FR3016882A1

FR3016882A1 - Procede de preparation de chitosane a haut degre d’acetylation

Info

Publication number: FR3016882A1
Application number: FR1450716A
Authority: FR
Inventors: Sebastien Francois; Sebastien Ladet; Muriel Guerin
Original assignee: Sofradim Production SAS
Current assignee: Sofradim Production SAS
Priority date: 2014-01-30
Filing date: 2014-01-30
Publication date: 2015-07-31
Also published as: EP2902401A1; US9527929B2; US20150210780A1; EP2902401B1

Abstract

La présente invention porte sur un procédé de préparation de chitosane de degré d'acétylation DAr à partir de chitosane β ayant un degré d'acétylation DAi inférieur à DAr, comprenant au moins une étape de purification et au moins une étape d'acétylation dudit chitosane β, ladite étape de purification comprenant au moins une étape de solubilisation dudit chitosane β dans un milieu aqueux acide et au moins une étape de précipitation dudit chitosane ainsi solubilisé, dans lequel ladite étape d'acétylation est réalisée en solution sur ledit chitosane solubilisé avant ladite étape de précipitation.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de chitosane ayant un degré d'acétylation déterminé, en particulier un degré d'acétylation au-delà de 40%, à partir de chitosane p de plus faible degré d'acétylation, avec une bonne reproductibilité et une bonne précision.

Le chitosane est un polysaccharide issu de la désacétylation de la chitine. La chitine est, avec la cellulose, le polysaccharide naturel le plus répandu sur terre. La chitine est par exemple présente dans les exosquelettes des arthropodes, les endosquelettes des céphalopodes ainsi que dans les 10 champignons. La chitine est un biopolymère constitué de la répétition d'unitésp(1- 4) N-acétyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Le chitosane est obtenu par désacétylation extensive de la chitine. Il est ainsi composé d'unités 13(1-4) Nacétyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose et d'unités 2-amino-2-deoxy-D-glucose. Le 15 degré d'acétylation (DA) d'un chitosane est le pourcentage d'unités 13(1-4) Nacétyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose par rapport au nombre total d'unités 13(1-4) N-acéty1-2-amino-2-deoxy-D-glucose et 2-am ino-2-deoxy-D-g lucose constituant ce chitosane. Ainsi, du point de vue chimique, la chitine et le chitosane se différencient l'un de l'autre essentiellement par leurs degrés d'acétylation qui 20 leur confèrent des propriétés différentes : en particulier, contrairement à la chitine qui est insoluble dans la majorité des solvants connus, le chitosane est soluble dans des solutions aqueuses faiblement acides et peut en conséquence être facilement traité et/ou transformé. Le chitosane se différencie donc de la chitine en premier lieu par sa capacité à être soluble en 25 milieu aqueux. Le degré d'acétylation du chitosane peut varier de 0 à environ 55%. Par ailleurs, on trouve la chitine principalement sous deux formes cristallines différentes : la chitine a et la chitine R. La chitine a est essentiellement extraite d'exosquelettes d'arthropodes tels que le homard, le 30 crabe, la crevette, tandis que la chitine p est extraite de l'endosquelette de céphalopodes tels que le calamar. La chitine a présente des chaînes polysaccharidiques disposées de façon antiparallèle entre plans de chaîne successifs, ce qui donne naissance à de nombreux ponts hydrogène. Une telle structure confère à la chitine a une 35 rigidité importante et une faible réactivité vis à vis de la désacétylation. La chitine a n'est pas soluble dans les solvants aqueux et ne gonfle que très faiblement en milieu aqueux. La chitine 13 présente au contraire des chaînes polysaccharidiques toutes parallèles entre elles ; les ponts hydrogène y sont moins nombreux, ce 5 qui confère à la chitine 13 une meilleure réactivité et hydrophilie. La chitine 13 présente ainsi la capacité de gonfler fortement dans l'eau. Comme vu ci-dessus, de par sa solubilité en milieu acide aqueux, le chitosane peut facilement être traité ou transformé. Par ailleurs, le chitosane possède des propriétés, telles que biodégradabilité, biorésorbabilité, 10 biocompatibilité, non toxicité, propriétés mécaniques, qui le rendent particulièrement intéressant pour des applications médicales. Ainsi, on peut incorporer du chitosane dans des dispositifs médicaux comme constituant d'implants, par exemple sous la forme d'éponges ou de films pour des renforts de paroi abdominale, ou encore comme excipient ou support pour des 15 systèmes de libération contrôlée de médicaments. Le secteur pharmaceutique et médical s'intéresse également aux propriétés coagulantes, cicatrisantes et de relargage contrôlé d'agents thérapeutiques du chitosane. Le chitosane présente également des propriétés antibactériennes et antifongiques. L'efficacité du chitosane dans les applications médicales, et en 20 particulier sa biodégradabilité, sa cinétique de biodégradation ou vitesse de dégradation enzymatique, et ses propriétés mécaniques, dont sa capacité de gonflement en milieu aqueux, sont fonction d'une part de son poids moléculaire et d'autre part de son degré d'acétylation. Ce dernier doit donc pouvoir être atteint et caractérisé de manière rigoureuse et particulièrement de manière 25 reproductible. L'extraction de la chitine des exosquelettes d'arthropodes implique des étapes d'hydrolyse des protéines et des lipides, de dépigmentation et de déminéralisation. Habituellement, l'hydrolyse des protéines et des lipides est effectuée en présence de soude, la déminéralisation nécessitant l'utilisation 30 d'acide chlorhydrique. En ce qui concerne les endosquelettes de céphalopodes, ces derniers étant dépourvus de minéraux, l'extraction de la chitine ne nécessite qu'une étape d'hydrolyse des protéines. Une fois la chitine extraite, le chitosane est obtenu par une étape de désacétylation, qui consiste en une hydrolyse des groupements acétamide. 35 Cette réaction est généralement effectuée à haute température dans une solution alcaline, par exemple une solution de soude (NaOH) à 48% dans de l'eau, à 90°C. Du fait de sa structure cristalline, la chitine 3, qui est extraite des endosquelettes de céphalopodes, présente une meilleure hydrophilie et une 5 plus grande réactivité à la désacétylation. Ainsi, du fait d'une part de sa structure cristalline, et d'autre part d'une étape corrosive moins agressive lors de l'extraction de la chitine 3, le chitosane 3, en particulier obtenu des endosquelettes de céphalopodes, présente également une meilleure réactivité et est particulièrement intéressant pour des applications médicales. Le 10 chitosane R issu de la chitine R peut ainsi atteindre des poids moléculaires impossibles à atteindre avec le chitosane a issu de la chitine a. Le chitosane R obtenu après désacétylation de la chitine R présente un taux d'acétylation relativement bas, généralement de l'ordre de 1 à 10%, lui conférant une très bonne solubilité dans les milieux acides dilués. 15 Toutefois, en fonction de l'utilisation que l'on souhaite en faire, ce chitosane R de faible degré d'acétylation doit par exemple être réacétylé, c'est-à-dire que son degré d'acétylation doit être à nouveau augmenté, par exemple pour lui conférer des propriétés particulières. Ainsi, dans le domaine des implants biodégradables servant de 20 renfort de parois abdominales, on a besoin de composés conférant à l'implant à la fois des propriétés mécaniques assurant la fonction, même temporaire, de renfort et de soutien, et à la fois une biodégradation contrôlée. Ainsi, selon la cinétique de biodégradation souhaitée pour l'implant, le chitosane devra présenter un degré d'acétylation de 20, 30, 40, ou encore 50% ou 55%. 25 De plus, pour de telles applications médicales et/ou pharmaceutiques, le chitosane R doit bien sûr être purifié et parfaitement caractérisé : en particulier, il doit présenter des taux de bactéries, d'endotoxines, de contaminants, tels que métaux lourds et particules insolubles, très bas ; il ne doit comporter aucun risque de contamination virale ; 30 ses paramètres physicochimiques, tels que son poids moléculaire et son indice de polydispersité doivent être contrôlés. Des procédés de purification du chitosane R existent. Toutefois, il a été constaté que l'acétylation d'un chitosane R de départ de faible degré d'acétylation et purifié était peu fiable et peu reproductible dès lors que l'on 35 cherchait à atteindre des degrés d'acétylation supérieurs ou égaux à 40%.

En effet, l'acétylation d'un chitosane 13 de départ à faible degré d'acétylation, par exemple allant de 1 à 10%, est généralement effectuée au moyen d'anhydride acétique, que l'on fait réagir avec la quantité de chitosane 13 que l'on cherche à acétyler dans des proportions stoechiométriques, procédé 5 pour lequel on peut se baser sur un modèle statistique permettant de déterminer a priori la quantité d'anhydride acétique nécessaire comme suit : le nombre (nch-NH2) de fonctions amines à acétyler dépend du degré d'acétylation initial du chitosane (DA) et du degré d'acétylation que l'on souhaite atteindre (DAf). La détermination de cette quantité se fait donc à l'aide 10 de la formule suivante : (nch-NF12) = (nch-NF12)i - (hch-NF12)f Où (nch-NH2); est le nombre de fonctions amines libres du 15 chitosane avant acétylation, i.e. DA, et (nch-NH2)f est le nombre de fonctions amines libres du chitosane de degré d'acétylation DAf que l'on souhaite atteindre, Avec 20 (nch-NF-12);= n total x (1- DA) et (nch-NF12)f = n total x (1- DAf) - DA est le degré d'acétylation initial du chitosane 13, 25 - DAf est le degré d'acétylation final que l'on souhaite atteindre, Et mchitosane X (1 - %eau) n = Mo 30 où -°/oeau représente le taux d'humidité du chitosane 3 initial. La masse Mo considérée est celle d'une unité du polymère de chitosane 13 initial. La masse d'anhydride acétique (maa) à ajouter est obtenue par la relation suivante : total 3016 882 maa = (nch-NH2) x Maa où Maa est la masse molaire de l'anhydride acétique, autrement dit 102,09 g.mo1-1. 5 Un tel procédé permet en général de produire une succession de lots homogènes de chitosane réacétylé avec un contrôle de la cinétique de dégradation du chitosane réacétylé, le chitosane étant réacétylé de manière homogène. Pour déterminer la reproductibilité et la précision d'un tel procédé, on mesure, pour un nombre N d'essais déterminé, la valeur D de la différence entre la valeur du degré d'acétylation final souhaité ou théorique, soit DAf, et la valeur du degré d'acétylation réel ou mesuré sur le produit d'arrivée, autrement dit le chitosane réacétylé, par exemple par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN), soit DA-. On calcule ensuite la moyenne A du pourcentage de différences D par rapport à la cible théorique, et son écart-type (a) par rapport au nombre N d'essais réalisés. Il a ainsi été constaté que dans le cas où le degré d'acétylation théorique était de 40 % ou plus pour la réacétylation de chitosane purifié, la moyenne A et son écart-type a, déterminés comme mentionné ci-dessus, atteignaient des valeurs trop élevées, rendant le procédé peu fiable et non reproductible. Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé permettant à la fois de purifier et d'acétyler un chitosane 13 à faible degré d'acétylation initial, ledit procédé permettant d'atteindre un degré d'acétylation réel mesuré sur le chitosane réacétylé supérieur ou égal à 40%, par exemple proche de 50%, ledit procédé étant fiable et reproductible. La présente invention porte sur un procédé de préparation de chitosane de degré d'acétylation DA,- à partir de chitosane 13 ayant un degré d'acétylation DA, inférieur à DA-, comprenant au moins une étape de purification et au moins une étape d'acétylation dudit chitosane 3, ladite étape de purification comprenant au moins une étape de solubilisation dudit chitosane 13 dans un milieu aqueux acide et au moins une étape de précipitation dudit chitosane ainsi solubilisé, dans lequel ladite étape d'acétylation est réalisée en solution sur 35 ledit chitosane solubilisé avant ladite étape de précipitation.

Ainsi, dans le procédé selon l'invention, la purification et l'acétylation sont effectuées en une seule étape globale. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des chitosane purifiés présentant un fort degré d'acétylation (DA), par exemple allant de 40% à 55%, par exemple d'environ 50%, de manière fiable et reproductible. En particulier, dans le procédé de l'invention, la valeur absolue de la moyenne A telle que mentionnée ci-dessus est par exemple inférieure ou égale à 2%, et son écart-type a est inférieur ou égal à 2%. Ainsi, grâce au procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir du chitosane purifié et ayant un DA élevé de façon précise, et ainsi de l'utiliser dans des applications médicales et/ou pharmaceutiques. Il est ainsi possible de réaliser des implants présentant une cinétique de dégradation totalement prédictible et contrôlée. De plus, comme il apparaîtra de la description qui suit, le procédé 15 selon l'invention permet de s'affranchir de nombreuses étapes de lavage et de séchage consommatrices de temps, étapes que l'on retrouve généralement dans les procédés connus où le chitosane est purifié avant d'être acétyle. Le chitosane 13 de degré d'acétylation initial DA constituant le matériau de départ du procédé selon l'invention peut être obtenu par 20 désacétylation de chitine 13 de la manière suivante : la chitine 3, par exemple extraite d'endosquelette de calamars broyés, comme décrit ci-dessus par hydrolyse des protéines, est lavée dans de l'eau puis centrigugée. Elle est ensuite séchée. La chitine ainsi broyée subit une étape de déprotéinisation à 25 température ambiante (environ 20-25°C) : pour ce faire, la chitine sous forme de poudre est mélangée à une solution de NaOH 1N pendant 24h. La chitine est ensuite lavée dans des bains d'eau successifs. La chitine ainsi lavée est désacétylée afin d'obtenir le chitosane : lors de cette étape, la chitine lavée est introduite dans un bain de NaOH 50% 30 (en poids) à 90°C pendant 20 min puis elle est lavée. Cette étape est répétée une deuxième fois. Le produit obtenu est séché en étuve : il s'agit du chitosane de faible degré d'acétylation. On obtient du chitosane 13 présentant un faible degré d'acétylation, 35 autrement dit un degré d'acétylation allant d'environ 1% à environ 10%, par exemple allant de 2 à 6%.

Les publications suivantes décrivent également des procédés de désacétylation de la chitine 13 pour obtenir du chitosane de faible degré d'acétylation : « Lamarque, G., C. Viton, and A. Domard, New Route of Deacetylation of a- and /3-Chitins by Means of Freeze-Pump Out-Thaw Cycles. 5 Biomacromolecules, 2005. 6(3) :p. 1380-1388.", "Lamarque, G., C. Viton, and A. Domard, Comparative Study of the First Heterogeneous Deacetylation of a-and /3-Chitins in a Multistep Process. Biomacromolecules, 2004. 5(3) :p. 9921001.", "Lamarque, G., C. Viton, and A. Domard, Comparative Study of the Second and Third Heterogeneous Deacetylations of a- and /3-Chitins in a 10 Multistep Process. Biomacromolecules, 2004. 5(5) :p. 1899-1907. », "Tolaimate, A., et al., Contribution to the preparation of chitins and chitosans with controlled physico-chemical properties. Polymer, 2003. 44(26): p. 79397952. » Le degré d'acétylation du chitosane peut être caractérisé par 15 exemple par l'une des méthodes suivantes : spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), spectrométrie UV, résonance magnétique nucléaire (RMN). Dans la présente demande, les degrés d'acétylation DAi, DAr et DAf sont caractérisés par la spectrométrie par Résonance Magnétique 20 Nucléaire (RMN) selon le protocole décrit dans la publication de Lavertu M. et al «A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan » Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 32 (2003) 1149-1158. Dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, 25 DA va d'environ 1% à environ 10%, par exemple va de 2 à 6%. Le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de purification et au moins une étape d'acétylation dudit chitosane R. L'étape de purification du procédé selon l'invention comprend une première étape de solubilisation du chitosane 13 dans un milieu aqueux acide. 30 Par exemple, la solubilisation peut se faire à l'aide d'acide acétique. Le chitosane 13 peut par exemple être solubilisé dans une solution d'eau déminéralisée en ajoutant une quantité stoechiométrique d'acide acétique. La masse molaire de l'acide acétique est de 60,052 g/mol. La détermination de la quantité d'acide acétique à ajouter se fait en calculant le nombre de fonctions 35 amines potentiellement protonables le long de la chaîne du chitosane.

Le nombre de fonctions amines potentiellement protonables s'obtient par la formule suivante : n(NH2) = m(chitosane) x (1-DA; x 1-% eau M(0) Dans laquelle -% eau représente le taux d'humidité du chitosane de départ et m(chitosane) la masse sèche utilisée. M(0) est la masse molaire du chitosane et se calcule suivant la 10 formule suivante : M(0) = 203xDA; + 161x(1-DA) On détermine ensuite la masse d'acide acétique (100%) à ajouter à l'aide de la formule suivante : 15 m(CH3COOH) = n(NH2) x M(CH3COOH) où M(CH3COOH) est la masse molaire de l'acide acétique, soit 60,052 g/mol. 20 La solubilisation se fait sous agitation jusqu'à obtention d'une solution homogène. Par exemple, la concentration en chitosane peut être fixée à 0,5% (en poids) en solution aqueuse acide afin d'obtenir de préférence une viscosité de la solution finale assez faible. Dans d'autres mises en oeuvre du procédé selon l'invention, la 25 solubilisation peut se faire à l'aide d'acide chlorhydrique, d'acide glutamique, d'acide lactique ou d'un mélange de ces derniers. Selon le procédé de l'invention, l'étape d'acétylation du chitosane est réalisée en solution sur ledit chitosane solubilisé, avant toute étape de précipitation. Ceci permet au chitosane de présenter une très bonne réactivité 30 vis-à-vis de l'acétylation. Dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, une étape de filtration est réalisée après ladite étape de solubilisation et avant ladite étape d'acétylation, afin de supprimer les particules insolubles et les contaminants potentiellement présents dans la solution aqueuse acide de 35 chitosane. La filtration de la solution de chitosane obtenue à l'étape précédente peut par exemple se faire sur des membranes poreuses telles que les cartouches millipore de porosité 1,0/0,5 pm vendues sous la dénomination commerciale « Opticap® XL » par la société Millipore. La solution de chitosane est par exemple versée dans une cuve de filtration adaptée au volume travaillé et elle est mise sous pression avec de l'air comprimé, la sortie de la cuve étant reliée à la membrane poreuse de filtration. Si nécessaire, pour accélérer la filtration si besoin, la solution de chitosane peut être diluée à de l'eau déminéralisée. Une fois la solution filtrée comme décrit ci-dessus, on procède à l'étape d'acétylation.

L'étape d'acétylation comprend l'ajout d'anhydride acétique en proportion stoechiométrique par rapport à la quantité de chitosane à acétyler pour obtenir ledit chitosane de degré d'acétylation La quantité de chitosane à acétyler, autrement dit le nombre (nchNH2) de fonctions amines à acétyler, dépend du degré d'acétylation du chitosane solubilisé (DA) et du degré d'acétylation que l'on souhaite atteindre (DAf). La détermination de cette quantité se fait donc à l'aide de la formule suivante : (non-NF12) = (nch-NF12)i - (nch-NF12)f Où (nch-NH2); est le nombre de fonctions amines libres du chitosane solubilisé avant acétylation et (nch-NH2)f est le nombre de fonctions amines libres du chitosane de degré d'acétylation DAf que l'onsouhaite atteindre, Avec (nch-NF-12); = n total x (1- DA) et (nch-NF12)f = n total x (1- DAf) - DA est le degré d'acétylation initial du chitosane, - DAf est le degré d'acétylation final que l'on souhaite atteindre, Et 3016 8 82 10 Mo La masse Mo considérée est celle d'une unité du polymère de chitosane initial. La masse d'anhydride acétique (maa) à ajouter est obtenue par la 5 relation suivante : maa = (nCh-NH2) x Maa où Maa est la masse molaire de l'anhydride acétique, autrement dit 102,09 g.mo1-1 10 Avant d'ajouter l'anhydride acétique au chitosane solubilisé, on peut ajouter un co-solvant, par exemple du 1-2, propanediol à la solution de chitosane. L'ajout d'un tel co-solvant permet d'homogénéiser la réaction. On ajoute ensuite l'anhydride acétique en proportion 15 stoechiométrique, comme déterminé ci-dessus. L'ensemble est de préférence mélangé sous agitation. Une fois l'étape d'acétylation réalisée, on continue la purification du chitosane par une étape de précipitation pour obtenir un précipité de chitosane. Dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, 20 l'étape de précipitation comprend l'ajustage à un pH allant de 9,5 à 11 du chitosane obtenu après l'étape d'acétylation. L'étape de précipitation peut inclure une étape de désactivation virale. L'étape de désactivation virale est une étape permettant d'hydrolyser les composantes liées aux virus, prions et endotoxines résiduelles. 25 Ainsi, dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'étape de précipitation comprend : - Une première précipitation à pH allant de 9,5 à 12 du chitosane obtenu après l'étape d'acétylation, - Une étape de désactivation virale à concentration molaire de 30 NaOH strictement supérieure à 1N du précipité de chitosane obtenu à l'issue de ladite première précipitation, - Une deuxième précipitation à pH allant de 9,5 à 11 du chitosane obtenu après ladite étape de désactivation virale. m x chitosane (1 - %eau) n total = Par exemple, dans un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on réalise une première précipitation du chitosane obtenu après l'étape d'acétylation, en milieu basique. Par exemple, on prépare une solution de soude 5N. Avant la précipitation, la solution de chitosane réacétylé, autrement dit obtenue après l'étape d'acétylation, est de préférence filtrée. La solution est ensuite portée à un pH allant de 9,5 à 12 pour réaliser la précipitation. Le précipité de chitosane est récupéré par filtration. Dans une forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, une étape de désactivation virale est réalisée sur le précipité issu de cette première précipitation. Par exemple, pour ce faire, le précipité récupéré par filtration est plongé sous agitation mécanique dans une quantité de soude permettant d'atteindre une concentration molaire de NaOH supérieure à 1N, par exemple un pH supérieur ou égal à 12. Par exemple, l'étape de désactivation virale comprend une solubilisation du précipité de chitosane obtenu à l'issue de ladite première précipitation dans une solution d'hydroxyde de sodium. L'augmentation du degré d'acétylation du chitosane par rapport à son degré d'acétylation initial favorise la solubilisation du chitosane lors de cette étape de désactivation virale. Ainsi, à l'issue de l'étape de désactivation virale, le chitosane réacétylé peut de nouveau être sous forme solubilisée.

Dans une forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention, une deuxième précipitation est alors réalisée, cette fois-ci sur la solution de chitosane réacétylé obtenue à l'issue de l'étape de désactivation virale. La solution de chitosane étant fortement basique, par exemple avec une concentration molaire de NaOH supérieure à 1N après l'étape de désactivation virale, la précipitation peut être réalisée à l'aide d'ajout d'acide acétique glacial jusqu'à obtention d'un pH allant de 9,5 à 11. On récupère le précipité de chitosane obtenu, qui est le chitosane purifié. Ce chitosane présent alors un degré d'acétylation Dans une forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention, une étape de lavage est réalisée sur le précipité de chitosane obtenu à l'issue de l'étape de précipitation, autrement dit sur le précipité obtenu à l'issue de la deuxième précipitation lorsque l'étape de précipitation inclut une étape de désactivation virale comme décrit ci-dessus. Cette étape de lavage peut par exemple être réalisée avec de l'eau stérile jusqu'à pH neutre, puis par exemple à l'éthanol jusqu'à obtention d'une conductivité inférieure à 1 pS/cm. 3016 882 12 Dans une forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le précipité de chitosane purifié de degré d'acétylation DA,- lavé est séché, par exemple sous flux laminaire. L'invention et ses avantages ressortiront mieux des exemples ci- 5 dessous. EXEMPLE 1 : (selon l'invention) On dispose de chitosane R obtenu de la manière suivante : broyage 10 de plume de calamar, puis déprotéination de la poudre de plume de calamar dans de la soude 1N, et déacétylation extensive en solution de soude 48% (en poids) pour obtenir un chitosane R de degré d'acétylation initial DA d'environ 3%. La masse molaire du chitosane est de 162,26 g/mol. 15 Dans le présent exemple, les degrés d'acétylation DA et DA- sont caractérisés par la spectrométrie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) selon le protocole décrit dans la publication de Lavertu M. et al « A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan » Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 32 (2003) 1149-1158. 20 On a procédé à la purification et à l'acétylation de chitosane R de la manière suivante : Dans une première étape, 55,38 g de chitosane ont été solubilisés 25 dans 5 litres d'eau déminéralisée auxquels ont été ajoutés de l'acide acétique en quantité stoechiométrique, soit 18,88 ml d'acide acétique. La solubilisation se fait sous agitation à une température d'environ 50 °C pendant environ 2h40, jusqu'à obtention d'une solution homogène. 30 La solution est ensuite filtrée sur une cartouche millipore de porosité 1,0/0,5 pm vendue sous la dénomination commerciale « Opticap® XL » par la société Millipore. On a ensuite ajouté 400 ml de 1-2, propanediol à la solution de 35 chitosane.

La quantité d'anhydride acétique à ajouter, à savoir la quantité stoechiométrique, a été déterminée à l'aide des formules suivantes pour un degré d'acétylation DAf final souhaité d'environ 50% : (nCh-NH2) = (nch-NF12)i - (nCh-NH2)f Où (nch-NH2); est le nombre de fonctions amines libres du chitosane solubilisé avant acétylation et (nch-NH2)f est le nombre de fonctions amines libres du chitosane de degré d'acétylation DAf que l'on souhaite 10 atteindre, Avec (nch-NF-12); = n total X (1- DA;) et 15 (nch-NF12)f = n total X (1- DAf) - DA est le degré d'acétylation initial du chitosane, - DAf est le degré d'acétylation final que l'on souhaite atteindre, 20 Et Mo La masse Mo considérée est celle d'une unité du polymère de chitosane initial. 25 La masse d'anhydride acétique (maa) à ajouter est obtenue par la relation suivante : Maa = (nCh-NH2) X Maa où Maa est la masse molaire de l'anhydride acétique, autrement dit 30 102,09 g.mo1-1 On a ajouté 14,791 g d'anhydride acétique pour procéder à l'acétylation. m x (1 -Voeau) chitosane n total = Puis on a procédé à la purification du chitosane à l'aide d'une solution de soude 5N. On verse 100 ml de soude pour porter la solution de chitosane à un pH de 11,56.

Une étape de désactivation virale est réalisée sur le précipité issu de cette première précipitation. Pour ce faire, le précipité récupéré par filtration est plongé sous agitation mécanique dans une quantité de soude permettant d'atteindre une concentration molaire de NaOH strictement supérieure à 1N, par exemple ici un pH d'environ 12,66, pendant environ 1 heure.

La solution est à nouveau précipitée par ajout d'acide acétique jusqu'à obtention d'un pH d'environ 9,53. Le précipité obtenu est ensuite lavé avec de l'eau stérile jusqu'à obtention d'une eau de lavage de pH neutre, puis avec de l'éthanol jusqu'à obtention d'une conductivité pour l'eau de lavage inférieure à 1 pS/cm. le précipité de chitosane purifié est séché dans une étuve à vide pendant environ 96h. On récupère 41,6 g de chitosane sec réacétylé et purifié.

On a procédé à dix-neuf essais. Pour chaque essai, le degré d'acétylation réel obtenu DA,- a été mesuré par spectrométrie de Résonance Magnétique Nucléaire selon la méthode décrite ci-dessus.

Pour chaque essai, on a ensuite déterminé la valeur D de la différence entre la valeur du degré d'acétylation final souhaité ou théorique, soit DAf, et la valeur du degré d'acétylation réel ou mesuré sur le produit d'arrivée, autrement dit le chitosane réacétylé, par exemple par résonance magnétique nucléaire (RMN), soit DA,- Les valeurs DAf, DA, et D sont rassemblées dans le tableau I suivant :35 Essais DA f DAr D=DAf -DAr 1 46.18% 44.00% 2.18% 2 50.05% 49.00% 1.05% 3 50.04% 49.00% 1.04% 4 50.12% 50.00% 0.12% 50.04% 48.00% 2.04% 6 50.02% 50.00% 0.02% 7 49.96% 48.00% 1.96% 8 50.03% 51.00% -0.97% 9 50.02% 49.00% 1.02% 52.92% 51.00% 1.92% 11 49.66% 45.00% 4.66% 12 50.00% 50.00% 0.00% 13 50.00% 50.00% 0.00% 14 50.00% 48.00% 2.00% 50.39% 49.00% 1.39% 16 50.38% 43.00% 7.38% 17 50.37% 49.00% 1.37% 18 50.37% 49.00% 1.37% 19 50.37% 49.00% 1.37% Moyenne 50.05% 48.47% 1.57% Ecart type 1.15% 2.20% 1.84% Tableau I : différences entre valeurs de DA théorique (DAf) et DA mesuré (DAr) 5 On a caculé la moyenne des différences D sur l'ensemble des 19 essais réalisés. Les analyses statistiques sont effectuées avec le logiciel « Minitab® 16.2» de Microsoft. Ainsi, la moyenne des différences est égale à 10 1,57% ± 1,84%. Ainsi, la reproductibilité et la précision du procédé selon l'invention est excellente et permet d'obtenir du chitosane présentant un degré d'acétylation supérieur à 40%, par exemple ici environ égal à 50%, de manière 15 très fiable, reproductible et précise.

EXEMPLE 2 : (comparatif) On dispose du même chitosane 13 qu'à l'Exemple 1, obtenu de la même manière et de même degré d'acétylation DA de 3%.

Les quantités d'anhydride acétique ajoutées ont été déterminées à l'aide de la même formule qu'à l'Exemple 1 pour chaque degré d'acétylation DAf final souhaité, soit environ 50%. Toutefois, la purification et l'acétylation du chitosane 13 ont été réalisées en deux étapes séparées, la purification dans une première étape, 10 puis l'acétylation dans une deuxième étape. 1°) Purification : Dans une première étape, 110,4 g de chitosane ont été solubilisés 15 dans 20 litres d'eau déminéralisé auxquels ont été ajoutés de l'acide acétique en quantité stoechiométrique, soit 40 ml d'acide acétique. La solution est ensuite filtrée sur une cartouche millipore de porosité 1,0/0,5 pm vendue sous la dénomination commerciale « Opticap® XL » par la société Millipore. 20 Puis on a procédé à la purification du chitosane à l'aide d'une solution de soude 5N. On verse 150 ml de soude pour porter la solution de chitosane à un pH de 11,79. Une étape de désactivation virale est réalisée sur le précipité issu de cette première précipitation. Pour ce faire, le précipité récupéré par filtration 25 est plongé sous agitation mécanique dans une quantité de soude permettant d'atteindre une concentration molaire de NaOH de 2N. Le précipité obtenu est ensuite lavé avec de l'eau stérile jusqu'à obtention d'une eau de lavage de pH neutre, puis avec de l'éthanol jusqu'à obtention d'une conductivité pour l'eau de lavage inférieure à 1 pS/cm. 30 2°) Réacétylation : 34,2 g de chitosane obtenu à l'étape 1°) sont solubilisés dans 3 litres d'eau déminéralisée auxquels ont été ajoutés de l'acide acétique en 35 quantité stoechiométrique, soit 10,9 g.

On a ensuite ajouté 2500 ml de 1-2, propanediol à la solution de chitosane. On a ajouté 9,1 g d'anhydride acétique pour procéder à l'acétylation.

La solution a ensuite été précipitée à l'aide d'une solution de soude 5N. On verse 71,6 ml de soude pour porter la solution de chitosane à un pH de 11,6. Le précipité obtenu est ensuite lavé avec de l'eau stérile jusqu'à obtention d'une eau de lavage de pH neutre, puis avec de l'éthanol jusqu'à obtention d'une conductivité pour l'eau de lavage inférieure à 1 pS/cm. le précipité de chitosane purifié est séché par lyophilisation. On récupère 35,5 g de chitosane sec réacétylé et purifié. On a procédé à 58 essais.

Pour chaque essai, le degré d'acétylation réel obtenu DA,- a été mesuré par Résonance Magnétique Nucléaire selon le protocole décrit à l'Exemple 1. Pour chaque essai, on a ensuite déterminé la valeur D de la différence entre la valeur du degré d'acétylation final souhaité ou théorique, soit DAf, et la valeur du degré d'acétylation réel ou mesuré sur le produit d'arrivée, autrement dit le chitosane réacétylé, par exemple par résonance magnétique nucléaire (RMN), soit DA,- On a ensuite caculé la moyenne des différences D sur l'ensemble des 58 essais réalisés. Les analyses statistiques sont effectuées avec le logiciel « Minitab® 16.1» de Microsoft. Ainsi, la moyenne des différences D est égale à -2,65% ± 2,84%.

Ainsi, la moyenne des différences D est élevée et ne permet pas de réaliser la purification et l'acétylation du chitosane 13 de façon fiable, précise et reproductible.35

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de chitosane de degré d'acétylation DA, à partir de chitosane 13 ayant un degré d'acétylation DA inférieur à DAr, comprenant au moins une étape de purification et au moins une étape d'acétylation dudit chitosane 3, ladite étape de purification comprenant au moins une étape de solubilisation dudit chitosane 13 dans un milieu aqueux acide et au moins une étape de précipitation dudit chitosane ainsi solubilisé, dans lequel ladite étape d'acétylation est réalisée en solution sur ledit chitosane solubilisé avant ladite étape de précipitation.
2. Procédé de préparation selon la revendication 1, dans lequel DA; va d'environ 1`)/0 à environ 10%, par exemple va de 2% à 6%.
3. Procédé de préparation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel une étape de filtration est réalisée après ladite étape de solubilisation et avant ladite étape d'acétylation, afin de supprimer les particules insolubles et les contaminants potentiellement présents dans la solution aqueuse acide de chitosane.
4. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape de précipitation comprend l'ajustage à un pH allant de 9,5 à 11 du chitosane obtenu après l'étape d'acétylation.
5. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape de précipitation inclut une étape de désactivation virale.
6. Procédé de préparation selon la revendication 5, dans lequel l'étape de précipitation comprend : - Une première précipitation à pH allant de 9,5 à 12 du chitosane obtenu après l'étape d'acétylation, - Une étape de désactivation virale à concentration molaire de NaOH strictement supérieure à 1N du précipité de chitosane obtenu à l'issue de ladite première précipitation, - Une deuxième précipitation à pH allant de 9,5 à 11 du chitosane obtenu après ladite étape de désactivation virale.
7. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel une étape de lavage est réalisée sur le précipité de chitosane obtenu à l'issue de ladite étape de précipitation.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la solubilisation en milieu aqueux acide se fait à l'aide d'acide acétique.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape d'acétylation comprend l'ajout d'anhydride acétique en proportion stoechiométrique par rapport à la quantité de chitosane à acétyler pour obtenir ledit chitosane de degré d'acétylation
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel l'étape de désactivation virale comprend une solubilisation du précipité 10 de chitosane obtenu à l'issue de ladite première précipitation dans une solution d'hydroxyde de sodium.