CN102763684A - 一种微胶囊制剂及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种以聚γ-谷氨酸为壁材的微生物胶囊制剂，其制备方法及在制备微生物农药和微生物肥料中应用。以聚γ-谷氨酸为壁材的微生物微胶囊具有良好的机械强度和柔韧性，应用于微生物包埋剂中具有良好的控缓释能力，能保护微生物细胞免收紫外线、温度、酸碱、离子强度和重金属离子的伤害，能使微生物细胞在生产过程中免受伤害和有效的延长制剂的保质期等优点。本发明的微生物微胶囊制剂，可根据微生物种类的不同制备不同的微生物微胶囊制剂，且可以在制备过程中有效的控制微胶囊囊壁厚度和微胶囊的直径。本发明的微胶囊对微生物细胞的包埋率达90％以上，可实现工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种以聚γ-谷氨酸为壁材的微生物胶囊制剂，其制备方法及在制备微生物农药和微生物肥料中应用。
背景技术
微胶囊技术是以天然或合成的高分子材料作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将一种或者多种活性物质包裹起来形成具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术。包裹的过程即为微胶囊化(microencapsulation)，形成的微小粒子即为微胶囊(张峻等，2005)。微胶囊化的优势在于形成微胶囊时，囊心被包覆而与外界环境隔离，它的性质能毫无影响的被保留下来，在适当条件下，壁材被破坏时又能将囊心释放出来，可使囊心免受外界的温度、氧气、紫外线等因素的影响(李玉新等，1998)。近年来，随着微胶囊制造技术的发展，其应用范围迅速扩大。被微胶囊化的芯材既可以是各种医用药物、食用调味品、化妆品的香料，也可以是颜料、农药、化肥等。微胶囊技术研究广泛，尤其是医学领域的研究最为活跃。
张稷博等用阿拉伯胶和明胶为壁材，聚乙烯5000为乳化剂成功制备DDVP原油微胶囊，并显著提高杀虫效果[1]。姚建国等采用明胶-阿拉伯胶为壁材，对丹参酮/肉豆蔻酸异丙酯微胶囊化，其包埋率可达80％[2]。田秀枝，王树根以明胶和阿拉伯树胶为微胶囊的壁材，玫瑰香精为芯材，采用复凝聚法制备香精微胶囊[3]。吴英，马卫以明胶和阿拉伯树胶为微胶囊的壁材，制备二氯苯醚菊酯微胶囊，其产品使用安全，持效期长[4]。
雄鹰等用改性壳聚糖代替聚赖氨酸，制备海藻酸钠/壳聚糖(ACA)微胶囊囊包埋人卵巢癌细胞用于细胞移植[5]。付颖丽等用海藻酸钠-壳聚糖微胶囊固定化大肠杆菌[6]。刘建辉，闫小平用海藻酸钠作囊材，用凝聚法将花椒油微囊化[7]。刘剑萍，陆大年研究了壳聚糖微胶囊的制备工艺[8]。闫向阳采用凝聚法制备薄荷脑微胶囊[9]。刘剑萍等采用明胶和壳聚糖作为壁材，通过复凝聚反应制备了包裹TiO2的微胶囊[10]。
张兴华等把环氧树脂固化促进剂制成了以脲醛树脂为外壁的微胶囊，并将其应用于环氧树脂胶带中[11]。冯薇等用脲醛树脂制备溴氰菊酯农药微胶囊[12]。李立等以尿素和甲醛为壁材，分散染料酸性红GP(C.I.266)为囊芯制备了分散染料微胶囊[13]。李嘉诚采用原位聚合法制备以脲醛树脂为壁材的甲维盐微胶囊制剂[14]。葛艳蕊，冯薇以脲醛树脂为壁材，用原位聚合法制备玫瑰香精微胶囊[15]。冯薇等用原位聚合法制备以脲醛树脂为壁材的酞菁绿G颜料微胶囊[16]。
白光月等分别用乙基纤维素和海藻酸钙作为膜材，将P507(2-乙基己基膦酸单乙基己基酯)微胶囊化，将这两种含萃取剂的微胶囊用于萃取La3+、Nd3+、Lu3+[17]。王玉洁用乙基纤维素微胶囊固定化过氧化氢酶[18]。刘丽雅，陈水林利用界面聚合法、原位聚合法、复凝聚法或β-环糊精包结法等微胶囊技术制备微胶囊香精[19]。陆晓滨等以β-环状糊精和明胶为壁材，制备酥油微胶囊[20]。
葛毅强等用阿拉伯胶、糊精和玉米糖浆为壁材制备VE微胶囊。许建明等用乙酸乙酯和乙基纤维素对硝酸铵进行包覆，制备成微胶囊，达到对对硝酸铵特性的改善，并具有良好的缓释效果[21]。梁治齐用脲醛树酯和丙烯腈-偏二氯乙烯共聚物为壁材制成石油醚发泡剂微胶囊，不仅可解决它在生产、运输、贮存过程中易挥发损失，污染大气环境，存在火灾隐患的问题，而且可用于生产有特殊性能的低密度微泡泡沫塑料[22]。
王立新等采用原位聚合法用三聚氰胺甲醛树脂包覆一种相变点为24℃相变材料，制得相变储热微胶囊[23]。朱立群，张玮采用水相分离法制备了以润滑油为囊心、聚乙烯醇为囊壁的微胶囊[24]。张永波等利用界面聚合的方法，以聚氨酯为皮材将香精包覆于其中制备了芳香微胶囊[25]。张黎明等通过将三聚磷酸纳溶液滴加到阳离子瓜尔胶和聚乙二醇(PEG)混合水溶液中，利用多糖聚电解质的离子凝胶化反应首次制得经PEG修饰的可降解瓜尔胶微胶囊[26]。
徐伟箭等采用原位聚合法制备了以正十八烷为囊芯、苯乙烯-二乙烯基苯为高分子囊壳的微胶囊[27]。李冬生等利用相分离法制得辣椒油树脂微胶囊[28]。朱瑞宜，H.M.Norbury用羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯为壁材，采用双乳液法研制配糖蛋白B的肠溶微胶囊[29]。滕剑敏利用蛋白质和麦芽糊精为壁材，制备粉末猪油微胶囊[30]。赵崇敏，全易用聚烯丙胺盐酸盐(PAAHC)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)作为壁材，制备糖甙酶微胶囊[31]。薛文通等利用明胶、大豆分离蛋白、糊精等水溶性壁材包裹核桃仁中的油脂，再经喷雾干燥脱去壁材中的水分使之成为O/W型微胶囊[32]。梁歧等用大豆分离蛋白、食用明胶、麦芽糊精、蔗糖组成的复合壁材包埋大豆粉末磷脂，制备成微胶囊[33]。
在前人大量的研究中，微胶囊技术已经取得了一定的发展，但也还存在一些未解决的问题，比如包埋率不高，缓释性能不好，制备微胶囊的设备要求高或原料不易得到而不宜规模化生产等。
目前，微生物作为微生物肥料和微生物农药的主体，广泛的应用于农业生产中，但微生物产品存在着抗逆性差、适应环境能力弱、变异性强等性质不稳定的缺点。近年来人们一直在对增强微生物制品在生产、运输、保藏和应用过程中的微生物活性进行研究，并取得了一定的成果，但还不能满足较高标准的需求。本发明所述的以聚γ-谷氨酸为壁材的微生物微胶囊具有良好的机械强度和柔韧性，应用于微生物包埋剂中具有良好的控缓释能力，能保护微生物细胞免收紫外线、温度、离子强度和重金属离子的伤害，能有效的延长制剂的保质期等优点，这些优点能有效的解决现有微生物制品中普遍存在的微生物活性差和保质期短的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术的不足，提供一种具有能提高微生物抗逆性、并能控制微生物在应用中的释放速度能力的微生物微胶囊及其制备方法。本发明的另一个目的是提供该聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂在农业中的应用。
本发明的技术方案如下：
为了实现以上目的，本发明提供了一种聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂，该制剂是由新型有机高分子聚γ-谷氨酸和明胶交联形成囊壁，以活的微生物细胞作为囊心组成。
所述的囊壁是由聚γ-谷氨酸和明胶交联构成。微胶囊的囊壁外层用甲醛加固。囊心是具有活性的微生物，该活性微生物包含抗病虫害类微生物、解磷解钾和固氮类微生物、促生长类微生物。本发明的微胶囊制剂的壁材为γ-谷氨酸由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过a-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每个重复单元的a-碳原子上还有一个游离的羧基，其平均分子量为10～10,000千道尔顿。
本发明中，上述聚γ-谷氨酸产品的制备方法参见申请人华中农业大学的授权专利：发明名称为聚γ-谷氨酸产生菌及生产聚γ-谷氨酸的方法，专利号为ZL03119583.6。
本发明所述的明胶、甲醛、盐酸、氢氧化钠等试剂从市场购买。
本发明中作为囊心的微生物所述的囊心可选自下列微生物，但不局限于下列微生物：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-10，保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011100，通过发酵获得其芽胞和菌体；
巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号：ACCC NO：10010，购自中国农业微生物菌种保藏中心(北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体；
胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏号：ACCC NO：10168，购自中国农业微生物菌种保藏中心(北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体；
侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)，保藏号：ACCC NO：11079，购自中国农业微生物菌种保藏中心(北京市海淀区中关村南大街12号)，从农业菌种保藏中心购买，通过发酵获得其芽胞和菌体；
紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)，保藏号：CICC NO：20026，购自中国工业微生物菌种保藏中心(北京市朝阳区霄云路32号)，通过发酵获得其菌体。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏号：ACCC NO：30680，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区霄云路32号)，通过发酵获得其菌体。
所述微胶囊的囊壁外层可以采用甲醛加固，甲醛用量为0.6ml/g明胶。上述固化剂不只局限于甲醛，凡是小分子的醛类都适用于本发明，醛类与甲醛的用量为等摩尔数。
申请人提供了一种制备聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂的方法，由聚γ-谷氨酸和明胶通过交联形成囊壁，以活的微生物细胞作为囊心构成微胶囊制剂；所述的制剂可以是水剂，也可以是固体制剂。
具体地，本发明的步骤如下：
(1)微胶囊的囊壁材料水溶液的制备：
a)按质量百分比配制1.5～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液，备用；
b)按质量百分比配制1.5～4.0％的明胶水溶液，备用；
(2)菌悬液的制备：将权利要求1所述的微生物发酵，12000r/min离心收集沉淀，然后用0.9％的生理盐水稀释到所需浓度。
其中：
枯草芽胞杆菌浓度为：2×1010个芽胞/ml菌悬液；
巨大芽胞杆菌5×1010个芽胞/ml菌悬液；
胶冻样芽胞杆菌5×109个芽胞/ml菌悬液；
侧胞芽胞杆菌8×1010个芽胞/ml菌悬液；
紫云英根瘤菌1×1011个芽胞/ml菌悬液；
淡紫拟青霉8×109个孢子/ml菌悬液；
(3)微胶囊固定液和pH调整液的配制：
a)配制40.0％的甲醛溶液；
b)配制3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液；
(4)微胶囊的制备：量取40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5～4.0％的明胶水溶液，在35～50℃下，300～500r/min的磁力搅拌下缓慢加入步骤(2)得到5～20体积份数的菌悬液，然后在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，然后慢速加入40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5％～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，用步骤(3)制备的3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液调PH到3.8～4.2，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，按0.6ml/g明胶的量加入步骤(3)中的甲醛溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，得到微生物微胶囊水剂，备用；
(5)将步骤(4)得到的微生物微胶囊水剂，采用喷雾干燥或真空干燥或真空冷冻干燥得到固体微胶囊制剂；
其中
喷雾干燥条件：进口温度为170±5℃，出口温度为70±5℃，进料速度为700±10ml/min；
真空干燥条件：70℃，-0.1～-0.09MP；
真空冷冻干燥条件：-110℃，-0.1～-0.09MP。
上述步骤(2)所述的菌悬液中的微生物为芽胞菌的芽胞、芽胞菌的营养体细胞、非芽胞细菌细胞或真菌孢子。
本发明提供的聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂可在微生物肥料和微生物农药中应用。
具体应用时，将本发明制备得到的微胶囊按照控制菌体终浓度为N×106稀释原产品，并将所得稀释液调pH至中性，灌施到作物根部或喷施到作物叶面，使其起到促进作物生长或抗病作用。
本发明提供的聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂及其制备方法和现有微生物肥料和微生物农药技术相比有如下优点：
1、本发明所述的聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂，具有抗紫外线，抗高温、抗高离子强度和重金属离子的伤害，能降低生产难度，便于运输和保藏，能有效的延长制剂的保质期、增强微生物在环境中的定植能力和繁殖能力等优点。
2、本发明所述的聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂，具有良好的膜结构，并具有良好的机械强度和柔韧性，对其囊心微生物具有良好的控缓释作用，具有良好的延长微生物肥料和微生物农药残效期等优点。
3、本发明所述的聚γ-谷氨酸微生物微胶囊制剂，其制备方法成本较低，其囊心包埋率高，产品合格率高，可实现工业化大生产。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：是本发明的聚γ-谷氨酸-明胶微胶囊的基本制备工艺流程图。
图2：pH对微生物微胶囊包埋率的影响。
图3：壁材浓度对微生物微胶囊包埋率的影响。
图4：聚γ-谷氨酸与明胶的质量比对微生物微胶囊包埋率的影响。
图5：甲醛用量优化实验及结果。
图6：聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌微胶囊盆栽效果实验。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-10分离筛选过程；
用于本发明微胶囊制剂囊心的微生物之一，是发明从湖北省武汉市武昌狮子山地区华中农业大学校园的菜园土中分离筛选获得一株适用于西瓜枯萎病防治的生防细菌枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)3-10，该菌株于2011年3月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2011100。
2、枯草芽胞杆菌3-10的分离鉴定及其菌学特征研究
(1)枯草芽胞杆菌3-10的分离鉴定
本发明的一株适用于西瓜枯萎病防治的生防细菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)3-10分离筛选于湖北省武汉市武昌狮子山地区华中农业大学校园的菜园土。其分离和鉴定方法按照报道的方法(周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版)进行，为常规微生物分离鉴定方法。
(2)枯草芽胞杆菌3-10的菌学特征
1)枯草芽胞杆菌3-10的形态学
枯草芽胞杆菌3-10在LB固体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，补充蒸馏水至1000m1，调pH至7.2，在121℃高压蒸汽灭菌20min)上，前期为光滑粘稠的菌落，中央隆起，菌落不透明，最后为表面皱褶的隆起菌落。菌体长杆状，大小为0.7-0.8×2-3μm，芽胞中生，卵圆形。
该菌株的保存按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。
2)枯草芽胞杆菌3-10菌株生理生化特性
本发明筛选的枯草芽胞杆菌3-10菌株适宜的生长温度为30℃，适宜的生长环境pH值为7.5。能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖、海藻糖、核糖、乳糖和淀粉等碳源；能利用酵母膏、牛肉膏和酵母粉等氮源；明胶液化、淀粉水解、干酪素水解等生化试验鉴定为阳性，革兰氏染色为阳性，VP测定为阳性，过氧化氢酶测定为阳性，葡萄糖氧化发酵测定为阳性，硝酸盐还原反应为阳性，丙二酸盐反应为阳性，柠檬酸盐的利用为阳性，NaCl浓度超过10％时不能生长，吲哚产生为阴性、氧化酶测定为阴性、甲基红(MR)测定为阴性、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性、卵黄卵磷脂酶反应为阴性。
3)枯草芽胞杆菌3-10的其他特征：
枯草芽胞杆菌3-10菌株对水稻纹枯病菌(Rizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大豆灰霉病菌(Botrytis cinerea)、西瓜、甜瓜和棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)等重要植物病原真菌具有强烈的抑制作用。
本实施例提供了一种聚γ-谷氨酸枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)微胶囊制剂，它是由位于内部的一种枯草芽胞杆菌的芽胞和/或营养体细胞与位于外层的由聚γ-谷氨酸和明胶交联成的囊壁组成。
其中所述的囊壁是由聚γ-谷氨酸和明胶交联构成。微胶囊的囊壁外层用甲醛加固。囊心是具有活性的微生物，其微生物包括了抗病虫害类微生物、解磷解钾和固氮类微生物、促生长类微生物。所述的壁材的γ-谷氨酸由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过a-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每个重复单元的a-碳原子上还有一个游离的羧基，其平均分子量为10～10，000千道尔顿。
本发明中，上述聚γ-谷氨酸的制备方法参见本申请人的授权专利：发明名称为：聚γ-谷氨酸产生菌及生产聚γ-谷氨酸的方法，专利号为ZL03119583.6(授权公告日：2005年12月14日)。
本发明所述的明胶、甲醛、盐酸、氢氧化钠等试剂从市场购买。
本发明中作为囊心的微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-10，保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011100，通过发酵获得其芽胞和菌体。
该菌株的发酵培养基配方及条件如下：
培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g；补充蒸馏水至1000ml；pH 7.2～7.4，按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，37℃，摇床180r/min培养36小时。
其制备步骤如下：
(1)微胶囊的囊壁材料水溶液的制备：
a)按照质量百分比配制2％的聚γ-谷氨酸水溶液，备用；
b)按照质量百分比配制2％的明胶水溶液，备用(配制明胶水溶液时需要在40℃水浴，以便明胶完全溶解)；
(2)微胶囊固定液和PH调整液的配制：
a)选用甲醛含量为40.0％的分析纯甲醛溶液；
b)准确配制3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液，备用；
(3)微胶囊的制备：量取40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为2％的明胶水溶液，在45℃下，在400r/min的磁力搅拌下缓慢加入20体积份数的菌悬液，然后在45℃，400r/min的磁力搅拌下搅拌10min，然后慢速加入40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为2％的聚γ-谷氨酸水溶液，在45℃，400r/min的磁力搅拌下搅拌10min，用步骤(2)配制的3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液调PH到4.0，在45℃，400r/min的磁力搅拌下搅拌10min，按0.6ml/g(明胶)的量加入步骤(2)中的甲醛溶液，在45℃，400r/min的磁力搅拌下搅拌10min，得到微生物微胶囊水剂，备用；
(4)将步骤(3)制备得到的微生物微胶囊溶液通过喷雾干燥(喷雾干燥用APVANHYDRO DSD52喷雾干燥机，干燥条件是：进口温度为170±5℃，出口温度为70±5℃，进料量为700±10ml/min)得到固体产品。
本实施例的发明效果见表1所示
表1聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌微胶囊制备参数及包埋率
实施例2
根据实施例1所介绍的方法，在本实施例中，用于囊心的微生物是胶冻样芽胞杆菌(Bacillusmucilaginosus)，保藏号：ACCC NO：10168，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体。
发酵培养基配方及条件如下：
培养基：豆粕粉42g/L，玉米淀粉8g/L，CaCO31g/L，K2HPO4 0.25g/L，FeCl3 0.015g/L，七水硫酸镁2.4g/L；补充蒸馏水至1000ml；pH 7.0-7.2；；按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，28℃，摇床180r/min培养24小时。
其中步骤(1)中的聚γ-谷氨酸和明胶溶液的浓度都为1.5％，步骤(2)中的明胶溶液和聚γ-谷氨酸溶液的用量为45体积分数，菌悬液的用量为10体积分数，反应温度为35℃，搅拌转速为300r/min。
本实施例的发明效果见表2所示
表2聚γ-谷氨酸-明胶胶冻样芽胞杆菌微胶囊制备参数及包埋率
实施例3
根据实施例1所介绍的方法，在本实施例中，用于囊心的微生物是巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)，保藏号：ACCC NO：10010，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体。
发酵培养基配方及条件如下：
培养基：玉米淀粉20.0g，蛋白胨15.0g，豆粕30.0g，KH2PO42.0g，碳酸钙2.0g，硫酸镁1.0g，硫酸锰0.5g；补充蒸馏水至1000ml；pH pH7.5；按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，28℃，摇床180r/min培养36小时。
其中步骤(1)中的聚γ-谷氨酸和明胶溶液的浓度都为2.5％，步骤(2)中的明胶溶液和聚γ-谷氨酸溶液的用量为47.5体积分数，菌悬液的用量为5体积分数，反应温度为50℃，调pH至4.2。
本实施例的发明效果见表3所示
表3聚γ-谷氨酸-明胶巨大芽胞杆菌微胶囊制备参数及包埋率
实施例4
根据实施例1所介绍的方法，在本实施例中，用于囊心的侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)，保藏号：ACCCNO：11079，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体。
发酵培养基配方及条件如下：
培养基：葡萄糖10.0g，豆粕30.0g，硫酸铵3.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾2.0g，碳酸钙1.0g；补充蒸馏水至1000ml；pH 7.2；按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，37℃，摇床180r/min培养36小时。
其中步骤(1)中的聚γ-谷氨酸和明胶溶液的浓度都为4.0％，步骤(2)中的反应温度为45℃，调pH至3.8，搅拌转速为500r/min。
将步骤(3)制备得到的微生物微胶囊溶液通过冷冻干燥(冷冻干燥用Thermo Heto Power DryLL1500冻干机，冻干条件：-110℃，-0.1～-0.09MP)得到固体产品。
本实施例的发明效果见表4所示
表4聚γ-谷氨酸-明胶侧孢芽胞杆菌微胶囊制备参数及包埋率
实施例5
根据实施例1所介绍的方法，在本实施例中，用于囊心的微生物紫云英根瘤菌(Rhizobiumastragula)，保藏号：CICC NO：20026，购自中国工业微生物菌种保藏中心，(地址：北京市朝阳区霄云路32号)，通过发酵获得其菌体。
发酵培养基配方及条件如下：
培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨3.9％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％；补充蒸馏水至1000ml；pH 7.2；按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，28℃，摇床200r/min培养36小时。
其中步骤(1)中的聚γ-谷氨酸和明胶溶液的浓度都为3.0％，步骤(2)中的明胶溶液和聚γ-谷氨酸溶液的用量为45体积分数，菌悬液的用量为10体积分数，反应温度为35℃，调pH至4.2，搅拌转速为300r/min。
本发明将制备得到的微胶囊以水剂的形式保藏。
本实施例的发明效果见表5所示
表5聚γ-谷氨酸-明胶紫云英根瘤菌微胶囊制备参数及包埋率
实施例6
根据实施例1所介绍的方法，在本实施例中，用于囊心的微生物淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)，保藏号：ACCC NO：30680，购自中国农业微生物菌种保藏中心，(地址：北京市朝阳区霄云路32号)，通过发酵获得其菌体。
发酵培养基配方及条件如下：
培养基：马铃薯200.0g(马铃薯200.0g加适量水煮制，方法按报道的常规方法)，蔗糖20g；补充蒸馏水至1000ml；pH自然(原始pH，不作调整)；按照常规方法灭菌(121℃高压蒸汽灭菌20min)。
发酵条件：摇瓶100ml/500ml装液量，28℃，摇床100r/min培养72小时。
将步骤(3)制备得到的微生物微胶囊溶液通过冷冻干燥(冷冻干燥用Thermo Heto PowerDryLL1500冻干机，冻干条件：-110℃，-0.1～-0.09MP)得到固体产品。
本实施例的发明效果见表6所示
表6聚γ-谷氨酸-明胶淡紫拟青霉微胶囊制备参数及包埋率
注：孢子悬液来自下列微生物
a枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-10，保藏号：CCTCC NO：M2011100
b胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏号：ACCC10168(商业菌株)
c巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号：ACCC10010(商业菌株)
d侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)，保藏号：ACCC11079(商业菌株)
e紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)，保藏号：CICC20026(商业菌株)
f淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏号：ACCC30680(商业菌株)
实施例7
本实施例选取了聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌3-10微胶囊抗西瓜枯萎病盆栽效果实验来验证微胶囊制剂的实用性。
本实验采用盆栽实验，设计16个对照，并采用灌根的方式浇灌菌悬液(本发明筛选的枯草芽胞杆菌3-10)或微胶囊溶液(含有本发明筛选的枯草芽胞杆菌3-10)，其有效活菌数为1×106个菌/g干土，所有的菌悬液和微胶囊都为一次性浇灌。
表7聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌3-10微胶囊制剂抗西瓜枯萎病盆栽效果实验结果
注：CK为空白对照；F是浇灌西瓜枯萎病病原菌(菌株号ACCC30373，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，cfu＝1×106/g干土；BS是只浇灌枯草芽胞杆菌3-10菌悬液，cfu＝1×106/g干土；W是只浇灌聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌3-10微胶囊水剂，cfu＝1×106/g干土；W-F是同时浇灌了西瓜枯萎病病原菌和聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌3-10微胶囊水剂，两者的菌密度都控制为：
cfu＝1×106/g干土。
表8聚γ-谷氨酸-明胶枯草芽胞杆菌3-10微胶囊剂抗西瓜枯萎病盆栽实验病情指数统计结果
注：发病率(％)＝发病株数/株数总和×100
病情指数＝100×∑(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)
病指防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
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Claims (7)
1.一种以聚γ-谷氨酸为壁材的微生物微胶囊制剂，其特征在于，它是由聚γ-谷氨酸和明胶通过交联形成囊壁，以活的微生物细胞作为囊心构成的微胶囊制剂；
其中：
所述的壁材的聚γ-谷氨酸由D型谷氨酸D-Glu和L型谷氨酸L-Glu通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每个重复单元的α-碳原子上还有一个游离的羧基，其平均分子量为10～10,000千道尔顿；
所述的囊心选自下列微生物：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-10，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011100；
巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)ACCC NO：10010；
胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC NO：10168；
侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)ACCC NO：11079；
紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CICC NO：20026；
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)ACCC NO：30680。
2.根据权利要求1所述的微胶囊制剂，其特征在于，述的微生物的质量为：
枯草芽胞杆菌：2×1010个芽胞/ml菌悬液；
巨大芽胞杆菌5×1010个芽胞/ml菌悬液；
胶冻样芽胞杆菌5×109个芽胞/ml菌悬液；
侧胞芽胞杆菌8×1010个芽胞/ml菌悬液；
紫云英根瘤菌1×1011个芽胞/ml菌悬液；
淡紫拟青霉8×109个孢子/ml菌悬液。
3.根据权利要求1或2所述的微胶囊制剂，其特征在于，所述微胶囊的囊壁外层采用甲醛加固，用量为0.6ml/g明胶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微胶囊制剂，其特征在于该制剂是水剂或为固体。
5.一种制备如权利要求1所述的微胶囊制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)微胶囊的囊壁材料水溶液的制备：
a)按质量百分比配制1.5～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液，备用；
b)按质量百分比配制1.5～4.0％的明胶水溶液，备用；
(2)菌悬液的制备：将权利要求1所述的微生物发酵，12000r/min离心收集沉淀，然后用0.9％的生理盐水稀释到所需浓度。所述的菌悬液浓度如下：
枯草芽胞杆菌3-10为：2×1010个芽胞/ml菌悬液；
巨大芽胞杆菌5×1010个芽胞/ml菌悬液；
胶冻样芽胞杆菌5×109个芽胞/ml菌悬液；
侧胞芽胞杆菌8×1010个芽胞/ml菌悬液；
紫云英根瘤菌1×1011个芽胞/ml菌悬液；
淡紫拟青霉8×109个孢子/ml菌悬液。
(3)微胶囊固定液和pH调整液的配制：
a)配制40.0％的甲醛溶液；
b)配制3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液；
(4)微胶囊的制备：量取40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5～4.0％的明胶水溶液，在35～50℃下，300～500r/min的磁力搅拌下缓慢加入步骤(2)得到5～20体积份数的菌悬液，然后在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，然后慢速加入40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5％～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，用步骤(3)制备的3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液调PH到3.8～4.2，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，按0.6ml/g明胶的量加入步骤(3)中的甲醛溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，得到微生物微胶囊水剂，备用；
(5)将步骤(4)的微生物微胶囊水剂，采用喷雾干燥或真空干燥或真空冷冻干燥得到固体微胶囊制剂；
其中：
喷雾干燥条件：进口温度为170±5℃，出口温度为70±5℃，进料速度为700±10ml/min；
真空干燥条件：70℃，-0.1～-0.09MP；
真空冷冻干燥条件：-110℃，-0.1～-0.09MP。
6.权利要求1-4任一项所述的微胶囊制剂在制备微生物农药中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的微胶囊制剂在制备微生物肥料中应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121107 |