JP3368323B2 - キチンビーズ、キトサンビーズ、これらビーズの製造方法及びこれらビーズからなる担体並びに微胞子虫胞子の製造法 - Google Patents

キチンビーズ、キトサンビーズ、これらビーズの製造方法及びこれらビーズからなる担体並びに微胞子虫胞子の製造法

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益裕 塚田
昭 白田
昭二 早坂
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主要な細胞壁物質がキチンである微胞子虫
胞子からなる均一微細粒径のキチンビーズ、該キチンを
Ｎ−脱アセチル化せしめた均一微細粒径のキトサンビー
ズ、これらビーズの製造方法及びこれらビーズからなる
担体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キトサンは、物理化学的吸着性、生体適合性及び微生
物分解性が良好であるため、医薬・医療用、香料用、化
粧品用、接着材・塗料用及び複写・記録表示用の材料等
として、幅広い産業分野で利用できる生体高分子であ
る。一方、粒径にばらつきの少ない多孔質ビーズは酵素
等の固定化用担体として化学分野、医療分野、食品分野
及び工業プロセス分野等幅広い各種産業分野で利用され
ている。そこで、キトサンの均一粒径の多孔質ビーズが
提供できれば、多様な方面で利用・活用することが期待
できる。
【０００３】 従来、キトサンビーズは、例えば、次のような複雑な
方法で調製されていた。先ず、甲殻類の外骨格を形成す
る成分から無機物を除去してキトサンとし、これを有機
酸で十分に溶解させた均一なドープとする。このドープ
を塩基性凝固液中に滴下又は放出して凝固させることに
よりキトサンビーズを製造していた（Knorr,D.,M.Daly:
Mechanics and diffusional changes observed in mult
i−layer chitosan/alginate coacervate capsules,Pro
cess Biochemistry,4,48−50（1988））。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来方法では、キトサンビーズの粒径及び多孔状
態は、脱溶媒の速さや生成ビーズ中への凝固液の浸透、
拡散速度等により大幅に変化してしまう。このため、ビ
ーズの粒径を揃えることは容易ではなく、粒径が均一な
キトサンビーズを製造するには、繁雑な調製作業と熟練
とが必要であり、多量生産することは困難であった。従
って、収率、効率、経済面で優れ且つ取扱いが容易な調
製作業により、均一微細粒径のキトサンビーズを製造す
る方法の開発が望まれている。
【０００５】 本発明においては、主要な細胞壁物質がキチンからな
る均一微細粒径の微胞子虫類の胞子が昆虫の体内又は培
養細胞内で効率良く生産され得るという特質を利用する
ことによって、前記の問題点を解消したものである。す
なわち、本発明の目的は、粒状の微胞子虫胞子の細胞壁
物質の主要成分がキチンであることを利用し、均一微細
粒径のキチンビーズ及びキトサンビーズを効率的且つ経
済的に製造する方法を提供するとともに、かくして得ら
れた均一微細粒径のビーズ及びこれらの均一微細粒径の
ビーズからなる担体を提供することにある。また、本明
細書中では関連する発明として微胞子虫胞子の製造方法
についても説明する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、昆虫由来の生体高分子の新しい利用技
術の開発について鋭意検討を進めてきた。微胞子虫胞子
が昆虫の体内又は培養細胞内で効率良く生産され、且微
胞子虫胞子が均一粒径で球状、楕円球状を呈することに
着目し、微胞子虫胞子の主要な細胞壁物質がキチンであ
ることから、粒径が均一のキチンビーズ又はキトサンビ
ーズに抗生物質や生理活性物質等を固定させると、徐放
担体として利用できることを初めて見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００７】 家蚕、野蚕若しくはその他多くの昆虫又は培養細胞に
微胞子虫胞子を接種すると、主要な細胞壁物質がキチン
で、数μｍの大きさの微胞子虫胞子が多量に増殖する。
本発明者らは、増殖した微胞子虫胞子を精製・分離し、
粒径が一定のキチンビーズ、キトサンビーズ及び微胞子
虫胞子を得る方法、また、これらのビーズを抗生物質や
生理活性物質等の固定化用担体とする簡易な方法を見出
した。 先ず、本発明者らは、微胞子虫胞子を昆虫又は培養細
胞に接種する時期、接種量、接種方法及び昆虫体内等で
増殖した微胞子虫胞子の精製・分離方法等、微胞子虫胞
子を効率的に生産するための最適条件を明らかにした。
【０００８】 昆虫又は培養細胞に微胞子虫胞子を接種するには、従
来から、例えば、昆虫の飼料に目的とする微胞子虫胞
子を添加して経口接種する方法、飼育過程の昆虫に微
胞子虫胞子を経皮的に直接接種する方法等がある。 微胞子虫胞子の形状は多様であるが、種類によって一
定のビーズ形状を保ち、その主要な細胞壁物質はキチン
及び蛋白質の複合体である。そこで、胞子を、増殖後
の微胞子虫胞子そのもののキチンビーズとして、また、
微胞子虫胞子のキチンをＮ−脱アセチル化させたキト
サンビーズとして利用できる。また、微胞子虫胞子表面
のキチンをＮ−脱アセチル化処理することにより、微粒
子表面がキトサンからなるキトサンビーズを調製でき
る。また、細胞内物質を活性化させ、胞子の細胞壁から
外に出すことで、微胞子虫胞子細胞壁に微細な孔があい
た中空ビーズを調製することもできる。
【０００９】 前記したように、本発明のキチンビーズは、昆虫又は
培養細胞内で増殖された微胞子虫胞子からなる、キチン
を主要な細胞壁物質とする均一微細粒径のビーズであ
り、また、キトサンビーズは、該細胞壁物質のキチンを
Ｎ−脱アセチル化させたものである。これらのキチンビ
ーズ及びキトサンビーズは蛋白質の除去された非抗原性
のものであってもよい。この蛋白質の除去は通常の加水
分解処理により行われる。また、前記増殖微胞子虫胞子
は必要に応じてその細胞壁に孔を有するものであっても
よく、前記キチンビーズ及びキトサンビーズは中空であ
ってもよい。この孔は、過酸化水素処理又はアルカリ処
理により開けられ得る。
【００１０】 本発明の担体は、前記したような増殖微胞子虫胞子か
らなる、キチンを主要な細胞壁物質とする均一微細粒径
のキチンビーズ又は該細胞壁物質のキチンをＮ−脱アセ
チル化させたキトサンビーズからなるものである。これ
らのキチンビーズ及びキトサンビーズは蛋白質の除去さ
れた非抗原性のものであってもよい。この蛋白質の除去
は通常の加水分解処理により行われる。前記したよう
に、この増殖微胞子虫胞子は必要に応じてその細胞壁に
孔の開けられたものであってもよく、このキチンビーズ
及びキトサンビーズは中空であってもよい。この孔は、
アルカリ処理又は過酸化水素処理により開けられ得る。
【００１１】 本発明の担体は、生理活性物質、抗生物質、生体細
胞、細菌等の微生物、無色及び有色の染料、医薬品、農
薬、香料、飼料素材並びに食品素材等を固定させ又は導
入するために用いられるものである。 なお、本発明のキチンビーズ及びキトサンビーズは、
ヒトなどの体内に埋め込む場合、非抗原性であることが
望ましい。
【００１２】 本発明の均一微細粒子（キチンビーズ及びキトサンビ
ーズ）の製造法は、昆虫に濃度５×102〜５×108個/m
l、好ましくは５×102〜５×107個/mlの微胞子虫胞子を
経口又は経皮的に接種して増殖させた後、生育した昆虫
体内より増殖した胞子を取り出し、精製して、均一微細
粒子（キチンビーズ）を得ること、次いで所望によりこ
のキチンビーズのキチンをＮ−脱アセチル化して均一微
細粒子のキトサンビーズを得ることからなる。胞子濃度
５×102個/ml未満であると、昆虫への感染効率が低く、
また感染率にバラツキが生じるため有効ではなく、ま
た、胞子濃度が５×108個/mlを超えると昆虫体内で胞子
の形成が完全に起こる前に昆虫が死亡してしまうため経
済的にも不利である。微胞子虫の接種時期は該昆虫が２
齡期蚕の時であること、胞子の採集は５齡期の昆虫から
行われることが好ましい。該昆虫は家蚕幼虫であること
が好ましい。 上記微胞子虫胞子の製造法は、家蚕幼虫の体液の上清
を細胞培養培地重量基準で５〜50重量％、好ましくは10
〜40重量％含む細胞培養培地に昆虫由来の培養細胞を加
え、これに微胞子虫胞子を接種して増殖させた後、増殖
した細胞より微胞子虫胞子を取り出すものであることが
好ましい。家蚕幼虫の体液の上清の添加量が５重量％未
満である場合も、該添加量が50重量％を超える場合も、
胞子はほとんど増殖しない。また、好ましい範囲では胞
子がさらに効率的に増殖する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる微胞子虫としては、特に制限はな
く、形状が一定のビーズ形状を保ち且つ主要な細胞壁物
質がキチンであるような胞子を有する微胞子虫であれば
よい。例えば、ノゼマ ボンビシス（Nosema bombyci
s）、ノゼマ ボンビシス（No.402）、ノゼマ ボンビ
シス（No.408）、ノゼマ ボンビシス（No.520）、ノゼ
マ ボンビシス（No.611）、ノゼマsp.（M 11）、及び
ノゼマsp.（M 14）のようなノゼマ属微胞子虫、バイリ
モルファ（Vairimorpha）（M 12）、プリストフォーラ
（Plestophola）（M 25）、プリストフォーラ（M 2
7）、並びにテロファニア（Thelophania）sp.等が用い
られ得る。
【００１４】 本発明では、家蚕、オオモンシロチョウ、エゾシロチ
ョウ、オビヒトリ、ヒマサン、アメリカシロヒトリ及び
シンジュサン等の広範囲の昆虫が微胞子虫胞子の宿主と
して利用できる。昆虫のうち、特に望ましいのは、飼育
方法、飼育技術が確立しており、遺伝的、育種的、生理
的、生態的な全ての側面から総合的に研究が行われてき
た家蚕である。家蚕幼虫を用いることにより微胞子虫類
胞子を多量に生産することが可能である。家蚕を対象に
して、微胞子虫胞子を調製するには、接種量は家蚕１頭
あたり、５×102〜５×107個/mlの微胞子虫胞子を２齡
期蚕に経口又は経皮的に接種し、５齡期に多量に増殖し
た微胞子虫胞子を精製・分離することが望ましい。微胞
子虫胞子を１齡起蚕の家蚕に経口接種すると、微胞子虫
胞子形成前に病死するためである。ノゼマ ボンビシス
の原虫を家蚕に投与する場合には、２齡期蚕に１頭当た
り好ましくは５×102〜３×103個の胞子を食下するよう
に接種し、幼虫が死亡し始める接種12日目頃の幼虫個体
より胞子を採取すると微胞子虫胞子が最も効率的に入手
できる。
【００１５】 本発明では、前記したように、昆虫体内又は培養細胞
内で目的とする微胞子虫胞子を多量に入手でき、家蚕等
の昆虫そのものでも可能であるし、哺乳動物及び広く脊
椎動物、無脊椎動物由来の培養細胞を用いても同様に入
手できる。接種後の昆虫は15〜32℃で通常の方法で飼育
することが可能であり、好ましくは飼育温度は25〜28℃
である。一方、接種後の培養細胞は20〜30℃で、好まし
くは25〜28℃で培養するとよい。 本発明に用いられる培養細胞としては、次のようなも
のが例示できる。 家蚕由来の培養細胞としては、Bombyx mori S.P.C.Bm
36、Bombyx mori Bm N−４、Bombyx mori SES−BoMo−1
5Aが、柞蚕由来のものとしては、Antheraea pernyi NIS
ES−AnPe−428が、シンジュ蚕由来のものとしては、Ph
ilosamia cynthia pernyi NIS ES−SaCy−12が例示でき
る。また、クワゴマダラヒトリ由来のものとしては、Sp
ilosoma imparilis FRI−SpIm−1229、ヨトウガ由来の
培養細胞としては、Mamestra brassicae SES−MaBr−４
が例示できる。
【００１６】 上記の培養細胞のうち、Antheraea pernyi NIS ES−A
nPe−428は家蚕幼虫の体液の上清を５〜50％含んだグレ
ース（Grace）の培養液を用いると、培養温度20〜30
℃、好ましくは25〜28℃で培養細胞内で効率的に微胞子
虫胞子が増殖できる。Antheraea pernyi NIS ES−AnPe
−428以外の培養細胞は、通常一般的に用いられる培養
液で培養すればよい（横田ら、九州蚕糸、34（199
5））。 培養細胞を用いて培養する際、培養培地に一定濃度の
家蚕体液の上清を入れることで微胞子虫胞子は培養細胞
内で容易に増殖し、多量の胞子を形成する。微胞子虫胞
子を経済的、効率的に生産するための家蚕体液の上清の
添加量は、培養液に対し好ましくは10〜40重量％であ
る。培養条件は、上清を添加しない場合と同一でよい。
体液の調製は、５齡家蚕幼虫の脚をハサミで切断し、氷
で冷却したガラス製の試験管に体液を集める方法が簡便
かつ有効である。こうして集めた体液をウォーターバス
で60℃で15分間加熱し、体液中に含まれる蛋白質を沈殿
させ、デカンテーション法で除去し、こうして得られる
体液の上清を用いると良い。
【００１７】 昆虫由来の培養細胞を用いれば、昆虫の飼育、採取
等、昆虫の入手に制約を受けることなく、タンク培養に
より微胞子虫胞子を簡易にかつ効率的に生産させること
ができる。 野蚕由来の培養細胞であるアンテラエア ユーカリプ
ティ（Antheraea eucalypti）細胞に微胞子虫胞子を投
与する場合には、家蚕幼虫体液の上清を最大40％まで加
えた市販の細胞培養液（例えば、グレース（Grace）培
養液、ギブコ（Gibco）社製）中の細胞に微胞子虫胞子
を直接接種することにより培養細胞中で微胞子虫胞子を
生産させることが効率的である。
【００１８】 昆虫又は昆虫由来の培養細胞に微胞子虫胞子を接種す
ることにより生産された胞子は、家蚕に対して強い伝染
性を持っているので、家蚕への汚染防除の立場から、取
り出した胞子は、ホルマリン、アルコール又は熱処理等
により無毒化することが望ましい。無毒化させた後の微
胞子虫胞子は、そのまま用いれば水に不溶解性のキチン
微粒子（キチンビーズ）として利用することができる。 本発明の均一微細粒径のキチンビーズを製造する際の
増殖微胞子虫胞子の精製は、次のようにして行われる。
すなわち、体内で微胞子虫胞子が増殖した昆虫幼虫を、
例えば、0.85％塩化ナトリウム水溶液中で磨砕した後、
脱脂綿で濾過して胞子を集め、遠心分離器で遠心操作を
２回繰り返す。次に、パーコール（商品名：ファーマシ
ア社製、スェーデン）（Percoll（Pharmacia Swede
n））に重層し、3,000rpmで30分間遠心分離を行うこと
によって微胞子虫胞子の精製ができる。
【００１９】 キチンをキトサンへと変換するＮ−脱アセチル化処理
は、通常の方法、例えば、微胞子虫胞子のキチンビーズ
を30〜50％水酸化ナトリウム溶液中、80〜120℃で数時
間処理することにより、細胞壁物質のキチンをＮ−脱ア
セチル化して、キトサンビーズへと変える方法で行われ
得る。なお、Ｎ−脱アセチル化に用いる薬剤、pH等の操
作条件としては従来知られている方法が適用できる（Br
ineら、Comp.Biochem.Physiol.69B、283（1983））。
【００２０】 本発明のキチンビーズ、キトサンビーズの細胞壁物質
は、非抗原性のキチン、キトサン及びグルカンと抗原性
の蛋白質とから成る。蛋白質は酸及び／又はアルカリに
よる加水分解処理によって溶出除去でき、その際ビーズ
の形態は変化しない。この加水分解処理は、0.1〜3N、
好ましくは0.5〜2N、さらに好ましくは0.9〜1.3Nの水酸
化ナトリウム、塩化水素の水溶液を用いて、温度５〜35
℃で１〜25時間、好ましくは20〜25℃で８〜15時間、さ
らに好ましくは室温で10〜12時間で行われ、これにより
非抗原性ビーズが得られる。加水分解処理は、初めに酸
性の水溶液で次の、プロセスとしてアルカリ水溶液を用
いて行ってもよいし、初めにアルカリ水溶液で、次のプ
ロセスとして酸性の水溶液を用いて行ってもよい。酸処
理とアルカリ処理とを１サイクルとし、これを繰り返
し、合計５サイクル以上処理することが望ましい。最後
に、水で洗浄した後、殺菌・脱水を行うため95重量％以
上のエタノールで所定の時間洗浄処理する。かくして、
微胞子虫胞子の細胞壁物質である蛋白質を完全に除去で
きる。
【００２１】 微胞子虫胞子に抗生物質、バクテリア、生理活性物
質、医薬品及び生体細胞を固定させたり、内部に導入す
るには、微胞子虫胞子の細胞壁に微細な孔を開けておく
ことがより有効である。微胞子虫胞子に微細な孔を開け
る方法としては、特に制限はされないが、例えば、次の
２つの方法が好ましい。 １〜６重量％H2O2と胞子浮遊液とを等量宛混合する方
法。 25℃の0.2N KOHで微胞子虫胞子を30分間浸漬処理した
後、pH7.2のリン酸緩衝液を少量づつ加えて浸漬溶液のp
Hを中性に調整する方法。
【００２２】 微胞子虫胞子をアルカリ水溶液で処理することにより
胞子内の細胞物質を活性化せしめると、細胞物質が、胞
子の大きさによって例えば約0.1〜0.3μｍ程度の微細な
孔を胞子壁に開けて胞子外に放出されるので、その際に
生じる微胞子虫胞子壁の微細な孔を活用するとよい。具
体的には、先ず、0.2Nの水酸化カリウム水溶液を用いて
微胞子虫胞子を15〜20℃で30分処理し、更にその後、pH
7.2のリン酸緩衝液で中和処理すると、胞子内細胞物質
が活性化して、昆虫培養細胞用培地に胞子内細胞物質が
放出される際に微細な孔ができる。 増殖後の微胞子虫胞子そのものは抗原になるが、前記
したように酸、アルカリで加水分解処理して細胞壁物質
の蛋白質を除去したキチンビーズ及びキトサンビーズは
抗原にはならない。
【００２３】 上記したように、本発明によれば、昆虫又は培養細胞
中で極めて多量に増殖する微胞子虫胞子を用いることに
より、球形又は楕円球形を呈し、数μｍ程度の大きさで
かつ均一は微細粒径を持つキチンビーズが得られ、ま
た、キチンビーズをＮ−脱アセチル化してキトサンビー
ズが得られる。本発明によると、従来の製造法では極め
て困難とされる均一微細粒径のビーズ、特に粒径が約１
〜６μｍ程度で粒径英にむらが無いビーズ、また、中空
のキトサンビーズの製造が可能である。こうした方法で
作製された均一微細粒径のキチンビーズ及びキトサンビ
ーズは、薬物デリバリーシステム用担体として、さらに
は化粧ファンデーション素材として利用できる。本発明
によるキチンビーズ及びキトサンビーズについては、微
胞子虫の種類によって各種の大きさのものを生産するこ
とが可能である。また、キトサンビーズに酵素や生体細
胞を付着、固定することにより、バイオリアクターとし
て、食品工業分野において、また、その他の広い産業分
野において利用できる。
【００２４】 本発明のキチンビーズ及びキトサンビーズは反応性に
富む化学組成成分を持っているので、その表面に酵素若
しくは免疫抗体を化学的、又は物理的に結合させること
もできる。例えば、免疫グロブリンなどの抗原・抗体を
粒子表面及び／又は内部に固定化することにより、免疫
担体として利用できる。また、キチンをグリコールキチ
ン及びカルボキシメチルキチンへと化学反応により改質
した改質キチンビーズは、保湿性に優れているため、化
粧品材料として利用できる。また、微胞子虫胞子又はキ
チンビーズに、ビニル化合物等をグラフト加工した後、
これにα−アミラーゼ等の酵素を固定化させれば、酵素
活性の安定性を高めるだけでなく、有効表面積の広い微
粒子という特徴を活かして、さらに効率的な酵素機能を
発揮させることが可能である。
【００２５】 昆虫由来のキチンビーズ及びキトサンビーズの場合、
加水分解処理したものの細胞壁物質は、上記したよう
に、キチン、キトサン及びグルカンなどからできてお
り、いずれも抗原とはなりにくい成分である。そのた
め、キチンビーズ及びキトサンビーズを徐放担体とし
て、ヒトを含めた動物の体内に埋め込んでも抗原抗体反
応が起こらない。微胞子虫胞子の細胞壁物質の蛋白質を
除去したものの抗原性は消失するからである。また、キ
チンビーズ及びキトサンビーズは、所定の時間後、体内
の酵素により分解されてしまうので、生体内で分解され
る安全素材として利用できる。
【００２６】 本発明のキチンビーズ及びキトサンビーズはいずれも
内部に空隙のある中空ビーズであることができ、細胞壁
組織には微細な孔が開いている。そこで、生体細胞、細
菌、抗生物質、生理活性物質等を陰圧環境下で微細な空
隙に導入することが可能となる。細菌等の微生物を該ビ
ーズに封入した場合、封入された微生物は外界の紫外線
等の蛋白質変性要因の影響を受けにくいので、該ビーズ
は天敵微生物保護材としても利用できる。
【００２７】 本発明のキチンビーズ及びキトサンビーズは、例え
ば、アフィニティークロマトグラフィー用担体、細胞培
養用担体及び医薬補助材として利用でき、医薬品、生理
活性物質、ホルモン及びワクチン等のマイクロカプセル
化基材としても優れた特性を発揮する。農薬若しくは肥
料等を微胞子虫胞子、キチンビーズ又はキトサンビーズ
に封入してカプセル化したものは、土壌改質材として利
用できるし、また、微量で有効な飼料成分や食品素材を
キチンビーズ又はキトサンビーズに封入してカプセル化
したものは、家畜飼料や養魚飼料として利用することも
可能である。また、細菌等を封入、固定化した微胞子虫
胞子、キチンビーズ及びキトサンビーズは、紫外線照射
に対する細菌等の保護作用があることから、生物防除材
用の資材として利用できる。特に、キチンビーズ及びキ
トサンビーズの粒径が揃っていると、ファインケミカル
分野等で特殊な利用が可能となる。また、本発明による
キチン、キトサンを成分とするマイクロカプセルを感圧
複写紙として応用する場合には、塗抹工程時の乾燥性を
向上させることができ、また、発色印字性を大幅に改善
することができる。
【００２８】 このように、キチン・キトサン微粒子は農業、工業、
医学、食品等の広い分野で有効に利用できる。 前記したように、微胞子虫胞子、キチンビーズ又はキ
トサンビーズに細菌等の微生物や生理活性物質等を封入
したものに紫外線を照射した場合、細胞壁物質のキチ
ン、キトサンが紫外線を吸収し紫外線のエネルギーを遮
断してしまうので、微胞子虫胞子、キチンビーズ及びキ
トサンビーズに封入された細菌等の微生物や生理活性物
質等の生物的及び生理的な活性を長く保つことが可能と
なる。このように、微胞子虫胞子、キチンビーズ及びキ
トサンビーズは、封入された生理活性物質、細菌等の微
生物の活性低下を防止する上で有効である。
【００２９】 本発明の、蛋白質の除去されたキチンビーズ及びキト
サンビーズは、上記したように生体組織体内に入れても
抗原とはなり難く、生体に悪影響を及ぼすことがないの
で、生理作用を持つ医薬品等を固定化させて、それをヒ
ト等の体内に埋め込んでも抗原抗体反応に基づく問題は
起こらない。そこで、特に、抗ガン作用を持つ医薬品を
封入したキチンビーズ、キトサンビーズは特定患部の治
療のためのミサイルキャリアーとして先端的な医療分野
で利用できる。 また、加水分解処理の程度により、又は、微胞子虫胞
子の細胞物質を活性化させ、内容物を放出させて微胞子
虫胞子に微細な孔を開ける程度を加減することにより、
担持せしめた又は封入せしめた医薬品、生理活性物質、
抗生物質等の徐放速度、徐放量さらには生分解性の程度
を簡単に制御できる。
【００３０】
【実施例】
次に、微胞子虫胞子の製造例も含めて本発明を実施例
及び比較例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこ
れらの例に限定されるものではない。なお、微胞子虫に
は多くの種があるが、特にことわらない限り家蚕幼虫に
由来するノゼマ ボンビシスを用いた。 実施例中の細菌活性及び抗原性の評価は次の方法に基
づいて行った。
【００３１】 A.細菌活性の評価 加熱溶解後、55℃に保持した半合成脇本培地又はキン
グＢ培地15mlと、検定菌の胞子液（濃度:109-10個/ml）
2mlとを混合し、この混合物をシャーレに流し込んで平
板状に固めた。この菌液混合平板培地上に被検試料を10
μｌ滴下し、２日間、20〜25℃に保った後、被検試料直
下の培地における細菌増殖阻害度を下記の判定基準によ
り４段階で評価した。 ＋＋＋：強い（菌はほとんど増殖せず、培地透明度は
高く透明ガラスの感じ） ＋＋：やや強い ＋：弱い（菌はわずかに増殖するため、培地透明
度は透明ガラスとすりガラスの中間程度） ±：軽微（菌の増殖は1/5程度であり、培地透明
度はすりガラス程度） −：菌は良く増殖し、培地は不透明
【００３２】 B.糸状菌に対する抗菌活性の評価方法 加熱溶解後、55℃に保持したPSA培地と、検定菌の胞
子液（濃度:105-6個/ml）2mlとを混合し、この混合物を
シャーレに流し込んで平板状に固め、上記細菌活性の評
価の場合と同様に処理し、観察した。 C.抗原性の評価 微胞子虫胞子の抗血清をつぎのように調製した。家蚕
幼虫で継代した胞子をパーコール（Percoll）密度勾配
管法で精製し、2,000rpm、10分間の遠心分離を行い、沈
殿した胞子を0.85％NaCl液に浮遊させて得た胞子浮遊液
（２×108個/ml）を抗原とし、これとフロインズ コプ
リート アジュバント（Freund's Complete adjuvant）
と等量宛混合し、得られた混合物の2.0mlを１回ウサギ
に筋肉注射した。その後、胞子浮遊液1mlを１週間間隔
で４回静脈注射し、最後の注射から７日後に採血した。
血清は56℃で30分間非動化し−20℃で保存した。
【００３３】 凝集反応用抗原については、精製した微胞子虫胞子を
１％ホルムアルデヒドで処理した後、蒸留水で遠心洗浄
し、この胞子を0.85％NaCl液に浮遊（４×107個/ml）さ
せることで調製した。 上記抗血清を0.85％NaCl液で２倍段階希釈後、胞子浮
遊液とスライドグラス上で等量宛混合し、37℃で１時間
反応せしめた後、倒立顕微鏡で観察して凝集素価を調べ
た。抗体（抗血清）の希釈倍率は16、32、64、128、25
6、512、1024、2040とし、下記の判定基準により２段階
評価した。 ＋：抗原抗体反応が認められる。 ＋：抗原抗体反応が全く認められない。
【００３４】 実施例１ 家蚕幼虫に各種の微胞子虫胞子を接種し、培養して、
家蚕幼虫から分離できる各種の微胞子虫胞子の種名、胞
子の大きさ及び抗原性を調べた。微胞子虫としては、表
−１に示すように、ノゼマ ボンビシス（Nosema bomby
cis）（他の微胞子虫の特性を比較するための基準
種）、ノゼマ ボンビシス（No.402）、ノゼマ ボンビ
シス（No.408）、ノゼマ ボンビシス（No.520）、ノゼ
マ ボンビシス（No.611）、ノゼマsp.（M 11）、バイ
リモルファ（Vairimorpha）（M 12）、ノゼマsp.（M 1
4）、プリストフォーラ（Plestophola）（M 25）、プリ
ストフォーラ（M 27）、及びテロファニア（Thelophani
a）sp.を用いた。検討の結果を表−１に示す。
【００３５】 使用した微胞子虫胞子の形は、概ね楕円形であり、長
径と短径とは、それぞれ、３〜５μｍ及び１〜３μｍで
あり、その形状と大きさは微胞子虫の種によって一定で
あった。すなわち、特定種の微胞子虫を用いることによ
り、均一な形のキチンビーズ、キトサンビーズが自由に
調製できる。各種の微胞子虫胞子の長径は、最大５μｍ
程度であり、所望の用途に合った微胞子虫を対象に用い
ることができる。なお、カイコの寄生部位も合わせて表
−１に示す。
【００３６】 実施例２ 前記表−１記載のノゼマ ボンビシス、ノゼマsp.
（Ｍ−11）及びプリストフォーラsp.の微胞子虫原虫を
用い、２齡期蚕の家蚕幼虫（日135号×支135号）１頭当
たりに３×103個の各微胞子虫胞子をそれぞれ経口接種
し、蚕体内で微胞子虫胞子を増殖させた後、得られた胞
子を取り出し、これをまず−30℃で凍結乾燥させ、つづ
いて東西通商株式会社製の凍結乾燥機で乾燥させて乾燥
粉末を得た。胞子溶液から得られた乾燥粉末の化学成分
を簡便に定性するため、乾燥試料粉末を臭化リチウムと
混ぜ合わせて錠剤ペレットにして、900〜1200cm-1の波
数範囲における赤外吸収スペクトルを日本分光工業社製
の赤外分光計を用いて測定した。なお、標準試料とし
て、和光純薬工業株式会社製の市販標準サンプルのキチ
ンを用いた。その結果を図１に示す。図１において、赤
外吸収スペクトル曲線ａは市販のキチンを示し、また、
曲線ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ微胞子虫のノゼマ ボンビ
シス、ノゼマsp.及びプリストフォーラsp.についての結
果を示す。得られた標準試料のキチンの赤外吸収スペク
トルでは985、1025、1065、1100、1145cm-1に吸収が現
れた。微胞子虫原虫の種類が異なっても、標準キチン試
料の赤外吸収スペクトルの場合とほぼ同一の波数領域
（1000〜1200cm-1）に同一の吸収が認められたことか
ら、各種微胞子虫胞子の細胞壁を構成する主要成分がキ
チンであることが確かめられた。
【００３７】 また、経口接種の代わりに経皮接種した場合も、上記
と同様な結果が得られる。 また、家蚕幼虫の代わりに、オオモンシロチョウ、エ
ゾシロチョウ、オビヒトリ、ヒマサン、アメリカシロヒ
トリ及びシンジュサン等を微胞子虫胞子の宿主として用
いた場合にも、上記と同様に細胞壁を構成する主要成分
がキチンである微胞子虫胞子が得られる。
【００３８】 実施例３ 実施例２と同じ微胞子虫原虫から得られる乾燥胞子粉
末の結晶形態を定性的に解明するため、Ｘ線回折装置
（理学電機株式会社製）を用いてＸ線回折写真を撮影し
た。得られた各試料の面間距離の測定値を基準品キチン
と共に表−２に示す。微胞子虫原虫の種類が異なって
も、試料のＸ線回折写真には、いずれも8.53、6.70、4.
64、3.31Åの面間距離に対応した回折が見られるが、こ
れはいずれも幅広いハローを示した。キチン標準品のＸ
線回折図には、9.30、6.90、4.64、3.36、3.00、2.80Å
の面間距離に対応した回折が現れており、胞子のＸ線回
折図と類似していた。微胞子虫胞子の細胞壁を構成する
主要物質がキチンであることが、Ｘ線回折写真によって
も確認できた。
【００３９】 実施例４ 蚕糸・昆虫農業技術研究所保存の微胞子虫、ノゼマ
ボンビシスの胞子を供試し、２齡期蚕の家蚕幼虫（日13
5号×支135号）１頭当たりに３×103個/mlのノゼマボン
ビシス胞子を経口接種した。家蚕幼虫体内では微胞子虫
胞子が極めて多量に増殖し、胞子形成が起こったため、
家蚕幼虫は５齡期にすべて微粒子病にかかって死亡し
た。死亡幼虫を0.85％塩化ナトリウム水溶液中で磨砕し
た後、脱脂綿で濾過し胞子を採集した。胞子の精製は、
0.85％塩化ナトリウム水溶液の胞子浮遊液２部を８部の
パーコール（商品名：ファーマシア社製、スェーデン）
（Percoll（Pharmacia Sweden））に重層し、3,000rp
m、25℃、30分間遠心分離して行った。 家蚕幼虫１頭から得られたノゼマ ボンビシス胞子数
は、全体で約１×1010個であった。胞子の水溶液を乾燥
することにより粉末状の胞子100mgが得られた。
【００４０】 実施例５ アンテラエア ユーカリプティ培養細胞に対する微胞
子虫ノゼマ ボンビシスの胞子形成状態を次のようにし
て検討した。異なる量の家蚕の血清（家蚕体液の上清）
を加えた市販の細胞培養培地（グレース（Grace）培養
液、ギブコ（Gibco）社製）に、アンテラエア ユーカ
リプティ培養細胞を接種した後、微胞子虫ノゼマボンビ
シス胞子の一定量を加え、所定の時間培養し、1ml当た
りに含まれる胞子数を血球密度計算板を用いて顕微鏡観
察により測定した。５齡家蚕幼虫の脚をハサミで切断
し、氷で冷却したガラス製の試験管に体液を集め、集約
した体液をウォーターバスで60℃で15分間加熱し、体液
中に含まれる蛋白質を除去し、かくして得られた体液の
上清を用いた。測定結果を表−３に示す。
【００４１】 この結果から明らかなように、培養細胞を増殖する際
に、培養液に一定濃度の家蚕体液の上清を入れると、微
胞子虫胞子は培養細胞内で容易に多量増殖し胞子を形成
した。微胞子虫胞子を経済的且つ効率的に生産するため
の家蚕体液の上清の添加量は、培養液に対し一般に約５
〜50重量％の範囲、好ましくは約10〜40重量％の範囲で
ある。
【００４２】 実施例６ 実施例５とは違った、他の昆虫由来の培養細胞を用い
て、培養細胞中での微胞子虫胞子の増殖状態を検討し
た。ノゼマ ボンビシス及びノゼマsp.（M11）の２種類
を異なる種類の昆虫培養細胞に接種し、昆虫培養細胞中
で増加する微胞子虫胞子の数を調べた。なお、培養細胞
の増殖方法は実施例５と同様であり、培養液に加える体
液量を細胞培養培地重量基準で０％と20％とした場合に
ついて評価した。得られた結果を表−４に示す。
【００４３】 実施例７ 前記実施例４で調製した微胞子虫、ノゼマ ボンビシ
ス胞子の細胞壁物質から次の方法でキトサン微胞子を調
製した。まず、この微胞子虫胞子を40％水酸化ナトリウ
ム溶液中、80℃で４時間処理後、水を加えて洗浄した。
その結果、微胞子細胞壁の主要成分のキチンはＮ−脱ア
セチル化された。各微胞子虫胞子を、光学顕微鏡観察及
び走査型電子顕微鏡観察したところ、Ｎ−脱アセチル化
処理しても微胞子虫胞子が溶解することはなく、微胞子
形状は保たれたままであることが確認された。
【００４４】 実施例８ 実施例４と同様に処理したノゼマ ボンビシス胞子で
あって、加水分解処理により胞子の内容物を除去して得
た粉末状キチン胞子2mgの細胞壁組織に次のようにして
抗生物質を吸着させた。加水分解処理にあたっては、室
温の1N NaOHで12時間処理した後、1N HClで再度12時間
処理した。NaOH及びHCl処理を１サイクルとして、合計
５サイクル繰り返した後、胞子を脱水するため最後に95
％エタノールで２時間処理した。こうした微胞子虫胞子
の細胞壁物質である蛋白質を完全に除去できた。また、
抗生物質の吸着については、リファンピシン又はテトラ
サイクリン10mgを3mlの蒸留水に溶解させたもの及び該
キチン胞子をチューブにいれ、水道アスピレーターで減
圧、脱気を３回繰り返し、更に抗生物質が細胞壁組織に
浸透するように超音波を10分間かけることによって行っ
た。次に、遠心器で2500rpm、20分間遠心分離させ、抗
生物質を含んだキチン胞子を沈殿させた。さらに、蒸留
水を10ml加えて再度遠心分離させ、上清をデカンテーシ
ョン法で除去してリファンピシン又はテトラサイクリン
を包含したキチン胞子を単離した。
【００４５】 ノゼマ ボンビシス胞子にリファンピシン又はテトラ
サイクリンが担持されているかどうかを次のようにして
確認した。ノゼマ ボンビシス胞子を丁寧に３回水洗い
した後、3000rpm、20分の遠心分離操作で回収した胞子
が、トマトかいよう病細菌（Clavibacter michiganensi
s pv.michiganensis）の増殖をどの程度阻害するかを評
価することにした。その結果、水洗いを繰り返して行っ
たノゼマ ボンビシス胞子でもトマトかいよう病細菌の
増殖を完全に阻害することから、抗生物質が胞子に担持
されているものと判断した。
【００４６】 実施例９ 実施例２に示した赤外吸収スペクトル測定用試料ディ
スクの作成方法を応用して、臭化リチウムを全く用いず
にノゼマ ボンビシス胞子のみからなる円形板ディスク
を次のようにして調製した。 実施例４で得られた粉末状のノゼマ ボンビシス胞子
200mgを、日本分光工学工業社製の直径10mmφの赤外吸
収スペクトル錠剤成型器に入れ、真空ポンプで20分間脱
気したのち、油圧式の加圧装置を用いて錠剤成型器に15
0kg/cm2の圧力を加え、この状態で10分間圧力を保持さ
せることで、厚さが約0.3mmで強靭な円形板ディスクを
調製した。かくして、得られる微胞子虫胞子等は塊状材
料として用いることができる。
【００４７】 実施例10 実施例４で得られた粉末状のノゼマ ボンビシス胞子
200mgを冷却器付きの50mlナス型フラスコに入れ、40重
量％の水酸化ナトリウム水溶液30mlを加えオイルバスを
用いて100℃で3.0時間処理することにより脱アセチル化
度93.6％の均一微細粒径のキトサンビーズを得た。
【００４８】 実施例11 天敵微生物の保護効果（微胞子虫胞子利用による紫外線
からの細菌保護効果）： 微胞子虫胞子に細菌を次のようにして封入した。実施
例８の場合と同様の条件下での加水分解処理により胞子
の内容物を除去したもので、実施例４と同様に処理して
得た粉末状のノゼマ ボンビシス胞子2mgを細胞培養用
の遠心管に入れ、これにヒラタケ腐敗病細菌（Pseudomo
nas tolaasii）又はトマトかいよう病細菌（Clavibacte
r michiganensis pv.michiganensis）の109個/ml濃度の
懸濁液2.0mlを加えて、水道を利用したアスピレーター
で10分間滅圧にした後、減圧を解除して空気を導入し
た。減圧と空気導入を３回繰り返した。次に、遠心器で
1000rpmで10分間遠心分離し、胞子を遠心管底に集め
た。沈殿した胞子（以下、有胞子区という）0.2mlを取
り、直径9cmのガラス製シャーレ内の寒天培地上にＬ字
棒で一様に広げた。胞子液が培地上で水状でなくなるま
で風乾してから、紫外線（UV）ランプより20cmの距離に
培地を置き、10秒、30秒、１分、２分、５分間照射し
た。なお、UV照射実験は、クリーンベンチ内で行い、光
源にはナショナルGL−15（15W）の殺菌灯を用いた。紫
外線照射３日後シャーレの1/6面積に出現した菌数を数
えて照射による微胞子虫胞子の保護効果を評価した。得
られた結果を表−５に示す。なお、微胞子虫胞子を全く
含まない系で、上記と同様に遠心管で沈殿させて得た細
菌液を対照区として用いた（以下、無胞子区という）。
【００４９】
【００５０】 上記表−５において、シャーレの1/6面積中に出現し
た細菌集落（コロニー）数が多過ぎて測定できない場合
は、「多」と表示し、また、コロニー数は多いが量的に
区別可能なものについては、＋＋＋〜−（無）の４段階
で表示した。 紫外線照射に対する胞子による細菌の保護効果は次の
ようにして定量化した。片対数方眼用紙を用い、シャー
レの1/6面積に出現した菌数の対数を縦軸にとり、照射
時間を分単位で横軸にとる。このグラフからシャーレに
出現する菌数が減少しておよそ20個になる照射時間を求
めると、無胞子区では30秒、有胞子区では５分であっ
た。 この結果から、ヒラタケ腐敗病細菌をノゼマ ボンビ
シス胞子に封入することで、紫外線が当たっても内部に
封入した細菌の死滅割合は無胞子区に比較して低く、約
10倍の保護効果があることが明らかとなった。また、ト
マトかいよう病細菌の場合も保護効果があることが明ら
かである。封入による保護効果が認められたことから、
細菌、酵素、生理活性物質等を封入した本発明の微胞子
虫胞子は、天敵微生物用の保護担体等として有用であ
る。
【００５１】 実施例12 キチン胞子への抗生物質の吸着試験： キチンビーズを濃度の濃いアルカリ溶液で次のように
してキトサンビーズに改質した。キチンビーズ100mgを
冷却還元器付のナス型フラスコに入れ、30重量％のNaOH
水溶液を50ml加え、オイルバスを用いて100℃で２時間
処置した。反応終了後、十分な蒸留水で洗浄し、遠心器
で3000rpmで10分間回転させ、キトサンビーズを調製し
た。次いで、リファンピシン10mgを水3mlに溶かして調
製した抗生物質の水溶液0.2mlに、上記キトサンビーズ
0.5mgを加えた後、水道アスピレーターで脱気を５回繰
り返した区を作製した。実施例８と同じ方法によりトマ
トかいよう病細菌の増殖阻害を調べたところ、リファン
ピシン脱気５回繰り返し区のキトサンビーズには抗生物
質が吸着されていることが明らかになった。リファンピ
シンを吸着させた微胞子虫胞子のキトサンビーズが徐放
担体として有効であるかを調べるため、トマトかいよう
病細菌を用いて徐放効果を評価した。
【００５２】 上記したように、0.5mgの微胞子虫胞子のキトサンビ
ーズの粉末を上記のリファンピシン水溶液0.2mlに分散
させ、この分散液を、遠心管中に入れた。次いで、5000
rpmで３分間速心分離し、微胞子虫胞子沈殿物と上清と
を分離した。沈殿物0.1mlを別の遠心管に入れ、これに
新たに1mlの蒸留水を加えて再度遠心分離し、上清と微
胞子虫胞子沈殿物とを同様の方法で分離した。かくして
得られた沈殿物と上清部分について、一定の時間毎に、
トマトかいよう病細菌の増殖抑制に及ぼす抗菌作用を調
べた。このようにして得られた結果を表−６に示す。
【００５３】 微胞子虫胞子を含む沈殿物は、上清に比べて常に高い
抗菌活性を示し、８日後でも抗菌活性が認められたこと
から、抗生物質の吸着された微胞子虫胞子は抗生物質の
徐放担体として有効であると判断された。対照として用
いた上清希釈液は、経過時間０日に対応した上清を原液
として用い、経過時間２、４、６、８日ごとに1/10に希
釈したものである（経過時間２、４、６、８日に対応し
た10、100、1000、10000倍に希釈された）。1000倍に希
釈すると対照上清希釈液の抗菌作用は失われているが、
同試料に対応した上清の抗菌性は依然発現している。こ
のことからも、微胞子虫胞子が抗生物質用徐放担体とし
て有効であることがわかる。
【００５４】 実施例13 培養細胞を用いる微胞子虫胞子の生産： 昆虫培養細胞として、ヤママユガ科の一種アンテラエ
ア ユーカリプティの培養細胞系、鱗翅目昆虫由来のBm
36培養細胞系を用いた。アンテラエア ユーカリプティ
の培養細胞系及びBm36培養細胞系のそれぞれを、グレー
ス（Grace）培地に60℃、15分間の加熱処理をした家蚕
幼虫体液の上清及びウシ胎児血清をそれぞれ５％加えた
培養液を用いて、26℃で培養した。培養細胞への微胞子
虫胞子の接種は、次のようにして行われた。すなわち、
部分精製した微胞子虫胞子をパーコールを用いて精製
し、0.2N−KOHで25℃、30分間処理後、得られた精製胞
子を培養細胞と混合して接種した。 接種10日以降にこれらの培養細胞を採取し、超音波洗
浄器で処理して破壊した培養細胞浮遊液をパーコールに
重層し、遠心分離操作することにより、微胞子虫胞子が
多量に調製された。
【００５５】 実施例14 実施例１で用いたものと同一の微胞子虫胞子（ノゼマ
ボンビシス）の細胞壁物質の蛋白質を次のようにして
除去することにより非抗原性のキチンビーズを製造し
た。 まず、加水分解処理にあたっては、室温の1N NaOHで1
2時間処理した後、1N HClで再度12時間処理した。NaOH
及びHCl処理を合計５回繰り返した後、胞子を脱水する
ため最後に95％エタノールで２時間処理した。次に、20
00rpmで20分間遠心分離処理して胞子を沈殿させ、この
沈殿物に水を加えるという遠心分離操作を７回繰り返
し、胞子細胞壁物質の蛋白質を完全に除去したキチンビ
ーズを製造した。かくして得られたキチンビーズの抗原
抗体反応を血清反応的に調べるため、無処理の微胞子虫
胞子を用いてウサギから作った抗血清を供試し、この抗
血清の希釈液を用いて、非処理胞子（対照区試料）及び
処理胞子（加水分解処理試料）に対する血清反応がどの
程度の希釈液まで起こるかを比較した。その結果を表−
７に示す。
【００５６】 非処理胞子（対照区試料）では希釈倍率が1024倍にな
っても血清反応がみられたのに対し、処理胞子（加水分
解処理試料）では16倍希釈でも反応は全く見られなかっ
た。かくして、加水分解処理によって胞子の細胞壁成分
中の抗原となる蛋白類は完全に除去され、得られたキチ
ンビーズは非抗原性であると判断された。
【００５７】 酸及び／又はアルカリにより微胞子虫胞子の細胞壁物
質の蛋白質が除去され、主要成分のキチン量が相対的に
増加するのは、Ｘ線回折強度測定からも確認された。微
胞子虫胞子をコロジオンで固めてＸ線回折測定すると、
前述の表−２に見られるように、R1、R2、R3、R4の回折
環（干渉環）があらわれるが、いずれも散漫な回折環を
示す。しかし、酸及び／又はアルカリで細胞壁物質のう
ち蛋白質のみを除去すると、この処理微胞子虫胞子のキ
チンが示すR1〜R2の回折強度がシャープになり、キチン
含有量が増していることが実証された。 また、加水分解処理試料を25℃で１％のニンヒドリン
と20時間反応させても、呈色反応は一切起こらず、試料
中にアミノ酸が全く存在しないことが確かめられた。
【００５８】 実施例15 微細な孔を有するキチンビーズ及びキトサンビーズ： 実施例１で用いたのと同一の微胞子虫胞子（プリスト
フォーラ M27）の浮遊液を0.2Nの水酸化カリウム水
溶液中に入れ、25℃で30分間放置した。１時間後に和光
純薬工業製の生化学用pH7.2リン酸緩衝液でこの試料を
中和した。この簡単な処理で微胞子虫胞子内の細胞物質
が活性化し、細胞内容物が胞子から放出され、この際
に、大きさ約0.3μｍの孔が１つあくことが走査型電子
顕微鏡観察により確認された。この細胞物質放出後の微
胞子虫胞子は、長径1.7μｍ×短径0.9μｍのサイズで、
細胞膜厚が約0.13μｍで、細胞壁内が完全に空隙の楕円
球状を呈し、細胞物質を放出した跡の孔は、楕円球状の
長径方向の一端にあった。このような孔ができるため、
この微胞子虫胞子の環境圧力を減圧、又は減圧解除する
ことにより、酵素、抗生物質、金属イオン、医薬品、ウ
イルス、生理活性物質等を微胞子内空隙に簡易に封入す
ることができるので、本発明のキチンビーズ及びキトサ
ンビーズは、大きさの揃った、微粒状態で、これらの薬
効成分の徐放支持体として有用である。
【００５９】 実施例16 微細な孔を有するキチンビーズ及びキトサンビーズ： 実施例15で用いた微胞子虫胞子の代わりにノゼマ ボ
ンビシスNo.520を用いて、実施例15と同様に処理した。
かくして得られた細胞物質放出後の微胞子虫胞子は、長
径2.6μｍ×短径1.4μｍのサイズで、細胞膜厚が約0.13
μｍで、細胞壁内が完全に空隙の楕円球状を呈し、細胞
物質を放出した跡には、楕円球体の長径方向の一端に直
径が0.1μｍの孔が１つあくことが透過型電子顕微鏡観
察により確認された。このような孔ができるため、実施
例15の場合と同様に薬効成分の徐放支持体として有効で
ある。
【００６０】 実施例17 微胞子虫胞子の細胞壁物質より蛋白質だけを除去した
ものの安全性の試験を次のようにして行った。 実施例１で調製した微胞子虫胞子を酸で加水分解処理
した胞子浮遊液（４×108胞子/ml）を、１週間間隔で４
回ウサギの静脈に注射し、ウサギの成育経過を観察し
た。接種６ケ月後、注射をしない対照区のウサギと比べ
て、注射をした処理区のウサギについては体重変化の異
常も、外見上の異常も全く確認されなかった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、均一微細粒径のキチンビーズ及びキ
トサンビーズは、薬物デリバリーシステム用担体とし
て、さらには化粧ファンデーション素材として利用でき
る。キトサンビーズに酵素や生体細胞等を付着、固定す
ることにより、バイオリアクターとして、食品工業分
野、その他の広い産業分野において利用できる。 また、これらのビーズの表面及び／又は内部に酵素若
しくは免疫抗体等を結合させることにより、免疫担体と
しても利用できる。また、キチンをグリコールキチン、
カルボキシメチルキチンへと改質した改質キチンビーズ
は、保湿性に優れているため、化粧品材料として利用で
きる。また、微胞子虫胞子又はキチンビーズに、ビニル
化合物等をグラフト加工した後、これに酵素を固定化さ
せれば、酵素活性の安定性を高めるだけでなく、有効表
面積の広い微粒子という特徴を活かして、さらに効率的
な酵素機能を発揮させることが可能である。
【００６２】 本発明の蛋白質除去処理を行ったキチンビーズ、キト
サンビーズをヒトを含めた動物の体内に埋め込んでも、
抗原抗体反応は起こらないので、徐放用担体として利用
できる。また、キチンビーズ、キトサンビーズは、所定
の時間経過後、体内の酵素により分解されるので、生体
内で分解される安全素材として利用できる。キチンビー
ズ、キトサンビーズは、生体組織体内に入れても抗原と
はなり難いため、これに生理作用を持つ医薬品を固定化
させて、それを体内に埋め込んで使用することが可能で
あり、特に、抗ガン作用の医薬品を封入したキチンビー
ズ、キトサンビーズは、ミサイルキャリアーとして先端
的な医療分野で利用できる。 また、本発明のキチンビーズ、キトサンビーズは内部
に空隙のある中空ビーズとすることもでき、細胞壁組織
には微細な孔が開いているので、生体細胞、細菌、抗生
物質、生理活性物質等を微細な孔を通して空隙に封入す
ることができる。封入された物質は、外界のタンパク質
変性要因（紫外線等）の影響を受けにくいので、その生
物的な活性を長く保つことが可能となる。かくして、か
かるビーズは、例えば、天敵微生物保護材の新しい素材
としても利用できる。
【００６３】 本発明で用いる微胞子虫胞子は、医薬品、生理活性物
質、ホルモン、ワクチン等のマイクロカプセル基材とし
ても優れており、農薬、肥料等を微胞子虫胞子に封入し
てカプセル化したものは土壌改質材として利用できる。
また、飼料成分を封入してカプセル化したものは、家畜
飼料や養魚飼料として利用することができる。 本発明によれば、加水分解処理の程度、又は、微胞子
虫胞子の細胞壁に微細な孔をあける程度を加減すること
で、医薬品、生理活性物質、抗生物質等の徐放速度、徐
放量、生分解性の程度を簡単に制御できる。さらには、
キチンビーズ、キトサンビーズな生体内の酵素により次
第に分解が進むので、生分解性素材としても利用でき
る。 ［図面の簡単な説明］
【図１】 実施例２で得られた乾燥粉末（キチンビー
ズ）と標準サンプルのキチンとを比較して示す赤外線吸
収スペクトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/36 Ａ６１Ｋ 47/36 Ｃ０９Ｂ 67/02 Ｃ０９Ｂ 67/02 Ｚ Ｃ１１Ｂ 9/00 Ｃ１１Ｂ 9/00 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/10 Ｃ１２Ｎ 1/10 11/10 11/10 Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｐ 19/26 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08L 37/08 A01N 25/10 A23K 1/16 303 A23L 1/00 A61K 9/50 A61K 47/36 C09B 67/02 C11B 9/00 C12N 1/10 C12N 11/10 C12P 19/26 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】昆虫又は培養細胞内で増殖された微胞子虫
    胞子からなる、キチンを主要な細胞壁物質とする均一微
    細粒径のキチンビーズ及び該細胞壁物質のキチンをＮ−
    脱アセチル化させたキトサンビーズ。
  2. 【請求項２】前記キチンビーズ及びキトサンビーズが蛋
    白質の除去された非抗原性のものである請求項１記載の
    キチンビーズ及びキトサンビーズ。
  3. 【請求項３】前記増殖微胞子虫胞子がその細胞壁に孔を
    有するものであり且つ前記キチンビーズ及びキトサンビ
    ーズが中空である請求項１又は２記載のキチンビーズ及
    びキトサンビーズ。
  4. 【請求項４】昆虫若しくは培養細胞内で増殖された微胞
    子虫胞子からなる、キチンを主要な細胞壁物質とする均
    一微細粒径のキチンビーズ又は該細胞壁物質のキチンを
    Ｎ−脱アセチル化させたキトサンビーズからなる担体。
  5. 【請求項５】前記キチンビーズ及びキトサンビーズが蛋
    白質の除去された非抗原性のものである請求項４記載の
    担体。
  6. 【請求項６】前記増殖微胞子虫胞子がその細胞壁に孔を
    有するものであり且つ前記キチンビーズ及びキトサンビ
    ーズが中空である請求項４又は５記載の担体。
  7. 【請求項７】前記担体が、生理活性物質、抗生物質、生
    体細胞、微生物、染料、医薬品、農薬、香料、飼料素
    材、若しくは食品素材を固定させ又は導入するために用
    いられるものである請求項４〜６のいずれかに記載の担
    体。
  8. 【請求項８】昆虫に濃度５×102〜５×108個/mlの微胞
    子虫胞子を経口又は経皮的に接種して増殖させた後、生
    育した昆虫体内より増殖した該微胞子虫胞子を取り出
    し、精製して、均一の微細粒子であるキチンビーズを得
    ることを特徴とする均一微細粒径のキチンビーズの製造
    法。
  9. 【請求項９】前記昆虫が２齡期蚕であり、前記生育後の
    昆虫が５齡期であることを特徴とする請求項８記載の均
    一微細粒径のキチンビーズの製造法。
  10. 【請求項１０】前記昆虫が家蚕幼虫であることを特徴と
    する請求項８又は９記載の均一微細粒径のキチンビーズ
    の製造法。
  11. 【請求項１１】昆虫に濃度５×102〜５×108個/mlの微
    胞子虫胞子を経口又は経皮的に接種して増殖させた後、
    生育した昆虫体内より増殖した該微胞子虫胞子を取り出
    し、精製して、均一の微細粒子であるキチンビーズを
    得、次いでキチンビーズのキチンをＮ−脱アセチル化し
    てキトサンビーズを得ることを特徴とする均一微細粒径
    のキトサンビーズの製造法。
  12. 【請求項１２】前記昆虫が２齡期蚕であり、前記生育後
    の昆虫が５齡期であることを特徴とする請求項11記載の
    均一微細粒径のキトサンビーズの製造法。
  13. 【請求項１３】前記昆虫が家蚕幼虫であることを特徴と
    する請求項11又は12記載の均一微細粒径のキトサンビー
    ズの製造法。
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