다. 언급된 생체활성은 글루칸에 의해 유발되고, 바이러스 및 세균 감염, 암, 심혈관 질환, 간 질환, 혈액 질환, 당뇨병, 저혈당증, 외상, 피부 노화, 골수계 조혈 이상, 관절염, 마이크로바이옴 결핍, 궤양성 질환 및 방사선 폭로의 치료에 적용 가능성을 가질 수 있다. 또한, 인간 건강의 범위 밖에서, 베타 글루칸은 축산업에서 적용 가능성을 가진다. 베타 글루칸은 가축이 거래에 통상적인 환경적 도전 및 질환과 같은 성장 속도 저지 요인과 싸우기 위해 면역 조절을 통해 최적의 속도로 성장하도록 함으로써 성장 성능을 잠재적으로 개선시킬 수 있다. 앞서 언급된 인간을 위해 의도된 잠재적으로 동의의 이점에 더하여, 베타 글루칸은 특히 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS), 돼지 유행성 설사증 바이러스(PEDv), 뉴캐슬병 및 조류 인플루엔자와 같은 비제한적 예에서 동물 질환을 유의적으로 줄이는 예방책을 제공할 수 있다. 또한, 베타 글루칸은 진균 감염에 의해 생성되는 진균독에 대한 흡수 효과를 가질 수 있다. 이것은 처음에 살진균 활성을 가짐으로써 또는 진균독 오염된 사료 섭취에서 기인하는 동물내 진균독 축적을 없앰으로써 진균독 생산을 예방하는 잠재성을 나타낸다.
에키네이셔, 알로에, 히드라스티스, 인삼, 마늘, 피망, 생강, 울금, 은행나무, 캣츠 클로, 영지 또는 황기를 포함하는 다른 천연 식품 또는 치료제에 의한 베타 글루칸 유도 생성물의 첨가로 상승 효과가 관찰될 수 있다. 이것은 비타민 C와 그리고 가능하게는 휴믹산 및 풀브산과 더 혼합될 수 있다. 심장병 및 가능하게는 암의 치료를 위해 작용하도록 글루칸을 레스베라트롤 또는 다른 폴리페놀과 혼합하는 것도 가능하다.
상기 설명 및 관련 도면에 제시된 교시의 이점을 갖는 본 발명의 다수의 개량 및 다른 실시양태가 당업자에게 떠오를 수 있다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시양태에 한정되지 않으며 그 개량 및 실시양태들은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다고 이해된다.

Claims (37)

  1. 약 2.0 내지 500 마이크로미터의 입도를 갖는 유글레나(Euglena) 용해물; 및
    세포 성분 및 유글레나 바이오매스와 유글레나 용해물을 생성한 발효 공정에서 남은 잔존 매질
    을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 금속 또는 이의 염을 더 포함하는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 금속이 아연을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 단회 복용량 캡슐로 제형화되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 잔존 매질이 무기질, 비타민, 당, 및 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 무기질 및 비타민은 비오틴, 칼슘, 구리, 엽산, 철, 마그네슘, 망간, 니아신, 인, 칼륨, 나트륨, 아연 및 비타민 B1, B2, B6, B12, C, D, E, K1 또는 이의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 세포 성분은 지질, 단백질 및 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 지질은 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 지방, 리놀산, 리놀렌산, 올레산, 팔미톨레산, 및 판토텐산 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 카로티노이드를 더 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 식이보충제 조성물을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 동물 또는 사람을 위한 식품 첨가제로서 제형화되는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 세포 성분은 1.2∼580 킬로달톤(kDa)의 분자량을 갖는 하나 이상의 베타-글루칸 중합체쇄를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 베타-글루칸 중합체쇄는 7∼3,400 단위의 중합체 길이를 갖는 것인 조성물.
  15. 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계;
    바이오매스를 용해시키는 단계; 및
    용해된 바이오매스를 건조시켜 유글레나 용해물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 유글레나 용해물의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 유글레나 용해물에 금속을 첨가하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  17. 제15항에 있어서, 용해가 기계적, pH 및 온도 매개 용해로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 기계적 용해는 균질화 또는 비드 밀링을 포함하는 것인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 500 barg 초과의 압력에서 바이오매스를 균질화하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  20. 제18항에 있어서, 500∼1,900 barg의 압력 범위에서 바이오매스를 균질화하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  21. 제17항에 있어서, 7.0 초과의 pH 및 5℃ 초과의 온도에서 바이오매스를 용해하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 바이오매스를 염기로 처리하고 9.0 초과의 pH 및 45℃ 초과의 온도에서 바이오매스를 용해하는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  23. 제15항에 있어서, 바이오매스를 리터당 3∼350 그램(g/L)의 농도로 성장 또는 농축시키는 것인 제조 방법.
  24. 제15항에 있어서, 성장된 바이오매스를 용해 전에 탈수하는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 탈수는 바이오매스의 원심분리 또는 중력 디캔팅을 포함하는 것인 제조 방법.
  26. 유글레나속 유기체로부터 바이오매스를 성장시키는 단계;
    바이오매스를 용해시켜 용해된 바이오매스를 형성하는 단계;
    용해된 바이오매스를 세정 및 탈수하여 베타-1,3-글루칸을 생성하는 단계; 및
    베타-1,3-글루칸을 건조하여 정제된 베타-1,3-글루칸을 생성하는 단계
    를 포함하는, 정제된 베타-1,3-글루칸의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 용해된 바이오매스를 복수회 세정 및 탈수하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  28. 제26항에 있어서, 용해가 기계적, pH 및 온도 매개, 계면활성제, 및 효소 용해로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 기계적 용해는 균질화 또는 비드 밀링을 포함하는 것인 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 500∼1,900 barg의 압력 범위에서 바이오매스를 균질화하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  31. 제28항에 있어서, 7.0 초과의 pH 및 5℃ 초과의 온도에서 바이오매스를 용해하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  32. 제28항에 있어서, 용해는 코코넛유, 팜유, 팜핵유, 및 필루(pilu) 오일 중 적어도 하나를 포함하고 지방산에서 유도되는 계면활성제로 바이오매스를 처리하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  33. 제28항에 있어서, 용해는 코코넛유, 팜유, 팜핵유, 및 필루 오일 중 적어도 하나를 포함하고 지방산에서 유도되는 아실-아미노 계면활성제로 바이오매스를 처리하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  34. 제26항에 있어서, 용해된 바이오매스를 물, 산, 염기, 에탄올, 또는 조합 중 하나 이상으로 처리함으로써 용해된 바이오매스를 세정하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  35. 제26항에 있어서, 건조는 분무 건조, 리본 건조, 트레이 건조, 동결 건조, 드럼 건조, 진공 리본 건조, 전열굴절식 건조 및 진공 드럼 건조로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
  36. 제26항에 있어서, 바이오매스를 리터당 3∼350 그램(g/L)의 농도로 성장 또는 농축시키는 것인 제조 방법.
  37. 제26항에 있어서, 성장된 바이오매스를 용해 전에 탈수하는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
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