CN109477125A - 裸藻裂解物组合物以及用于生产所述组合物和纯化的β-1,3-葡聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种组合物，包括裸藻裂解物以及细胞组分和从生产裸藻生物质和裸藻裂解物的发酵过程剩余的残余培养基。所述细胞组分可包括一条或多条具有1.2至580千道尔顿(kDa)分子量的β‑葡聚糖聚合物链。一种用于生产裸藻裂解物的方法，包括从裸藻属生物体生长生物质，将生物质裂解，并且将裂解的生物质干燥，形成裸藻裂解物。一种用于生产纯化的β‑1,3‑葡聚糖的方法，包括生长生物质，将其裂解，洗涤并脱水和干燥。
Description
相关申请
这个PCT申请是基于2016年6月9日提交的美国申请系列No.15/177，368；和基于2016年6月9日提交的美国申请系列No.15/177,376；以及基于2016年6月9日提交的美国申请系列No.15/177,383；将这些申请的公开内容全部按引用并入。
技术领域
本发明涉及裸藻(Euglena)属生物体的领域，并且更特别地，本发明涉及裸藻裂解物组合物以及用于生产裸藻裂解物和生产纯化的β-1,3-葡聚糖的方法。
背景技术
β-葡聚糖是一组通过细菌、酵母、藻类、真菌以及在谷物中产生的β-D-葡萄糖多糖。β-葡聚糖的性质取决于来源，例如，是否来自细菌、藻类、酵母或其他来源。通常，β-葡聚糖用1,3β-糖苷键形成直链骨架。已知在人或动物膳食中掺入β-葡聚糖是有益的。一些β-葡聚糖可以帮助免疫调节以及降低饱和脂肪的水平和降低心脏病的风险。还已知不同类型的β-葡聚糖对人的生理学具有不同的作用。例如，谷物β-葡聚糖可以影响患有高胆固醇血的那些人的血糖调节，而蘑菇β-葡聚糖可以作为免疫系统的生物应答调节剂。在一些情况中，已经发现了酵母β-葡聚糖可以降低与过敏性鼻炎相关的IL4和IL5细胞因子的水平以及提高IL12的水平。
还已经确定了含有副淀粉(β-1,3-葡聚糖)的细小裸藻(Euglena gracilis)生物质可以增强个体的免疫功能。副淀粉是具有高分子量的直链(未分支的)β-1,3-葡聚糖多糖。这种未分支的聚合物不同于其他β-葡聚糖，如来自酵母细胞壁和谷物(例如，燕麦和大麦)的支链β-(1,3；1,6)-葡聚糖；以及用β-(1,4)-糖苷键形成多糖侧链的支链β-1,3-葡聚糖，如在蘑菇中发现的。
来自裸藻的β-葡聚糖的优点在于其缺乏β-(1,6)、β-(1,4)和β-(1,2)键以及任何侧分支结构。作为分子并且与具有分支的一些其他葡聚糖相似，这种直链β-葡聚糖是不溶的，并且认为是同质的，并且对于免疫应答中涉及的受体具有更高的组合定位和结合亲和性。副淀粉可以获自细小裸藻藻类，细小裸藻是原生生物体，并且是裸藻科(euglenales)内的微藻分类裸藻(euglenophyceae)的成员并且包括许多不同的自养和异养物种，这些物种也可以产生副淀粉。这些原生生物可以在富营养的淡水中找到，如浅水河流、湖泊和池塘。副淀粉是用于裸藻类(Euglenoid)的能量储存化合物并且与其他藻类中的淀粉或油和脂肪相当。副淀粉在淀粉核中产生并作为颗粒储存在细胞质中。细小裸藻中的副淀粉颗粒是椭圆形的并且直径约为0.5-2微米(um)。细小裸藻的原种通常维持在受控的实验室条件下并且用作初始接种源。细小裸藻可以在密闭的、可灭菌的生物反应器中无外来污染地(axenically)生产。可以将细小裸藻接种物转移至种子生物反应器中，以累积较大量的生物质，并且随后按照需要传送至较大的生物反应器中。
理想的是使用改进的发酵技术，从裸藻属生物体，并且更特别地，从细小裸藻，扩大生产这种直链、未分支的β-1,3-葡聚糖。细小裸藻衍生的β-葡聚糖对于人和其他动物健康可以给予有利特性，包括增强的免疫应答和其他促进健康的性质。理想的是形成对于提高的免疫调节和其他用途具有增强性质的β-葡聚糖组合物。
发明内容
提供这个概述来介绍以下在详述中进一步描述的概念的选择。这个概述不是打算来鉴定所要求主题的关键或必要特征，也不是打算用作限制所要求主题的范围的辅助。
组合物包含裸藻裂解物和来自产生裸藻生物质和裸藻裂解物的发酵过程的细胞组分以及剩余的残余培养基。所述组合物可以包含金属，包括锌，并且配制成单剂量胶囊或作为营养补充剂添加。
残余的培养基可以包含至少一种矿物质和维生素。在一个实例中，所述矿物质和维生素选自生物素、钙、铜、叶酸、铁、镁、锰、烟酸、磷、钾、钠、锌和维生素B1、B2、B6、B12、C、D、E、K1或其盐。所述细胞组分可以包含脂质、蛋白质和氨基酸。在一个实例中，所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。所述脂质选自花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、脂肪、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸和泛酸。所述组合物可以进一步包含类胡萝卜素，包括α-和β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素和玉米黄质。
在再另一个实例中，所述组合物可以包含裸藻裂解物和来自产生裸藻生物质和裸藻裂解物的发酵过程的细胞组分以及剩余的残余培养基。所述细胞组分可以包含一条或多条具有1.2至580千道尔顿(kDa)分子量的β-葡聚糖聚合物链。所述β-葡聚糖聚合物链可以具有7至3,400个葡萄糖单位的聚合物长度。
一种用于生产裸藻裂解物的方法，包括从裸藻属生物体生长生物质，并且在非限制性的实例中，将生长的生物质脱水。所述方法进一步包括将生物质裂解，并且将裂解的生物质干燥，以形成裸藻裂解物。可以将金属加入裸藻裂解物中。
在一个实例中，脱水可以包括将生物质离心或重力滗析。在更多实例中，离心可以选自滗析离心(或译为沉降式离心)、碟式离心(stacked-disk，或译为碟盘式离心)、锥板离心、推料离心和去皮离心(或译为刮刀卸料离心)。裂解可以选自机械、pH和温度驱动的。机械裂解可以包括均质或珠磨。可以将生物质在高于500barg的压力下均质，并且在另一个实例中，在500至1,900barg的压力范围下，并且在再另一个实例中，在750至1,000barg压力范围下。
可以将生物质在高于7.0的pH和高于5℃的温度下裂解，并且在另一个实例中，用碱处理生物质并且在高于9.0的pH和高于45℃的温度下裂解。还可以用碱处理生物质并且在9.0至12.5的pH和45至100℃的温度下裂解。可以通过选自喷雾干燥、螺带(ribbon，或译为螺条)干燥、盘式干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、真空螺带干燥、折射窗干燥和真空鼓式干燥的方法来干燥裂解的生物质。可以将生长的生物质脱水至50至350克/升(g/L)的浓度。
在再另一个实例中，所述方法不包括将生长的生物质脱水。用于生产裸藻裂解物的方法可以包括从裸藻属生物体生长生物质，将生物质裂解，并且将裂解的生物质干燥，以形成裸藻裂解物。
用于生产纯化的β-1,3-葡聚糖的方法包括从裸藻属的生物体生长生物质，并且在非限制性的实例中，将生长的生物质脱水。所述方法进一步包括将生物质裂解，形成裂解的生物质，将裂解的生物质洗涤并脱水，产生β-1,3-葡聚糖，并将β-1,3-葡聚糖干燥，产生纯化的β-1,3-葡聚糖。所述方法可以包括将裂解的生物质多次洗涤和脱水。所述脱水可以包括将生物质离心或重力滗析。示例性离心选自滗析离心、碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心。
裂解可以选自机械、pH和温度驱动的、表面活性剂和酶裂解。机械裂解可以包括将生物质均质或珠磨，例如，在高于500barg的压力下，在500至1,900barg的压力范围下，并且在另一个实例中，在750至1,000barg的压力范围下，将生物质均质。可以将生物质在高于7.0的pH和高于5℃的温度下裂解。还可以用碱处理生物质并且在高于7.0的pH和高于45℃的温度下裂解生物质。可以用碱处理生物质并且在7.0至12.5的pH和45至100℃的温度下裂解。可以将生物质形成具有3至350克/升(g/L)，并且更优选50至175g/L浓度的浆液。
裂解可以包括用源自脂肪酸的并且包含椰子油、棕榈油、棕榈仁油和pilu油中的至少一种的表面活性剂处理生物质。在另一个实例中，裂解可以包括用源自脂肪酸的并且包含椰子油、棕榈油、棕榈仁油和pilu油中的至少一种的酰基-氨基表面活性剂处理生物质。在再另一个实例中，使得裂解后的细胞片段更易于洗涤的裂解或处理可以包括用溶菌酶、蛋白酶、脂酶或其组合中的一种或多种处理生物质。可以通过用水、酸、碱、乙醇或组合中的一种或多种处理裂解的生物质来洗涤裂解的生物质。干燥可以选自喷雾干燥、螺带干燥、盘式干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、真空螺带干燥、折射窗干燥和真空鼓式干燥。
在另一个实例中，生长的生物质可能必须或不必须在裂解前脱水。用于生产纯化的β-1,3-葡聚糖的方法可以包括从裸藻属生物体生长生物质，将生物质裂解，形成裂解的生物质，将裂解的生物质洗涤或脱水，产生β-1,3-葡聚糖，并且将β-1,3-葡聚糖干燥，产生纯化的β-1,3-葡聚糖。
附图说明
根据附图考虑时，从以下的本发明的详述，将清楚本发明的其他目的、特征和优点，所述附图中：
图1是高水平流程图，显示了根据非限制性实例使用重复补料分批发酵的优选β-葡聚糖生产方法。
图2是另一个高水平流程图，显示了根据非限制性实例使用连续发酵的β-葡聚糖生产方法。
图3是高水平流程图，显示了根据非限制性实例制备纯化的β-葡聚糖的下游加工的实例。
图4是高水平流程图，显示了根据非限制性实例制备β-葡聚糖裂解物的下游加工的实例。
图5是高水平流程图，显示了根据非限制性实例制备全细胞细小裸藻的下游加工的实例。
图6是根据非限制性实例使用自养、兼养和异养组合的β-葡聚糖生产方法的高水平流程图。
图7是根据非限制性实例含有从图1的实例细小裸藻加工形成的组合物的胶囊的实例。
发明详述
现在将参照其中显示了优选实施方案的附图在下文中更全面地描述不同的实施方案。可以列出许多不同的形式，并且所述的实施方案不应当解释为限于本文中列出的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开是彻底和完整的，并且将充分地将所述范围传达给本领域技术人员。
来自细小裸藻的β-葡聚糖也被本领域技术人员称为：β-1,3-葡聚糖、β-1,3-D-葡聚糖、副淀粉、藻类β-葡聚糖或裸藻β-葡聚糖。以下是使用称为细小裸藻的原生生物体的发酵的扩大加工方法的详细内容，细小裸藻通常产生50-75％重量的β-葡聚糖并且作为胞内晶体颗粒存储。β-葡聚糖是葡萄糖聚合物并且细小裸藻产生的β-葡聚糖中的葡萄糖键主要是1,3(>99％)。其他来源的β-葡聚糖具有不同比例的1,3、1,4、1,6、2,3和3,6键，并且包括分支和不同的聚合物长度，例如，从酵母产生的β-葡聚糖与从细小裸藻产生的β-葡聚糖相比。认为这些来自其他β-葡聚糖来源的结构差异在体内动物试验中引发了不同的响应。根据用途，用非限制性的官能团改变天然的β-1,3-葡聚糖结构，如酰化、磺化、硝化、磷酸化或羧甲基化，可以有利地改变葡聚糖的物理化学性质，例如，提高溶解性、产品本土化或结合位点亲和性。
现在参照图1，其中在20概括地说明了根据非限制性实例可以用于生产β-葡聚糖的加工步骤的顺序。所述方法使用了称为重复-补料分批发酵的过程并且产生了作为纯化的β-葡聚糖、细小裸藻裂解物或干燥的裸藻生物质的组合物。
所述方法从起始种子驯化(starter seed train)(模块22)开始(模块21)并且在Fernbach烧瓶(例如，本领域技术人员已知的标准大小的烧瓶)中使培养物异养生长(模块24)。将传代培养部分返回补料，同时将其他部分通入种子容器或种子罐中(模块26)并随后通入发酵罐中。此时，发酵以重复补料分批发酵的过程进行(模块28)，如使用已灭菌的补料(模块30)在以下更详细解释的。
在操作上，发酵过程控制温度为23-32℃，具有3-5的pH和10-40％的溶解氧含量，使用或未用通过搅动提供的搅拌和空气或氧的递送。营养源可以包括作为碳源的葡萄糖和其他糖或短链脂肪酸，氨基酸或氨及其用于氮的盐，以及微量金属成分和维生素。在发酵过程中，可以将至少一种现有的和新的发酵生长组分加入发酵批次中，并且可以收集至少一部分发酵批次，以产生生物质。
根据发酵需求和操作参数，收集大约5％至约95％的批次(模块32)，并且残余的发酵液是用于下一批次的接种物。这个过程对应于“重复”或“取出和补足(draw and fill)”过程。此时，将来自收集约5％至约95％批次的输出物离心，形成浓缩浆液或湿饼，随后是根据这个非限制性实例中所需的产物类型，从各自的模块34、36和38中所示的优选滗析离心开始的三个加工阶段。应当理解滗析离心使用离心力，将浆液中的固体材料与液体分离。不同的离心技术可以替代滗析离心用于脱水，如碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心。它们是针对大规模加工设计的。除了其他浓缩技术，如过滤，重力滗析和其他离心技术可以用于将生物质脱水。
在第一个顺序中，离心后，只将第一遍通过的生物质裂解(模块40)。还进行了洗涤(模块42)，如在离心过程中，并且在裂解和洗涤后，作为实例，将其喷雾干燥(模块44)，并且作为从洗涤得到的纯化β-葡聚糖包装(模块46)。以下描述了洗涤过程，并且可以根据所用的细胞裂解技术而改变。为了裂解细胞，可以使用各种机械破坏设备、化学物质或其他专门的裂解操作。在第二个可能的顺序中，离心后(模块36)，将生物质裂解(模块48)并喷雾干燥(模块50)，以针对细小裸藻裂解物来包装(模块52)。在第三个可能的顺序中，离心后(模块38)，将其喷雾干燥(模块54)并以干燥的细小裸藻生物质包装(模块56)。
如以下更详细解释的，裂解物或全细胞材料组合物可以包括发酵过的材料，包括发酵器中的藻类细胞外部的那些组分，并且包括在由此形成的组合物中。所述组合物可以包括一些培养基和维生素，即使许多成分已经在发酵过程中被消耗。这可以包括包含金属和β葡聚糖的组合物，其中所述金属可以是锌。所述组合物可以包括含有蛋白质和氨基酸、脂质、矿物质(如锌)、代谢产物、维生素和β-葡聚糖的生物质裂解物。细胞片段和其他组分的这种组合可以给予终产品更多的有利特性。发酵器中的生物质外的那些组分可以变成裂解物产品和组合物的一部分，用于各种和可能的膳食、医学和化妆品用途中有利的和有用的益处。
现在解释起始种子驯化(模块22)，可理解的是，开始异养培养的第一步是准备培养基。种子驯化可以从斜面、平板、冷冻培养物或其他培养物储存机构启动。从50毫升开始在烧瓶中多次传代扩大至三升或更多，可以用于制备用于种子容器和起始种子驯化的培养物。
完成种子驯化处理后，可以进行种子发酵。在生产规模环境中，典型的是具有至少一个种子容器，将培养物传代至逐渐增大的种子容器中，接着使用最大的生产发酵设备。种子容器的目的与种子驯化相同：最大化生物质累积。种子容器过程通常是分批发酵过程，但在一个实例中包括一些或全部培养基组分的无菌补料。其可能需要通风和一些混合来防止生物质沉淀。
在生产规模环境中，最终发酵罐通常是最大的容器并且可以是整个设备输出中的限制性步骤。生产发酵容器的目的是产生有价值的分子。在这个阶段使用的培养基可以包括不同的组分，并且可以产生另外的培养基的变化和改变。与种子驯化和整体种子发酵相比，所述方法的这个阶段不仅累积了额外的生物质，而且还将优化副淀粉生产。对于细小裸藻加工存在几个发酵选择。这些包括：(1)分批；(2)补料-分批；(3)重复-分批；和(4)连续发酵。
1.在分批中，在接种前加入培养基。分批发酵的其他处理可以是通风、混合、温度控制和用于pH控制的酸/碱组分。
2.在补料-分批中，可以在发酵批次中连续或在分开的时间添加另外的培养基。补料材料可以是完整的培养基配方、选定的组分或起始批次培养基中没有包括的新组分。可以存在多次补料，其可以在发酵过程中的任何时间开始、停止并具有可变的给料速率。补料-分批发酵的其他处理可以是通风、混合、温度控制和用于pH控制的酸/碱组分或所列的任意组合。
3.重复-分批(重复-取出)过程是分批发酵。然而，在一批结束时，与收集整个发酵器的标准分批发酵相比，可以收集一部分发酵物。可以将新灭菌的培养基加入发酵器中的残余培养物中。重复分批可以允许高于种子容器可递送的接种量。另外，罐周转期(停工期)和/或非生产期可以缩短。种子罐通常是启动重复-分批系列必需的，但不是每一批都需要的，这降低了种子驯化工作量。重复-分批发酵的其他处理可以是通气、混合、温度控制和用于pH控制的酸/碱组分或所列的任意组合。
4.在连续发酵中，如图2中所示，可以将灭过菌的培养基组分或从初始培养基选定的组分或初始培养基中未列出的组分的物流加入发酵过程中，同时收集发酵器或发酵罐的连续冲洗物。将发酵维持在装载容积，并且在进口营养物和出口收集物流速率之间保持生物平衡保持。这种发酵过程从未完全收集，并且允许不间断的收集体积和最小的罐周转。连续发酵的其他处理可以是通气、混合、温度控制和用于pH控制的酸/碱组分的使用或所列的任意组合。
图2中的连续发酵过程与重复-补料分批发酵相似，除了连续发酵(模块28a)替代重复-补料分批发酵(图1中的模块28)。此外，使用连续发酵时，不存在收集5至95％的批次(图1中的模块32)并且替代的是收集存储，以从发酵罐收集连续的排出物(模块32a)。
存在多种技术来生产所需的生物质。优选的技术是通过滗析离心接着喷雾干燥来机械地脱水。可以使用不同的离心技术，如碟式离心、锥板离心、推料离心或去皮离心。喷雾干燥步骤可以产生流动性粉末，其可以加热以降低微生物的生物负荷。另外，在喷雾干燥前，可以将生物质浆液加热，以降低最终材料中的微生物生物负荷。还可以将生物质螺带干燥、盘式干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、真空螺带干燥、折射窗干燥、真空鼓式干燥或通过本领域技术人员已知的其他技术干燥。
认为裸藻生物质的完整裂解物对于组合物是有利的，因为其可能具有增强的生物利用率和其他功能益处。干燥的裂解物是优选的细小裸藻生物质的干燥形式，其中细胞膜，或更具体地是菌醭(pellicle)已经被裂解或破坏。应当理解裂解物可以源自裸藻属的任何物种。裂解可以通过机械或化学途径发生。在非限制性实例中，机械细胞裂解可以通过在高于500barg的压力下的均质来进行，包括500至1900barg和700至1000barg的靶范围。工业规模下的可替换方法是使用珠磨机来机械裂解。化学裂解的非限制性实例是从氢氧化钠(NaOH)或其他强碱(如氢氧化钾(KOH))的裂解。在一个非限制性实例中，为了破坏细胞，可以用约0.05至约2wt％浓度或至高于7.0pH的NaOH在高于5℃的温度下处理3至350克/升(g/L)浓度的生物质浆液，并且更优选50至175g/L。实例温度范围可以为50至70℃。这种温度和碱用量的组合破坏了细胞，而不需要机械力。裂解形式比完整细胞形式存在更高的β-葡聚糖和其他代谢产物的生物利用率。所得到的干燥的裂解物材料可以具有2-500微米的平均颗粒大小。更具体地，平均颗粒大小可以为5-125微米。
生产干燥的生物质裂解物的优选技术是机械破坏浓度为3至350g/L生物质的培养液，并且更优选50至175g/L生物质。在高于500barg的压力下使用均质机，这已经经过测试并且显示出在均质和产生游离的β-葡聚糖颗粒中是有效的。运行均质机的实例范围可以为约500至1,900barg和更优选，750至1,000barg，而所述方法不需要另外的化学物质或添加剂来裂解生物质。可替换地，可以使用珠磨机替代均质机来机械裂解生物质。所得到的裂解物材料没有洗涤或分离并且通过喷雾干燥处理进行干燥，以保存所有存在的固体和非挥发性的、可溶性成分。作为喷雾干燥的替换，裂解物材料还可以是螺带干燥、盘式干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、真空螺带干燥、折射窗干燥或真空鼓式干燥的。可以使用本领域人员已知的其他干燥技术。除了具有增益价值的细胞所产生的材料或具有健康益处的细胞组分，这种方法产生了从生物质中游离出来的含β-葡聚糖的材料。还存在用于从其生产纯化的副淀粉的不同技术和选项。
I.机械破坏
生产干燥的纯化的β-葡聚糖的优选技术是机械破坏浓度为3至350g/L生物质的培养液，或更优选，50至175g/L生物质。均质机可以在高于500barg的压力下使用，其已经经过测试并且显示出在均质以及产生游离的β-葡聚糖颗粒中是有效的。运行均质机的实例范围可以为约500至1,900barg和更优选，750至1,000barg，而所述方法不需要另外的化学物质或添加剂来裂解生物质。可替换地，可以使用珠磨机替代均质机来机械裂解生物质。可以用水洗涤裂解的材料，以除去细胞组分。可以使用碱、酸、水或其组合来进行另外的洗涤。碱，例如，氢氧化钠(NaOH)可以以0.05至2.0wt％浓度或至高于7.0的pH加入裂解的浆液中。可以使用其他碱，如氢氧化钾(KOH)和氢氧化铵(NH4OH)，作为非限制性实例。可以用水或0.05至2.0wt％苛性碱(NaOH)溶液完成另外的洗涤。酸洗涤是可以的。例如，可以加入0.05至1.0wt％的硫酸或pH在2.0至10.0并且优选3.0至5.0的溶液。酸洗涤后可以进行最终的水洗涤。其他可能的酸可以包括盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)和柠檬酸(C6H8O7)作为非限制性实例。还可以通过使用乙醇和使用以上处理的任意组合来完成洗涤。β-葡聚糖浆液或饼应当在每个洗涤步骤之间脱水。脱水可以在重力静置后用离心或滗析来进行。所得到的洗涤过的β-葡聚糖浆液或饼可以喷雾干燥。可替换地，所述材料可以通过螺带干燥机、真空螺带干燥机、鼓式干燥机、盘式干燥机、冷冻干燥机、折射窗干燥机、真空干燥机来干燥，或通过本领域技术人员已知的其他技术来干燥。
II.表面活性剂
生产纯化的β-葡聚糖的第二种技术涉及用浓度为0.2至2.0wt％的表面活性剂(如十二烷基硫酸钠(SDS))处理浓度为3至350g/L生物质和更优选50至175g/L生物质的培养液。将这种溶液加热至约50℃至约120℃，目标温度为约100℃，持续至少30分钟。在SDS的存在下，这种加热步骤破坏了细胞膜，使得胞内副淀粉晶体颗粒游离。
使浆液重力滗析约4至24小时，同时晶体颗粒沉淀至反应器/滗析罐的底部。将浓缩的底部泵出，用于另外的加工，并且将剩余的液体送至废水处理。可替换地，可以将材料离心，替代重力滗析，除去大量液体。可以使用不同的离心技术，如碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心。基于食品级硅氧烷的消泡剂，如Tramfloc或Xiameter以高于20ppm加入，更具体地，可以使用200至400ppm来降低由SDS引起的泡沫。如果使用，可以在SDS/热处理之前或之后加入消泡剂。可以用水洗涤所得到的材料。可以将所得到的晶体浆液或饼喷雾干燥。可替换地，所述材料可以通过螺带干燥机、真空螺带干燥机、鼓式干燥机、盘式干燥机、冷冻干燥机、折射窗干燥机、真空干燥机来干燥，或通过本领域技术人员已知的其他技术来干燥。
III.天然油表面活性剂
生产纯化的β-葡聚糖的第三种技术涉及用约0.2至约5.0wt％含量的产自天然油的表面活性剂处理浓度为3至350g/L生物质并且更优选50至175g/L生物质的培养物，所述表面活性剂如源自椰子油中的脂肪酸的椰油酰甘氨酸钠或N-椰油酰-L-丙氨酸钠(ACS12)。将这种溶液加热至约50℃至约120℃，当前目标为约100℃，持续至少30分钟。在N-椰油酰-L-丙氨酸钠或椰油酰甘氨酸钠的存在下，这种加热步骤破坏了细胞膜，使得胞内副淀粉晶体颗粒游离。可以根据所用的确切表面活性剂，将时间、温度和浓度参数精细化。
使浆液重力滗析约4至24小时，同时晶体颗粒沉淀至反应器/滗析罐的底部。将浓缩的底部泵出，用于另外的加工，并且将剩余的液体送至废水处理。可替换地，可以将材料离心，替代重力滗析，除去大量液体。可以使用不同的离心技术，如碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心。可以添加消泡剂。实例消泡材料是基于食品级硅氧烷的消泡剂，如Tramfloc或Xiameter消泡剂可以用于降低由表面活性剂引起的泡沫。如果使用，可以在表面活性剂/热处理之前或之后加入消泡剂。实例用量范围包括高于20ppm的含量，更具体地200至400ppm。可以用水洗涤所得到的材料。可以将所得到的晶体浆液或饼喷雾干燥。可替换地，所述材料可以通过螺带干燥机、真空螺带干燥机、鼓式干燥机、盘式干燥机、冷冻干燥机、折射窗干燥机、真空干燥机来干燥，或通过本领域技术人员已知的其他技术来干燥。
源自椰子油脂肪酸的基于氨基酸的表面活性剂是阴离子的并且证明了对于外层皮肤损伤的可能性较低，同时还呈现出同等或更高的清洁能力。这些属性描述于Regan等的题目为“一种新的基于甘氨酸盐的沐浴液(A Novel Glycinate-Based Body Wash)”的论文中，Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology，2013年6月；Vol.6，No.6，pp.23-30，将其公开内容按引用并入本文中。椰油酰甘氨酸钠(SCG)是由N-末端连接的甘氨酸组成，具有天然椰油中的脂肪酸谱，分别含有10、12、16、18:1和18:2的碳长度以及6、47、18、9、6和2的百分比，如来自National Industrial Chemicals Notification and AssessmentScheme，椰油酰甘氨酸钠，EX/130(LTD/1306)，2010年8月中所述的，将其公开内容按引用并入本文中。N-椰油酰-甘氨酸钠和N-椰油酰-L-丙氨酸钠都是椰油衍生的表面活性剂的实例。可以使用源自棕榈油、棕榈仁油和pilu油的表面活性剂，基于大小从C8至C18的脂肪酸的比例和分布，这些油与椰油相似。椰油含有大量的月桂酸(C12)，还含有相当量的辛酸(C8)、癸酸(C10)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)和油酸(C18)。棕榈油、棕榈仁油和pilu油具有与椰油相似的脂肪酸特征，这意味着源自这些油的表面活性剂可以与源自椰油中的脂肪酸的表面活性剂同等有效。这些也可以是SDS的合适替代品。这些脂肪酸作为天然衍生的表面活性剂的范围和含量可以改变。
IV.pH介导的裂解
生产纯化的β-葡聚糖的第四种技术是使用碱化学破坏生物质。非限制性实例是从氢氧化钠(NaOH)或其他碱(如氢氧化钾(KOH))的裂解。在一个非限制性实例中，为了破坏细胞，用浓度为约0.05至约2wt％的NaOH或使pH高于7.0在高于5℃的温度下处理浓度为3至350克/升(g/L)并且优选50至175g/L的生物质浆液。非限制性实例温度范围可以为45至70℃，并且pH范围可以为9.0至12.5。这种温度和碱用量的组合破坏了细胞，而不需要机械力。用碱的第一次处理应当裂解细胞。如果使用太少的碱或温度太低，不可能破坏细胞，而如果使用太多碱和/或温度太高，大部分组分和β-葡聚糖可能进入溶液中。可以用水进行洗涤。可以使用碱、酸或水按顺序或任意组合地进行另外的洗涤，如用酸、碱，并且随后用水洗涤。
可以用水或0.05至1.0wt％的氢氧化钠(NaOH)溶液或pH高于7.0进行另外的洗涤。也可以使用氢氧化钾(KOH)。其他可能的碱包括作为非限制性实例的氢氧化铵(NH4OH)。可以完成酸洗涤。例如，可以加入0.05至1.0wt％的硫酸或可以完成至溶液pH为2.0至10.0并且优选3.0至5.0，并且在酸洗涤后可以进行用水的最终洗涤。其他可能的酸可以包括作为非限制性实例的硝酸(HNO3)、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)和柠檬酸(C6H8O7)。还可以通过使用乙醇和使用以上处理的任意组合来完成洗涤。应当在每个洗涤步骤之间将β-葡聚糖浆液或饼脱水。脱水可以使用离心或重力滗析来进行。可以使用不同的离心技术，如碟式离心、锥板离心、推料离心或去皮离心。可以将所得到的洗涤过的β-葡聚糖浆液或饼喷雾干燥。或者，所述材料可以通过螺带干燥机、真空螺带干燥机、鼓式干燥机、盘式干燥机、冷冻干燥机、折射窗干燥机、真空干燥机来干燥，或通过本领域技术人员已知的其他技术来干燥。
V.酶处理
生产纯化的β-葡聚糖的第五种技术聚焦于酶处理。细胞裂解可以通过机械破坏或以上所述的其他处理来进行，并且生物质浓度可以为3至350g/L，并且更优选，50至175g/L。处理前的细胞裂解也可以是不需要的。可以用酸或碱和能量调节浆液的pH和温度，以满足最佳酶处理所需的条件。非特异性蛋白酶可以用于降解来自细胞的蛋白质。非限制性实例可以是来自Novozymes的2.4L FG。可以用酸、碱、乙醇或水，或其中的任意组合洗涤所得到的酶处理的浆液，以除去酶处理过的组分，并且随后脱水。脱水可以用离心或重力滗析来进行。可以使用不同的离心技术，如碟式离心、锥板离心、推料离心或去皮离心。可以将所得到的β-葡聚糖浆液或饼喷雾干燥。或者，所述材料可以通过螺带干燥机、真空螺带干燥机、鼓式干燥机、盘式干燥机、冷冻干燥机、折射窗干燥机、真空干燥机来干燥，或通过本领域技术人员已知的其他技术来干燥。除了蛋白酶，可以使用其他酶，如脂酶。另一个实例是单独或组合使用的溶菌酶。另外，可能需要酶灭活步骤。可以在处理过程中确定酶处理后洗涤的量，但也可以遵循以上列出的过程。
图3是显示了用于制备纯化的β-葡聚糖的下游过程的流程图。参照图1中流程组成部分的一般描述，使用对应于图1中所示那些的参照数字。发酵过程形成了裸藻生物质(模块28)，将其脱水以浓缩生物质(模块34)。脱水可以包括通过优选的滗析离心或包括碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心的其他离心技术的处理。还可以使用重力滗析。与图1的一次通过处理相同，细胞裂解处理破坏了细胞表膜并且可以使用机械裂解来完成(模块40a)，包括如上所述的优选的均质机或珠磨机。pH介导的裂解(模块40b)可以包括作为优选碱的氢氧化钠(NaOH)，在大约50至70℃下，具有其他可能性和更多处理，包括高于5℃下的KOH，高于5℃下的NH4OH和高于5℃下的其他碱。另一个实例可以包括酶裂解(模块40c)并且可以包括蛋白酶、脂酶、溶菌酶或那些处理的组合。蛋白酶是催化蛋白水解的酶，使用水来水解蛋白质和肽键，而脂酶催化脂质的水解。溶菌酶通常作为糖苷水解酶来使用。
细胞裂解处理的另一个实例包括使用表面活性剂裂解(模块40d)，如使用十二烷基硫酸钠(SDS)(模块40e)或天然油衍生的表面活性剂(模块40f)，包括N-椰油酰-L-丙氨酸钠或N-椰油酰-甘氨酸钠。其他可能的天然油衍生的表面活性剂包括棕榈油的衍生物、棕榈仁油的衍生物、pilu油的衍生物和椰油的衍生物。洗涤步骤(模块42)清洗掉非β-葡聚糖组分并且可以包括通过洗涤的纯化(模块42a)。对于优选的处理，这可以包括添加碱和酸以及水和任意组合，包括氢氧化钠(NaOH)，接着硫酸(H2SO4)和水。纯化可以通过包括蛋白酶、脂酶或组合的酶处理来进行(模块42b)，在处理时可能使用水洗涤。纯化还可以通过用水和基于硅氧烷的消泡剂或组合的洗涤来进行(模块42C)。最终的干燥步骤(模块44)可以包括优选的喷雾干燥或盘式干燥，真空螺带干燥、折射窗干燥、冷冻干燥、螺带干燥、鼓式干燥或真空干燥作为替换方案，以及本领域技术人员已知的其他技术。
图4是显示了用于制备β-葡聚糖裂解物的下游过程的流程图。参照图1中流程组成部分的一般描述,使用对应于图1中所示那些的参照数字。发酵过程形成了裸藻生物质(模块28)，将其脱水以浓缩生物质(模块36)。脱水可以包括通过优选的滗析离心或包括碟式离心、锥板离心、推料离心和去皮离心的其他离心技术的处理。还可以使用重力滗析。细胞裂解处理破坏了细胞表膜(模块48)并且可以使用机械裂解来完成(模块48a)，包括如上所述的优选的均质机或珠磨机。pH介导的裂解(模块48b)可以包括作为优选碱的氢氧化钠(NaOH)，在大约50至70℃下，具有其他可能性和更多处理，包括高于5℃下的KOH，高于5℃下的NH4OH和高于5℃下的其他碱。另一个实例可以包括酶裂解(模块48c)并且可以包括蛋白酶、脂酶、溶菌酶或这些处理的组合。干燥用优选的喷雾干燥进行(模块50)并且可以包括盘式干燥、螺带真空干燥、折射窗干燥和冷冻干燥。
图5是用于制备全细胞细小裸藻的下游处理的流程图。同样，参照图1中流程组成部分的一般描述,使用对应于图1中所示那些的参照数字。发酵过程形成了裸藻生物质(模块38)，将其脱水以浓缩生物质(模块38)。同样，滗析离心是优选操作，并且还可以使用关于图4所述的其他处理。干燥可以用作为优选的喷雾干燥来进行(模块54)，如关于图4所述的，也可以使用适用的其他干燥技术。
β-葡聚糖生产过程的另一个实例显示于图6中的100，并且显示了使用自养、兼养和异养生长技术生产β-1,3-葡聚糖的方法。作为高水平描述，通过培养细小裸藻来产生β-1,3-葡聚糖。用于所述方法的起始培养物可以从起始斜面或其他储存的培养物来源启动。随后使其自养生长。接着通过添加葡萄糖将所述批次转变成兼养生长。随后将兼养材料用于接种异养运行的细小裸藻发酵。
如图6的流程图中进一步解释的，所述过程(模块100)开始(模块101)并且制备起始斜面(模块102)。将细小裸藻种继代培养物在种子瓶中异养生长(模块106)，将继代培养部分返回给新的大玻璃瓶。
细小裸藻种继代培养物异养生长后，无菌添加葡萄糖(模块118)，将其转移至兼养种子瓶中(模块120)。自养生长的细小裸藻种继代培养物现在兼养生长约7至约30天，并且随后用于接种发酵罐，在那进行异养发酵约4至约7天(模块122)。这个异养发酵过程进行约4至约7天，产生富含β-葡聚糖的细小裸藻。取出细小裸藻生物质，并且通过离心脱水(模块128)，接着在烤箱中干燥(模块130)。将生物质饼在约80℃至120℃下干燥。一旦干燥，可以将材料磨碎和研磨(模块132)，接着筛选和真空包装(模块134)，接着巴氏杀菌(模块136)。巴氏杀菌温度范围可以改变，并且在一个实例中，可以为约160℃，并且运转不少于2小时。巴氏杀菌后，产品可以包装用于人或动物使用(模块138)。此外，离心物，如水(模块140)，可以作为废物处理(模块142)。
现在参照图7，裂解组合物递送系统200包括胶囊214，其含有作为如图1中所述的方法产生的裂解物216的终产物。胶囊200可以从常规的上下胶囊部分214a和214b形成。然而，其他递送机制，如片剂、粉末、乳液、凝胶、液体溶液和液体悬浮液也是可以的。
如作为取自胶囊内的材料的裂解物216的终产物的放大部分所示的，胶囊材料216不仅含有直链、未分支的β-葡聚糖220，而且还含有来自发酵罐的形成增强组合物的其他材料。这些组分可以包括脂质222，蛋白质和氨基酸224，代谢产物226，矿物质如锌228和维生素230，和其他增值的、细胞产生的组分和细胞材料。因此，在一个实例中，这种组合物包括另外含有来自产生裸藻裂解物的发酵批次的细胞组分和剩余的残余培养基的裸藻裂解物。所述组合物还可以包括各种添加的金属组分，如锌。对于金属组分的实例范围，包括锌，为0.1至10wt％。
在一个实例中，在单剂量胶囊中递送组合物。一些β-葡聚糖组分可以包括一条或多条β-葡聚糖聚合物链并且分子量可以从低如1.2kDa至高如580kDa之间改变，并且具有范围从低如7至高如3,400个葡萄糖单位的聚合物长度，作为一条或多条聚合物链。β-葡聚糖聚合物可以单独存在或以高阶实体存在，如三螺旋物和其他分子间键合的结构，取决于发酵或加工条件。例如，对于用上述方法产生的裂解物，平均颗粒大小范围可为2.0至500微米。更具体地，平均颗粒大小可以为5-125微米。这个范围可以根据所用的加工参数和干燥技术而改变。可以包括在裂解组合物内的其他组分包括类胡萝卜素，如α-和β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素和玉米黄素。可以包括氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他脂质、维生素和矿物质包括花生四烯酸、生物素、钙、铜、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、脂肪、叶酸、铁、亚油酸、亚麻酸、镁、锰、烟酸、油酸、棕榈油酸、泛酸、磷、钾、蛋白质、钠、维生素B1、B2、B6、B12、C、D、E、K1、锌或其盐，以及来自裸藻的残余组分，包括以上未列出的其他细胞组分和获自发酵的添加的培养基。
补充剂的范围可以改变。例如，作为用于人食用的膳食补充组合物，所述组合物范围可以为50至6,000mg/kg食品或约50mg至2,000mg作为胶囊剂量。这些含量可以根据最终用途而改变，并且甚至用于其他用途时可以改变更多。在某些实例中，这可以包括动物使用。
下面给出针对不同裂解物组分的范围列表。这些范围是针对所产生的裂解物并且不包括添加至裂解物中的其他组分，例如，锌。这些非限制性实例是针对裸藻裂解物中鉴定的组分或化合物的近似重量百分比。
表1：维生素和矿物质
维生素和矿物质(<2％)
表2：蛋白质和氨基酸
表3：脂肪
表4：其他组分
所期望的来自葡聚糖补充剂的响应可以改变。例如，可溶的和颗粒的β-葡聚糖具有引发的超越免疫调节的生物效应。对于抗微生物、抗病毒、抗肿瘤、抗纤维化、抗糖尿病和抗炎响应以及产生以益生元(prebiotic)形式的微生物菌群(microbiome)、保肝、降血糖、降低胆固醇、伤口愈合、骨髓创伤和辐射和鼻炎缓解作用，存在证据支持。所提及的生物活性由葡聚糖引起并且随后在病毒和细菌感染、癌症、冠心病、肝病、血液疾病、糖尿病、低血糖、创伤、皮肤衰老、异常骨髓生成、关节炎、微生物菌群缺陷、溃疡疾病和辐射暴露的治疗中具有潜在应用。另外，在人类健康的范围之外，β葡聚糖在动物工业中具有潜在的应用。β葡聚糖可以通过允许牲畜通过免疫调节以最佳速率生长来对抗生长速率遏制，如商业中常见的疾病和环境挑战，从而潜在地提高生长性能。除了之前对于人类提及的可能同义的益处，β葡聚糖可以特异性地在对抗重要动物疾病中提供预防方法，所述动物疾病的非限制性实例如猪呼吸与生殖综合征(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDv)、新城疫和家禽流行性感冒。另外，β葡聚糖可以对真菌感染产生的毒枝菌素具有吸收效应。这表示通过最初具有杀真菌活性或清除动物中由毒枝菌素污染的饲料摄入引起的毒枝菌素累积预防毒枝菌素产生的可能。
在其他天然食物和治疗方法中添加β葡聚糖衍生的产品可以观察到协同作用，所述天然食物和治疗方法包括紫锥菊、芦荟、金印草、人参、大蒜、甜椒、姜、姜黄、银杏、猫爪草、灵芝或黄芪。可以进一步与维生素C以及可能的腐殖酸和富里酸混合。还可以将葡聚糖和白藜芦醇或其他多酚混合，并且用于治疗心脏病和可能的癌症。
根据之前的描述和相关附图中呈现的教导的益处，本领域技术人员将获知本发明的许多改变和其他实施方案。因此，将理解本发明不限于所公开的特定实施方案，并且打算将所述改变和实施方案包括在所附权利要求的范围内。
Claims (37)
1.一种组合物，其包含：
具有约2.0至500微米颗粒大小的裸藻(Euglena)裂解物；和
来自产生裸藻生物质和裸藻裂解物的发酵过程的细胞组分以及剩余的残余培养基。
2.根据权利要求1的组合物，进一步包含金属或其盐。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述金属包括锌。
4.根据权利要求1的组合物，其中将组合物配制成单剂量胶囊。
5.根据权利要求1的组合物，其中残余培养基包含矿物质、维生素、糖和氨基酸中的至少一种。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述矿物质和维生素选自生物素、钙、铜、叶酸、铁、镁、锰、烟酸、磷、钾、钠、锌和维生素B1、B2、B6、B12、C、D、E、K1或其盐。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞组分包含脂质、蛋白质和氨基酸。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述脂质选自花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、脂肪、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸和泛酸，或其任意组合。
10.根据权利要求1的组合物，进一步包含类胡萝卜素。
11.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物包含膳食补充组合物。
12.根据权利要求1的组合物，其中将所述组合物配制成用于动物或人类的食品添加剂。
13.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞组分包含一条或多条具有1.2至580千道尔顿(kDa)分子量的β-葡聚糖聚合物链。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述β-葡聚糖聚合物链具有7至3,400个单位的聚合物长度。
15.一种用于生产裸藻裂解物的方法，其包括：
从裸藻属生物体生长生物质；
将生物质裂解；和
将裂解的生物质干燥，形成裸藻裂解物。
16.根据权利要求15的方法，包括将金属加入裸藻裂解物中。
17.根据权利要求15的方法，其中所述裂解是选自机械、pH和温度驱动的。
18.根据权利要求17的方法，其中所述机械裂解包括均质或珠磨。
19.根据权利要求18的方法，包括在高于500barg的压力下将生物质均质。
20.根据权利要求18的方法，包括在500至1,900barg的压力范围下将生物质均质。
21.根据权利要求17的方法，包括在高于7.0的pH和高于5℃的温度下裂解生物质。
22.根据权利要求21的方法，进一步包括用碱处理生物质，并且在高于9.0的pH和高于45℃的温度下裂解生物质。
23.根据权利要求15的方法，其中将所述生物质生长或浓缩至3至350克/升(g/L)的浓度。
24.根据权利要求15的方法，进一步包括在裂解前将生长的生物质脱水。
25.根据权利要求24的方法，其中所述脱水包括将生物质离心或重力滗析。
26.一种用于生产纯化的β-1,3-葡聚糖的方法，其包括：
从裸藻属生物体生长生物质；
将生物质裂解，形成裂解的生物质；
将裂解的生物质洗涤和脱水，产生β-1,3-葡聚糖；和
将β-1,3-葡聚糖干燥，产生纯化的β-1,3-葡聚糖。
27.根据权利要求26的方法，包括将裂解的生物质洗涤和脱水多次。
28.根据权利要求26的方法，其中所述裂解是选自机械、pH和温度驱动的、表面活性剂和酶裂解。
29.根据权利要求28的方法，其中所述机械裂解包括均质或珠磨。
30.根据权利要求29的方法，包括在500至1,900barg的压力范围下将生物质均质。
31.根据权利要求28的方法，包括在高于7.0的pH和高于5℃的温度下裂解生物质。
32.根据权利要求28的方法，其中裂解包括用源自脂肪酸的、并且包含椰子油、棕榈油、棕榈仁油和pilu油中的至少一种的表面活性剂处理生物质。
33.根据权利要求28的方法，其中裂解包括用源自脂肪酸的并且包含椰子油、棕榈油、棕榈仁油和pilu油中的至少一种的酰基-氨基表面活性剂处理生物质。
34.根据权利要求26的方法，包括通过用水、酸、碱、乙醇或组合中的一种或多种处理裂解的生物质来洗涤裂解的生物质。
35.根据权利要求26的方法，其中所述干燥选自喷雾干燥、螺带干燥、盘式干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、真空螺带干燥、折射窗干燥和真空鼓式干燥。
36.根据权利要求26的方法，其中将生物质生长或浓缩至3至350克/升(g/L)的浓度。
37.根据权利要求26的方法，进一步包括在裂解前将生长的生物质脱水。
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