CN1642986A - 来自生物量的细胞壁衍生物和其制品 - Google Patents

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Abstract

第一方面，本发明涉及从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法。根据此方法，可获得几丁质聚合物或几丁质－葡聚糖共聚物。另一方面，本发明涉及从几丁质中制备壳聚糖的方法。本发明还涉及几丁质聚合物、几丁质－葡聚糖共聚物和壳聚糖聚合物，它们可根据本发明方法获得。此外，本发明涉及在医学、药学、农业、营养保健品保健品、食品、纺品、化妆品、工业和/或环境应用中使用几丁质聚合物、几丁质－葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物，它们可根据本发明方法获得。

Description

来自生物量的细胞壁衍生物和其制品
发明的技术领域
第一方面，本发明涉及从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法。另一方面，发明涉及从几丁质中制备壳聚糖的方法。本发明还涉及几丁质聚合物、几丁质-葡聚糖共聚物和壳聚糖聚合物，它们可根据本发明方法获得。此外，本发明涉及在药学、医学、农业、营养保健品、食品、纺织品、化妆品、工业和/或环境应用中使用几丁质聚合物、几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物，它们可根据本发明方法获得。
发明的背景
天然多糖如淀粉、纤维素或几丁质具有极大的技术重要性，因为它们易于大量获得且它们具有通常合成聚合物所没有的独特的特性。例如，真菌细胞壁特征是由多糖、蛋白质、脂类的网络组成，其多糖链的主要组分是β-葡聚糖和几丁质。
几丁质是自然界中广泛存在的天然高分子量聚合物，事实上是继纤维素之后的第二种主要生物聚合物。几丁质是一种多糖，其结构接近于纤维素。它是昆虫和甲壳类角质层的主要成分，也是一些真菌和其它微生物的细胞壁成分。壳聚糖是通过化学修饰几丁质以产业化水平产生的，它天然见于一些微生物体中。几丁质是经β(1.4)糖苷键连接的N-乙酰-(D)-葡糖胺聚合物，可由结构I表示。壳聚糖是N-乙酰-(D)-葡糖胺和(D)-葡糖胺的随机共聚物，可由结构II表示。几丁质和壳聚糖是粘多糖聚合物家族的组成组分。
与纤维素类似，几丁质是一种纤维状多糖，具有其它化学和生物性能，可用于许多产业和医学应用。然而，几丁质提取更难，因为通常见到的是其天然结构，结构中它与其它物质紧密相结合。
壳聚糖可通过组分水解N-乙酰-葡糖胺单元的乙酰基团来制备，从而使此聚合物在大多数酸性稀释溶液中变得可溶。壳聚糖可从提取自生物量几丁质的聚合物获得。它由两种分子特征所确定：即平均分子量和乙酰化程度，即沿着聚合物主链的乙酰化葡糖胺单元的比例。
结构式I：几丁质
结构式II：壳聚糖
Figure A0380594700062
产业化生产几丁质和壳聚糖一般利用甲壳类的壳废物，例如螃蟹或虾壳。2个步骤可分离几丁质，即通过酸处理脱钙和通过碱处理除去蛋白质，然后用热的浓碱溶液脱乙酰步骤。然而，产自甲壳类生物量的几丁质通常含高水平的矿物质，主要是碳酸钙，其量可高达几丁质干重的90％。因此几丁质和壳聚糖的质量常常不能重复且取决于季节变化和甲壳类种类。脱乙酰方法是一种降解方法，壳聚糖通常具有高度不同的分子量和乙酰化程度，使得使用者开发产品更困难。此外，高生产成本对大量热能和大量氢氧化钠的需求以及几丁质与碳酸钙分离所需的广泛酸处理，碳酸钙的量可高达几丁质干重的90％。
然而存在另一种几丁质和壳聚糖来源，例如真菌，其细胞壁可含高达40％壁干重的几丁质和壳多糖。真菌菌丝体是由细胞组成的复杂丝状网络。菌丝体细胞壁由半纤维素、几丁质和β-葡聚糖组成。可以选择含足够量几丁质的真菌并特殊培养用于提取几丁质。此外，工业发酵过程的副产品如真菌或酵母发酵后收集的生物量也含有与其它生物聚合物相结合的几丁质，这类其它生物聚合物主要是葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和脂类。这些发酵副产品一般从培养基分离后立即烧掉，因为储存它们经济上不合算。
为了使几丁质和壳聚糖尽可能有更多的用途，它们的质量应该均一和纯净。因此从纯几丁质生产壳聚糖是此领域的一个实质性进步，几丁质应有以可再生方式大量得到且应含少量无机和蛋白质杂质。
关于除甲壳类以外的其它几丁质和壳聚糖来源，此领域不很广泛。一些专利和专利申请称真菌菌丝体是潜在的几丁质工业来源，例如美国专利号4,960,413、6,255,085、4,195,175、4,368,322、4,806,474、5,232,842、6,333,399和专利申请WO 01/68714、GB-A-458,839、GB-A-2,026,516、GB-A-2,259,709、DE-A-2,923,802 et RU-C-2,043,995。大组分这些文献公开了从真菌菌丝体制备壳聚糖或壳聚糖-葡聚糖的方法。此外，这些方法描述了直接转化真菌细胞壁中所含几丁质，而没有分离和纯化几丁质的中间步骤。因此这些专利和专利申请中所述方法不能分离得到纯几丁质作为纯壳聚糖的来源。在这些方法中，采用了高浓度碱溶液和严格的温度及持续条件，这再次带来高污染风险。另外，这些破坏性加工可能产生很低分子量的几丁质衍生物和壳聚糖，不能用于生产较高分子量的壳聚糖。
其它文章描述了对一些真菌细胞壁结构的基础研究，例如Hartland等.(1994)Yeast 10，1591-1599；Hong等.(1994)Yeast 10，1083-1092；Hearn等.(1994)Microbiology 140，789-795；Fontaine等.(2000)Journal of BiologicalChemistry 275，27594-27607。这些研究一致推断细胞壁主要由几丁质和β-葡聚糖组成，2种聚合物链紧密相连，在大组分真菌中可能通过共价键相连。这些研究中的一些提到利用特异酶来选择性降解细胞壁成分，即葡聚糖酶和几丁质酶，来进一步鉴定剩余糖以可能估计初始的多糖组成。本发明的总目标是提供一种改进的方法从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物。本发明的一个具体目标是提供分离几丁质或几丁质-葡聚糖聚合物的方法。本发明的另一个目标是提供制备壳聚糖的方法。
发明的又一个目标是分离几丁质聚合物和快速加工后制备壳聚糖，此种加工不需消耗高能量或不产生对环境有害的化学物。
本发明的另外一个方面是提供分离纯几丁质聚合物和从非动物来源制备壳聚糖聚合物的方法，适合于多种领域的应用。
本发明也旨在提供高纯度的几丁质聚合物。此外，本发明的另外一个目标是提供几丁质-葡聚糖共聚物，其中几丁质和β-葡聚糖的量可调节。本发明还旨在提供高纯度并且乙酰化程度和分子量可控制的壳聚糖。
发明概述
第一方面，本发明涉及从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法，该方法包括下列步骤：
a)使所述生物量接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留含所述细胞壁衍生物的碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得酸化的碱不溶组分的悬浮液，碱不溶组分含有所述细胞壁衍生物，
c)使碱不溶组分的所述酸化悬浮液接触β-葡聚糖酶，从而获得所述细胞壁衍生物。
本发明此方法处理的真菌或酵母生物量由真菌或酵母细胞组成，其细胞壁包含几丁质。另外，所述生物量也可以是工业培养过程的副产品，此过程中采用了真菌或酵母培养物。
本发明提供的方法避免了现有方法的主要缺点。更具体说，本发明提供的几丁质分离方法，比现有方法和来源更有经济和环境优点。更具体说，本发明公开了以可以控制方法从β-葡聚糖中分离几丁质而不会降解或转化几丁质链的方法。
在一个较佳实施方案中，本发明涉及一种方法，其中步骤c)获得的所述细胞壁衍生物是几丁质聚合物或富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物。更具体说，本发明涉及从真菌或酵母生物量中分离几丁质的方法以获得基本没有其它多糖如β-葡聚糖的几丁质聚合物。
术语“几丁质聚合物”所指几丁质聚合物包含80％以上的几丁质和不到20％的β-葡聚糖，优选90％以上的几丁质，甚至更优选95％以上的几丁质。
术语“富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物”所指的聚合物包括几丁质聚合物以及一些相对量的葡聚糖聚合物，但几丁质的量相对高于葡聚糖。本本发明的方法能特定调节这些几丁质-葡聚糖共聚物中几丁质和葡聚糖的量。共聚物中几丁质的量可通过控制本发明方法中酶水解步骤的条件来调节。因此本发明提供获得含有纯度可控制的几丁质的共聚物的方法，。术语“含有纯度可控制的几丁质的聚合物”指其中几丁质的量可通过葡聚糖酶以可控制方式调节的一种聚合物产品。在一个较佳实施方案中，所述富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物中几丁质的量可调节，优选75％以上甚至更优选80％以上。
在另一个较佳实施方案中，本发明涉及的方法中步骤a)或b)获得的所述细胞壁衍生物是几丁质-葡聚糖共聚物，该共聚物中的几丁质对葡聚糖的相对量取决于所用的生物量。如本文所用，术语“几丁质-葡聚糖共聚物”所指的共聚物在真菌或酵母生物量提取后但在用葡聚糖酶的酶反应前获得。所述几丁质-葡聚糖共聚物中几丁质的量由它提取自的生物体所确定。在一个较佳实施方案中，黑曲霉(Aspergillus niger)菌丝体用于本本发明的方法中，提取自黑曲霉菌丝体的几丁质-葡聚糖共聚物含有30-50％(w/w)之间的几丁质和50至70％之间的β-葡聚糖。
本文所用的术语“几丁质”和“几丁质聚合物”意义相同。另外，本文所用的术语“壳聚糖”和“壳聚糖聚合物”意义相同。
第二方面，本发明涉及从几丁质制备壳聚糖的方法，该方法包括下列步骤：
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留含部分脱乙酰几丁质的所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得酸化的碱不溶组分的悬浮液，碱不溶组分含有所述部分脱乙酰几丁质，
c)使所述酸化组分接触几丁质脱乙酰酶，从而获得所述壳聚糖。
在此方面，本发明提供制备壳聚糖的方法，通过几丁质与几丁质脱乙酰酶的酶促脱乙酰反应获得乙酰化程度可控制的高分子量壳聚糖。在此方面，本发明也提供制备壳聚糖的方法，从而可获得乙酰化程度可控制的低和中等分子量壳聚糖。
术语“低和中等分子量”指平均分子量低于100kDa，通过乌氏毛细管粘度法测度。术语“高分子量”指平均分子量高于100kDA，通过乌氏毛细管粘度法测度。
术语“乙酰化程度可控制的壳聚糖”指一其中乙酰化程度即N-乙酰-葡糖胺单元的比例以可控制方式调节的产品。
在一个较佳实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述几丁质是真菌或酵母几丁质，通过本发明从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法获得。由于此几丁质来源含很高纯度，本发明可制备的壳聚糖也具有高纯度。另外，本发明也提供乙酰化程度可调节的壳聚糖，因为乙酰化程度可通过控制本方法中的酶促脱乙酰条件来调节。
另一方面，本发明涉及从真菌或酵母几丁质制备壳聚糖的方法，该方法包括下列步骤：
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液，从而获得酸不溶组分和酸可溶组分，弃去所述酸不溶组分并保留含壳聚糖的所述酸可溶组分。
在此方面，本发明提供制备具有低和中等分子量的壳聚糖的方法。此方法包括获自真菌或酵母生物量的几丁质碱水解反应，。术语“低和中等分子量”指平均分子量低于100kDa，如以上所定义。
另外一方面，本发明涉及用本发明方法获得的几丁质聚合物。
此外，本发明也涉及富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物，可通过本发明的方法获得。
本本发明还涉及可通过根据本发明方法获得的壳聚糖聚合物。
本发明另一方面涉及含有用本发明方法获得的几丁质聚合物、富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物的组合物材料。
又一方面，本发明涉及在医学、药学、农业、营养保健品、食品、纺织品、化妆品、工业和/或环境应用中使用本发明方法获得的几丁质聚合物、富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物。
本领域技术人员从下面提供的详细描述和实施例中将会很快理解本方法的许多其它效果和优点及本发明最终用途的多种可能性。
附图的详细说明
图1代表碱不溶组分的固态13C-NMR谱，碱不溶组分含有碱消化真菌生物量后获得的纯化几丁质-葡聚糖共聚物，根据本发明分离细胞壁衍生物方法的第一个步骤。计算的几丁质-葡聚糖比例为41∶59(w/w)。
图2代表碱不溶组分的X光散射研究，碱不溶组分在碱消化真菌生物量后获得，根据本发明分离细胞壁衍生物方法的第一个步骤，其几丁质-葡聚糖比例为38∶62±3(w/w)。
图3代表按照本发明分离细胞壁衍生物方法第一步骤，碱消化真菌生物量后获得的碱不溶性组分的X光散射研究，其几丁质∶葡聚糖比例为85∶15±8(w/w)
发明详述
分离细胞壁衍生物的方法
发明第一方面揭示从真菌和酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法包括上述步骤。
在一个较佳实施方案中，本发明涉及的方法特征在于所述细胞壁衍生物是几丁质聚合物。如本文所用，术语“聚合物”指高分子量物质，它们是由一种或几种单体单位重复组成的链混合物。一般，聚合物由至少3个单体单位组成。单体单位是构成聚合链的重复单位。术语“几丁质聚合物”所指的聚合物由至少3个单体重复单位β(1，4)-N-乙酰-(D)-葡糖胺组成，优选10个以上，甚至更优选20个以上单体单位。几丁质聚合物是单体β(1，4)-N-乙酰-(D)-葡糖胺单位经共价β(1-4)糖苷键相连的链(状物)。
本发明提供一种能够提取真菌和酵母菌丝体所含几丁质的方法。现有技术反复显示在大组分酵母和真菌细胞壁中，几丁质经共价键与其它聚合物相结合，例如与β-葡聚糖类多糖相结合，从而形成典型的纤丝结构。这就是为什么难以从真菌和酵母生物量中提取几丁质并以纯化形式收集的原因。为获得几丁质链，而使几丁质链与其它聚合链分离，优选通过非降解方法。本发明揭示的方法可几丁质与其它聚合物主要包括β-葡聚糖相分离，而会不降解几丁质链。
几丁质可获自非动物生物量，特别是获自几种茴类的真菌或酵母菌丝体的细胞壁，包括接合菌(Zygomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)、子囊菌(Ascomycetes)和半知菌(Deuteromycetes)和/或它们的混合物，优选子囊菌。曲霉菌(Aspergillus)和酵母样酵母(Saccharomyces)属于后一菌类。在一个较佳实施方案中，本发明涉及的方法特征在于所述生物量选自的菌类包括但不限于丝状真菌或酵母，如曲霉菌、青霉菌(Penicillium)、木霉菌(Trichoderma)、酵母和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)种，可食用蘑菇如伞菌(Agaricus)、Pleurotus、牛肝菌(Boletus)和Lentinula种和/或它们的混合物。这些真菌和酵母的一个共同特征是它们的细胞壁中存在几丁质。在一个更佳实施方案中，所述生物量获自黑曲霉菌。
在另一个较佳实施方案中，所述方法的特征在于所述生物量是采用真菌或酵母培养物作培养过程中获得的副产品。真菌菌丝体能在经基因工程改造的真菌培养物中收集，用于产业化生产化合物例如柠檬酸、酶和抗生素。几丁质可提取自这些培养副产品的细胞壁。在一个较佳实施方案中，所述方法的特征在于所述生物量是采用黑曲霉培养物用于获得柠檬酸的培养过程的副产品。
本本发明的方法包括使所述生物量接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留含所述细胞壁衍生物的所述碱不溶组分。用于消化真菌或酵母生物量的碱溶液是碱的水溶液，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵，优选氢氧化钠或钾。在一个较佳实施方案中，所述碱溶液的浓度低于10％(w/v)。碱浓度范围优选在0.1至15％(w/v)之间，更优选低于10％。反应进行的温度范围优选5-120℃之间，更优选温度低于60℃。生物量在碱溶液的悬浮液中反应，浓度范围优选1-15％(干重，w/v)之间，更优选3-12％之间。反应优选进行4-48小时，更优选少于30小时。第一个提取步骤可去除碱可溶化合物，包括色素、蛋白质、一些脂类和一些多糖。
在另一个较佳实施方案中，生物量可在第一种碱溶液中处理，过滤并再次在第二种碱溶液中处理。可在碱性悬浮液中采用添加剂以改进碱不溶产物的提取。这种添加剂可包括但不限于有机溶剂如环己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇；防泡剂如structol；表面活性剂如十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温或poloxamers；或酶制品，含羧酸酯酶、羧酸脂水解酶或三酰甘油脂肪酶(都与EC 3.1.1.3同义)。
对于生物量细胞壁的碱不溶产物的分离，第一步后重复用水洗涤的步骤，接着过滤和干燥，此碱不溶产物在许多真菌和酵母生物量中是几丁质-葡聚糖共聚物。对于分离几丁质聚合物，第一步后重复用水洗涤，接着进行下述方法的其余步骤。
本本发的方法中第二步骤包括使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得酸化的碱不溶组分(含细胞壁衍生物)的悬浮液。
上述最后一个过滤步骤后，将碱不溶产物悬浮于水中以获得优选在1-8％(w/v)间的浓度，更优选1-5％之间。然后加入酸溶液调节碱不溶产物的水悬浮液pH至低于7.0。酸溶液优选酸的水溶液，例如盐酸、乙酸、蚁酸、乳酸、谷氨酸、天冬氨酸或乙醇酸，优选乙酸。此步骤优选在5-60℃之间的温度进行，更优选低于30℃。
本发明方法中第三个步骤包括使所述酸化碱不溶组分接触β-葡聚糖酶，从而获得所述细胞壁衍生物。在一个更佳实施方案中，此方法的特征是β-葡聚糖酶选自内-β(1，3)-葡聚糖酶、外-β(1，3)-葡聚糖酶、β(1，3)(1，4)-葡聚糖酶、β(1，6)-葡聚糖酶或它们的混合物。甚至更优选将酶混合物加入酸化碱不溶组分的悬浮液以水解与几丁质相结合的β-葡聚糖链。β-葡聚糖酶活性可容易地在一些公司供应的商品化β-葡聚糖酶制品中发现。水解反应宜在5-60℃之间的温度进行，更优选低于40℃。反应持续时间优选少于5天。
优选的制品主要包含β-葡聚糖酶活性，优选低或没有几丁质酶活性。可采用商业上可购买到的酶制品，它们提取自生物体例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)、节杆菌Luteus、青霉菌emersonii、青霉菌funicolosum、腐殖菌insolens、黑曲霉、木霉菌harzanium、木霉菌longibrachiaum。所述制品可获自如NovoZymes、Erbsloh、Roche或Lyven公司。为了水解提取自真菌菌丝体细胞壁多糖的β-葡聚糖链，优选的酶制品包含下列β-葡聚糖酶活性：内-β(1.3-1.4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)；内-β(1.3)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)；外-β(1.3)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)；内-β(1.6)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)；和/或β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21，β-D-葡糖苷葡糖水解酶)。在下面提供的实施例3中，阐述了一些可用于本发明方法的商业酶制品。
在一个较佳实施方案中，本发明涉及的方法特征在于所述细胞壁衍生物是富含几丁质的的聚合物(即几丁质聚合物或富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物)。方法中获得的不溶组分主要包含大分子几丁质链，其与一定量的残留寡聚或大分子β-葡聚糖链相连。几丁质与葡聚糖的比例不难通过控制反应条件，主要通过所用的β-葡聚糖酶制品和反应持续时间来调节。在一个更佳实施方案中，本发明涉及的方法特征在于几丁质的相对量可调节，优选80％以上，更优选90％以上，甚至更优选95％以上。几丁质的相对量可通过固态13C-NMR测定。所述富含几丁质的的不溶组分也可能含有残留的蛋白质、脂类和碳水化合物。
在本方法的下步骤中，任选在水解反应结束时加入第二种碱溶液，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵溶液，优选氢氧化钠或钾。此步骤优选在20-80℃之间的温度进行，更优选低于70℃，持续时间优选为30分钟到3小时，更优选少于2小时。第二次碱处理可分离待完成的几丁质和β-葡聚糖，从而分离得到几丁质。
为产生几丁质聚合物，此过程宜持续的复洗涤步骤，然后是干燥步骤。
另一方面，本发明涉及可用本发明方法获得的几丁质聚合物。本发明所述方法有几个优点。此方法可提取到组分或完全与β-葡聚糖链相分离的纯几丁质，。相反，其它方法直接产生壳聚糖、几丁质-葡聚糖或壳聚糖-葡聚糖产物。
在一个较佳实施方案中，该几丁质聚合物含有80％以上的几丁质，优选90％以上的几丁质，甚至更优选95％以上的几丁质。
此外，本发明从真菌或酵母生物量所获得几丁质的结晶指数低于获自甲壳类壳的几丁质聚合物。在一个较佳实施方案中，该几丁质聚合物的结晶指数低于80％，更优选低于70％，甚至更优选低于65％，其中几丁质获自黑曲霉生物量。结晶指数可用Struszczyk等.的方法(J.Appl.Polym.Sci.，1987，33：177-189)计算。
在另一个实施方案中，本发明涉及的富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物，可根据本发明方法获得。在一个较佳实施方案中，所述富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物具有可调节量的几丁质，优选80％以上。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明方法具体在酶水解步骤前获得的几丁质-葡聚糖共聚物，。在一个较佳实施方案中，几丁质获自黑曲霉生物量，酶水解步骤前获得的所述几丁质-葡聚糖共聚物包含的几丁质量优选在30-50％之间。
此外，本方法不会诱导几丁质链降解，与其它采用浓碱溶液的方法相反。本提取方法不需要使用破坏性表面活性剂，也不需要酸性化合物。本方法产生可再生来源的几丁质，例如真菌或酵母生物量，它们是替代甲壳类壳的另一种有价值来源。另外，此方法所用的碱溶液可在提取加工过程中再循环使用。
制备壳聚糖的方法
另一方面，本发明涉及制备壳聚糖的方法。本发明公开的方法制备的壳聚糖经第1步加工具有较高分子量，经第2步加工具有较低分子量。
在一步加工中，本发明涉及从几丁质制备壳聚糖的方法，包括下列步骤
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去所述碱可溶组分并保留含部分脱乙酰几丁质的所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得酸化的碱不溶组分的悬浮液，该碱不溶组分含所述部分脱乙酰的几丁质，
c)使所述酸化碱不溶组分的悬浮液接触几丁质脱乙酰酶，从而获得壳聚糖。
此方法中制备壳聚糖的几丁质来源可包括甲壳类来源的几丁质或者真菌或酵母来源的几丁质。在一个较佳实施方案中，所用几丁质来源是真菌几丁质或酵母几丁质，可通过上述本发明的方法获得。
根据制备壳聚糖的此方法，几丁质用浓碱溶液处理，从而几丁质链能膨胀并且进一步促进几丁质脱乙酰酶接近几丁质底物。优选的碱溶液是氢氧化钠或钾溶液，所用量使碱与几丁质的重量比例范围在2-25之间，优选在10-25之间。为避免几丁质链降解和促进溶胀几丁质水凝胶形成，碱浓度优选尽可能高。在一个较佳实施方案中，所述碱溶液的浓度高于40％(w/v)。反应在50-120℃的温度进行。在一个较佳实施方案中，步骤a)所进行的温度在50-120℃之间，更优选在80-120℃之间。在另一个较佳实施方案中，步骤a)进行的时间在30-180分钟之间，优选30-120分钟之间。步骤a)中获得的碱不溶组分被悬浮，随后稀释、过滤并用水充分洗涤。
优选在第1个步骤后所用的碱溶液收集、浓缩、再循环和再用于上述本发明的几丁质分离方法。
然后，使所得悬浮的碱不溶组分接触酸溶液，从而获得含部分脱乙酰几丁质的酸化组分。将悬浮液的pH值调至低于7.0，更优选低于4.8，通过加入酸调节，例如盐酸、乙酸、蚁酸、谷氨酸、邻苯二甲酸，优选蚁酸。此步骤在室温发生。
随后使获得的所述酸化组分接触几丁质脱乙酰酶。优选使用毕赤巴斯德酵母菌产生的重组几丁质脱乙酰酶，该酵母菌已用携带编码毛霉菌rouxil几丁质脱乙酰酶的DNA序列的表达载体转化。重组几丁质脱乙酰酶(rCDA)与几丁质的比例范围优选在0.5-10mg/g几丁质之间，更优选在0.5-5mg/g之间。脱乙酰酶水解反应优选在15-50℃的温度下进行，更优选在20-40℃之间，持续时间少于120小时，直到达到所需的残留乙酰化葡糖胺单元的比例。
重要的是应注意此酶促步骤在酸性条件下进行。该酶促步骤的pH值优选低于5.0，甚至更优选在3.5-4.5之间。在此低pH值时意外地获得良好的酶促脱乙酰作用，虽然重组脱乙酰酶的最佳pH值在5.0-5.5之间。在低pH值，此酶保持了活性且酶促脱乙酰反应可在更短时间内有利地进行。因此用于CDA酶的反应条件与重组CDA酶稳定性和活性的最佳条件不相对应。事实上，虽然CDA酶在60℃的最佳条件下有活性，pH优选低于5.0，更优选在4.0-5.0之间，但本步骤在不同条件下进行而不会损害此酶的活性。
在另一实施方案中，本本发明的方法包括进一步步骤，即包括沉淀所述获得的壳聚糖。因此，过滤此悬浮液以去除非脱乙酰几丁质链，将pH值调至7.0以上，通过加入碱如氢氧化钠、钾或铵来调节。随后过滤沉淀的化合物、洗涤，干燥以产生氨基形式的壳聚糖，或在酸溶液中重溶并冷冻干燥。例如，可将沉淀的化合物溶于盐酸、乙酸、柠檬酸、蚁酸、乳酸、谷氨酸、天冬氨酸、乙醇酸、苯甲酸、山梨酸(2，4-hexadienoic)、草酸、苹果酸、丙醇二酸、抗坏血酸、月桂酸或棕榈酸、或任何其它无机或有机酸、或任何其它多元酸例如透明质酸或聚丙烯酸。
此酶促方法可从真菌或甲壳类来源的几丁质中回收更高分子量的壳聚糖，通过仔细选择几丁质脱乙酰酶反应的条件，例如反应的pH或持续时间，也能控制乙酰化量终程度在所需值。
在本发明的另一个较佳实施方案中，也可采用在毕赤巴斯德酵母菌中表达毛霉菌rouxil的重组几丁质脱乙酰酶(rCDA)来延伸真菌或甲壳类来源的壳聚糖的脱乙酰化，而不会损失分子量。
例如，可使粘度计分子量为500,000Da且乙酰化程度为19mol％的壳聚糖与聚合物浓度为0.5g/l蚁酸溶液(1N)中的rCDA在pH3.8室温反应6小时。随后宜通过加入碱如氢氧化钠、钾或铵，将溶液的pH提高到7.0之上，以促进壳聚糖沉淀，优选过滤取得壳聚糖，然后洗涤并干燥。在此例子中，乙酰化最终程度为10mol％，分子量不改变。
本本发明制备壳聚糖的酶促脱乙酰方法可有利的产生高度脱乙酰的壳聚糖，不会损失分子量且没有损失物质，不需分级分离聚合物链。由于产生重组几丁质脱乙酰酶的方法是用于大体积批次发酵的方法，可被酶转化的几丁质和壳聚糖的量以成本效率很高且环境安全的方式合用于工业生产和所得高度脱乙酰壳聚糖的应用。
在第2个过程中，本发明涉及从真菌或酵母几丁质制备壳聚糖的方法，包括下列步骤：
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去所述碱可溶组分，保留所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液，从而获得酸不溶组分和酸可溶组分，弃去所述酸不溶组分并保留含壳聚糖的所述酸可溶组分。
在一个较佳实施方案中，所用几丁质来源是真菌几丁质或酵母几丁质，可通过上述本发明的方法获得。
制备低分子量壳聚糖的方法包括高温下的强碱反应。将碱如氢氧化钠、钾、锂或铵，优选氢氧化钠或钾加入几丁质悬浮液中，例如碱与干几丁质块的重量比例范围优选在1-20(w/w)之间，更优选1-15(w/w)之间。可用添加剂来最大程度减少几丁质链的降解，例如硼氢化钠、苯硫酚，也可加入有机溶剂如甲醇、乙醇。
优选在第1个步骤后收集所用的碱溶液、浓缩、再循环和再用于上述本发明几丁质分离方法中。
然后，分离和悬浮所得碱不溶组分。在一个较佳实施方案中，所述步骤在80℃以上的温度下进行。悬浮液优选放置在温度范围在80-140℃之间，更优选100-120℃之间，反应发生的持续时间范围优选在30-300分钟之间，更优选少于240分钟。
过滤取得碱不溶组分并用水洗涤。然后溶于稀释的酸溶液中，例如盐酸、乙酸、蚁酸，优选浓度为0.1-1N的乙酸。过滤去除碱不溶组分。
在另一实施方案中，本方法包括进一步的步骤，此步中使所述酸可溶组分该组分接触碱溶液来沉淀的壳聚糖。该酸可溶组分的pH优选用碱溶液提高到8.0以上，如浓氢氧化钠或铵溶液。过滤沉淀的化合物，用水反复洗涤并干燥。所得化合物是氨基形式下的壳聚糖。在一个例子中，可获得的壳聚糖乙酰化程度为14％，粘度计分子量为20kDa(由毛细管测粘法测定)。
在另一实施方案中，壳聚糖盐也可获自该酸可溶组分。因此，通过加入碱溶液沉淀该酸可溶组分，如氢氧化钠或铵。过滤沉淀的化合物，用水反复洗涤然后溶于酸溶液中，接着冰冻干燥此酸溶液。可将沉淀的化合物溶于盐酸、乙酸、柠檬酸、蚁酸、乳酸、谷氨酸、天冬氨酸、乙醇酸、苯甲酸、山梨酸(2，4-hexadienoic)、草酸、苹果酸、丙醇二酸、抗坏血酸、月桂酸或棕榈酸、或任何其它无机或有机酸、或任何其它多元酸例如透明质酸或聚丙烯酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明方法获得的壳聚糖聚合物。
在一个较佳实施方案中，本发明涉及具有可调节分子量的壳聚糖聚合物。取决于脱乙酰反应的方法和条件，可获得具有低、中等或高分子量的壳聚糖。所述壳聚糖的分子量优选在10-1000kDA之间，如乌氏毛细管测粘法测定。
在另一个较佳实施方案中，本发明涉及脱乙酰程度可调节的壳聚糖聚合物。取决于脱乙酰反应的方法和条件，可调整乙酰化程度，范围优选在0-40mol％之间。
工业应用
本发明提供来自非动物来源的几丁质聚合物和富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物，它们可通过本发明的方法获得。
本发明的几丁质-葡聚糖共聚物，获自本发明方法酶促水解步骤之前，包括β-葡聚糖链组分，该共聚物的结构和组成由它提取自的生物体所确定。在一个较佳实施方案中，几丁质-葡聚糖共聚物提取自黑曲霉菌丝体，主要包括几丁质和β-(1，3)(1，4)和β-(1，3)葡聚糖链。根据本发明，这些聚合物中的几丁质和葡聚糖量可进一步调节，这取决于酶水解所用的具体条件，以获得富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物。
可通过本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物提供了令人感兴趣的性能，使它们适用于所有种类的应用。这些产物的主要优良特征包括它们的伤口愈合性有和它们的螯合活性。
同样非动物的壳聚糖可通过本发明的方法获得。优点是能从很纯的几丁质获得很纯的壳聚糖。另外，可控制的酶促脱乙酰方法能获得高分子量且同时脱乙酰程度可调节(低)的壳聚糖。同样，由于真菌或酵母生物量的可利用性相对不受限制，从而能以可再生和可调节方式制备大量壳聚糖。优点是，当采用甲壳类聚糖来源时，这种生产不受季节变化影响。
当在不同应用中采用动物来源的壳聚糖时，遇到一些问题。例如，在营养保健品应用中，这种壳聚糖不适用于素食者，可引起对甲壳类产品的过敏，需要相应标示该食品产品。在化妆品应用中，这种壳聚糖可能引起过敏而趋向于使用非动物产品。因此，本发明方法获得的非动物壳聚糖提供了这些情况的解决方法。
本发明方法获得的壳聚糖具有一些令人感兴趣的性能，包括阳离子电荷、可生物降解性、无毒性、螯合性、伤口愈合、保湿性。此外，本发明的壳聚糖不诱导过敏反应且可提供抗真菌和抗微生物活性。
本发明获得的几丁质和壳聚糖产物可以多种形式使用，这取决于它们在不同系统中的应用。壳聚糖聚合物可以例如以铵盐形式使用，作为不同无机和有机酸的稀释溶液，例如但不限于盐酸、乙酸、柠檬酸、蚁酸、乳酸、谷氨酸、天冬氨酸、乙醇酸、苯甲酸、山梨酸(2，4-hexadienoic)、草酸、苹果酸、丙醇二酸、抗坏血酸、月桂酸或棕榈酸、或任何其它无机或有机酸、或任何其它多元酸例如透明质酸或聚丙烯酸。这些溶液中的壳聚糖浓度优选以所需粘度的功能选择。因此根据本发明，也可获得含有有本发明几丁质或壳聚糖产物的不同粘性程度的溶液，。
本发明获得的壳聚糖产物也可以水凝胶形式使用。这种水凝胶可用本领域已知方法制备，例如但不限于制备浓缩溶液，与阴离子(大)分子形成复合体如藻酸盐、肝素(heparine)、黄原胶或果胶，化学交联或在壳聚糖和其它(大)分子间形成共价键。这类产物也可以热可逆性水凝胶形式使用。
本发明获得的几丁质和壳聚糖产物还能以薄膜形式使用。例如，根据本发明方法制备的高分子量，壳聚糖可能具有改进的薄膜形成性质并能因此提供更稳定的薄膜。也可能制备多层膜或含有与其它聚合物相结合的壳聚糖的物质。
此外，本发明获得的几丁质和壳聚糖产物还能用于生产多孔薄膜或多孔物体，孔大小可通过应用本领域技术人员已知方法来控制。
在另一个实施方案中，本发明获得的几丁质和壳聚糖产物可以微米、毫米或纳米颗粒形式提供，可通过本领域技术人员已知技术获得(如参见《聚合生物材料》(Polymeric Biomaterials)，S Dimitriu ED，Marcel Dekker，2002，第1章)。本发明获得并以颗粒形式提供的壳聚糖产物可具有多种应用可能性，包括包裹物质、生物体或活性分子如种子、细胞、色素、香料、有气味物质、药物、疫苗、生物活性(抗菌或抗真菌)制剂、酶。壳聚糖包裹的颗粒中能够固定、保护、运输或以控制方式释放活性物质。
本发明的几丁质-葡聚糖共聚物基本上不溶于任何溶剂，尽管它们是亲水的，因此适合以粉末、纤维或冻干形式使用。
在本发明的又一个实施方案中，提供的组合物材料包括几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物，它们可用本发明的方法获得。本发明的真菌来源的几丁质聚合物或壳聚糖聚合物可与一种或多种其它物质混合使用。例如可与其它聚合物混合，该混合物可以上述形式之一使用，以赋予新的性能或协同性能。
可将本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物与低分子量分子混合。与其它物质组合时，如果该物质带负电荷，本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物也适合作为复合制剂，或者适合作为控释药物或活性剂的基质，或者适合作为化妆品成分如色素、香味或有气味物质的基质。
可将本发明方法获得的壳聚糖聚合物与疫苗混合，其中它们适合作为佐剂。也将几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物与无机物质混合，例如陶土，优选磷酸钙，从而可能产生适用于支持组织再生如软骨或骨的基质。
本发明的另外一个实施方案涉及几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物的衍生物，它们可通过根据本发明的方法获得。几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物能根据本领域技术人员已知技术进行化学修饰以获得衍生物。这种化学修饰可例如在D-葡萄糖、N-乙酰-D-葡糖胺或D-葡糖胺单位的一个或多个功能基团上实施，例如在位置6的氧原子或N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺位置1中α碳的氮原子上进行。
可将本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物应用于多种产品和系统中，优选用于医学、药学、农业、营养学、食品、纺织品、化妆品、工业和/或环境应用中。
在一个较佳实施方案中，本发明的壳聚糖聚合物可在药物制备中用作赋形剂。它们可用于兽医以及人类医学应用中。本发明也涉及一种含有本发明壳聚糖聚合物的药物组合物。为将壳聚糖能用于药物形式中，该化合物需要可控制的和可重复的分子量分布、乙酰化程度、低的和可重复水平的杂质。根据本发明的方法，可能获得具这种特征的化合物。
几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物无抗原性，生物相容性极佳。此外，它们可通过酶水解生物降解，例如在溶菌酶存在时。由于它们的抗凝血酶原和止血特征，它们可用于所有医学领域。因此，可将本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物应用于伤口愈合系统。也可将本发明方法获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物用于防止伤口中形成纤维蛋白、防止疤痕形成、支持细胞再生。几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于组织工程、细胞移植和细胞包裹。由于这些产物可形成空气能渗透的薄膜，它们可支持细胞再生，同时保护组织不受微生物侵袭。它们也可用于制作缝线、绷带，优选制作可降解的缝线和绷带。本发明方法获得的壳聚糖聚合物还适合生产造工皮肤和重建组织和器官的系统和/或移植细胞。例如，几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于整形外科或畸齿矫正中的骨修复系统，用于修复皮肤、角膜、视网膜、软骨或用于重建器官如胰腺、胃和神经系统。
本发明的壳聚糖聚合物也适用于接触透镜、防止眼干燥的组合物，在修复视网膜剥脱和黄斑再生的装置中和手术辅助中以局部水凝胶形式用作眼泪替代物、眼药的局部运载体、用作眼内局部递送的微粒或水凝胶系统。
由于具有优良的生物粘附性能，本发明的壳聚糖聚合物可用作手术辅助抗粘附剂，例如防止手术中组织之间的粘附。由于优良的粘膜吸附性能，它们也可用作疫苗的佐剂。
可将本发明获得的壳聚糖聚合物进一步用作植物、动物和人中运输和缓释活性化合物的载体。关于药物的口服形式，当包裹的产物必须没有改变地到达小肠时，特别适合采用壳聚糖聚合物，因为此产物不被胃消化。可将壳聚糖制成颗粒，从而给予更多的口服和肠胃外控释应用机会。壳聚糖可通过化学修饰和结合药物或其它生物功能分子，提高口服运载效率，。由于壳聚糖聚合物具有优良的薄膜和胶形成性能，它可用于生产透皮膜。与外表皮肤层的良好接触需要其粘膜吸附性能。壳聚糖也可用于制备新的药物递送系统，用于局部和全身给药如阴道、口腔和肠胃外途径给药。
可将本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物用作形成片剂、粉末颗粒，制造凝胶和薄膜，制备乳剂中的赋形剂，也可作为保湿和包衣剂。壳聚糖的一些更原始性能也可用于口服药物递送系统，如它提供药物控释基质的能力、其生物粘附性能、薄膜形成性能、与阴离子药物和阴离子聚合物形成复合物的能力。因此，它们可用于药物系统以改进水溶性差的药物的溶解、形成水凝胶以提高药物透过粘膜组织的吸收、加强疫苗的免疫应釜。
在另一个实施方案中，可将本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物进一步应用于农业和农业化学系统。当应用于新鲜水果、蔬菜和农作物时，它们可作为防腐性包衣和生物杀真菌剂或作为肥料，从而增加有用的土壤微生物数量并减少有害微生物的数量。可将植物种子浸泡在壳聚糖水溶液中以防止微生物感染和提高植物产量。可将根据本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物用于溶液、粉末或种子包中。在低含量即约几毫克/每立方米水时，几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于激发植物防御机制抵抗寄生虫感染和侵袭。除了抗真菌性能外，几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于加强植物根系和增厚植物茎干。也可将本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物用于刺激植物合成保护剂。此外，它们可用于加速植物萌芽和生长。在农业-食品部门，它们可用于包被种子、肥料或杀虫剂。
由于它们的薄膜形成性能，本发明的壳聚糖聚合物可用作杀虫剂的添加剂以提供杀虫剂更好的接触和更好的渗透。另外，将杀虫剂与少量本发明的几丁质或壳聚糖混合可能适合于减少所用杀虫剂的量。
在另外一个实施方案中，本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物还特别适用于营养保健品和食品应用。几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物可用作食品添加物，具体说，壳聚糖聚合物可用作营养保健品学中的食品成分。由于壳聚糖聚合物不被人体消化，它们适合起着类似纤维的作用，纤维是饮食中的重要元素。由于壳聚糖聚合物携带阳离子电荷，它们能结合负电荷脂类，而适合捕浮消化道中的脂质。另外，壳聚糖聚合物可应用于营养保健品品以获得降低血胆固醇的效果。
此外，本发明的壳聚糖聚合物可用作天然食品添加剂以获得抵抗广泛范围的食品-携带的真菌、酵母和细菌的抗微生物和抗真菌活性。另外，它们可用作常规食品防腐剂的辅佐剂，作为抗褐变剂(browing agent)、作为适合水果/蔬菜储存的气体可渗透食用薄膜成分，作为增稠、稳定或乳化剂，作为触变剂或作为天然。此外，本发明的壳聚糖聚合物可用于食品加工，它们可例如用作起泡剂、增稠或稳定剂。由于壳聚糖聚合物的凝血和絮凝能力，它们也可应用于饮料，如葡萄酒、啤酒和果汁的净化加工。此时它们能沉淀使这些饮料混浊的化合物。
在食品工业的另一方面，壳聚糖聚合物也可用于制备食用薄膜和包被以延长新鲜或加工食品的保存限期。真菌壳聚糖聚合物可能直接应用于水果和蔬菜，可延长保存限期、更好控制水果/蔬菜腐烂和延迟成熟。壳聚糖聚合物适合作为水果和蔬菜的抗褐变剂，它们可有利地用作替代亚硫酸盐，亚硫酸盐是目前可得到的最有效褐变抑制剂，尽管怀疑它可引起不利于健康的作用。
另外一方面，可将本本发明的壳聚糖聚合物的抗微生物和抗真菌活性用于食品工业，以保护肉、甲壳类(牡蛎)、水果、蔬菜和终产品，单独应用或协同联用常规防腐剂，例如亚硫酸盐或苯甲酸钠。当联用其它防腐剂时，可用壳聚糖聚合物来最大程度减少达到抑制效果所需的防腐剂浓度。
在又一个实施方案中，可将本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物进一步用于纺织品应用。例如，可将壳聚糖聚合物以薄膜形式能应用于纺织品纤维，用其溶液浸渍所述纤维或组织。这样做，通过施加几丁质或壳聚糖，可改变纤维或纺织品的性质，这种纤维或纺织品可具有抗菌特征。医用纺织品品也可用本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物浸渍而适合治疗伤口作用的系统。
在化妆品应用中，本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于适合护理皮肤的组合物、化妆组合物或牙膏中，如适用于皮肤的面霜，护理头发如喷雾、洗发精和护发素。它们还可应用于抗UV组合物、除臭剂制备、口腔卫生组合物和色素包裹组合物中。本本发明所述方法获得的非动物来源几丁质或壳聚糖能使其消除过敏风险。
在环境应用中，可将本发明获得的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物用作为螯合剂，如重金属络剂。几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于水纯化技术中捕浮重金属，或它们可用于饮用水系统以分离有机化合物和重金属。它们也可通过沉淀某些废物和捕获污染物如DDT和聚氯苯用于处理水，。另外，它们也可用于适合固定自由基的应用。
此外，本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物可用于纸的生产过程。在此过程中，它们可替代一些氨基取代物如树脂或聚合多糖，它们适用于减少所用的化学添加剂并提供改进的输出。用本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物生产的纸具有更平滑的表面且表现出更好的抗湿性。另外，也可用本发明的几丁质聚合物、(富含几丁质的)几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物来生产卫生纸、包装纸和纸板。
实施例
实施例1 碱消化黑曲霉菌丝体
此实施例阐述了本发明从真菌生物量中分离细胞壁衍生物方法的第1个步骤。以生物量为用黑曲霉制备柠檬酸培养过程的副产品而获得，。
在此例子中，收集含71％水的995g生物量与含2升水和93g氢氧化钠反应，室温培养达到3.4％(w/v)的生物量终浓度。此例子中，NaOH的终浓度为10.6％(w/v)，NaOH与生物量(干重)的比例为32％。26小时后，过滤混合物收集残留生物量的不溶组分，反复洗涤直到获得中性pH。在此例子中，不溶组分的干重为145g。通过固相13C-NMR分析此组分显示主要获得几丁质和葡聚糖聚合物的混合物。此例子中，几丁质与葡聚糖的比例为52∶48±15(w/v)，用固态13C-NMR谱计算。
不溶的分中的几丁质含量通过分析该不溶组分经几丁质酶和壳二糖酶水解后释放的N-乙酰葡糖胺，按照Jeuniaux(“Chitine et chitinolyse：un chapitre debiologie moleculaire”1963，Masson，Paris，181)和Reissig等.(J.Biol.Chem.，1955，217：959)的方法测定。几丁质含量也可通过核磁共振分析碱消化生物量后获得固态(13C-NMR)碱不溶组分的碳13来测定，。图1代表碱不溶组分的13C RMN谱，其主要含纯几丁质-葡聚糖聚合物。将N-乙酰-(D)-葡糖胺和(D)-葡萄糖单元的碳原子信号去卷积和螯合后，计算，几丁质∶葡聚糖的重量比为41∶59(w/w)。
实施例2 碱消化黑曲霉的菌丝体
此实施例也阐述了本发明从真菌生物量中分离细胞壁衍生物方法的第1个步骤。此生物量为用黑曲霉制备柠檬酸培养过程的副产品而获得。
在此例子中，黑曲霉的菌丝体根据不同条件处理。测定1-4号在10L-反应器中进行，测定5-6号在30L-原型反应器中进行。测定1-5用1步法进行，而测定4’和6号用2步法进行。在测定4’号中，生物量用第1种NaOH溶液(3.4％)处理，随后过滤并再用第2种NaOH溶液(2.8％)处理。在测定6号中，该生物量分成相继的两组分置于反应器中，加入较低量NaOH，然后加入较高量的NaOH。结果见表1。
                                                     表1
   号   m菌丝体(g，干重)    c菌丝体％(w/v)    CNaOH％(w/v)     T(℃)  持续时间(小时)    mF％(w/w)    Ch∶GI比例*(w/w)
   1     289     10.6     3.4     26     25     50     41∶59±3
   2     505     9.2     1.5     25     26     57     N/D
   3     580     10.7     1.5     40     26     57     44∶56±2
   4     313     5.2     1.7     25     24     50     32∶68
   4’     485     10.6     3.4/2.8     25     24/6     40     37∶63
   5     496     2.9     2.0     25     22     49     N/D
   6     446/446     2.9/2.9     2.0/4.0     25     22/18     49     N/D
mF：最终的碱不溶产物与起始菌丝体的比例(干重)
N/D：未测定
*几丁质与葡聚糖的重量比，用13C-NMR测定
在测定4号中应用于收集的碱不溶组分的提取过程，如Folch等所述(1957，JBiol Chem 224：497-509)，显示亲脂化合物量为起始干重的6％。
测定4号中用X光散射研究(Siemens D5000，Cu-Kα，λ＝0.15406nm，2θ＝1.5a30°，fente 1mm，T＝25℃)了收集的碱不溶组分，其几丁质-葡聚糖比例为37∶63(w/w)，显示在2θ＝20°时有大的散射条带(图2)，表明是一种半晶体结构。结晶指数按照Yinhai等，(Chem.Mag.2002，4：27)或Struszczyk等，(J.Appl.Polym.Sci.，1987，33：177-189)所提议的方法计算，作为该化合物中结晶区相对非晶区比例的指标。根据Struszczyk的计算，此几丁质-葡聚糖碱不溶化合物的结晶指数(Crl)为64％，比提取自虾壳的几丁质样品值低得多并以同样条件作X光散射分析(Crl＝87％)。
实施例3 酶活性β-葡聚糖酶制品
此实施例阐述了测试本发明方法所用的几种商品化β-葡聚糖酶制品的优选程离。β-葡聚糖酶活性可从标准曲线定量，该曲线用纯β-葡聚糖酶参考品与标准β-葡聚糖底物反应而建立。例如，为测试EC 3.2.1.6β-葡聚糖酶活性，可使地衣酶(Megazyme)或β-葡聚糖酶(Fluka)与β-葡聚糖底物(Megazyme)反应；为测试EC 3.2.1.39β-葡聚糖酶活性，可使内-β-(1，3)酶(Megazyme，Fluka)与茯苓聚糖或curdlan底物(Megazyme)反应；为测试EC 3.2.1.58活性，可使外-β-(1，3)葡聚糖酶(Megazyme)与海带多糖或schleroglucan底物(Sigma，Megazyme)反应，为测试EC 3.2.1.75β-葡聚糖酶活性，可使β-(1，6)葡聚糖酶与石耳素(Sigma)反应。β-葡聚糖酶活性(U，单位)定义为与标准底物在推荐的pH下37℃培育后，每分钟释放1μmole葡萄糖所需的酶量。
商品化酶制品所含蛋白量可用BCA(二辛可宁(bicinchoninic)酸)方法测定，此法依靠在碱性条件下，蛋白质将Cu(II)离子还原成Cu(I)离子。Cu(I)离子能与BCA形成复合物，其526nm的吸光值与蛋白质浓度成比例(PK Smith等.(1985)Anal.Biochem.150，76)。商品化制品表现出的特异性β-葡聚糖酶活性(U/mg)是酶活性与制品所含蛋白质量的比例。
优先测定于含有上述一种或几种β-葡聚糖酶活性的酶制品(见表2)。在测试过程中，优先研究了所选酶组合水解被消化的黑曲霉菌丝体碱不溶组分β-葡聚糖链的能力。
表2商品化酶制品中发现的β-葡聚糖酶活性(U每mg制品蛋白质)
  制品号  3.2.1.6活性(U/mg蛋白质) 3.2.1.39活性(U/mg蛋白质) 3.2.1.58活性(U/mg蛋白质)
    1     33     0     0
    2     37     0     0
    3     19     0     0
    4     0     20     0
    5     0     22     28
    6     54     0     0
    7     0     17     8
    8     22     0     0
β-葡聚糖酶水解反应优选在本发明碱处理生物量后获得的碱不溶组分的悬浮液中进行，pH优选在4.0-7.0之间，更优选4.5-6.8之间。将β-葡聚糖酶制品的混合物，例如内-β-(1，3)、外-β-(1，3)和内-β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶的混合物加入的悬浮液。为水解提取自黑曲霉生物量的几丁质-葡聚糖的β-葡聚糖链，以每克消化的生物量干重表示的β-葡聚糖酶活性单位范围优选在5-1500U/g之间，更优选在20-500U/g之间。消化的生物量浓度范围优选在0.5-15％(w/v)之间，更优选在2-8％(w/v)之间。反应温度优选低于40℃。水解反应持续时间在1-8天，优选少于5天。
实施例4 从本发的从黑曲霉生物量中分离细胞壁衍生物
此实施例阐述了本发明方法从真菌生物量中分离的细胞壁衍生物。此生物量作为用黑曲霉制备柠檬酸培养过程的副产品而获得。
在此例子中，将含71％水的3.3kg生物量、7.2升水和320g NaOH沉淀室温置于反应器中。26小时后，过滤该混合物收集残留生物量的不溶组分，洗涤3次。收集碱不溶组分并悬浮于4升水中。加入冰乙酸将悬浮液pH调至5.5。为酸化悬浮液，加入13.2g β-葡聚糖酶制品5号(见表2)和8.25ml β-葡聚糖酶制品6号(见表2)。反应在37℃进行4天。随后过滤悬浮液，不溶组分用水洗涤，冷冻干燥，产生34％起始几丁质-葡聚糖的量。对于此例子，该化合物的固相13C-NMR谱显示存在几丁质和残留的β-葡聚糖聚合物，几丁质∶葡聚糖比例为94∶6±14(w/w)。
实施例5 β-葡聚糖酶水解黑曲霉生物量的几丁质-葡聚糖组分
此实施例阐述了本发明从真菌生物量中分离细胞壁衍生物的方法中所进行的β-葡聚糖酶水解反应。
在此例子中，β-葡聚糖酶水解反应在不同条件下进行，采用不同量的商品化β-葡聚糖酶制品2、5和6号(见表2)，反应持续时间为5天。待水解的起始化合物是冷冻干燥的几丁质-葡聚糖偶联物，根据上述方法提取自黑曲霉菌丝体，其几丁质与葡聚糖的比例为32∶68(试验1)或38∶62(试验2-7)。结果见表3。
                                               表3
   N°    Ch∶GIo比例(w/w)     mo(g干重)    CCh-GI％(w/v)     酶5(mg/g)      酶6(mg/g)    酶2(mg/g)   mF(％)    Ch∶GIF比例(w/w)
   1     32∶68     2.0     4.4     12.5     27.5     0   37   100∶0±5
   2     38∶62     2.7     8.6     13     28     0   37   85∶15±8
   3     38∶62     1.9     4.2     56     33     0   38   96∶4±22
   4     38∶62     1.9     4.2     29     0     0   48   104∶0±23
   5     38∶62     1.9     4.2     12     33     0   30   105∶0±23
   6     38∶62     1.9     4.2     12     0     160   41   96∶4±21
   7     38∶62     1.9     4.2     6     16     0   46   80∶20±9
mF：最终的碱不溶性产物与起始菌丝体的比例(干重)
Ch∶GIF比例：几丁质与葡聚糖的比例，用13C-NMR测定。
测试2的富含几丁质的碱不溶组分的X光散射研究(Siemens D5000，Cu-Kα，λ＝0.15406nm，2θ＝1.5到30°，fente 1mm，T＝25℃)，其几丁质-葡聚糖比例为85∶15±8(w/w)，显示在2θ＝20°时有大的散射条带(图3)。在此例子中，按照Struszczyk等.(J.Appl.Polym.Sci.(1987)，33，177-189)计算出该化合物的结晶指数为67％，而提取自虾壳的几丁质为87％。
实施例6 从几丁质制备真菌壳聚糖
此实施例阐述了从β-葡聚糖酶水解黑曲霉菌丝体的几丁质∶葡聚糖组分后获得的几丁质制备壳聚糖。
将实施例4中通过β-葡聚糖酶水解获得的4g不溶组分、40g NaOH和40ml水置于120℃1小时。将所得悬浮液悬浮于200ml水，加入乙酸以达到pH3.5。12小时后，过滤溶液并收集过滤物。在此例子中，通过加入氢氧化铵将过滤物的pH调至9.5以促进壳聚糖沉淀。离心后，洗涤并冷冻干燥，获得1g酸可溶组分。此例子中，此化合物的固相13C-NMR谱显示该酸可溶组分是纯的壳聚糖，没有残留的β-葡聚糖链。N-乙酰-D-葡糖胺的比例为14mol％，粘度测定分子量约为20,000Da，通过乌氏毛细管测粘法测量。
实施例7 从几丁质制备真菌壳聚糖
此实施例阐述了从β-葡聚糖酶水解黑曲霉菌丝体的几丁质-葡聚糖组分后获得的几丁质制备壳聚糖。
在此例子中，将实施例4中通过β-葡聚糖酶水解获得的60g富含几丁质的的不溶组分、300g NaOH、6g氢化硼钠和300g水置于120℃1小时。随后离心所得悬浮液，过滤并洗涤直到传导率很低。将不溶组分悬浮于200ml 0.5M乙酸中。12小时后，过滤溶液并收集过滤物。此例子中，通过加入氢氧化铵将过滤物的pH调至9.5以促进壳聚糖沉淀。离心和洗涤后，将酸可溶组分溶于28ml pH3.6的1N HCl中。然后冷冻干燥该溶液，产生6g氯化铵形式的壳聚糖。N-乙酰-葡糖胺的比例为17mol％，粘度法测定分子量约为20,000Da。
实施例8 通过酶促脱乙酰几丁质制备乙酰化程度低的高分子量壳聚糖
在此实施例中，在不同条件下处理虾壳的商品化几丁质以产生壳聚糖。首先，用不同浓度的NaOH强碱溶液和不同的NaOH∶几丁质比例处理几丁质，以使几丁质转变成凝胶形式和诱导N-乙酰-葡糖胺部分脱乙酰成为葡糖胺单元。随后，过滤部分脱乙酰的几丁质、洗涤和重悬浮于pH5.5的邻苯二甲酸钠液(10mM)中产生5％浓度(w/v)的几丁质。接着，加入重组几丁质脱乙酰酶(rCDA)使rCDA∶几丁质比例达到5∶1000，将该悬浮液置于37℃5天。为估计rCDA促进的脱乙酰程度，评估了释放的乙酸。过滤悬浮液，用水洗涤碱不溶组分并干燥。然后将其溶于乙酸溶液中，过滤，然后加入氢氧化铵提高pH以促进壳聚糖链沉淀。接着洗涤沉淀并干燥。测定结果见表4。
                                             表4
  试验     T(分钟)    T(℃)   CNaOH％(w/w)  C几丁质％(w/v)   NaOH∶几丁质(w/w)    mF(％)    DA*(mol％)  方面   DDA**(％)
  1     30   100     30     7     6   100     87   X   ＜10
  2     30   100     40     8     8   76     64   X   ＜10
  3     30   80     50     10     10   75     75   X   ＜20
  4     30   80     50     10     10   88     82   X   ＜20
  5     60   80     50     10     10   45     68   胶   ＞20
  5’     60   80     50     10     10   60     57   胶   ＞20
  6     30   100     50     4     25   46     72   胶   ＜20
  7     30   110     50     10     10   51     53   胶   ＞20
  8     60   110     50     10     10   43     39   胶   ＞20
mF：碱处理后几丁质的量；
*DA：碱处理后几丁质的乙酰化程度；
**DA：与rCDA反应前或后，碱处理几丁质的酸可溶分的乙酰化程度差异(CDA酶反应的效率)
在此例子中，如与rCDA反应前或后DA差异所示，rCDA酶的效率取决于前面的碱处理，主要是NaOH浓度和温度。如此例子的试验5-8中所观察到的，当碱浓度高于50％(w/w)时，几丁质优先为凝胶形式，优选充分的预脱乙酰，以使rCDA催化脱乙酰反应。
实施例9 通过壳聚糖的酶促脱乙酰制备高分子量的壳聚糖
此实施例阐述了通过壳聚糖的酶促脱乙酰制备高分子量和乙酰化程度低的壳聚糖。不同壳聚糖样品的特征在于它们的起始粘度测定分子量(MVo)和乙酰化程度，使壳聚糖样品与重组几丁质脱乙酰酶(rCDA)反应以使乙酰化程度减少到更低值(DAF)。在此系列试验中，反应媒介是1N盐酸(试验1-4)或1N蚁酸(试验5-10)的非缓冲溶液，或者是1N蚁酸与邻苯二甲酸钠(试验10)或谷氨酸盐(试验11)的不同pH缓冲溶液。在此例子中，rCDA与壳聚糖的比例为1∶1000(试验4)或5∶1000。
然后如上述实施例所述通过在高于7.0的pH沉淀回收壳聚糖。试验结果见表5。所有样品最终粘度测定分子量未改变。
                                               表5
  号     DAomol％  MVokDa     Cp％(w/v)      溶液   pH     T(小时)     T(℃)    CCDA(g/kg)    DAF(mol％)
  1     19  500     0.5     HCl 1N   3.8     6     20     5    11
  2     19  500     0.5     HCl 1N   4.6     6     20     5    21
  3     19  500     0.5     HCl 1N   3.6     3     20     5    12
  4     19  500     1.0     HCl 1N   3.8     6     20     1    13
  5     19  500     0.5     蚁酸1N   3.8     6     20     5    12
  6     19  500     0.5     蚁酸1N   3.8     6     50     5    20
  7     17  142     0.5     蚁酸1N   3.8     6     20     5    11
  8     12  225     0.5     蚁酸1N   3.8     6     20     5    10
  9     13  245     0.5     蚁酸1N   3.8     6     20     5    10
  10     19  500     0.5     邻苯二甲酸10M，蚁酸1N   4.6     6     20     5    11
  11     19  500     0.5     谷氨酸10M，蚁酸1N   4.8     6     20     5    14
实施例10 制备含壳聚糖的多孔支持物
本发明方法获得的壳聚糖可用于制备孔大小受一控制的薄膜或多孔物体。
例如，可将标准大小的由水溶性分子(如氯化钠)组成的颗粒与壳聚糖的酸溶液中混合。随后通过溶剂蒸发或冰冻干燥使此壳聚糖基质固体化。洗去颗粒产生孔。
含壳聚糖的多孔基质也可通过加热诱导聚合物/溶剂相分离液体和固体，或液体和液体类型来制备。例如，将壳聚糖溶于溶剂如浓的或稀释的有机酸，例如乙酸或蚁酸，随后在低于该溶剂固化(冻结点)的温度冻结，然后冷冻干燥。在溶剂结晶的位置产生孔，通过液相转化为固相机制在冻结时形成结晶。也可通过使壳聚糖溶于溶剂和非溶剂(二者都能被冷冻干燥)的溶剂混合物诱导从液相转化为液相。溶剂可以是浓有机酸如乙酸或蚁酸。孔的大小和分布取决于聚合物/溶剂相转化的机制。

Claims (30)

1.一种从真菌或酵母生物量中分离细胞壁衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)使所述生物量接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留含所述细胞壁衍生物的所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得含有所述细胞壁衍生物的酸化碱不溶组分悬浮液，和
c)使所述酸化碱不溶组分的悬浮液接触β-葡聚糖酶，从而获得所述细胞壁衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中获得的所述细胞壁衍生物是几丁质聚合物或富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物中几丁质的量可调节，且优选高于80％。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤a)或b)中获得的所述细胞壁衍生物是几丁质-葡聚糖共聚物，其几丁质与葡聚糖的相对量取决于所用的生物量。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱溶液浓度低于10％(w/v)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物量选自接合菌、担子菌、子囊菌和半知菌和/或它们的混合物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物量是用真菌或酵母培养物培养过程中可获得的副产品。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，β-葡聚糖酶选自内-β-(1，3)-葡聚糖酶、外-β-(1，3)-葡聚糖酶、β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶、β-(1，6)-葡聚糖酶或它们的混合物。
9.一种从几丁质制备壳聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去碱可溶组分并保留含部分脱乙酰几丁质的所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液以获得含有所述部分脱乙酰几丁质的酸化碱不溶组分的悬浮液，和
c)使所述酸化碱不溶组分的悬浮液接触几丁质脱乙酰酶，从而获得壳聚糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中还有一步骤包括沉淀所述获得的壳聚糖。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述几丁质是根据权利要求1-8中任一项所述方法可获得的真菌几丁质或酵母几丁质。
12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱溶液的浓度高于40％(w/v)。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，碱溶液与几丁质量的比例在5-25(w/w)之间。
14.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤a)在温度50-120℃之间。
15.一种从真菌或酵母几丁质制备壳聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)使所述几丁质接触碱溶液，从而获得碱可溶组分和碱不溶组分，弃去所述碱可溶组分并保留所述碱不溶组分，
b)使所述碱不溶组分接触酸溶液，通过悬浮所述碱不溶组分并使所述悬浮组分接触所述酸溶液，从而获得酸不溶组分和酸可溶组分，弃去所述酸不溶组分并保留含壳聚糖的所述酸可溶组分。
16.如权利要求15所述制备壳聚糖的方法，其特征在于，其中还有一步包括使所述组分接触碱溶液来沉淀所述酸可溶组分中的壳聚糖。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，使用的所述几丁质是根据权利要求1-8中任一项所述方法可获得的真菌几丁质或酵母几丁质。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于，碱溶液与几丁质量的比例在1-20(w/w)之间。
19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述第1个步骤在80-140℃之间的温度下进行。
20.几丁质聚合物，其特征在于，所述聚合物可通过权利要求1-8中任一项所述方法获得。
21.如权利要求20所述的几丁质聚合物，其特征在于，所述几丁质聚合物包含80％以上的几丁质。
22.如权利要求20或21所述的几丁质聚合物，其特征在于，其结晶指数小于80％。
23.富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物，其特征在于，所述共聚物可通过权利要求1-8中任一项所述方法获得。
24.如权利要求23所述的富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物，其特征在于，几丁质的含量高于80％。
25.几丁质-葡聚糖共聚物，其特征在于，所述共聚物可通过权利要求1-8中任一项所述方法获得。
26.壳聚糖聚合物，其特征在于，所述聚合物可通过权利要求9-19中任一项所述方法获得。
27.如权利要求26所述的壳聚糖聚合物，其特征在于，其分子量可调节。
28.如权利要求26或27所述的壳聚糖聚合物，其特征在于，其脱乙酰程度可调节。
29.组合物材料，其特征在于，所述材料包含权利要求20-28中任一项所述的几丁质聚合物、几丁质-葡聚糖共聚物、富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物。
30.如权利要求20-29中任一项所述的几丁质聚合物、几丁质-葡聚糖共聚物、富含几丁质的的几丁质-葡聚糖共聚物或壳聚糖聚合物的用途，其特征在于，可用于医学、药学、农业、营养保健品、食品、纺织品、化妆品、工业和/或环境应用。
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