CN108610437A - 生物相容的和生物可吸收的衍生的壳聚糖组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物相容的和生物可吸收的衍生的壳聚糖组合物。具体地，本发明涉及一种生物相容的、生物可吸收的衍生非交联壳聚糖组合物，以及制造和测试这种组合物的方法。该组合物具有可被调节在约0％(w/w)至约8％(w/w)之间的酸成分，以将所述组合物定制用于需要和/或忍受不同水平的细胞毒性、粘合性、组合物凝聚性和到所述组合物中的细胞渗透性的用途。

Description

生物相容的和生物可吸收的衍生的壳聚糖组合物
本申请是申请日为2014年03月14日的题为“生物相容的和生物可吸收的衍生的壳聚糖组合物”的中国专利申请号201480015466.7的分案申请。
相关申请
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/784467的优先权，其内容通过引用完全并入本文。
技术领域
本发明一般涉及生物相容的、生物可吸收的衍生的非交联壳聚糖组合物以及制造和测试所述组合物的方法，所述组合物可以会或可能不会被1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)交联到凝胶/胶原以用于生物医学用途。本发明的组合物包含被重乙酰化到程度在约15％至40％之间的N-脱乙酰(DDA)的衍生的壳聚糖。如使用由本发明人开发的改良的急性全身毒性实验所确认的，本发明的组合物可以植入哺乳动物中而不产生会引起提升的细胞因子IL-1β反应的有毒的生物降解物种。本发明的组合物是典型地在约90天或更短的时间内生物可吸收的，且可制成以不同的速率被生物吸收。本发明的组合物最初溶于pH低于6.5的水溶液。本发明的组合物具有可被调节在约0％(w/w)至约8％(w/w)之间的酸成分，以将所述组合物定制用于需要和/或忍受不同水平的细胞毒性、粘合性、组合物凝聚性和到所述组合物中的细胞渗透性的用途。
背景技术
甲壳素是广泛存在于自然界的一种天然高分子量聚合物。它是昆虫和甲壳动物角质层的主要成分，并且也是某些真菌和其它生物的细胞壁的一部分。甲壳素是一般通过用强酸(如需要的话，去除钙沉积)和强碱(去除蛋白质残渣)处理来从天然来源提取。甲壳素在通常的水溶液条件下是不溶的，且被认为是相对难加工的聚合物(难以处理)。将甲壳素溶解以能够直接加工成纤维或其它形式需要使用缺乏吸引力的溶剂系统，它们一般是腐蚀性的和有毒的。
在工业水平通过甲壳素的脱乙酰水解来生产壳聚糖。甲壳素和壳聚糖是糖胺聚糖族聚合物的一部分。壳聚糖通常是在碱存在下从甲壳素脱乙酰而获得的。壳聚糖是用于描述线性多糖的通用名称，它们由由β-(1-4)糖苷键所连接的葡萄糖胺和N-乙酰基葡萄糖胺残基组成的(通常葡萄糖胺的数量≥N-乙酰基葡萄糖胺)，且它们的组合物可溶于稀酸水溶液。壳聚糖族包括聚β-(1-4)-N-乙酰基葡萄糖胺和聚β-(1-4)-N-葡萄糖胺，具有影响壳聚糖化学性质的基序装饰(无论是无规或嵌段)和乙酰残余馏分。在壳聚糖的氨基葡萄糖环上的2碳氨基允许质子化，因此使壳聚糖溶解于水(Roberts)。这允许稳妥地将壳聚糖处理成纤维、薄膜和其它形式，以及能够制备高纯度的壳聚糖以用于生物医学用途。
取决于原始生物材料源和将甲壳素处理成壳聚糖的控制，聚-N-乙酰基葡萄糖胺化合物呈现出可用水溶液处理的各种不同的物理和化学特性。这些不同是由于壳聚糖的不同分子量、不同程度的乙酰化和污染物的存在(如共价结合的物种特异性蛋白、单一的氨基酸和无机污染物等)造成的。
许多注意力放在作为性功能性聚合物的壳聚糖上，因为已经报道了一些独特的生物特性，如无毒、生物相容性和生物降解性。确实，壳聚糖被广泛认为是无毒的生物相容的聚合物。(Keen T.等人，2005，Adv.Drug Deliv.Rev.62：3-11(“Kean”)；Ren，D.等人，2005年，Carbohydrate Res 340(15):2403-10(“Ren”))。
壳聚糖的潜在的安全的、生物相容的和生物可吸收的用途使其成为一种有吸引力的天然材料以用于生物医学植入物。此外，脱乙酰的和部分脱乙酰的壳聚糖制剂显示出潜在的有利的化学性质，例如高反应性、致密的阳离子电荷、强大的金属螯合能力、共价结合蛋白质的能力以及在许多含水溶剂中的溶解度。此外，通常可以理解的是，壳聚糖能够粘附于活体组织、用作止血剂、促进快速愈合并且具有抗菌特性。
这些化学和生物特性现在开始被证明可用于许多医疗应用。虽然壳聚糖组合物越来越多地在美国、欧洲和亚洲被用于体外医疗应用，如伤口组合物产品、海绵体、粉末止血剂和抗微生物凝胶，生物相容的和生物可吸收的壳聚糖组合物尚未被批准用于体内外科用途。
壳聚糖尚未获得作为生物相容的和生物吸收的生物医学植入物材料的用途，至少部分是这样，因为壳聚糖包括一大群结构上不同的化学实体，且它的生物降解性能受到多种相互依赖的因素所影响，这使得该组合物的设计是不可预测的。壳聚糖的各种物理化学特性，如分子量、脱乙酰程度以及在壳聚糖分子中的乙酰胺基团的分布，影响了壳聚糖功能和生物可吸收性。(Kofuji，K.等，2005，Eur.Polymer J.41：2784-2791(“Kofuji”))。这些特性、分子量和N-脱乙酰的程度(DDA)被认为是壳聚糖的生物可吸收性的两个最重要的决定因素。(Ren；Kean)。
壳聚糖的在体内降解是尚未完全清楚的，但相信是通过聚合物链的酶裂解而发生的。(Kean；Ren)。溶菌酶是人体中最主要的壳聚糖降解酶，但一般还可以在动物、植物和微生物中发现其它各种壳多糖酶。(Kean)。壳聚糖的降解行为对生物相容性材料的性能起着重要作用。降解动力学可能影响许多细胞过程，包括细胞生长、组织再生和宿主反应。(Ren)。关于由溶菌酶降解的壳聚糖的调查显示，壳聚糖的DDA是控制壳聚糖降解的关键因素之一。(同上)。此外，已经注意到，N-取代可影响酶促降解。(Kean)。
体内的生物降解率和生物吸收率也经受异物包囊(纤维囊形成)的竞争过程，该过程可最终隔开所述生物吸收组合物，如果其生物吸收率足够慢且所述异物引起适度的炎症反应以促进包囊的增强速率的话。这种包囊对于期望的生物可吸收组合物是不希望的，因为它可以将组合物在体内的潜在滞留时间从数月延长至数年。降低包囊的速率以及及时清除和除去异物是所希望的，因为持久的滞留时间可导致血管和/或神经冲击以及促进感染的不良事件。
通过溶菌酶有效断裂的壳聚糖先决条件是，在多糖链中具有至少三个连续的N-乙酰葡萄糖胺单体的常规分组(Aiba)，即壳聚糖的DDA足够低(<70％DDA)，具有必要的N-乙酰基序结构以使能(enable)系统性的酶裂解。通常，壳聚糖上的乙酰基越多，降解速率越快。(Tomihata，K.等，1997，Biomaterials 18：567-575(“Tomihata”))。
高于pH 6.5的壳聚糖水溶性范围，其在45％和55％DDA之间(Roberts 1992)，经常会对生物吸收和断裂的绝对速率的判断造成混淆，因为水溶性壳聚糖看起来会更快地被生物吸收，而实际上它只是被溶解。(Freier，T.等，2005Biomaterials，26(29)：5872-8(“Freier”))。
作为一般事项，除了其DDA之外，壳聚糖分子的其它特性，如它的分子量、粘度、溶解性和乙酰胺基团的分布，影响壳聚糖的生物吸收性质。
此外，如前所述的，生物材料的生物相容性在生物吸收中起着重要作用。可通过酶、水解或氧化的途径生物降解、但其仅略微提升局部生物材料炎症反应的生物材料，与适度提升同样反应的生物可降解的生物材料相比，将以更慢的速度被生物吸收。有趣的是，高DDA的壳聚糖被证明有很好的生物相容性，而报道的生物相容性在DDA减小时下降。(Tomihata)。
通常可理解的是，壳聚糖的生物吸收和生物降解要求壳聚糖具有低于70％的DDA和超过40％的DDA，如果聚β-(1-4)N-乙酰氨基葡萄糖胺仍然被认为是壳聚糖(溶于稀水溶液)。纯甲壳素(DDA近乎0.0)已证明是生物可吸收的。(Tomihata)。含约70％和更高DDA的壳聚糖组合物表明具有最小的生物降解，至少部分地是因为缺乏乙酰基以促进酶裂解和/或缺乏溶解性。(参见Freier，T.等，2005Biomaterials，26(29)：5872-8(“Freier”))。
已经发现在植入一周之内，这些高DDA的壳聚糖，虽然表现出非常良好的生物相容性，但开始经历包囊。(Vandevord)。因此，接近70％和更高DDA的壳聚糖组合物，具有缓慢的生物降解和包囊的速率，可能永远不会在体内被完全再吸收，并可能产生不良的包囊。
据文献报道，具有低于70％DDA的壳聚糖已证明是生物相容的和生物可吸收的，且被提出对生物医学用途是安全的。然而，只有具有约40-70％DDA的壳聚糖组合物已经被证明在体内是生物可吸收的，其中聚β-(1-4)N-乙酰氨基葡萄糖胺被定义为壳多糖，或者具有更低DDA的壳聚糖依赖于其其水溶液等于或低于pH 6.5，如Roberts所公开的。这些生物可吸收的壳聚糖组合物的生物相容性，尽管低于高DDA的壳聚糖，已被报道值得进一步研究。但是，报道的发生实际生物吸收的壳聚糖的生物吸收的体内研究的数量，是非常低的。(见例如，Tomihata)。大多数的声称研究壳聚糖生物再吸收的其它研究仅仅使用体外酶条件(一般溶菌酶)。如所显示的，溶菌酶溶液允许分析壳聚糖的在体内生物降解的相对敏感性，但是，它不能考虑与生物材料的生物相容性相关联的吸收和生物降解效应以及生物降解制品的生物相容性。
DDA低于40％的壳聚糖组合物的生物相容性和生物吸收性还没有被广泛研究。这可以部分地是因为难以获得具有较低DDA的壳聚糖的事实。(Ren)。另外，降低壳聚糖的DDA至低于40％以实现更快速率的生物降解受挫于以下事实：具有小于40％DDA的壳聚糖将使壳聚糖不溶于pH低于6.5的水溶液，从而不是如Roberts所定义的壳聚糖。(见例如，Ren，Xu，J.等，1996，Macromolecules 29：3436-3440(“Xu”)；Freier)。此外，具有低于50％DDA的壳聚糖通常不是市售的。
然而，在某种程度上来说，降低壳聚糖的DDA可以有利地增加其生物降解速率，传统的观点是，生物降解太快的速率可能是不可取的，因为公知的是，生物材料的生物降解越快，它们越可能引起急性炎症反应，因为在很短的时间内显著大量地产生低分子量化合物。(Tomihata)。
另外，制备以包括含有45％-55％DDA的水溶性范围的壳聚糖的组合物会造成不希望的膨胀和通过组合物的流体吸收，这在生物吸收过程中可能导致植入物的尺寸和性能的不希望的和不可预测的波动。
如下面详述的，本发明的发明人惊奇地发现，与传统的观点和工业实践相反，包括具有在40％和约70％之间的DDA范围的衍生非交联壳聚糖组合物的组合物在植入时是有毒的、生物降解的和生物吸收的。本发明人还惊奇地发现，具有在约15％和40％之间的DDA范围的生物相容的、无毒的和生物可吸收的生物医学壳聚糖组合物是可以制备的，在植入后，在约90天或更小时间内可被生物吸收至少85％。因此，本发明人已不仅克服本领域技术人员广泛持有的对包括具有在40％和约70％之间的DDA范围的壳聚糖的组合物的生物相容性和生物可吸收性的误解，而且还实现了：1)对具有在约15％和40％之间的DDA范围的生物相容的和生物可吸收的壳聚糖的惊人认识，2)使用具有在约15％和40％之间的DDA范围的壳聚糖制备本发明的包括衍生的非交联的壳聚糖的组合物的方法，以及3)开发了改良的急性全身毒性测试，以确保本发明的组合物在植入后不产生会引起提升的IL-1β细胞因子反应的有毒的生物降解物种。
发明内容
本发明首先涉及包含衍生的非交联壳聚糖的生物相容的和生物可吸收的生物医学组合物，所述壳聚糖的DDA范围在约15％和40％之间，所述组合物的衍生的非交联壳聚糖至少最初可溶于pH 6.5的水溶液。本发明的组合物是专门用于生物可吸收的和生物相容的可植入结构体的简单水性制备，所述结构体在约90天或更段的时间内被完全生物降解和生物吸收。通过使生物相容材料能够被易于水性构造制备(纤维、薄膜、冷冻干燥基质等)和被可接受地快速控制的生物吸收，本发明减少了使用者的不必要的风险，因为炎性异物或不吸收物的长期存在可能引起粘附、包囊(encapsulation)和/或感染。
本发明还涉及制造生物相容的、生物可吸收的组合物的方法，所述组合物包含衍生的非交联壳聚糖(其可以是或可以不是通过EDC交联到凝胶/胶原)，其具有在约15％和40％之间的DDA范围以供生物医学使用。在一个实施方案中，本发明的组合物通过在乙酸中将已被脱乙酰到DDA为约80％或更高的壳聚糖重乙酰化以实现DDA范围在约25％和40％之间而制备。具体地，从在约85％至100％之间的纯高DDA的壳聚糖的再激活是优选的。除了直接重乙酰化重乙酰化，本发明的方法可任选地包括通过与亲电试剂反应来还原壳聚糖的游离胺官能度。
本发明的组合物被制成以便至少最初可溶于pH低于6.5的水溶液。
在本发明的组合物中使用的术语“壳聚糖”是指至少最初可溶于具有低于或等于约pH 6.5的水溶液的壳聚糖。值得注意的是，在本发明的组合物中包括的壳聚糖可在某些时候变为不溶性的，但是该不溶物基于其在具有低于或等于约pH 6.5的水溶液中的初始溶解度仍然继续在本说明书中称为壳聚糖。因此，本文所公开的本发明组合物所包括的壳聚糖，可以是或可以不是在某些时候包含不溶性壳聚糖材料。
本发明组合物具有在约0％(w/w)和约8％(w/w)之间的可调节的酸成分，它可以根据其预期用途和根据需要和/或忍受不同水平的细胞毒性、粘合性、组合物凝聚性和到所述组合物中的细胞渗透性而被定制。
另外，本发明还涉及测试这种组合物的方法。具体而言，本发明人已开发出一种改良的急性全身毒性(AST)大鼠病变检测(MLT)，以确保本发明的组合物在植入哺乳动物中后不产生会引起提升的细胞因子IL-1β反应的有毒生物降解物种。AST MLT涉及部分溶菌酶生物降解的壳聚糖，这是对壳聚糖生物吸收毒性的预测。
本发明的组合物可以在生物医学应用中，包括但不限于用于手术、微创手术(内窥镜与腹腔镜)、止血器、组织填充、支架、组织再生、防止粘连和药物递送。
本发明的组合物可以采取几种物理形式，包括但不限于海绵体、膜片、支架、薄膜、凝胶、可注射的凝胶和/或流体、纤维、纳米纤维、粉末等。
本发明的组合物克服关于包含具有在40％至约70％之间的DDA的壳聚糖的组合物的安全性和生物相容性的普遍持有的和有问题的误解，即，这样的组合物提供了改善的生物相容的和生物可吸收的植入组合物。本发明人首次令人惊讶地发现安全的、生物相容的和生物可吸收的用于植入的组合物，其包括具有DDA范围在约15％至40％之间的壳聚糖。本发明人对这种较低的壳聚糖DDA范围用于生物相容的生物可吸收的内部使用的认识不仅揭露了关于具有DDA在40％至约70％之间的壳聚糖的安全性的误解，而且与本领域技术人员已知的用于尝试开发具有不希望的例如溶解性问题、缺乏可预测性等等这样的组合物的各种其它因素相反。
附图说明
附图包含在本说明书中并构成本说明书的一部分，其中示出了各种示例性实施方式。
图1-A和图1-B是显示在植入七天后皮下植入材料(大鼠)的组织病理学的载玻片。图1-A示出了壳聚糖+20％的酸(w/w)的样品。图1-B示出用无酸壳聚糖样品。
图2是显示对于含有标准酸(～20％>)和低酸(～3％)成分的测试样品的体外模拟的动脉缠绕密封(SAWS)的测试结果的图。
图3是显示包括具有不同DDA水平的壳聚糖的组合物的溶菌酶敏感性的图。
图4-A和图4-B是显示包括在8天后取出的具有～35％的DDA的壳聚糖的测试组合物分别在20倍放大倍率(图4-A)和在60倍放大倍率(图4-B)(大鼠，腹膜内)的组织病理学的载玻片。
图5-A和图5-B是表示包括在28天后取出的具有～35％的DDA的壳聚糖的测试组合物分别在20倍放大倍率(图5-A)和在60倍放大倍率(图5-B)(大鼠，腹膜内)的组织病理学的载玻片。
图6-A和图6-B是显示包含具有0％DDA(A)和～35％DDA(B)的壳聚糖的组合物的外推吸收时间的图。
图7是表示对于各个大鼠和相应的大鼠血清IL-1β[pg/ml]的总皮炎评分。
图8-A、图8-B、图8-C和图8-D是在腹膜内引入生物吸收的壳聚糖之后在大鼠和小鼠(病变的图像)中的特应性皮炎病变的排名程度的系统。
图9-A和图9-B是材料组合物和主要字母标识符索引。
图10表示大鼠植入研究组合物与生物吸收后的生物相容性。
图11是壳聚糖材料组合物的MLT测试和结果。
图12表示止血功效结果的表格。
图13表示生物可吸收性、生物相容性和止血功效。
具体实施方式
A.组合物
本发明使用的壳聚糖可以来自任何来源。壳聚糖的工业生产一般利用甲壳类动物的壳废弃物，如蟹或虾壳。壳聚糖的替代来源包括，例如，真菌和其它工业发酵过程的副产物，如在真菌或酵母发酵后收集的生物物质。
本发明使用的壳聚糖的起始材料可以是取得ASTM F 2103-01资质的来自于虾的优质医疗级壳聚糖。优选的是，壳聚糖起始材料被至少约75％至100％脱乙酰化，更优选地，壳聚糖起始材料被至少约85％至100％脱乙酰化，并且进一步优选地，壳聚糖起始材料被至少约95％至100％脱乙酰化。
壳聚糖起始材料可以是药用级或同等的质量，例如，超纯FMCNovamatrix壳聚糖和乙酰化的超纯FMC Novamatrix壳聚糖。有利地，实施壳聚糖可以是药用级的，按照GMP(良好生产规范)标准进行准备和处理。实施壳聚糖不应包含过量的重金属、蛋白质、内毒素或其它潜在有毒的污染物。干燥的壳聚糖起始材料应当是至少99％纯的并证明无重金属(Pb+Hg+Cd+As<500ppb)；检测不到残留蛋白质(<200ppm)；和低的内毒素(优选地<100EU/g，更优选地<20EU/g，最优选地<5EU/g)。
本发明使用的壳聚糖的起始材料应具有至少约80kDa的平均分子量，优选地，具有至少约250kDa的平均分子量，更优选地，具有至少约150kDa的平均分子量。
优选地，所述壳聚糖起始材料在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其是约100厘泊至约2000厘泊)。更优选地，所述壳聚糖在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其是约125厘泊至约1000厘泊)。最优选地，所述壳聚糖在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其为约150厘泊至约500厘泊)。
在壳聚糖起始材料的情况下，优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的不溶解固体<10％w/w。更优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的不溶解固体<2％w/w。最优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的不溶解固体<1％w/w。
在一个实施方案中，脱乙酰壳聚糖起始材料被重乙酰化以实现本发明的组合物。所述脱乙酰壳聚糖的重乙酰化有利地增强了对脱乙酰程度的控制至40％以下，有助于去除不希望的残留蛋白质抗原位点，并产生更理想的受控材料。从含约85％-100％DDA的纯高DDA壳聚糖的重乙酰化是优选的，因为(1)更稳健的脱乙酰化处理将更可能除去不需要的蛋白质抗原位点，(2)壳聚糖材料可被过滤，因为壳聚糖是可溶的，(3)溶解的壳聚糖的重乙酰化提供了更加可再现性的随机壳聚糖结构，和(4)所述DDA范围将更加均匀(存在有毒生物降解残余物的可能性较小)。
本发明使用的重乙酰化壳聚糖材料应该具有至少大约90kDa的平均分子量，更优选地，其具有至少约280kDa的平均分子量，且最优选地，它具有至少约170kDa的平均分子量。
优选地，所述重乙酰化壳聚糖起始材料在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其是约100厘泊至约2000厘泊)。更优选地，所述壳聚糖在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其是约125厘泊至约1000厘泊)。最优选地，所述壳聚糖在主轴LV1为30rpm时在25℃在1％w/w乙酸(AA)的1％w/w溶液中具有粘度(其为约150厘泊至约500厘泊)。
所述重乙酰化壳聚糖材料的纯度是通过红外分析测定的，优选地证明在1740±10cm-1处没有O-酰基吸收且测定残留水分。存在o-乙酰化的小的残余水平应该不会显著影响生物相容性或功效。其控制提供了用于规范目的的在目标衍生壳聚糖中的杂质控制水平。
所述干燥的重乙酰化壳聚糖可以变为不溶的，如果在高于40℃的温度加热且如果在室温存储七天以上的话。优选地，所述材料是在低于20℃通过冷冻干燥法而被干燥至接近5％w/w的残留水分。如果需要存储多于七天，则优选地它应被存储于2℃-8℃，或者更优选地，在-20℃或以下存储。
在重乙酰化壳聚糖的情况下，随后的溶解度曲线是期望的。优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的未溶解固体<10％w/w。更优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的未溶解固体<2％w/w。最优选地，在25℃在1％乙酸的1％w/w壳聚糖溶液中的未溶解固体<1％w/w。
重乙酰化壳聚糖优选地具有至少约15％至40％的DDA范围，优选地约15％至35％，更优选地至少约20％至35％，和最优选地至少约20％至30％。
在这里，“DDA”或“脱乙酰化程度”被定义为指在构成所述壳聚糖(或聚β-(1-4)-N-乙酰基-D-葡萄糖胺或聚β-(1-4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖)的D-葡萄糖胺(D-吡喃葡萄糖)单元的2位中氨基的最终比例，它已通过脱乙酰化或者脱乙酰化与重乙酰化和/或涉及亲电试剂的取代的任何组合而被转化为游离的氨基。100％DDA的壳聚糖(聚β-(1-4)-D-葡萄糖胺或聚β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖)通过从D-葡萄糖胺的2-位去除所有的乙酰基(乙酰氨基)官能度而获得。
典型地，这些亲电/亲核试剂(Lewis酸-碱)反应提供用于C-2胺的酰胺形成、N-乙酰化、羧基化和烷基化。
根据本发明的DDA的测量通过FTIR光谱分析来确定。Baxter,A.等,1992,Int.J.Biol.Macromol.14:166-169("Baxter")；Miya,M.等,1980,J.Biol.Macromol.2(5):323-324("Miya")；Roberts,G.A.F.,1992,London:MacMillan 86-91("Roberts")。此FTIR方法提供了接近±3％DDA的DDA测定的精度。虽然在本发明中主要使用FTIR方法，用于确定DDA的替代技术被用来证实FTIR分析。所使用的其它技术是1H核磁共振(ASTMF2260-03)和用浓磷酸作为溶剂的DDA的UV光度计法测定(Hein 2008)。
根据一个实施方案，本发明的生物可吸收的组合物在润湿时具有的pH值与内部使用的相容，优选地初始pH值在5.5和7.5之间，其在24小时内被平衡到接近pH 7.4的生理pH值。
根据一个实施方案，该组合物是在约100天或约14个星期内被生物吸收植入物的至少85％。在另一个实施方案中，所述组合物在约60天或9个星期内被生物吸收植入物。在另一个实施方案中，所述组合物在约30天或4个星期内被生物吸收植入物的至少85％。在另一个实施方案中，所述组合物在约14天或2个星期内被生物吸收植入物的至少85％。在另一个实施方案中，所述组合物在约7天或1个星期内被生物吸收植入物的至少85％。
在一个实施方案中，所述壳聚糖组合物进一步包含凝胶或胶原。使用的高纯度凝胶或胶原是优选的试剂以使壳聚糖凝胶发泡。所述凝胶(来源于猪)来自Gelita并含有小于90EU/g的内毒素。所述凝胶具有286g菌绒(bloom)，pH值5.54，0.01％灰分含量，和小于100cfu/g的生物负荷。在优选的实施方案中，所述包含壳聚糖和凝胶的组合物是发泡的并结合冷冻干燥法而制备，以形成低密度泡沫海绵体。这种泡沫海绵体的柔软压缩产生高顺应性的粘性的组合物。在一个优选实施方案中的壳聚糖组合物在植入时表现出可接受的在长度和宽度上不超过20％的膨胀水平。取决于在热压缩前的原始海绵体厚度尺寸，植入的组合物的厚度在超过7-14天后可以恢复到原来的海绵体厚度。根据本优选实施例的含有在0-8％(w/w)范围内的残留酸的组合物的植入可以抵抗溶解和有效地在稳健级别控制出血。
本发明的组合物可进一步包括另外的亲水性聚合物和/或不那么亲水的聚合物。所述另外的聚合物可包括但不限于胶原、胶原衍生物、凝胶、藻酸盐、壳聚糖、角蛋白、亲水性多胺、亲水聚胺盐、聚二甲基二盐、聚六亚甲基双胍、聚氨基丙基双胍、壳聚糖衍生物、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、黄原胶、角叉菜胶、季铵聚合物、硫酸软骨素、淀粉、改性纤维素聚合物、葡聚糖、透明质酸、卡波普、聚乙烯吡咯烷酮、氢化植物油、石蜡、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、支链淀粉、果胶或它们的组合物。所述淀粉可包括但不限于淀粉酶、支链淀粉和支链淀粉和淀粉酶的组合。所述改性纤维素聚合物可以包括但不限于乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基、羧甲基纤维素、氧化纤维素或它们的组合。
本发明的组合物还可以包括活性成分。所述活性成分可以包括但不限于钙、白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、因子VIIa、因子XIII、血栓烷A2、前列腺素-2a、活性蛋白C、玻连蛋白、硫酸软骨素、硫酸类肝素、硫酸角质素、葡萄糖胺、肝素、核心蛋白聚糖、双链蛋白聚糖、睾丸蛋白聚糖、纤维调节剂、基膜聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、串珠素、溶菌酶、lysly氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇氧化酶和/或氨基酸氧化酶、D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸、乙醇酸、氨基酸、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、血管性血友病因子、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、角质细胞生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子、骨形态发生蛋白(BMP)、肝细胞瘤衍生的生长因子(HDGF)、白细胞介素、双调蛋白、视黄酸、促红细胞生成素、乙酸磺胺米隆、磺胺嘧啶银、硝酸银、纳米晶体银、青霉素、氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、阿莫西林、卡佛莫(clavamox)、克拉维酸、羟氨苄青霉素、氨曲南、亚胺培南、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、万古霉素、克林霉素、林可霉素、红霉素、多粘菌素、杆菌肽、两性霉素、制霉菌素、利福平、四环素、强力霉素、氯霉素、头孢呋辛、头孢拉定、氟氯西林、氟氯青霉素、双氯、克拉维酸钾、克霉唑、环吡酮胺、特比萘芬、酮康唑、紫杉醇、多西它赛、伊马替尼、依西美坦、它莫昔芬、威罗菲尼(vemurafenib)、易普利姆玛、达卡巴嗪、白细胞介素-2、阿比特龙、阿霉素、5-氟尿嘧啶、它莫昔芬、奥曲肽、索拉非尼、白藜芦醇、氯胺酮、双氯芬酸、布洛芬、扑热息痛、可待因、羟考酮、二氢可待因酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡、曲马多、文拉法辛、氟吡丁、卡马西平、加巴喷丁、普瑞巴林、利多卡因、自体的细胞系、干细胞以及它们的组合。
本发明可以根据各种方法来完成并且该组合物可以包括各种形式，包括但不限于冷冻干燥的海绵体、组织支架、基质、纤维、粉末、片材、薄膜、膜片、纳米纤维、纳米颗粒和水凝胶。本发明的组合物可被部署为单独的可植入的快速吸收的装置或者在可植入装置上的快速吸收的表面涂层。部分地由于壳聚糖的抗菌性质，本发明的可吸收组合物的植入物可有利地进一步允许消除或减少可能导致继发感染的环境污染。
本发明的组合物的生物降解和生物吸收的质量和速率可以使用各种方法来评估。例如，生物吸收的速率可以使用关于随时间而保持的植入材料的量的视觉评估和/或测量来确定。对于用于体内特定应用位置的医疗装置的所估计的生物吸收速率的判定需要在那个位置植入在厚度上(以及否则具有均匀尺寸)类似尺寸的测试组合物。厚度横截面的相对密度或变化沿着所述测试组合物在每个时间点至少两种动物并经过至少三个时间点的条件下确定，其中百分比变化超过50％。当测试组合物的85％或更多被吸收时，被认为是达到了生物吸收。这个测试假定测试组合物通常从表面到内部均匀降解且它不会分裂为大块(>100微米)，所述大块随后将从植入位点迁移出来。在生物吸收过程中的这种碎裂是不期望的。所述测试还假定材料的损失与生物降解相关联，而不是简单地溶解。有很多准则来进行体内生物降解/生物吸收的研究：ASTM F2150-07“Standard Guide for Characterizationand Testing of Biomaterial Scaffolds Used in Tissue-Engineered MedicalProducts(用于表征和测试在组织-工程医疗产品中使用的生物材料支架的标准指南)”，ASTM F1983“Practice for Assessment of Compatibility of Absorbable/ResorbableBiomaterials for Implant Applications(用于植入应用的可吸收/可再吸收生物材料的相容性的评定实践)”，ISO 10993-9“Biological Evaluation of Medical Devices-Pt 9:Degradation of Materials Related to Biological Testing(医疗器械的生物学评价-Pt 9：与生物测试相关的材料的降解)”。在下面的壳聚糖生物吸收的实施例中使用的体内测试由在ASTM F2150-07、ASTM F1983和ISO 10993-9中概述的原则指导。
需要注意的是，在生物材料通过水解而降解的情况下，这里接受和受到标准水解测试的指导：ASTM F1635“Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolyrically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for SurgicalImplants(用于可水解降解的聚酯树脂和用于外科植入物的制造模件的体外降解测试的测试方法)”。这是因为水解是简单的模型，并且可以容易地控制。在那些生物材料被酶解或通过吞噬作用而降解的情况下，例如在壳聚糖的情况下，体外测试可以对可预期的东西提供有用的指导，但是直到对于特定植入位置的体内研究被执行以证实体外测试结果为止，所述体外测试结果不能被认为是生物吸收率的可靠指标。
根据本发明的非毒性可以在壳聚糖的生物吸收-生物降解过程中/之后使用各种标准方法来评估。利用壳聚糖的溶菌酶预处理可以复制在体内的生物吸收-生物降解化学变化。在标准的生物相容性测试如MEM洗脱测试和/或急性全身毒性测试中允许进行随后的对降解壳聚糖的测试，以进行毒性的快速筛选。如在后面的部分(C)所述，本发明人已开发出一种改良的急性全身毒性测试，以在植入根据本发明制备的组合物后检测提升的细胞因子IL-1β反应。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物是已被冷冻干燥和压缩的海绵体的形式。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的冷冻干燥的海绵体包括具有约15％至40％DDA的衍生壳聚糖以及在冷冻干燥之前合并和发泡的凝胶。在本发明的实施方式中壳聚糖与凝胶的比例可以是1:1、2:1、3:1中的任一个，对于止血的组合物应用优选的比例为3:1，更优选的比例为2:1，且最优选的比例为1:1。
根据本发明的海绵体实施方案包括的壳聚糖衍生物材料为约40％至约100％w/w，优选地约45％至约85％w/w，更优选地约50％至约75％w/w，进一步更优选地约50％至约65％，最优选地约50％至约55％w/w。
在替代实施例中，发泡的壳聚糖凝胶海绵体可包含约40％至约100％w/w、优选地约45％至约85％w/w、更优选地约50％至约75％w/w、进一步更优选地约50％至约65％、最优选地约50％至约55％w/w的所述壳聚糖衍生物材料，以及约0％至约60％w/w、优选地约15％至约55％w/w、更优选地约25％至约50％w/w、进一步更优选地约35％至约50％、最优选地约45％至约50％w/w的凝胶材料。
本发明组合物可具有在约0％和约8％之间的可调节的酸成分，其可以基于预期用途根据需要和/或忍受不同水平的细胞毒性、粘合性、组合物凝聚性和到所述组合物中的细胞渗透性来定制。优选的酸包括诸如乙酸、碳酸、乳酸、乙醇酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、抗坏血酸、盐酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、酒石酸等的酸。
本发明组合物具有许多生物医学应用，包括但不限于，用于手术、微创手术(内窥镜与腹腔镜)、止血控制、控制感染、组织充填、支架、组织工程、组织再生、活性剂的受控递送、受控药物递送和防止粘连和/或这些的组合。
B.制作根据本发明的组合物的方法
本领域普通技术人员已知有各种方法可实现具有约15％至40％DDA的壳聚糖的生产。然而，本发明人已有利地开发出一种重乙酰化化学技术，其允许用一步工艺来产生具有介于约15％和40％之间的DDA的壳聚糖。从具有75％至100％的DDA和具有99％至99.99999％的纯度的高纯度的壳聚糖形式开始，它以有利地促进了具有可控的特异性降解曲线的生物可吸收的壳聚糖植入材料的生产。
因此，在一个优选实施方案中，衍生壳聚糖的制备涉及高纯度壳聚糖的衍生步骤，其中将乙酸酐化学计量地添加(稍过量)到在乙酸中具有80％或更高的DDA的2％壳聚糖溶液中。在乙酸酐与壳聚糖反应以将壳聚糖乙酰化至具有在约15％至40％的DDA(通过FTIR光谱分析确定)，通过加入10M氢氧化钠水溶液将所述壳聚糖升高至pH 13。这种升高至高pH使壳聚糖沉淀为浆液并导致任何壳聚糖O-乙酰酯的水解。随后通过用多重变化的水洗涤或渗析直到壳聚糖浆液的导电率接近水的导电率(接近1微西门子/厘米)，除去NaOH和乙酸钠。具有在约15％至40％DDA的N-乙酰化的衍生壳聚糖可以优选地通过使用乙酸再溶解成水溶液。一旦在水溶液中，所述壳聚糖可以加工成不同的物理形式。如前所述的N-乙酰化的衍生壳聚糖是N-酰化壳聚糖的一个子集，其中可以对壳聚糖进行N-甲酰基、N-乙酰基、N-氯乙酰基、N-乙基、N-丙基、N-丙酰基、N-异丙基、N-(2-甲基丙酰基)、N-羟乙基、N-琥珀酰基、N-二戊酰基、N-羧基酰胺基、N-羧甲基、N-丁酰基、N-(2,2-二甲基丙酰)、N-(3-甲基丁酰基)、N-(3,3-二甲基丁酰)、N-磺酰基、Ν,Ν二羧基、N-丁基、N-戊基和/或N-己酰基修饰以达到类似的效果。涉及葡萄糖胺C-2氮的亲核/亲电反应的其它通用的化学修饰将包括N-烷基化、N-亚烷基/N-亚芳基衍生和金属螯合。
在重乙酰化步骤之后除去过量乙酸的另一种方法是在1.2”深的涂覆TeflonTM的铝模中倒入深度为0.5"的重乙酰化的壳聚糖酸溶液，将铝模放置在-40℃的平坦不锈钢冷冻干燥机架子上，在冷冻干燥所述溶液之前冷冻以在48小时的干燥周期上升华所有的游离水和乙酸。乙酰化壳聚糖的这种冷冻干燥制备提供了一种具有残留的盐结合乙酸的海绵体，其中如果需要的话，可以在加热和湿度条件下通过酸的挥发而去除所述残留的盐结合乙酸。这种方法规避了用碱(NaOH或KOH)中和和随后通过用大量WFI(注射用水)洗涤以去除碱的需要。这种方法的一个可能限制是，如果发生O-乙酰葡萄糖胺/N-乙酰葡萄糖胺(通过在1740±10cm-1的IR吸光度来证实)，其可能需要用碱(NaOH或KOH)处理以除去酯，否则该酯的存在将需要被控制且O-酯壳聚糖材料验证了它并没有改变壳聚糖的安全性和功效曲线。
在一个替代实施方案中，衍生化步骤涉及通过上述方法将具有80％或更多DDA的壳聚糖重乙酰化至具有至少低至约65％的DDA，然后通过用亲电试剂衍生葡萄糖胺C-2氮而进一步降低壳聚糖的游离胺官能度至在约15％和40％之间。如先前所描述的N-乙酰化的衍生壳聚糖是N-酰化的壳聚糖的一个子集，其中可以对壳聚糖进行N-甲酰基、N-乙酰基、N-氯乙酰基、N-乙基、N-丙基、N-丙酰基、N-异丙基、N--(2-甲基丙酰基)、N-羟乙基、N-琥珀酰基、N-戊酰基、N-羧基、N-羧甲基、N-丁酰基、N-(2、2-二甲基丙酰基)、N-(3-甲基丁酰基)、N--(3,3-二甲基丁基)、N-磺酰基、N，N-二羧酰胺、N-丁基、N-二戊基和/或N-己酰基修饰涉及葡萄糖胺C-2氮的亲核/亲电反应的其它通用的化学修饰将包括N-烷基化、N-亚烷基/N-亚芳基衍生和金属螯合。通常，执行这些反应在本领域技术人员的知识和技术范围内。
由于可植入材料中的酸性残余物是不希望的，因为它会导致酸中毒/细胞毒性，在壳聚糖组合物的铸造(casting)或冷冻干燥中使用乙酸是优选的，因为基本上所有的乙酸可以通过将该组合物加热至约60℃至约130℃而从最终组合物中除去。优选地，在除去乙酸的最终成分时，该加热过程用约5％至约25％的湿度受控的空气进行。替换地，在组合物中希望有一定量的酸，以影响其粘接性能，可以留在组合物中的酸含量为约2％w/w至约8％w/w。
干燥的壳聚糖衍生物的组合物的成分由单一的含水酸性壳聚糖衍生物溶液，或由酸性壳聚糖衍生物溶液和加入或不加入的水溶性酸的凝胶水溶液的组合中制备。这些溶液也可包括D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、果糖、麦芽糖、右旋糖、葡萄糖、聚环氧乙烷和甘油作为增塑剂或流变改性剂。这些溶液还可以包括少量的活性剂。用于溶解壳聚糖衍生物且可以作为壳聚糖盐潜在地包括在最终组合物中的所述酸可以包括诸如乙酸、碳酸、乳酸、乙醇酸、盐酸、柠檬酸、抗坏血酸和酸等的酸。可使用的酸的其它例子包括甲酸(由于其毒性，将需要通过挥发而完全除去)、琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸和酒石酸。
合并的壳聚糖凝胶溶液通过所制备的壳聚糖衍生物水溶液和凝胶的质量分数组合来制备。在凝胶和壳聚糖衍生物溶液的情况下，在凝胶壳聚糖混合物中可以使用EDC以共价结合(交联)凝胶和壳聚糖。可以通过将组合的凝胶壳聚糖混合物充气搅拌(层流罩的过滤空气)至预定的较低溶液密度(例如，为1.0g/cm3至0.6g/cm3)来制备壳聚糖衍生物和凝胶的发泡组合物。表1显示了这些溶液的可能组合。
表1.材料和优选范围
在干燥组合物的情况下，壳聚糖衍生物的最终方案被相位分离并干燥。相位分离的优选方法是通过冷冻并引入热梯度。典型的矩形铝模具为28.5"×4"×1.05"具有顶端凹部28"×3.5"×0.8"以及薄的TeflonTM涂层，其被水平放置在平坦表面上并填充0.4"高的壳聚糖衍生物溶液。然后将模具放置在水平架子上，所述架子或者被预冷却到接近-45℃，或者接近25℃的所述架子以在0.8℃/分钟和2℃/分钟之间的冷却速度被斜线冷却至最终温度接近负45℃(-45℃)。在斜线冷却处理的情况下可以使用5分钟至60分钟的延迟间隔。延迟间隔的目的是缓和穿过0.4"壳聚糖层的热梯度以控制冰核的范围和位置。替换地，如果热梯度不足以提供有利于在冷冻的糕状物中形成层状相位分离结构的冰核，所述壳聚糖可以在装入模具前先被加热或在用于冷冻干燥的模具内被加热到温度高于25℃。用于改善层状结构的优选的预冷却斜线方案温度是45℃。更优选的温度为30℃。最优选的温度为35℃。通常使用较高的初始温度而没有延迟间隔，以在高纯度壳聚糖溶液中获得所需的冷冻结构，其中没有通常会更容易促进冰核形成的异质颗粒。将溶液放置60～180分钟之间以便完全冷冻。典型地，这个冷冻可以在冷冻干燥机(例如，VIRTISTM24平方英尺冷冻干燥机)的可控制环境内部的冷却架上进行。
通过在与所述冷却架直接接触的所述模具基座表面直接快速去除热量，和由最初接近室温的水溶液的相对较高的热容量、所述水溶液在模具中的深度和作为液体与作为冰的所述溶液的隔热性能所造成的该热量去除中的延迟，来在所述冷冻的溶液中达到热梯度。一旦该溶液被充分冷冻，通过施加热和真空来实现所述冰的升华，直到壳聚糖糕状物中的残留水分低于5％w/w。通常用在100-300毫乇之间的真空，冷冻干燥机架子温度在24～48小时逐渐增加到25℃附近。
温度的升高以这样的方式实现：原来的相位分离的冷冻海绵体结构被保留下来，也没有发生回熔现象，也就是说，没有由于因冰变成液态的糕状物塌陷而产生结构损失。一旦架子温度达到25℃，再保持10至12小时的干燥，以确保海绵体的足够均匀的干燥。
在冷冻-干燥后，接近27"×3"×0.35"的干燥海绵体被移走处理，以减少挥发性酸成分。如果使用碳酸来获得溶液且不存在其它酸，则不需额外的处理以除去酸，因为碳酸在冷冻干燥步骤中已除去。在使用其它挥发性酸的情况下，但这些酸比碳酸的挥发性低，通常为乙酸和乳酸，在潮湿的环境(5％至25％的湿度)中将含这些酸的海绵体加热到接近80℃(以及在60℃和130℃之间的温度)会导致挥发性酸成分的基本去除。对于止血应用，较高密度(接近0.03g/cm3)的原始冷冻干燥的海绵体是需要的，以实现对海绵体的合适的湿力学性能。典型地，这是通过将密度接近0.03g/cm3的冷冻干燥的壳聚糖海绵体单轴热压缩至密度大于0.09g/cm3和大于0.25g/cm3但不超过0.5g/cm3而进行的。优选地，这是通过在60℃至85℃之间的温度范围内，优选地在80℃，将密度接近0.03g/cm3的冷冻干燥的壳聚糖海绵体单轴热压缩至密度大于0.07g/cm3，优选地大于0.12g/cm3，但不超过0.5g/cm3而进行的。
如实施例中和在下面进一步详细解释的，本发明人已经发现，含有大于约45％的DDA的壳聚糖组合物的测试样品的生物吸收在测试啮齿类动物中引起不希望水平的细胞因子反应，这在某些情况下导致的真皮病变和/或全身特应性皮炎。通过确定在血液样本中IL-1β细胞因子反应的存在，本发明人能够监视接收植入的动物中的细胞因子反应的水平。本发明人还发现，通过制备包括含有在约15％至40％之间的DDA的壳聚糖组合物，它们能够克服提升的细胞因子反应。
在一个特别优选的实施方案中，本发明有利地实现一种壳聚糖组合物，其在90天或更短时间内被生物吸收至少85％，表现出非常良好的生物相容性，以及在渗出外科和高出血损伤及抗凝血中良好的止血功效。本优选实施例包括约5％w/w或以下的酸质量分数，具有约40％或更低、例如约15％至约30％DDA的重乙酰化壳聚糖。
C.改良的急性全身性测试
标准急性毒性测试是小鼠模型(N＝5)测试腹腔注射后的材料提取物的全身毒性。标准测试方法描述于ANSI/AAMI ISO 10993-11:2006，"Biological Evaluation ofMedical Devices.Pt 11.Tests for Systemic Toxicity"(医疗器械的生物学评价，第11部分，全身毒性测试)。通过将表面积60cm2的测试材料(～0.8克壳聚糖)在37℃下放在20ml生理盐水(9％)中72小时来得到测试材料提取物。提取物的注射体积为50ml提取物每公斤体重(1.0ml每20克小鼠)中。
作为标准生物相容性测试被发现在大鼠模型中在腹膜内植入(剂量≈82mg/kg，～185g的动物中～14mg)3-4天后对某些低酸(<5％w/w乙酸)壳聚糖的严重全身性反应是不可预测的结果，开发了改良后的急性全身测试系统。事实上，包括急性全身毒性测试(AST)的标准(非植入物)ISO10993生物适应性测试表明在植入时造成严重的全身反应所述壳聚糖材料是生物相容的。
在植入时观察到的全身性反应涉及脱发和在大鼠的尾、手足和面部上与特应性皮炎相一致的真皮病变、以及丧失食欲、嗜睡和重量损失的发生。通常在植入时的全身反应效应被发现存在于其中发生壳聚糖生物降解的动物中。全身反应的程度被发现对于在植入后迅速降解的壳聚糖是最大的。全身反应被发现存在于在植入后壳聚糖的脱乙酰程度至少大于35％度脱乙酰和至多小于70％度脱乙酰。对脱乙酰度接近65％的壳聚糖观察到强烈的全身反应。接近65％脱乙酰度的壳聚糖，无论是由甲壳素(0％脱乙酰度)直接脱乙酰制备的或由接近90％脱乙酰度的高纯度壳聚糖重乙酰化制备的，都表现出在植入时同样严重的炎症反应。接近65％脱乙酰度的壳聚糖，其通过所述葡萄糖胺C-2胺与凝胶部分地交联，虽然展示出在植入时的生物降解，未发现引起大鼠的特应性皮炎反应，且大鼠没有表现出体重下降或嗜睡。被重乙酰化到35％脱乙酰度的相同高程度脱乙酰的壳聚糖被发现保持可溶于稀释的乙酸溶液(仍然能被定义为壳聚糖)和能够被制备为敷料形式以用于大鼠植入研究。这种低的脱乙酰度(35％)被发现在植入后快速降解，但没有表现出在也迅速降解的更高程度的脱乙酰壳聚糖的情况下发现的任何不利系统毒性反应。也制备了重乙酰化甲壳素(接近0％脱乙酰度)。它不溶于稀释的酸性水溶液。该重乙酰化甲壳素也展示了生物降解性和没有不良的全身毒性。
从植入研究中的大鼠采集的血液样本展示了与细胞因子IL-1β的上调相关的不利的全身毒性，细胞因子IL-1β是白介素1的细胞因子家族的成员。这种细胞因子是由活化的巨噬细胞作为蛋白原而产生的，其通过胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)被蛋白水解加工成其活性形式。这种细胞因子是炎症反应的重要介体，并且涉及各种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。
改良AST测试包括在可生物降解的壳聚糖的情况下在溶菌酶中处理(在37℃在0.37％w/w的溶菌酶溶液中24小时)的初始步骤，以用降解产物灌注(prime)病变系统。为了在AST洗脱液中溶解壳聚糖，测试材料中的残余乙酸通常较高(>5％w/w)。为了确保检测到任何全身效应，使用了高浓度的测试组合物(剂量≈2000mg/kg，～40mg每～20g动物)。用于标准AST测试的3天正常测试窗口延长至用于改良测试的7天。此外，增加了更多的观测准则，包括监测实验动物的毛囊-勃起反应、出现病变、显示脱发以及标准的嗜睡、食欲不振和体重减轻。另外引入排名机制以分级病变的严重程度。在改良AST测试的情况下，对照组盐水包含0.37％w/w的溶菌酶。通常所述改良AST测试是在相同条件下和在相同的时间周期上与标准非降解(非溶菌酶处理的)的样品结合运行的。这允许对与样品中的残留酸相关的任何毒性效应的控制。
下面的实施例仅用于公开和不以任何方式意在限制本文中一般性描述的本发明。
例1
在壳聚糖组合物中减少的酸含量和细胞渗透性
在本发明的组合物中低的(5％w/w)至最小的(<1％w/w)残余酸盐含量通过除去与壳聚糖酸盐直接相关的组合物溶解效应和细胞毒性而增强了本发明组合物的生物相容性。在壳聚糖基质中的壳聚糖酸盐为较低级别(<3％w/w)时，组合物中的壳聚糖基质的原始结构被维持为润湿的，且活细胞容易穿过基质渗入。图1-A和图1-B显示2个组织病理学载玻片(大鼠，皮下植入七天后)，展示在测试组合物中出现的酸盐对细胞渗透到组合物中的能力的影响。
图1-A和图1-B所示的组合物是壳聚糖(88％DDA，没有凝胶)压缩组合物。如前所述，这些组合物的制备包括将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中、将壳聚糖乙酸水溶液混合物浇注到模腔中、冷冻和低温诱导冰和模制的壳聚糖乙酸盐糕状物的相位分离、升华所述冰、从干燥的糕状物挥发乙酸(或不)、和热压缩所述干燥的糕状物。
在图1-A中，由于酸的存在(>5％w/w)，所述组合物的壳聚糖材料为球形(失去了初始的矩阵结构)和无细胞渗透性，但在图1-B中当酸被基本上除去(<3％w/w)后，所述组合物的壳聚糖基质保持其原有的层状结构，出现纤维状，并显示出相当大的细胞渗透性。在图1-B所示的所述组合物中通过挥发过程将酸除去至不超过3％w/w。
该实验表明，组合物酸含量大于5％w/w时将对壳聚糖材料的生物吸收速率有不利影响。该研究的结果表明在较高酸含量的壳聚糖基质中初始的冷冻干燥的内部互连的层结构的失去和不良的细胞毒性。互连的多孔结构的失去和细胞毒性的这种结合严重地限制了诸如中性粒细胞、白细胞和单核细胞的细胞渗透到组合物中的能力。因为主要负责生物材料降解过程的是细胞渗透性和吞噬，由水溶性的细胞毒性的壳聚糖酸盐诱发的限制的细胞渗透性不利地影响了生物降解以及因而生物吸收的速率。
此外，本发明人已经确定，更高的酸盐重量百分比，例如大于8％w/w，可能在腹膜植入的情况下诱发酸中毒毒性。因此本发明人确定，在植入的壳聚糖中将酸盐的存在降低至低于8％w/w有助于壳聚糖的吸收和降低酸中毒毒性的危险。
然而，本发明人还确定，从组合物中去除或基本上去除酸将降低组织粘附性特性。基于组合物中酸存在的量的这种改变的粘附性可被用于将组合物定制用于各种止血应用等，以使这些组合物具有或多或少的粘附性并考虑到预期应用的毒性耐受性。
例2
在50:50壳聚糖:凝胶压缩组合物中降低的酸含量和细胞渗透性
使用了两种不同的方法，以努力实现低酸50:50壳聚糖:凝胶压缩组合物的增大粘附功效，所述组合物是发泡的或不发泡的。
这两种方法都通过挥发过程将酸除去至足以实现粘附的水平(2％-5％)，而且除去足够的酸，使得与细胞毒性或酸中毒相关的毒性不是主要关心的问题。
第一种方法由在低酸处理之前具有高粘附性的组合物形式开始，目的是保持足够的粘附性以满足低酸处理后的功效目标。第二种方法涉及由本发明人开发的一种新型的低酸生产工艺，用于温和地去除酸以减少水分对组合物的微观结构的影响。第二种方法使用低水平的挥发性较低的共酸(例如乳酸、乙醇酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等)，在较易挥发的酸已通过包含热和湿度的挥发处理而基本上除去后，所述共酸残留在壳聚糖组合物中。
有趣的是，将组合物中的乙酸降低至接近3％w/w的低含量会引起压缩的50:50壳聚糖：凝胶组合物的增强的粘附性，与乙酸含量较高的压缩50:50壳聚糖：凝胶组合物(20％w/w)相比。
图2示出对于两组成对的压缩50:50壳聚糖：凝胶组合物的模拟动脉伤口密封(SAWS)的结果。SAWS提供了标准的HemCon组合物在附加到平坦PVC表面时能抵抗的突发失效阈值，其中应力在在室温下在8mmHg/s(毫米汞柱/秒)的动态斜率条件下通过牛全血的中央4毫米直径柱垂直于该PVC表面而施加。在此压力斜升之前，在室温下在牛全血中有一个预附加10秒浸没，以及紧接其后的三分钟的55kPa压力附加应用以将润湿的组合物附加到该PVC表面。
在图2中，显示了来自两对相同的压缩50:50壳聚糖：凝胶组合物的结果，区别在于，第一对包括发泡的壳聚糖：凝胶组合物且所述第二对包括尚未发泡的壳聚糖：凝胶组合物。第一对压缩50:50壳聚糖：凝胶发泡组合物表明，低酸(-3％w/w)的组合物具有1800mmHg的失效压力而包含接近20％w/w酸含量的组合物具有950mmHg的失效压力。第二对压缩50:50壳聚糖：凝胶非发泡组合物表明，低酸(～3％w/w)的组合物具有1300mmHg的失效压力而含有接近20％w/w酸含量的组合物具有700mmHg的失效压力。
因此，本发明人确定，与非发泡的对应组合物相比，包含低酸含量(～3％w/w)的压缩50:50壳聚糖：凝胶泡沫组合物展示了增大的粘附性。
例3
含有不同程度脱乙酰的壳聚糖的50:50壳聚糖：凝胶的发泡压缩组合物的比较体外生物吸收测试
在溶菌酶中在37℃下测试了50:50壳聚糖：凝胶发泡和压缩的组合物对吸收的随时间变化的敏感性，所述组合物仅仅是脱乙酰(DDA)程度不同。如图3所示，随着DDA降低，所述组合物在溶菌酶中变得越来越对时间依赖性的吸收敏感。所述组合物使用相同的方法制备。所述组合物用Primex壳聚糖(DDA>80％)、非乙酰的超纯FMC Novamatrix壳聚糖(DDA>85％)和乙酰化超纯FMC Novamatrix壳聚糖进行处理。获得了用作测试组合物的不同程度的脱乙酰化：71％、63％和35％。
测试组合物在37℃悬浮在0.37％w/w的溶菌酶溶液中。定期对样品作出目视检查。在正常的工作日(上午8时至下午5时)每天进行目视检查，每天的开始和每天的结束分别至少一次检查。将通过在样品溶菌酶悬浮水溶液中出现样品碎片表示的第一次出现降解的时间记录为降解的初始时间。在测试混合物中不再可以观察到悬浮样品碎片的时间记录为100％降解的时间。
例4
各种组合物的大鼠腹腔生物吸收的比较研究
进行了大鼠腹腔吸收的研究，以确定各种组合物的吸收性和生物相容性，所述组合物包括具有从88％脱乙酰的不同程度脱乙酰的壳聚糖至完全重乙酰化的壳聚糖(0％DDA)。
a.测试组合物的成分和制备
图9-A和图9-B提供在例4～8中使用的所有样品和对照组合物、处理方法、尺寸、压缩和密度的主表。样品A、B、C、E、F、G、H、I、J、K和M以及对照组合物AC和AD在例4的大鼠植入物研究中使用。
从挪威的FMC Novamatrix公司获得了具有88％DDA和63％DDA的壳聚糖，作为超纯级壳聚糖。所述材料为灰白色粉末，含有小于0.5％的不溶物、小于1％的灰分成分、小于0.3％的蛋白质成分、小于10pm的重金属和小于10cfu/g(细菌菌落个数/克)的生物负荷。壳聚糖分子量为数值平均大于60kDa。内毒素分析在接收到的材料上进行并证明内毒素EU小于10EU/g。在这些研究中使用的水为注射用水。乙酸来自Emprove公司，为100％纯度。凝胶(来源于猪)来自Gelita公司并含有小于90EU/g的内毒素。所述凝胶有286g菌绒，pH值5.54，0.01％灰分含量，和小于100cfu/g的生物负荷。微分散的氧化纤维素(聚葡糖醛酸酐的Na/Ca盐)来自Synthesia AS公司(捷克共和国)，作为生物医学级材料。交联剂1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自Pierce公司，目录号22980。乙酸酐是来自JTBaker公司的试剂级ACS。最终重乙酰化壳聚糖的红外分析表明，没有任何残留的O-乙酰酯官能度(1850cm-1处的吸收)。
在环境生物负荷被监测的受控环境下进行所有组合物的制备。通过冷冻和冷冻干燥在2％w/w的含水乙酸溶液中的2％w/w壳聚糖水溶液或在2％乙酸水溶液中的1％w/w凝胶和1％w/w壳聚糖水溶液来制备所述组合物。测试植入样品B、C、E、F、G、H、I、J、K和M接近14毫克质量，而与EDC交联的植入物样品A为5毫克质量。在凝胶壳聚糖组合物(样品A)的情况下，EDC加入到碳酸、酸化水的混合物(在不存在其它酸)中以交联基质。另一个组合物(样品I)包括在与壳聚糖组合的微分散的氧化纤维素(MDOC)。两个组合物由通过施加乙酸酐(样品K和M)已从88％程度脱乙酰被重乙酰化的壳聚糖制备。冷冻干燥后，含水量等于或低于5％w/w水分的组合物在80±1℃从接近7至8毫米厚度被热压缩至2毫米或1毫米厚度(只有样品A被制备为2毫米厚)。
在氧化的纤维素基体(SurgicalTM)和假手术组的对照下对十一个测试组合物进行了调查。所述测试组合物所含的壳聚糖具有约88％、71％、63％、35％(重乙酰化)和0％(重乙酰化)的脱乙酰度。
B.测试对象
麻醉大鼠(大鼠，来自Sprague Dawley，雄性，120-200g，每种条件和时间点N＝6，除了N＝4的假手术组外)，准备了无菌手术室和进行腹侧切口以检查腹膜腔。通过放置和保持在撕裂伤口上而将测试组合物片(5mm×10mm×1mm，14mg)安装在肝脏上2分钟，导致停止出血，且手术部位被关闭。通常壳聚糖在保持2分钟后能很好地粘附在肝脏上，而对照的SurgicelTM是非粘合性的，只是通过在其非织造结构周围和透过所述非织造结构的血液凝固而停留就位。动物返回到它们的笼子中从麻醉中恢复。向动物提供水和食物，并监测食欲不振或嗜睡的迹象。通过注射致死剂量的巴比妥酸盐处死动物。测试样品对于手术人员及病理学家是盲法研究的，直到病理报告完成。
最初植入时间被设计为49天和97天，然而在研究的早期意外发现真皮病变时，它被改变为7和28天的较短时间。从每个受试者收集血液标本、标靶器官、真皮病变活组织检查(如果存在的话)和植入的测试组合物(如果存在的话)。在零时间和植入时间测试所有的血样。在植入时间，受试者进行一般健康检验，以及为测试组合物、测试组合物碎片、器官健康、受伤肝叶的愈合和手术粘连进行腹膜腔的目视检查。测试组合物的任何碎片被认为不期望的。在不同测试样品形式的碎片和真皮病变的发生率列于图10中。
真皮病变(图10)在动物的耳朵、鼻子、嘴、脚和尾部周围的暴露皮肤上是清晰可见。一旦受试者不是盲法研究的，可以发现病变只存在于具有63％DDA的壳聚糖的测试对象组中。在大鼠腹膜内空间中的受伤肝脏上植入测试组合物后约三到四天出现病变。在植入后经过近10天真皮病变消退。该生物吸收研究终止很早，以允许判断引起真皮病变的可能原因。样品制备的条件、盲法研究、样品的处理和低的残余酸度被足够好地控制，以消除污染事件和手术程序问题的可能性。仅在63％DDA的壳聚糖组一致出现的病变提出了材料炎性/毒性问题。
其中观察到病变的材料组合物包含快速吸收壳聚糖，它具有的63％脱乙酰程度和未反应的C2胺官能度(即没有交联或与亲电物质等反应的)。
在生物吸收、不存在真皮病变、没有在体内的碎片、控制出血的能力(图10中没有计入)和优异的组织病理学方面，表现最佳的样品是50:50壳聚糖：凝胶发泡和压缩的组合物(样品K)，它通过将88％DDA的壳聚糖重乙酰化至～35％DDA的壳聚糖。该组合物也不会引起真皮病变或碎裂，并表现出在植入后28天内基本上但不是全部被吸收。图4-A、图4-B以及图5-A、图5-B分别展示出在8和28天时到50:50壳聚糖：凝胶发泡和压缩的组合物样品K中的期望的活性细胞渗透性。图6-A和图6-B分别预测在90天内完全吸收(至少85％被吸收)测试组合物样品M和K的时间，基于在植入后0、8和28天对取出的材料测试组合物的组织切片的横截面面积的测量。
例5
在生物吸收上的细胞因子提升
为了鉴定在例4中如上面讨论的大鼠吸收模型中观察到的真皮病变的来源，考虑了一些细胞因子的可能性。选择细胞因子IL-1β进行研究，因为它是白介素1细胞因子家族的成员。这种细胞因子是由作为蛋白原的活化的巨噬细胞产生的，它通过胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)被蛋白水解加工成其活性形式。这种细胞因子是炎症反应的重要介体，并且涉及包括细胞增殖、分化和凋亡的各种细胞活动。
使用从显示出病变的例4的大鼠测试对象、以及没有显示病变的对照受试者和测试对象所收集血液的血清来在体外进行IL-1β中提升的研究。据推测，如果测试组合物活化了巨噬细胞，其转而产生IL-1β，这可以解释所出现病变类似于特应性皮炎。也有人推测，巨噬细胞活化和随后的细胞因子提升取决于在生物吸收过程中壳聚糖材料被活性分解为其生物降解产品。
使用标准ELISA(RandD系统，Quantikine大鼠IL-1/IL-1F2免疫，目录号RLB00)测试血液血清。测试了在植入后七天的来自例4的大鼠的血清样品。血液血清测试的结果表明，具有病变的大鼠与无病变的大鼠相比展示出统计上显著(P<0.01)的IL-1β提升(参见图7)。图7中的0-18总病变规格是基于病变排名指数0-4(参见图8-A、图8-B、图8-C和图8-D)在来自6只动物的结果上被求和的总和。病变得分规格如下分配病变评分：没有观察到病变为零；轻微至红色或结硬皮为1；中度至红色带有硬皮为2；中度或重度溃烂为3；严重到脱落和坏死为4。
图8-A示出带有评为3的尾巴病变的大鼠90-14A。图8-B示出眼睛评为3且耳朵评为2的一个例子。图8-C示出大鼠的鼻子和嘴评为3。图8-D示出大鼠的鼻子和嘴评为3。与此发现相一致，含有交联的壳聚糖的组合物没有表现出提升的IL-1β，包括含有大于70％和小于40％DDA的壳聚糖的组合物没有表现出提升的IL-1β，而包含具有超过35％但小于70％例如63％的脱乙酰程度的壳聚糖材料的组合物表现出提升的IL-1β以及特应性皮炎。
本发明人发现，真皮病变的发生是材料介导的，而且吸收过程引起壳聚糖的变化，这介导了细胞因子提升。本发明的发明人还令人惊奇地和出乎意料地发现，包含被重乙酰化至低于40％DDA的壳聚糖的组合物，以及具体地说，包含被重乙酰化至约35％DDA的壳聚糖的组合物被快速地生物吸收而不引起IL-1β细胞因子的上调(up regulation)。
例6
用于生物可吸收的壳聚糖的生物相容性的快速筛选测试
明显的是，包含非交联的63％DDA的壳聚糖的组合物的腹膜内植入导致了大鼠的真皮病变。无论所述63％脱乙酰程度(DDA)的壳聚糖是从甲壳素直接脱乙酰而生产的，还是从高纯度88％DDA的壳聚糖重乙酰化而生产的，所述包含65％DDA的生物可吸收的壳聚糖的组合物产生了提升的IL-1β和过敏性皮炎。大鼠血清的IL-1β测试结果支持了以下认识，来自包括具有约63％DDA的壳聚糖的组合物的降解过程或降解产物激活了血液中IL-1β的不希望的巨噬细胞产生。
根据国际标准化组织(Biological evaluation of medical devices(医疗器械的生物学评价)，Pt 1，ISO 10993-1)进行的用于快速生物可吸收的植入材料(有限的植入物接触持续时间)的标准生物相容性测试表明，具有63％DDA的壳聚糖具有用于植入的可接受的生物相容性。所进行的标准ISO 10993-1测试包括用于细胞毒性、刺激性和急性全身毒性的测试。
然而重要的是，因为ISO 10993-1标准测试不能预测在生物吸收过程中观察到的真皮病变，本发明人开发了一种改良的急性全身毒性测试(AST)，称为小鼠病变测试(MLT)。此外，本发明人开发MLT以提供了一种可靠的测试，它不需要手术植入以筛选生物相容的生物可吸收壳聚糖。这是因为手术植入研究需要高技能人才、特殊的手术设施以及对使用动物的许可，并且会消耗显著的开发资源。
该MLT测试方法已如前描述在本发明公开说明书的C部分。MLT是对小鼠的标准ISO10993-1急性全身测试的变形。MLT和AST之间在测试方法上的差别如下：(1)MLT利用比标准AST规定更高浓度的测试组合物；(2)MLT测试窗口由3天延伸到7天；(3)除了体重减轻和/或死亡之外，有额外的用于测试实验室的观测接受/失败的标准；和(4)测试的壳聚糖材料是通过使用溶菌酶以生物降解产品灌注系统而无菌地预降解。MLT是一种低成本的测试，可以用作标准测试以在收缩的测试实验室中快速有效地筛选制备生物可吸收的聚β-(1-4)-N-乙酰基-D-葡萄糖胺(甲壳素和壳聚糖)，以避免与生物降解产品的形成有关的不期望的IL-1β提升。与在AST测试中所使用的体重减轻和/或死亡的标准毒性接受/失败反应一样，MLT包括毛囊-勃起、嗜睡、脱发和出现病变，因为这些是提升的细胞因子反答的各种表现。在开发的MLT中的剂量方案是2000mg/kg(40mg/20g小鼠)，与生物吸收指南ASTM F2150-07、ASTMF1983和ISO 10993-9一致，并提供了存在或缺乏与一些壳聚糖的生物吸收有关的急性IL-1β反应的明确指示。
对来自大鼠吸收研究的样品，包括来自例4的样品C和样品K，使用MLT测试进行了测试(N＝5)。测试了其中观察到病变的样品C(含有<5％w/w酸成分的压缩组合物，包括其中采用直接脱乙酰化制备的63％DDA的壳聚糖)和其中没有观察到病变的样品K(含有<5％w/w酸成分的压缩组合物，包括发泡的50:50壳聚糖：凝胶，其中通过使用将88％DDA的壳聚糖重乙酰化至约35％DDA而制备壳聚糖)。
在小鼠的样品C和样品K的测试结果之间可以见到区别。对于用溶菌酶预降解的样品C的测试样品，在第4天，所有受试小鼠记为病变0分；然而，实验室技术人员指出，动物的皮肤出现粗糙。动物是活泼的、警觉的、反应灵敏的。在第5天，所有受试小鼠标记为病变1分(轻度)。在第6天，所有测试小鼠标记为病变2分(中度)。注意到它们遍及全身有变红、增厚和硬皮。它们的眼睛眯起，且周围组织出现粉红色和肿胀。它们还出现小幅脱水。水瓶被检查且是功能性的。注意到动物的毛发变为片状，特别是在上腹部。对于用溶菌酶预降解的样品K的测试样品，在测试或对照组没有出现病变。所有的小鼠看起来是正常的和保持健康，直到作出研究结论(7天)。
样品O、P、Q、R、S、T、U和V包括相同的起始超纯88％DDA的壳聚糖，其被重乙酰化至最终DDA，这些样品之间的唯一区别(除了没有用溶菌酶预先降解的对照组之外)是从含水乙酸酐重乙酰化壳聚糖的程度。所有样品O、P、Q、R、S、T、U和V是具有<5％w/w酸成分的压缩组合物，含有发泡的50:50壳聚糖：凝胶，其中，通过使用88％DDA的壳聚糖重乙酰化至所需的DDA来制备壳聚糖。样品D通过采用含有<5％w/w酸成分的压缩组合物来制备，所述组合物包括采用直接脱乙酰化制备的63％DDA的壳聚糖。
如图9所示通过使用88％DDA的UP FMC壳聚糖来制备样品参考编号N的组合物。
样品AB从食品级葡萄糖胺制备，且意欲作为对聚β-(1-4)-N葡萄糖胺单体的对照组。
图10中的所有样品都在40mg/ml测试。将1ml的样品降解前提取物注射到20g小鼠的腹膜内腔中，以提供2000mg/kg的剂量。所有测试均进行7天的测试周期，其中在存活的动物中在第4天出现毒性症状，在第7天出现最高的水平。在图11提供该MLT测试的结果。
如图11所示，该MLT测试表明，包含具有35％DDA或低于30％DDA的壳聚糖的组合物没有产生临床毒性迹象，如毛囊勃起、嗜睡、体重减轻、脱发、病变和死亡。相比之下，包含具有45％、60％和63％DDA的壳聚糖的组合物产生了临床毒性迹象，包括毛囊勃起、嗜睡、消瘦、脱发、病变和死亡中的一个或多个。因此，该测试辅助的对生物相容性DDA的识别给出的壳聚糖范围是低于45％DDA和包括35％DDA以及小于30％DDA。
例7
功效
评价了原型的壳聚糖止血测试组合物W、X、Y和Z与对照组AE和AC在中度和强健的出血性流血的猪模型中的止血功效。
包括所述的(参见图9)50:50凝胶：壳聚糖溶液的压缩组合物W、X、Y和Z使用由超纯88％DDA的壳聚糖制备的壳聚糖，所述超纯88％DDA的壳聚糖被重乙酰化至期望的DDA且也涉及如例4中所述在冷冻和冷冻干燥之前使溶液发泡。溶液被发泡是因为本发明人发现，发泡组合物能够显著改善组合物的柔韧性和使所述组合物易于应用的组织顺应性以及增强止血功效。通过搅打所述混合物引入充气来实现将50:50壳聚糖：凝胶溶液发泡至接近0.6g/cm-3的密度。
如图12所示，测试组合物也使用在约2.7％w/w至约5％w/w之间范围内的低酸成分。
在两个难以控制的渗血手术出血和高压大量外伤型出血的情况下评估了测试组合物的止血功效。
麻醉了80磅到130磅重的健康猪，开腹以暴露腹腔。以避免血管、泌尿、胆汁和淋巴结构创伤的方式进行暴露。
采用了肝囊剥离或脾包膜剥离之后的急性肝素化出血的猪薄壁组织模型，因为这两种薄壁组织出血的模型是典型的难以控制的渗血手术出血。一共有17头猪被测试了肝素化的肝囊剥离和脾剥离中的任一个或两个。
对于肝囊剥离和脾剥离都被进行的动物，使用的创伤是：一个伤口产生在两个肝叶(左内侧和左侧)的每个上，一个伤口产生在脾上。注射肝素(10,000u)用于维持大于250秒的活化凝血时间(ACT)。每15分钟测试一次ACT，且追加注射肝素(10,000u)以维持ACT>250秒。对在脾脏和肝脏上的2cmx2cmx0.3m的囊剥离伤口进行止血测试。测试和对照组合物被切割，使得2cm×2cm的片段将被塞在伤口中，以及5cm×5cm的片段放置在其上和在伤口上。对肝脏或脾脏的成功测试是，在施加的组合物上用4“×4”、48层外科纱布保持均匀压力三分钟后，没有后续的出血，且在移去压力20分钟内无出血。
用猪主动脉穿刺模型一共测试了3头猪，这是严重的失血性出血的很好的模型。这些猪没有肝素化。通过将～25cm直径的圆形牵开器放置在腹腔中紧邻在主动脉上来暴露腹主动脉。主动脉的伤口通过使用3mm的手术刀切开主动脉和使用4mm直径的血管穿刺器出去连续的4mm直径的一段主动脉而制成。使用HextendTM输液将平均动脉压(MAP)保持在接近60mmHg。测试和对照组合物为5cm×5cm。通过用MAP保持位于或接近60mmHg，以及除去先前的敷料和用盐水润湿的干净纱布擦拭紧邻伤口周围的区域以除去任何壳聚糖残余物，动物中的伤口可以使用多达6次。对主动脉上的成功测试是，在施加的组合物上用4“×4”、48层外科纱布保持均匀压力三分钟后，没有立即出血，且在移去压力30分钟内无出血。
在手术过程中观察到，低酸含量的组合物虽然一般与较高酸含量的组合物相比对组织的粘附性较低，但增大了对溶解的抵抗力且仍然表现出非常好的效果。另外，低酸含量的组合物的降低的粘附性有利地导致在去除时最低的组织创伤以及易于清理残余物。
图12中的测试结果表明，包括具有35％DDA的壳聚糖的组合物在67％的对肝素化的肝囊剥离模型中测试的猪是有效的。测试结果还表明，包括具有小于或等于30％DDA的壳聚糖的组合物在63％的对肝素化的肝囊剥离模型中测试的猪、在80％的对肝素化的脾囊剥离模型中测试的猪以在100％的对猪主动脉穿刺模型中测试的猪是有效的。
例8
35％DDA壳聚糖的生物吸收性、生物相容性和止血
如例4所述通过使用壳聚糖制备了包括使用50:50凝胶：壳聚糖发泡溶液的压缩组合物，所述壳聚糖用被重乙酰化至20％DDA的超纯88％DDA的壳聚糖制备，所述具有接近或低于5％的酸含量。
图13示出了这些组合物在28天大鼠腹膜内吸收、生物相容性(MEM洗脱、AST、MLT、刺激)以及如例7所述的猪止血测试的测试结果，相对于市售的由氧化纤维素组成的止血吸收对照组合物SurgicelTM。
该测试组合物在植入后28天内被生物吸收约30％，展示了良好的细胞毒性、良好的急性全身毒性、可接受的低刺激性分数，以及在难以控制的外科手术式出血或高压大流量外伤创伤型出血的一些出血情况中有效的止血控制。所测试的组合物满足了可吸收的组合物的所有要求，并证明在止血功效方面优于市售的对照组。

Claims (10)

1.一种已降低胺官能度壳聚糖组合物，包含具有90kDa至170kDa的分子量和在15％和40％之间的N-脱乙酰程度的壳聚糖材料。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物包含最初溶于pH低于或等于6.5的水溶液中的壳聚糖。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述壳聚糖材料是非交联的。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述壳聚糖材料是与凝胶和胶原中的至少一种交联的。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物是生物相容的和生物可吸收的中的至少一种。
6.一种制造已降低胺官能度壳聚糖组合物的方法，包括：
获得具有至少75％的N-脱乙酰程度的脱乙酰的壳聚糖材料；
将所述脱乙酰的壳聚糖材料溶解在酸化的水溶液中；
从所述脱乙酰的壳聚糖材料生产具有在15％和40％之间的N-脱乙酰程度的已降低胺官能度壳聚糖材料；
将所述已降低胺官能度壳聚糖材料重新溶解在酸化的水溶液中；和
使结合至所述已降低胺官能度壳聚糖材料的残留的酸。
7.根据权利要求6的方法，还包括将所述已降低胺官能度壳聚糖材料与凝胶和胶原中的至少一种交联。
8.一种组合物，包含具有在15％和小于30％之间的N-脱乙酰程度的已降低胺官能度壳聚糖材料。
9.一种组合物，包含具有在15％和40％之间的N-脱乙酰程度的已降低胺官能度壳聚糖材料并且包含2％(w/w)至5％(w/w)之间的酸含量。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物是生物相容的和生物可吸收的。
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