WO2007066458A1 - 脂溶性成分抽出用酵母、その生産方法及びそれを用いた色調改善剤、並びに脂溶性成分の製造方法 - Google Patents

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    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • a method using a mother is known as a method for producing the 000 2 species without using chemical synthesis.
  • Some mothers produce some chemicals such as phosphine, which accumulates in the cells.
  • phosphine phosphine
  • Astaxanthin which accumulates astaxanthin.
  • This astaxtax is known to have a strength called Vita's 500f.
  • Patent 2 states that
  • Patent 4 describes a method of decomposing cells and extracting astaxanthin existing in cells using an enzyme capable of decomposing fire.
  • Patent 4 also requires a separate device and process for producing an element for cell decomposition, which is also difficult to apply. Therefore, it is an object of the present invention to provide a delivery mother that has the above-mentioned cells and that can efficiently extract the amount contained in the components of the mother, and a method therefor. It also aims to provide a color tone using the minute method and the mother of choice.
  • the yeast having an extractable part in the mother of OO Ming is provided with a growth step that grows to the growth range so that the growth rate of the medium decreases as the growth proceeds.
  • yeast substitutes nutrients, which causes acidification and lowers local H2. In this case, it is not always necessary to externally perform H crops for the bottom of the land in the breeding process.
  • O PO 2 O O consists of a few selected 3 4 4 2 4 3
  • ammonium salts ammonium sulphate, ammonium, ammonium and ammonium chloride are used as nitrogen. It should be noted that these salts are generated from the salt,
  • Astaxanthin which is used as a red pigment, is used for aquaculture and chicken eggs.
  • astaxanthin is being studied for its potential as a potent anti-oxidant, and its use is wide-ranging. However, it is not limited to the astaxanthin possessed by the mother.
  • the color tone containing the above-mentioned mother For example, it can be added to the material of aquaculture and poultry. However, I am the mother of my choice. Therefore, it contains astaxanthin in the mother, especially in the mother By taking the color tone containing the mother together with the feed, it can be absorbed efficiently in aquaculture, and the tone of meat color and yellow can be improved.
  • the mother and the law that can efficiently take the minutes are provided.
  • the tone using the minute method and the mother of choice is provided.
  • FIG. 24 is a graph showing the temporal change of the degree of during the feeding of 24.
  • a batch method, a semi-batch method, a flow method, a continuous method, or the like can be applied to the mother.
  • a suitable method can be arbitrarily selected depending on these methods and conditions, the type of mother's strain, and the land.
  • the spontaneous H 2 reduction methods include a method of voluntarily lowering H by the acid generated by the mother and a method of voluntarily lowering H by the generation of metabolized nutrients.
  • the method of voluntarily reducing the occurrence of metabolic nutrients is preferable. More specifically, the amount of nutrients in the mother's soil is metabolized by the mother and released into the soil, thereby lowering the amount of soil. According to this method, the amount of H in the ground of the mother can be sufficiently reduced to the growth area. In addition, in the case of the voluntary H 2 reduction method caused by the mother, it is preferable to use the growth aerobic condition to sufficiently promote the mother's apology.
  • ana salt which contains the mother element and produces acid that is metabolized.
  • an annuum anum, anum, ammonium, and ammonium are preferable.
  • SO O C is preferable because it is produced by the metabolism of nutrients, and O O 2 is more preferable.
  • the land to be used for multiplication kiss-containing land, goose, kiss-containing synthetic land, and various land used for these lands can be used. If the pH of the medium is lowered spontaneously after culturing, use ammonium, ammonium, ammonium, and ammonium. It is preferable that a salt such as a salt is added to the ground, and it is more preferable that an ammonium salt is added.
  • Astaxanthin has been used. In addition, astaxanthin has a strong antibacterial action, and its use as a drug is being investigated. Astaxanthin is
  • Astaxatin is widely distributed in nature, and is contained in eggs of crustaceans, meat of salmon, skins of red sea bream, etc., and is involved in the manifestation of these.
  • Zanthophilus densius a microorganism that produces astaxanthus, there is a known alga species, Cass pluvius.
  • the mother may also include the extent that the mother does not proliferate under conditions where the nutrients for the proliferation are limited, for the purpose of the existence of the mother. It should be noted that it may include such a degree that the mother does not grow after the growth is completed.
  • Astazartine has a yellow
  • vitamins and nella may be added in order to have not only color tone but also nutritional function at the same time.
  • the CC242 2 strain Prior to the scale-up of the CC242 2 strain of Xanthesis Dend, which had been preserved in the ground, the CC242 2 strain was pre-cultured in the area of 6 kisses. A plant was planted from the ground and cultivated at a temperature of 20oC for 48 hours to obtain a nutrient solution. 004 As a place of nourishment. For the kiss, we added g0 with an addition of 0,3 to the triangular frustum (volume: 500). The obtained nutrient solution 0 was inoculated as a nutrient. It was cultivated at a rotation speed of p and a temperature of 20C.
  • the above fermentation syrup was put into a lath 0049, and then 8 1 was added. Then, the glass was placed in a dark place at a temperature of 5C for 3 times, and astaxanthin contained in the glass was extracted.
  • the amount of astaxanthin floating on the surface of the ace was determined using an absorptiometer. The amount of astaxanthin thus determined was used for the extraction of xanthesis dend (below,
  • the collected yeast was centrifuged and the yeast contained therein was recovered. It was put in the collected 05C for 24 hours and dried. In this way The amount of the sample was measured, and this value was divided by the product of the samples collected to calculate the degree of the medium.
  • the amount of astaxanthin and the amount of astaxanthin were determined in the same manner as in the case where the annealed water was gradually added so that the amount of astaxanthin was maintained at 4.5.
  • Acid was added to the nutrients to decrease p sharply and to fill the growth zone.
  • Began to adjust by adding for 48 hours, and held at 2.2. . Then, after 32 days from the start of lactic acid, the nutrition was completed.
  • the implementation differs in the following points. , As a place of nourishment
  • Umm with 0 pp added was used.
  • um was added to alleviate the degree of breeding and to ensure a time interval during which the breeding of the. After nourishing under these conditions, in the same manner as in the implementation, astaxanthin was produced and astaxanthin was determined.
  • Astaxanthin output (gg 271 63 79 258 59 00 61 shows a graph showing the change over time during feeding It shows that the yeast is growing at the degree of. The growth of the yeast is rapid during the period beginning at 48, and the culture medium drops to 2.5 degrees after the cultivation. This is well below the mother's range of 4. At the stage more than 48 hours after the start, the breeding of the is suppressed and the level of p is also controlled.
  • Comparative Example 003 Comparative Example 3 was performed in the same way as Comparative Example, so that the amount of astaxanthin was relatively high because the treatment with acid was performed. It is common to use such acids to extract astaxatin contained in cells for analysis, and it is not suitable for cells or industrial use. In No. 3, astaxanthin is required to be efficiently extracted in the same manner as astaxanthin, which requires a cellular treatment step with an acid, a neutralization step with acetic acid and a salt generated by the washing, and a washing step.
  • Table 2 shows the astaxanthin results for 007 2-4. In Figure 2, the start time and the time at were taken into account.
  • Example 23 (g 52 04 .2 Astaxanthin output gg 3 3 305 97 007 22 2 As shown in Example 23, the astaxanthin output was 300 9 9 or higher, indicating a high output.
  • Astaxanthin production and astaxanthin production were carried out in the same manner as in the case of using Astaxanthin productivity instead of CC242 2 strain as Xanthesis Dend strain.
  • Table 4 shows the results of astaxanthin emission in No. 56.
  • Astaxanthin output (99) 57 315 00 (7)
  • Zaphyces Dade CC242 2 strains
  • Table 5 shows the astaxanthin output in 0084 7 and 85.
  • Example 8 Comparing the astaxanthin output of Example 8, Example 8 was higher. In this step, culture medium p was added to mother's

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Abstract

　本発明による脂溶性成分抽出用酵母の生産方法は、抽出すべき脂溶性成分を有する酵母を、増殖にしたがって培地のｐＨが低下するように、増殖可能ｐＨ領域の下限未満まで増殖させる増殖工程を備える。

Description

明 細 書
脂溶性成分抽出用酵母、その生産方法及びそれを用いた色調改善剤、 並びに脂溶性成分の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、抽出すべき脂溶性成分を有する脂溶性成分抽出用酵母、その生産方 法及びそれを用いた色調改善剤、並びに脂溶性成分の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 各種の化学成分を化学合成によらず製造する方法として、酵母を用いる方法が知 られている。酵母の中には、脂溶性成分などの化学成分を産生し、細胞内にその化 学成分を蓄積するものがある。例えば、キサントフイロマイセス 'デンドロウス（Xanthop hyllomyces dendrorhous)は、脂溶性成分であるァスタキサンチンを産生し、細胞内 にァスタキサンチンを蓄積する。このァスタキサンチンは、ビタミン Eの 500倍ともレヽゎ れる強い抗酸化能力を持つことが知られている。
[0003] しかし、酵母は一般的にその細胞壁が固いため、細胞内に蓄積された細胞内成分 を抽出することは困難である。酵母の中でも上記のキサントフイロマイセス'デンドロウ スは特に強固な細胞壁をもっている。そのため、キサントフイロマイセス 'デンドロウス の細胞内成分に含まれるァスタキサンチンの抽出は非常に困難である。
[0004] このような酵母の細胞内成分を抽出するため、物理的、化学的、あるいは生物学的 手法により酵母自体又は酵母の細胞壁を処理する方法が知られてレ、る。
[0005] 物理的処理法としては、ロールミル、フレンチプレス、ホモジナイザー、ビーズミル、 超音波などを用いて酵母自体を粉砕する方法が知られている。例えば、特許文献 1 には、ロールミルを用いてファフィァ 'ロドチーマ（Paffiarhodozyma、キサントフイロマイ セス ·デンドロウスの無性世代名）の乾燥菌体を加圧処理する方法が記載されてレ、る
[0006] 一方、化学的処理法としては、酸又はアルカリを用いて酵母の細胞壁を破壊又は 脆弱化する方法が知られている。例えば、特許文献 2には、ファフィァ'ロドチーマの 細胞内のァスタキサンチンを利用するため、酸を用いて、約 80°Cの加温下で化学的 処理を行うことが記載されている。また、特許文献 3には、ファフィァ 'ロドチーマ酵母 菌体の培養過程において、栄養源が制限された条件下で増殖制限期を経た後に、 酸及び Z又はアルカリを用いて化学的処理を行うことが記載されている。
[0007] また、生物学的処理法としては、細胞溶解酵素を用いる方法が知られている。例え ば、特許文献 4には、ファフィァ'ロドチーマの細胞壁を溶解することのできる酵素を 用いて、細胞壁を溶解し、細胞内に存在するァスタキサンチンを抽出する方法が記 載されている。
特許文献 1 :特開平 8— 257号公報
特許文献 2：特開平 6— 7153号公報
特許文献 3 :特開平 8— 228765号公報
特許文献 4 :特開平 8— 259号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] しかし、上述した特許文献 1に記載のロールミルを用いた物理的処理法では、数十 から数百気圧での高圧処理が必要であり、実用性に欠けるものであった。その他の 物理的処理法においては、例えば、フレンチプレスによる処理は数百から数千気圧 での加圧処理を要する。また、ホモジナイザー、ビーズミル、超音波などによる処理は 長時間を要する。物理的処理法はこれらの欠点を有するため、いずれも商業上の適 用は困難であった。
[0009] また、特許文献 2及び 3に記載の化学的処理法においては、酸'アルカリの添加に 伴レ、、その中和処理が必要である。また、化学的処理に使用する酸'アルカリの洗い 出しや中和処理によっては生じる塩類の洗い出し等の工程も必要となり、煩雑な操 作が必要であった。更に、化学的処理時に熱を加える場合は、加熱のためのェネル ギー、設備等も必要となり商業的に実用し得るものではなかった。このような化学的 処理法は、分析のために細胞内成分に含まれる脂溶性成分を全量抽出する場合に 用いられるに限られていた。
[0010] また、特許文献 4に記載の生物学的処理法では、細胞壁を溶解するための酵素を 製造する装置及び工程が別途必要であり、これも商業上の適用は困難であった。 [0011] そこで本発明は、脆弱化した細胞壁を有し、酵母の細胞内成分に含まれる脂溶性 成分を効率的に抽出し得る脂溶性成分抽出用酵母及びその生産方法を提供するこ とを目的とする。また、本発明は、脂溶性成分の製造方法及び脂溶性成分抽出用酵 母を用いた色調改善剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明による脂溶性成分抽出用酵母の生産方法は、抽出すべき脂溶性成分を有 する酵母を、増殖にしたがって培地の pHが低下するように、増殖可能 pH領域の下 限未満まで増殖させる増殖工程を備える。
[0013] 酵母などの微生物を増殖させる場合、培地の pHを一定に維持調整し、増殖可能 p H領域内で酵母を増殖させることが求められる。従って、増殖時の pHは一定に制御 することが常識とされ、特に生育環境が劣悪な酸性側に培地の pHを偏らせることは 避けるべきとされていた。し力 ながら、本発明者らは、従来の常識に反して培地の p Hを増殖にしたがって培地の pHを下げること、そして培地の pHを増殖可能 pH領域 の下限未満に至らせることにより、酵母が有する脂溶性成分を効率的に取出すことが できることを見出した。このような生産方法によれば、脆弱化した細胞壁を有する脂溶 性成分抽出用酵母を生産することができる。そして、このような脂溶性成分抽出用酵 母に対しては、従来から行われているような細胞壁を破壊又は脆弱化する処理を施 さずとも、通常の抽出工程により、細胞内成分に含まれる脂溶性成分を抽出すること ができる。
[0014] 上記の増殖工程にぉレ、て、増殖にしたがって代謝された栄養分から酸性基が生じ ることにより培地の pHが低下することが好ましい。即ち、好適には酵母が栄養分を代 謝し、この代謝によって酸性基が生じ、培地の pHを徐々に低下させる。この場合、増 殖工程において、培地の pH低下のための pH調整操作を必ずしも外部から行う必要 はない。
[0015] 酵母の増殖にしたがって代謝された栄養分から生じる酸性基が、 SO 2_、 HSO "
4 3
、 NO―、 PO 3_、 HPO 2—、 H PO―、 PO—及び C1—からなる群より選ばれる少なく
3 4 4 2 4 3
とも 1つであることが好ましい。このような酸性基を生じる栄養分としては、アンモニア 塩である硫酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム及び塩化アンモニ ゥムがある。これらは酵母の栄養となる窒素元素を含有するため、窒素源としての役 割がある。なお、これらのアンモニア塩から生じ得る酸性基は、硫酸アンモニゥムから は SO 2 及び HS〇一、硝酸アンモニゥム力らは N〇一、リン酸アンモニゥムからは P〇
4 3 3
HPO 2—、 H PO—及び PO 塩化アンモニゥムからは C厂である。
4 4 2 4 3
[0016] 本発明の脂溶性成分抽出用酵母の生産方法においては、キサントフイロマイセス' デンドロウスを用いることができる。この場合、酵母の細胞内に脂溶性成分であるァス タキサンチンを含有し、細胞壁が脆弱化した脂溶性成分抽出用のキサントフイロマイ セス 'デンドロウスを得ることができる。
[0017] 上記の脂溶性成分抽出用のキサントフイロマイセス 'デンドロウスからはァスタキサン チンを抽出することができる。赤色カロチノイドの一種であるァスタキサンチンは、赤 色色素として養殖魚、鶏卵卵黄等の色調改善剤として使用されている。また、ァスタ キサンチンは、強力な抗酸化作用を有することから医薬活性成分としての用途などが 検討されており、その用途は多岐にわたる。なお、脂溶性成分抽出用酵母が有する 脂溶性成分はァスタキサンチンに限られるものではない。
[0018] 本発明は、また、上記の生産方法により得られる脂溶性成分抽出用酵母を提供す る。上記本発明の生産方法により得られる脂溶性成分抽出用酵母は、脆弱化した細 胞壁を有している。従って、従来から行われているような細胞壁を破壊又は脆弱化す る処理を施さずとも、通常の抽出工程により、細胞内成分に含まれる脂溶性成分を抽 出すること力 Sできる。
[0019] 本発明の脂溶性成分の製造方法は、脂溶性成分抽出用酵母から脂溶性成分を抽 出する抽出工程を備える。本発明の脂溶性成分の製造方法によれば、脆弱化した 細胞壁を有する脂溶性成分抽出用酵母に対して、従来力 行われているような細胞 壁を破壊又は脆弱化する処理を施さずとも、その後の抽出工程により、細胞内成分 に含まれる脂溶性成分を抽出し、製造することができる。
[0020] 本発明は、また、上記の脂溶性成分抽出用酵母を含む色調改善剤を提供する。こ の色調改善剤は、例えば、養殖魚、養鶏等の飼料に配合して用いることができる。上 述の通り、脂溶性成分抽出用酵母の細胞壁は脆弱化している。そのため、脂溶性成 分抽出用酵母、特に脂溶性成分としてァスタキサンチンを含有する脂溶性成分抽出 用酵母を含む色調改善剤を飼料と共に養殖魚等に摂取させると、養殖魚等の体内 に効率的に吸収され、肉色や体色、卵黄の色調を改善することができる。
発明の効果
[0021] 本発明によれば、脆弱化した細胞壁を有し、酵母の細胞内成分に含まれる脂溶性 成分を効率的に抽出し得る脂溶性成分抽出用酵母及びその生産方法が提供される
。また、本発明によれば、脂溶性成分の製造方法及び脂溶性成分抽出用酵母を用 レ、た色調改善剤が提供される。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]実施例 1の本培養中 ίこおける培地液の ρΗ及び培地液の酵母濃度の経時的変 化を表すグラフである。
[図 2]比較例 4の本培養中 ίこおける培地液の ρΗ及び培地液の酵母濃度の経時的変 化を表すグラフである。
[図 3]実施例 8の本培養中 ίこおける培地液の ρΗ及び培地液の酵母濃度の経時的変 化を表すグラフである。
[図 4]比較例 5の本培養中 ίこおける培地液の ρΗ及び培地液の酵母濃度の経時的変 化を表すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明の実施形態について詳しく説明する。
[0024] まず、本発明の脂溶性成分抽出用酵母の生産方法について説明する。本発明の 脂溶性成分抽出用酵母の生産方法は、抽出すべき脂溶性成分を有する酵母を、増 殖にしたがって培地の ρΗが低下するように、増殖可能 ρΗ領域の下限未満まで増殖 させる増殖工程（以下、単に「増殖工程」とレ、う）を備えることを特徴とする。
[0025] 増殖工程で増殖させる酵母としては、細胞内成分に脂溶性成分を含む酵母を用い る。例えば、キサントフイロマイセス 'デンドロウス、サッカロミセス属、キャンディダ属等 力 S挙げられる。また、これらの酵母は、脂溶性成分の生産量増大のために種々の変 異誘導が施されたものであってもよレ、。例えば、キサントフイロマイセス 'デンドロウス であって、特表平 6— 506122号公報等に記載の方法により変異誘導が施された高 生産性変異株を用レ、てもよレ、。 [0026] 増殖工程により酵母を増殖させるにあたり、酵母を培養する方法としては回分法、 半回分法、流加培養法、連続培養法などが適用できる。これらの培養方法及び培養 条件は、酵母の菌株の種類、培地などにより、適した方法を任意に選択できる。
[0027] 増殖にしたがって培地の pHを低下させる方法は、外部から酸を少量ずつ添加して pHを低下させる方法、及び、酵母の代謝に起因した自発的な pH低下方法がある。 自発的な pH低下方法としては、酵母の代謝によって生じる酸により pHを自発的に低 下させる方法、代謝された栄養分力 酸性基が生じることにより pHを自発的に低下さ せる方法などがある。これらの方法のうち、代謝された栄養分から酸性基が生じること により pHを自発的に低下させる方法が好ましい。この方法はより具体的には、酵母の 栄養分となる培地中の成分が酵母に代謝され、この成分中の酸性基が培地中に遊 離されることにより、培地の pHを低下するものである。この方法によれば、酵母の代 謝にしたがい培地の pHを増殖可能 pH領域の下限未満まで十分に低下させることが できる。なお、酵母の代謝に起因した自発的な pH低下方法による場合は、酵母の代 謝を十分に促進するため、増殖工程は好気条件とすることが好ましい。
[0028] 代謝されることにより酸性基が生じる栄養分として、酵母の栄養となる窒素元素を含 有し、代謝されると酸性基を生じるアンモニア塩が好ましい。アンモニア塩としては、 硫酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、塩化アンモニゥムなどが 好ましい。これらのアンモニア塩から生じ得る酸性基は、硫酸アンモニゥムからは S〇
4 及び HSO 硝酸アンモニゥムからは NO―、リン酸アンモニゥムからは PO 3 H
3 3 4
PO 2 H PO—及び P〇―、塩化アンモニゥムからは C厂である。
4 2 4 3
[0029] 培地の pHを十分に低下させるためには、栄養分が代謝されることで生じる酸性基 は、培地溶液中での解離度が高レ、ものが好ましい。上記の酸性基のうち、栄養分が 代謝されることで生じる酸性基として好適なものは、 SO 2_ NO _ C厂であり、より
4 3
好適なものは、 S〇 2— NO—である。
4 3
[0030] ここで、増殖工程に用いる培地としては、モルトエキス希釈液を含有する培地、グノレ コース、酵母エキスを含有する合成培地、これらの培地に各種の添加剤を用いた培 地などを使用することができる。増殖にしたがって培地の pHを自発的に低下させる場 合には、硫酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム、塩化アンモニゥ ムなどのアンモニア塩が培地に添加されていることが好ましぐ硫酸アンモニゥムが添 加されてレ、ることがより好ましレ、。
[0031] 抽出すべき脂溶性成分を有する酵母の増殖可能 pH領域は、通常、 pH値が異なる 複数の培地を用意し、これらの培地の pH値を維持しながら酵母を増殖させ、それぞ れの pH値の培地における酵母の増殖率から決めることができる。このようにして決め られた酵母の増殖可能 pH領域は、酵母の種類によっても異なる力 その範囲は、通 常、 4〜9である。即ち、増殖可能 pH領域の下限未満、例えば、 4未満である培地で 酵母を増殖させることは困難である。しかし、本発明においては、酵母の増殖可能 p H領域の下限未満に至らせることにより、細胞壁が脆弱化した脂溶性成分抽出用酵 母を生産することができる。
[0032] 脂溶性成分抽出用酵母から抽出される脂溶性成分は、ァスタキサンチン等のカロ チノイド類、ビタミン A、 D、 E等の脂溶性ビタミン、ステロール類、テルペン類、脂溶性 アミノ酸、脂溶性タンパク質等である。これらの脂溶性成分のうち、赤色カロチノイドの 一種であるァスタキサンチンは、赤色色素として養殖魚、鶏卵卵黄等の色調改善剤 として使用されている。また、ァスタキサンチンは強力な抗酸化作用を有することから 、医薬活性成分としての用途などが検討されている。ァスタキサンチンは、脂溶性成 分抽出用酵母として上記方法により生産されたキサントフイロマイセス 'デンドロウスか ら抽出することができる。
[0033] なお、ァスタキサンチンは、 自然界に広く分布し、甲殻類の殻や卵、鮭の肉、キンメ ダイの表皮などに含まれており、これらの肉色や体色の発現に関わっている。ァスタ キサンチンを産生する微生物としては、キサントフイロマイセス 'デンドロウス以外に、 藻の一種であるへマトコッカス'プルビアリスが知られている。
[0034] 本発明の脂溶性成分抽出用酵母の生産方法によれば、脆弱化した細胞壁を有す る脂溶性成分抽出用酵母を生産することができる。
[0035] なお、本発明の脂溶性成分抽出用酵母の生産方法においては、培地の pHを増殖 可能 pH領域の下限未満まで低下させて脂溶性成分抽出用酵母の生産を終了させ ればよい。即ち、必ずしも酵母を増殖させる全工程にわたり、増殖にしたがって培地 の pHが低下するように酵母を増殖させる必要はない。酵母を増殖させる初期工程に おいては従来公知の増殖方法を用レ、、増殖の後期工程において、増殖工程を実施 してもよレ、。例えば、従来公知の培地にて、常法の培養スケールアップ手段を用いて 種培養から通気攪拌培養へ移行し、その後、本培養で増殖工程を備える生産方法 を行うこともできる。
[0036] また、増殖工程の過程にあっては、常に酵母が増殖している必要はない。増殖ェ 程には、酵母の保存などを目的として、増殖のための栄養分が制限された条件下で 、酵母が増殖しない培養工程が含まれていてもよい。なお、増殖工程終了後にこのよ うな酵母が増殖しなレ、培養工程が含まれてレ、てもよレ、。
[0037] 増殖工程を経て増殖された脂溶性成分抽出用酵母は、遠心分離機等を用いて集 菌される。集菌されたスラリー状の脂溶性成分抽出用酵母に対し、必要に応じて 1回 又は 2回以上の水洗浄処理をして、酵母菌体スラリーを得ることが好ましい。また、使 用目的にあわせて乾燥処理をしてもよぐこれにより湿酵母菌体又は乾燥酵母菌体 を得ることもできる。
[0038] このようにして得られた脂溶性成分抽出用酵母は、細胞壁が脆弱化している。その ため、従来から行われているような細胞壁を破壊又は脆弱化する処理を施さずとも、 通常の抽出工程により、細胞内成分に含まれる脂溶性成分を抽出することができる。
[0039] 本発明の脂溶性成分抽出用酵母は、脂溶性成分としてァスタキサンチンを含む脂 溶性成分抽出用のキサントフイロマイセス 'デンドロウスが好ましい。この脂溶性成分 抽出用のキサントフイロマイセス'デンドロウスは、細胞壁が脆弱化しているため、ァス タキサンチンが効率的に抽出されるのみならず、その特徴力 様々な用途に使用す ること力できる。例えば、色調改善剤、栄養補助剤、皮膚外用剤、免疫増強剤、眼疾 患改善剤などとして用いることができる。脂溶性成分抽出用のキサントフイロマイセス' デンドロウスは、その細胞壁が脆弱化しているため、キサントフイロマイセス'デンドロ ウスを飼料、食品などと共に摂取することにより、ァスタキサンチンを効率的に体内に 吸収することができる。従って、ァスタキサンチンが有する肉色や体色、卵黄の色調 改善作用、抗酸化作用などを十分に利用することができる。
[0040] 次に、本発明の脂溶性成分の製造方法について説明する。本発明の脂溶性成分 の製造方法は、上述した脂溶性成分抽出用酵母から脂溶性成分を抽出する抽出ェ 程を備える。
[0041] 上述した脂溶性成分抽出用酵母は細胞壁が脆弱化している。そのため、従来から 行われているような細胞壁を破壊又は脆弱化する処理を施さずとも、その後の抽出 工程により、細胞内成分に含まれる脂溶性成分を抽出し、製造することができる。
[0042] 脂溶性成分の抽出工程では、酵母菌体スラリー又は湿酵母菌体の状態である脂溶 性成分抽出用酵母に対して、有機溶媒を用いて脂溶性成分を抽出する。有機溶媒 としては、アセトン、エタノール、へキサン、クロ口ホルムなど、又はこれらを混合して使 用することができる。有機溶媒に抽出された脂溶性成分は、エバポレータなどを用い て有機溶媒を蒸発させることにより回収することができる。
[0043] 次に、本発明の色調改善剤について説明する。本発明の色調改善剤は、脂溶性 成分抽出用酵母を含む。上述の通り、脂溶性成分抽出用酵母の細胞壁は脆弱化し ている。そのため、養殖魚、養鶏等に脂溶性成分抽出用酵母を含む色調改善剤を 飼料と共に摂取させると、養殖魚等の体内に効率的に吸収され、肉色や体色、卵黄 の色調を改善することができる。
[0044] 色調改善剤は、脂溶性成分抽出用酵母のみからなるものであってもよいが、脂溶 性成分抽出用酵母と、食物繊維、各種オリゴ糖、多糖類などの配合剤とからなるもの であってもよい。また、色調改善作用のみならず、栄養補助剤の機能を同時に持た せるために、さらにビタミン、ミネラルなどが含まれていてもよい。
実施例
[0045] 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例及び比較例においては、培 地液の pH値 4を酵母の増殖可能 pH領域の下限とした。
[0046] (実施例 1)
<キサントフイロマイセス ·デンドロウスの培養 >
傾斜培地に保存されたキサントフイロマイセス 'デンドロウスの菌株、 ATCC24202 株をスケールアップするため、本培養に先立ち、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈 液の培地で ATCC24202株の前培養を行った。即ち、傾斜培地から菌株を植菌し、 温度 20°Cで 48時間培養し、前培養液を得た。 [0047] 本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニ ゥムが 0. 3質量％添加された培地液 90mlを三角フラスコ（内容積： 500ml)内に用 意した。前培養で得た培養液 10mlを本培養の培地液に接種した。本培養では、回 転速度 180rpm、温度 20°Cの条件で 144時間振盪培養した。
[0048] <ァスタキサンチンの抽出 >
本培養終了後、培地液 100mlを遠心分離装置にかけ、培地液に含まれるキサント フイロマイセス 'デンドロウスの酵母菌体 (以下、「酵母菌体」という）を回収した。回収 した酵母菌体を水で 2回洗浄し、ァスタキサンチンを抽出するためのスラリー状の酵 母菌体を得た。
[0049] 三角フラスコに上記スラリー状の酵母菌体 lOOmgを入れ、さらにアセトン 8mlを添 カロした。そして、この三角フラスコを温度 5°Cの冷喑所に 3時間安置し、酵母菌体の細 胞成分に含まれるァスタキサンチンをアセトンに抽出した。
[0050] <ァスタキサンチン抽出量測定 >
冷喑所に 3時間安置した後、アセトンの液面に浮遊しているァスタキサンチンの質 量を吸光光度計を用いて測定した。このように測定されたァスタキサンチンの質量を 抽出に用いたキサントフイロマイセス 'デンドロウスの乾燥酵母菌体 (以下、「乾燥酵母 菌体」という）の質量で除した値、即ち、乾燥酵母菌体の単位質量あたりのァスタキサ ン抽出質量をァスタキサンチン抽出量（ x gZg)とした。なお、乾燥酵母菌体の質量 は、本培養終了時の培地液の酵母菌体濃度測定結果から算出した。培地液の酵母 菌体濃度測定について、以下に説明する。
[0051] <培地液の酵母菌体濃度測定 >
本培養において、本培養開始直後、本培養開始後 24時間、 48時間、 72時間、 96 時間、 120時間及び 144時間に培地液の酵母菌体濃度測定を行った。単位体積あ たりの培地液に含まれる乾燥酵母菌体の質量を培地液の酵母菌体濃度 (g/1)とし た。
[0052] 本培養中の上記時間において、酵母菌体を含有する培地液 30mlを採取した。採 取した培地液を遠心分離装置にかけ、培地液に含まれる酵母菌体を回収した。回収 した酵母菌体を温度 105°Cの恒温槽に 24時間入れて乾燥させた。このようにして得 られた乾燥酵母菌体の質量を測定し、この値を採取した培地液の体積で除して培地 液の酵母菌体濃度を算出した。
[0053] <培地液の pH測定 >
また、本培養において、本培養開始直後、本培養開始後 24時間、 48時間、 72時 間、 96時間、 120時間及び 144時間に培地液の pH測定を行った。培地液の pHは、 ガラス電極式水素イオン濃度計を用いて測定した。
[0054] (比較例 1)
本培養において、培地液の pHが 4. 5に維持されるように、培地液に対してアンモ ユア水を徐々に添加したこと以外は実施例 1と同様にして、酵母菌体の培養、ァスタ キサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽出量測定を行つた。
[0055] (比較例 2)
本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液を用い、培地液に硫酸 アンモニゥムが添加されていないこと以外は実施例 1と同様にして、酵母菌体の培養 、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽出量測定を行った。
[0056] (比較例 3)
酵母菌体からのァスタキサンチンの抽出に酸による細胞壁破壊処理を施した。即ち 、本培養において、比較例 1と同様に培地液の pHが 4. 5に維持されるように、培地 液に対してアンモニア水を徐々に添カ卩して、酵母菌体を培養した。このようにして得 られたスラリー状の酵母菌体を三角フラスコに入れ、濃度力 Nとなるように希硫酸を 添加した。この三角フラスコを沸騰水浴中に浸し、 5分間煮沸した後急冷した。このよ うに細胞壁破壊処理を施した酵母菌体を遠心分離装置を用いて回収した。回収した 酵母菌体を水で 2回洗浄し、ァスタキサンチンを抽出するためのスラリー状の酵母菌 体を得た。スラリー状の酵母菌体を得た後は、実施例 1と同様にして、ァスタキサンチ ンの抽出、及び、ァスタキサンチン抽出量測定を行った。
[0057] (比較例 4)
本培養の途中に培地液に対して乳酸を添加して、培地液の pHを急激に低下させ 、培養終了時の pHを増殖可能 pH領域の下限未満とした。即ち、本培養開始後 48 時間から乳酸添加による培地液の pH調整を開始し、培地液の pHを 2. 2に維持した 。そして、乳酸添カ卩開始後 32時間で本培養を終了した。
[0058] 比較例 4はさらに以下の点で実施例 1と異なる。即ち、本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニゥムが 0. 3質量％、及び炭酸 カルシウムが lOOOppm添加された培地液を用いた。なお炭酸カルシウムは、酵母菌 体の増殖による培地液の pH低下速度を緩和し、酵母菌体が増殖する期間を確保す るために添加した。このような条件での本培養を行った後、実施例 1と同様にして、ァ スタキサンチンの抽出、及び、ァスタキサンチン抽出量測定を行った。
[0059] 実施例 1及び比較例：!〜 4におけるァスタキサンチン抽出量測定結果を表 1に示す 。表 1には、本培養開始時及び本培養終了時における培地液の pH及び培地液の酵 母菌体濃度をあわせて示した。
[0060] [表 1]
Figure imgf000014_0001
[0061] 実施例 1の本培養中における培地液の pH及び培地液の酵母濃度の経時的変化 を表すグラフを図 1に示す。培地液の酵母濃度の上昇は酵母菌体が増殖しているこ とを示す。図 1では本培養開始力 48時間において、急激に酵母菌体が増殖してい る。酵母菌体の増殖にしたがって培地液の pHが 2. 5程度まで低下している。この値 は、酵母の増殖可能 pH領域の下限である 4を大きく下回っている。従って、本培養 開始から 48時間以上経過した段階では、酵母菌体の増殖が抑制され、培地液の pH 低下も抑制されている。
[0062] 一方、比較例 1では、本培養中において、培地液の pHが増殖可能 pH領域内であ る 4. 5に維持されている。表 1に示すように、比較例 1においても本培養開始時と本 培養終了時の培地の酵母菌体濃度を比較すると、酵母菌体は増殖していることが分 かる。しかし、酵母菌体の増殖にしたがって培地液の pHが低下していないため、ァス タキサンチンの抽出量は実施例 1と比べて低レ、。
[0063] また、比較例 2では、培地液の pHを一定に調整しているわけではないが、培地液 に硫酸アンモニゥムが含まれていないため、酵母菌体の増殖にしたがって代謝され る酸性基の量が十分でない。このため、本培養終了時の培地液の pHが十分に低下 せず、増殖可能 pH領域内である 4. 0に留まっている。
[0064] 一方、比較例 3では、比較例 1と同様に行った本培養後において、酸を用いて酵母 菌体の細胞壁破壊処理を施しているため、ァスタキサンチン抽出量が比較的高い。 このような酸を用いる細胞壁破壊処理は、分析のために細胞成分に含まれる全ァス タキサンチンを抽出する場合に行うのが一般的であり、細胞壁破壊処理は、工業的 に見合うものではない。比較例 3では、ァスタキサンチン抽出工程の前工程において 、酸による細胞壁破壊処理工程、アルカリによる中和工程及び中和で発生した塩の 洗浄工程などが必要であり、効率的にァスタキサンチンを抽出することができなかつ た。
[0065] また、比較例 4の本培養中における培地液の pH及び培地液の酵母濃度の経時的 変化を表すグラフを図 2に示す。図 2では、図 1と同様に本培養開始から 48時間の間 において、急激に酵母菌体が増殖している。酵母菌体の増殖にしたがって培地液の pHが 4. 4程度まで低下している。この値は、酵母の増殖可能 pH領域内であり、実 施例 1の同じ時間での pH2. 5と比較すると高い。これは、培地液に添加された炭酸 カルシウムの影響と考えられる。増殖可能 pH領域内から乳酸を用いて外部から急激 に培地液の pHを低下させたのでは、実施例 1のような高いァスタキサンチン抽出量 は得られないことがわ力る。
[0066] なお、ァスタキサンチン抽出量は培養バッチによって微妙に異なるため、上記実施 例 1及び比較例 1、 3と同様な本培養及び各種測定をさらにそれぞれ 2回行つたが、 いずれも実施例 1及び比較例 1、 3と同様な結果となった。
[0067] (実施例 2)
本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニ ゥムの代わりに硝酸アンモニゥム 0. 3質量％が添加された培地液を用いたこと以外 は実施例 1と同様にして、酵母菌体の培養、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキ サンチン抽出量測定を行つた。
[0068] (実施例 3) 本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニ ゥムの代わりに塩化アンモニゥム 0. 3質量％が添加された培地液を用いたこと以外 は実施例 1と同様にして、酵母菌体の培養、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキ サンチン抽出量測定を行つた。
[0069] (実施例 4)
本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニ ゥムの代わりにリン酸アンモニゥム 0. 3質量％が添加された培地液を用いたこと以外 は実施例 1と同様にして、酵母菌体の培養、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキ サンチン抽出量測定を行つた。
[0070] 実施例 2〜4におけるァスタキサンチン抽出量測定結果を表 2に示す。表 2には、本 培養開始時及び本培養終了時における培地液の pH及び培地液の酵母菌体濃度を あわせて示した。
[0071] [表 2]
Figure imgf000016_0001
[0072] 表 2に示すように、実施例 2及び 3におけるァスタキサンチン抽出量は 300 x gZg 以上であり、高い抽出量を示した。一方、培地液に含まれるアンモニア塩カ^ン酸ァ ンモニゥムである実施例 4のァスタキサンチン抽出量は、培地液にアンモニア塩を含 まない培地液を用いた比較例 2と比べると高いが、その値は 100 μ g/g程度に留ま つている。この理由は、リン酸アンモニゥムが代謝されることにより生じる酸性基、 P〇
4
3_、 HPO 2_、 H PO—及び PO—の培地液中の解離度が比較的低いため、硫酸ァ
4 2 4 3
ンモニゥム、硝酸アンモニゥム、塩化アンモニゥムなどのアンモニア塩を添加した場 合と比較すると培地液の pHが十分に低下しないためと考えられる。しかし、リン酸ァ ンモニゥムに含まれるリンが酵母菌体の増殖に好影響を与え、本培養終了時の培地 液の酵母菌体濃度は 17. 2g/lと高かった。従って、培地液にリン酸アンモニゥムを 添加する場合は、硫酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、塩ィ匕アンモニゥムなどのァ ンモユア塩と併用することが好ましいと考えられる。このようにすると、実施例 4と同様 な本培養方法であっても酵母菌体濃度及びァスタキサンチン抽出量の両方を高水 準とすることが期待できる。
[0073] (実施例 5)
本培養の培地として、硫酸アンモニゥムが 0. 3質量％添加された糖濃度 6質量％ のモルトエキス希釈液の代わりに合成培地を用いたこと以外は実施例 1と同様にして
、酵母菌体の培養、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽出量測定を行 つた。なお、合成培地の組成は表 3の通りとした。
[0074] [表 3]
Figure imgf000017_0001
[0075] (実施例 6)
キサントフイロマイセス ·デンドロウスの菌株を ATCC24202株の代わりにァスタキサ ンチン高生産性付与変異株を用いたこと以外は実施例 1と同様にして、酵母菌体の 培養、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽出量測定を行った。
[0076] 実施例 5及び 6におけるァスタキサンチン抽出量測定結果を表 4に示す。表 4には、 本培養開始時及び本培養終了時における培地液の pH及び培地液の酵母菌体濃 度をあわせて示した。
[0077] [表 4]
Figure imgf000017_0002
[0078] (実施例 7) 本培養を通気攪拌培養が可能な培養装置を用いて行うため、傾斜培地に保存され たキサントフイロマイセス 'デンドロウスの菌株、 ATCC24202株を 2段階でスケール アップした。傾斜培地から糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液の培地に植菌後、温 度 20°Cで 48時間培養し、第 1の前培養を行った。
[0079] 第 2の前培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液の培地液 90ml を 500mlの三角フラスコ内に用意した。このような三角フラスコを 2つ用意した。それ ぞれの三角フラスコ内の培地液に対して、第 1の前培養で得た培養液 10mlを接種し た。第 2の前培養では、回転速度 180rpm、温度 20°Cの条件で 48時間振盪培養し た。
[0080] 本培養の培地として、糖濃度 6質量％のモルトエキス希釈液に対して硫酸アンモニ ゥムが 0. 3質量％添加された培地液 1. 8リットルを培養装置の培養槽（内容積：5リツ トル）内に用意した。この培養装置は温度制御装置及び通気攪拌装置を有している 。第 2の前培養で得た培養液 180mlを培養装置内の培養液に添加し、温度 20°Cの 条件で 144時間通気攪拌培養した。
[0081] 本培養を終了した後は、実施例 1と同様にして、ァスタキサンチンの抽出、及びァス タキサンチン抽出量測定を行った。
[0082] (実施例 8)
本培養において、培地液の糖濃度が 3%を切るまで培地液の pHが 4. 5となるよう に調整した。培地液の pHを 4. 5に調整するため、培地液に対して、アンモニア水を 徐々に添加した。本培養開始力も 48時間後に培地液の糖濃度が 3%を下回った。そ の後は、培地液の pH調整は行わなかった。このような培地液の pH調整を本培養に て実施したこと以外は、実施例 7と同様にして酵母菌体の培養を行った。本培養の終 了後、実施例 1と同様にして、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽出量 測定を行った。なお、培地液の糖濃度測定は、 HPLCを用いて行った。
[0083] (比較例 5)
本培養において、培地液の pHが 4. 5となるように、培地液に対してアンモニア水を 徐々に添加したこと以外は、実施例 7と同様にして酵母菌体の培養を行った。本培養 の終了後、実施例 1と同様にして、ァスタキサンチンの抽出、及びァスタキサンチン抽 出量測定を行った。
[0084] 実施例 7、 8及び比較例 5におけるァスタキサンチン抽出量測定結果を表 5に示す。
表 5には、本培養開始時及び本培養終了時における培地液の PH及び培地液の酵 母菌体濃度をあわせて示した。
[0085] [表 5]
Figure imgf000019_0001
[0086] 実施例 8の本培養中における培地液の pH及び培地液の酵母濃度の経時的変化 を表すグラフを図 3に示す。また、比較例 5の本培養中における培地液の pH及び培 地液の酵母濃度の経時的変化を表すグラフを図 4に示す。
[0087] 実施例 8では、図 3に示す通り、培地液の pHが調整させている本培養開始から 48 時間において、酵母菌体が順調に増殖している。培地液の pH調整をしなくなった後 、さらに 48時間程度、酵母菌体は増殖を続け、増殖にしたがって培地液の pHが低 下し、その値は 2. 5程度まで低下している。この値は、酵母の増殖可能 pH領域の下 限である 4を大きく下回っている。
[0088] 実施例 7と実施例 8のァスタキサンチン抽出量を比較すると、実施例 8の方が高かつ た。この理由は、実施例 8では本培養の前段階において培地液の pHを酵母の増殖 可能 pH領域内にすることによって、十分に酵母菌体を増殖させることができたためと 考えられる。
[0089] 一方、本培養中において、培地液の pHが増殖可能 pH領域内であるである 4. 5に 維持されている比較例 5では、図 4に示すように、本培養開始から 120時間において 、酵母菌体は増殖している。しかし、酵母菌体の増殖にしたがって培地液の pHが低 下していないため、ァスタキサンチンの抽出量は実施例 7及び 8と比べて低かった。 産業上の利用可能性
[0090] 本発明によれば、脆弱化した細胞壁を有し、酵母の細胞内成分に含まれる脂溶性 成分を効率的に抽出し得る脂溶性成分抽出用酵母及びその生産方法が提供される 。また、本発明によれば、脂溶性成分の製造方法及び脂溶性成分抽出用酵母を用 レ、た色調改善剤が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 抽出すべき脂溶性成分を有する酵母を、増殖にしたがって培地の pHが低下するよ うに、増殖可能 pH領域の下限未満まで増殖させる増殖工程を備える、脂溶性成分 抽出用酵母の生産方法。
[2] 前記増殖工程において、増殖にしたがって代謝された栄養分から酸性基が生じる ことにより培地の pHが低下する請求項 1に記載の脂溶性成分抽出用酵母の生産方 法。
[3] 前記酸性基が SO 2—、 HSO NO PO 3—、 HPO 2—、 H PO―、 PO—及び C
4 3 3 4 4 2 4 3
Γからなる群より選ばれる少なくとも 1つである請求項 2に記載の脂溶性成分抽出用 酵母の生産方法。
[4] 前記酵母がキサントフイロマイセス 'デンドロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous) である請求項 1〜3のいずれか一項に記載の脂溶性成分抽出用酵母の生産方法。
[5] 前記脂溶性成分がァスタキサンチンである請求項 1〜4のいずれか一項に記載の 脂溶性成分抽出用酵母の生産方法。
[6] 請求項:!〜 5のいずれか一項に記載の生産方法により生産される脂溶性成分抽出 用酵母。
[7] 請求項:!〜 5のいずれか一項に記載の生産方法により生産される脂溶性成分抽出 用酵母から脂溶性成分を抽出する抽出工程を備える脂溶性成分の製造方法。
[8] 請求項 6に記載の脂溶性成分抽出用酵母を含む色調改善剤。
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