WO2021258226A1 - Formulacion para el control de botrytis cinerea que comprende un biocontrolador de. bacillus subtilis y un adyuvante de origen natural - Google Patents

Formulacion para el control de botrytis cinerea que comprende un biocontrolador de. bacillus subtilis y un adyuvante de origen natural Download PDF

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botrytis cinerea
control
biocontroller
extract
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PCT/CL2020/050067
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Hector CARRASCO ALTAMIRANO
Nancy ALVARADO ALMONACID
Evelyn SILVA MORENO
Claudia INFANTE DULCIC
Andres OLEA CARRASCO
Christian ROBLES KELLY
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Universidad Autónoma De Chile
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides

Definitions

  • the present invention corresponds to a formulation for the control of the pathogenic fungus Botrytis cinerea, where said formulation is composed of a biocontroller, corresponding to the bacterium Bac ⁇ llus subt ⁇ ll ⁇ s strain 110 and an adjuvant of natural origin corresponding to a cinnamon extract contained in a polymeric nanoaggregate. , where in turn, both are contained in a polymeric alginate nanoaggregate.
  • Said formulation is useful in the treatment and control of crops infected by Botrytis cinerea, particularly in table grape crops.
  • the scope of the invention also includes a method for the control of the pathogenic fungus Botrytis cinerea, which comprises treating the culture infected by Botrytis cinerea with the formulation described.
  • a method is also included to prevent the infection of the pathogenic fungus Botrytis cinerea by means of the preventive treatment of the culture with the described formulation.
  • the present invention relates to the area of agriculture in the control of phytopathogens.
  • the formulation comprises a biocontroller and a natural adjuvant contained in nanoaggregates, which aim to provide an alternative for the control of the pathogenic fungus B. cinerea on table grape crops.
  • Botrytis cinérea is an important pathogenic fungus in crops, since it is the cause of the disease known as gray rot (Benito et al., 2000). This disease manifests itself in crops by the appearance
  • This fungus (B. cinérea) has a variety of attack mechanisms on its host and different target sites, so its control is difficult. In addition, it is capable of surviving as mycelia, conidia or sclerotia for long periods.
  • the second control method consists of the use of microorganisms such as fungi, bacteria and nematodes that have an antagonistic activity on B. cinerea.
  • This control method has been widely explored, and has had good results.
  • One of them is the case of the use of the fungus Trichoderma harzianum, which has shown good results in the control of this fungus (B. cinérea) (Molina G et al., 2006).
  • Canelo extract (Drimys w ⁇ nter ⁇ ). Cinnamon has been studied for its antihistamine, anti-inflammatory, and antinociceptive properties. The extracts produced from Canelo plants have been studied in plants and it has been determined that it has an impact on their growth, in addition to having antimicrobial and insecticidal activities (Robles-Kelly et al., 2017).
  • patent documents disclosing the use of natural extracts as antifungal agents such as patent documents.
  • W02013013178, US2015366890 in which the use of compounds such as terpenes, sesquiterpenes and other types of compounds is presented and which present antifungal activity.
  • document CL201402052 describes the use of natural compounds obtained from cinnamon, which are used for the preparation of a formulation for aquatic purposes, while document EP2124575 for its part, presents an antimicrobial composition that It presents a synergistic effect when it is included in a polymeric matrix of polyethylene glycol, encapsulating compounds such as polygodial and / or drimenol.
  • Botrytis cinerea Even though there are proposals for the control of Botrytis cinerea, these correspond to alternatives based on the application of toxic chemicals that are harmful to humans and the environment.
  • the present invention presents a formulation particularly designed for the controlled release of active ingredients of natural origin such as a bacterial biocontroller (B. subtillis) and an adjuvant corresponding to a natural extract derived from the cinnamon plant, which are encapsulated in matrices
  • Active ingredients of natural origin such as a bacterial biocontroller (B. subtillis) and an adjuvant corresponding to a natural extract derived from the cinnamon plant, which are encapsulated in matrices
  • Polymeric agents can reduce the growth and / or prevent the proliferation of the infection caused by B. cinerea in crops, mainly table grape crops.
  • This formulation is not phytotoxic and can control the growth of B. Ashen both in pre-harvest and post-harvest, which has not been described previously.
  • Figure 1 Evaluation of antifungal activity in vitro of extracts encapsulated in conjunction with the biocontroller in a polymeric alginate nanoaggregate.
  • the inhibition percentages of the different treatments described on the X axis are presented at 24 (" ⁇ * ), 48 ('*"') and 72 ("*") hours of action.
  • the representative results of the different treatments are presented after 48 hours of testing.
  • FIG. 1 Graph summarizing correlation between the concentration of extracts obtained in Valdivia and Osorno and the different types of treatment. This graph presents a test in which the biocontroller and the encapsulated extract (3 ⁇ 43 ⁇ 4Ü), without encapsulation (M), and without biocontroller (IIi) are evaluated.
  • FIG. 3 Graphic relationship of the biocontroller effect / active principle on the growth of Botrytis. a) The EC50 values are presented in relation to the concentration of the biocontroller, which correspond to 79 ppm and 10 9 CFU / mL respectively.
  • the image shows the characteristic bands of alginate at 3300 cnT 1 .
  • FIG. 1 Scanning electron microscopy images of alginate microcapsules. Representative images of the generated microcapsules are presented in A and B. Core-shell microparticles are presented in C and D
  • FIG. 6 Phytotoxicity evaluation test of the compounds and formulations generated. Images are presented representative of the results of the phytotoxicity evaluation test on leaves of Tomato plants (Solanum lycopersicu) cv. Cal Ace. a), b) and c) indicate evaluation days 0, 1 and 5 respectively, while 1) corresponds to the control test, 2) test with alginate microparticles, 3) test with the biocontroller, 4) test with extract microparticles in pluronic lmM and 5) biocontroller microparticle assay, extract in pluronic lmM.
  • Solanum lycopersicu cv. Cal Ace. a
  • b) and c) indicate evaluation days 0, 1 and 5 respectively, while 1) corresponds to the control test, 2) test with alginate microparticles, 3) test with the biocontroller, 4) test with extract microparticles in pluronic lmM and 5) biocontroller microparticle assay, extract in pluronic lmM.
  • Figure 7 Antifungal activity assay. The figure qualitatively presents the test carried out on Red Glove grape berries, without previous applications of fungicides, to evaluate the antifungal activity of the formulation and its effect on the composition of the berries.
  • Figure 8 Test evaluation of the effect of the formulation on B. cinérea in Thomson seedless grapes incoculated via sprinkling.
  • results of grapes with wounds and inoculated with the fungus are presented as a measure of the diameter of the lesion.
  • results observed in grapes without wound and inoculated with the fungus are presented, presenting the results as% rot.
  • the present invention refers to a formulation that comprises a biocontroller corresponding to the bacterium Bac ⁇ llus subt ⁇ ll ⁇ s strain 110 and an adjuvant of natural origin corresponding to a cinnamon extract contained in a polymeric nanoaggregate. In turn, these components are contained in a polymeric alginate nanoaggregate. This system of polymeric nanoaggregates allows the controlled release of the biocontroller and adjuvant.
  • This formulation presents advantageous and remarkable technical characteristics for the control of B. cinerea with Regarding current technologies used to control this pathogen in crops, particularly table grape crops.
  • the particular components of this formulation and their grouping in polymeric nanoaggregate systems allow obtaining a greater fungicidal effect on B. cinerea using a lower concentration of the Bac ⁇ llus subt ⁇ ll ⁇ s biocontroller.
  • the required amount of the biocontroller is decreased by 3 orders of magnitude.
  • the EC50 values increase for encapsulated extracts, 30% less biocontroller is used, allowing it to optimize its activity.
  • the proposed formulation allows the control of the B. cinerea fungus in a natural way by means of active principles that are not chemically synthesized, such as the natural extract derived from Drimis winteri and the biocontroller Bac ⁇ llus subt ⁇ ll ⁇ s 110.
  • active principles such as the natural extract derived from Drimis winteri and the biocontroller Bac ⁇ llus subt ⁇ ll ⁇ s 110.
  • the formulations part of the scope of the invention are not phytotoxic and do not affect the physical characteristics of leaves and fruits.
  • the extracts part of the formulation may come from the bark of the cinnamon tree (Drymis winteri).
  • the extract can be extracted preferably from the bark of the cinnamon tree (Drymis winteri) of the IX, X and XIV region of Chile.
  • the extract is included in a polymeric nanoaggregate that increases its stability, where the polymer corresponds to Pluronic, in particular, Pluronic F-127.
  • the extract of Drimis winteri (cinnamon) contained in pluronic polymer F-127 is in a concentration of 20-80 ppm.
  • the biocontroller corresponds to Bac ⁇ llus subtilis strain 110, which is found in the formulation at a concentration of lxlO 5 to lxlO 12 CFU / mL, particularly from lxlO 6 to lxlO 9 CFU / mL.
  • nanoaggregate when reference is made to "nanoaggregate”, “polymeric nanoaggregate” or “polymeric nanocomposite” corresponds to a homogeneous matrix that comprises filler particles of nanometric dimensions inside the polymeric network.
  • biological control it corresponds to a method that allows controlling pests, diseases and / or weeds that affect crops, where it is intended to use living organisms.
  • Biocontroller refers to products of non-synthetic origin that are used to control pests in crops, which can be other living organisms or compounds of natural origin.
  • biological control organisms it refers to microorganisms that have the ability to inhibit the growth of another microorganism and that are used for pest control.
  • adjuvant it refers to any substance that can have activity in conjunction with another substance to obtain a desired effect that may or may not be enhanced.
  • adjuvant of natural origin includes any substance that can complement another to obtain a desired effect, being obtained from a natural source.
  • EC 50 refers to the maximum mean effective concentration, which is defined as the concentration of a compound, substance, drug, antibody or toxic compound that induces a mean response after a specific exposure time.
  • the formulation can be administered by means of sprinkling on the aerial part of the plant, being able to be sprinkled on leaves and fruits.
  • treating a crop infected by Botrytis cinerea this corresponds to including, administering or putting the formulation in contact with the crop, be it leaves and / or fruits and / or flowers.
  • the scope of the application includes the administration of the formulation in a preventive and curative way, which can be applied in pre and post-harvest on crops. Table grape crops are preferred.
  • a method is then included to prevent the infection of the pathogenic fungus Botrytis cinerea in a crop, which comprises treating the crop preventively with the formulation described, and then defining the burden of Botrytis cinerea in the infected crop.
  • Treatment or administration is by spraying.
  • Preventive and curative methods include foliar spraying of fruits, leaves and flowers.
  • the present invention refers to treating the culture in a preventive manner with the described formulation, it means that it can be added to the cultures without these being contaminated or showing evidence of being contaminated by Botrytis cinerea.
  • Example 1 Obtaining extracts obtained from cinnamon and evaluation of their antifungal activity on strains of B. cinérea. a) Obtaining plant material and obtaining extracts.
  • Bark of the native canelo tree (Drymis w ⁇ nter ⁇ , from the IX, X and XIV region of Chile, was collected. In particular, this bark was obtained from the following areas:
  • the barks were air-dried for 1 week and then mashed.
  • the mashed plant material was macerated with ethyl acetate (AcOEt) for a period of 3 to 4 days using a metal digester. This procedure was repeated 3 times.
  • the obtained solution was filtered and concentrated through a simple distillation system, and then brought to dryness by means of a rotary evaporator. Finally, with this procedure, the semipolar extract of the bark is obtained, which is enriched with metabolites with antifungal activity (Robles-Kelly et al., 2017; Carrasco et al., 2017).
  • the percentage of the metabolite extraction yield ranges from 10 to 12% (Table 1).
  • Table 1 Determination of the performance of the metabolite extraction process from Canelo bark. b.Evaluation of antifungal activity of extracts in vitro.
  • Table 3 shows that all the extracts have the ability to inhibit the growth of B. cinérea isolates at different concentrations. On the other hand, the effect depends on the geographic area from which the crusts were obtained.
  • the highest activity presented on the growth inhibition of B. cinérea was presented in the extracts of Osorno and Chiloé, which presented an EC 50 of 79 and 84 ppm respectively for the strain B05.10, while strain PN2 (corresponding to a resistant isolate) had less growth when it was found on the Osorno extract, presenting an EC 50 of 22 ppm.
  • the effect of the encapsulated extracts in conjunction with the biocontroller in a polymeric alginate nanoaggregate was determined, according to the previously described protocol.
  • the treatments were particularly evaluated: alginate + biocontroller, alginate + extract 20 ppm (Ext 20) + biocontroller, alginate + extract 40 ppm (Ext 40) + biocontroller, alginate + extract 80 ppm (Ext 80) + biocontroller and alginate + extract 160 ppm (Ext 160) + biocontroller.
  • FIG 2 a summary graph is presented that establishes the relationship between the concentration of the extracts (ppm) and the treatments with extracts obtained from Valdivia and Osorno in the different presentations (encapsulated, not encapsulated, and without biocontroller). . Although the EC50 values increase for encapsulated extracts, 30% less biocontroller is used, allowing it to optimize its activity.
  • Example 2 Generation of the formulation with antifungal activity a. Determination of the extract / biocontroller ratio that inhibits the growth of B. cinerea to generate a formulation with antifungal activity.
  • the respective mixtures were obtained, they were applied in the form of a monolayer on a surface of solid culture medium, in this case, potato dextrose.
  • a surface of solid culture medium in this case, potato dextrose.
  • 100 pL of the mixture was added and with the help of a glass loop it was spread on the surface of the culture plates containing 7 mL of potato dextrose agar medium and the excess liquid was allowed to evaporate during 30 min.
  • the EC50 values were calculated, using the Origin8 statistical program.
  • the results show that the optimal concentration of biocontroller is 10 9 CFU / mL, and that the EC50 of the biocontroller / extract ratio is from 40ppm to 10 9 CFU / mL of biocontroller, with the EC50 value of the pure extract being 79 ppm ( figure 3).
  • the EC50 for B05.10 and PN2 (resistant isolate) of BC1000 a commercial natural product is 110 ppm and 140 ppm respectively.
  • Example 3 Generation of microparticles that will contain the biocontroller and natural adjuvant.
  • polymeric alginate microparticles In section, the preparation of polymeric alginate microparticles is described that will incorporate a mixture made up of the biocontroller and the adjuvant, where said adjuvant can be previously encapsulated in a polymer.
  • the alginate of the microparticles was prepared as a 1.5% (m / v) solution by weighing 3.3 g of sodium alginate and adding it to 200 mL of distilled water. The mixture is vigorously stirred for 24 hours at room temperature. Once the solution is prepared, the microcapsules are generated.
  • Alkinate-Bacillus subtilis microparticles were prepared by incorporating into 200 mL of a 1.5% (m / v) alginate solution 10 mL of a 4.8% v / v Bacillus subtilis suspension in 0.9% NaCl. The mixture is left stirring for one hour. Then, with this mixture, the respective microparticles are generated.
  • the alqinato-baclllus subtilis microcapsules + Osorno extract in oil were developed with the core-shell methodology.
  • this methodology two solutions are prepared where the core corresponds to what is wanted in the center of the microcapsule, while the part of the shell is what surrounds the core.
  • the core is the extract of Osorno dissolved in an oil
  • the shell corresponds to alginate with bac ⁇ llus subtilis (4.8% v / v).
  • 0.06 g of Osorno extract were weighed and dissolved in 20 mL of oil to obtain a 200 ppm solution.
  • To prepare the Shell (300 pm) this was done as described for the preparation of alkinato-baclllus subtilis already described.
  • microcapsulation The production as such of all the microparticles was carried out in the Buchi Encapsulator B-390 equipment, which was used with a frequency of 800 Hz, an electrode of 800 V and a pressure of 500 mbar. To obtain microcapsules of approximately 400 m, 200 m heads were used. Once the microcapsules were obtained, they were filtered and stored in 0.9% NaCl at a temperature of 4 ° C. The viability of the biocontroller was verified by sowing the capsules in a nutrient medium.
  • the average size of the microcapsules varies between 310-790 mpi (size obtained from Feret's length).
  • the core-shell microparticles composed of oil-alginate, show a spherical configuration and are not collapsed.
  • the average size of these ranges between 960 and 1180 pm (figure 5 AD).
  • the zeta potential was measured on a Zeta Nanosizer (Malvern). Usually, this analysis is used to quantitatively study the electrical charge of microparticles or macromolecules.
  • the measured value for the alginate microcapsules was -5 mV; this value is in agreement with the stoichiometric concentrations used of alginate (negative charge) and calcium ions (positive charge), where possibly there is a slight excess of negative charge related to the free carboxylates of the alginate (-COO-).
  • microscopy analysis the microparticles were previously dried by lyophilization. After drying, the microparticles were covered with 15 nm of gold to facilitate their observation. Images were obtained using the Zeiss EVO MA10 scanning electron microscope
  • Example 4 In vitro evaluation of antifungal activity and phytotoxicity of the formulation. a.Evaluation on plants.
  • the phytotoxicity of the microparticles generated was determined based on the Osorno cinnamon extract encapsulated in 1 mM Pluronic F-127 and embedded in alginate microcapsules.
  • the test was carried out on tomato plants (Solanum lycopers ⁇ cum) cv. Cal Ace grown in soil, under a photoperiod of 12 hours day and 12 hours night at 28 ° C and 40% relative humidity. The three week old plants were sprayed with 300 pL of: 1) Physiological serum (control);
  • the treated plants were cultivated for 5 days under a photoperiod of 12 hours day and 12 hours night, at 28 ° C and 40% relative humidity. The plants were photographed every 0, 1, 3 and 5 days after application. The experiments were carried out in quadruplicate (4 plants per treatment). The aerial tissue of the plants was reviewed as an indicator of phytotoxicity, looking for signs of a dry appearance on the edges, dryness or necrosis of the tissue after applying the treatments, determining the number of leaves affected in the event that they present any of the signs. previously described.
  • physiological saline as a storage medium for alginate capsules, produces a negative effect of dryness on plant leaves.
  • the differences observed in the treatment are similar to those of the control plants with physiological saline, which makes it possible to indicate that it is most likely that the same physiological saline is responsible for the damage observed in the leaves ( Figure 6). b.Evaluation on fruits.
  • Curative condition Inoculation with B. cinérea and application 24 hours later.
  • the fruits were evaluated 72 hours post inoculation or application, respectively.
  • the longitudinal diameter of the lesion was measured, measured in mm.
  • Possible detrimental effects on the grape such as stain, burning russet, colored halos, etc. were also evaluated at days 7 and 10 after application. (figure 7).
  • the treatment with the best effect was the Canelo extract in a concentration of 500 ppm, which achieved a differentiation with respect to the control treatment.
  • the treatment with the best results was Canelo extract + Pluronic F-127 500 ppm and Canelo Extract at a concentration of 100 ppm. No detriment was detected in the quality and safety of the grape bunches (color changes, stain, burning, etc.) with any of the treatments and doses used, being an indication that the mixtures proposed at the different doses do not cause damage. to the fruit. c. Essay on vine flowers.
  • Example 5 In vivo test of the antibacterial effect of the formulation when administered by spraying and inoculation in clusters and branches of Thomson seedless.
  • the grape clusters were incubated for a period of 24 hours, after the incubation period, 5 branches were obtained per cluster and in each one of them 3 berries were marked and a wound with sterile syringe. The remaining berries corresponded to berries without injury.
  • Each branch in its entirety, (considering berries with and without wound) were inoculated by spraying with the multi-resistant strain of Botrytis cinerea, corresponding to strain PN2. This aspersion with the fungus on the branches was carried out with a concentration of B. cinérea PN2 of 100,000 conidia / mL. After this, the shoots were placed in humid chambers and incubated under controlled conditions of temperature and light.

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Abstract

La presente invención corresponde a una formulación para el control del hongo patógeno Botrytis cinerea, donde dicha formulación está compuesta por un biocontrolador y un adyuvante de origen natural. Dicha formulación es útil en el tratamiento y control en cultivos infectados por Botrytis cinerea, particularmente, en cultivos de uva de mesa. También se divulga un método para el control del hongo patógeno Botrytis cinerea, que comprende tratar el cultivo infectado por Botrytis cinerea con la formulación. Se presenta además un método para prevenir la infección del hongo patógeno Botrytis cinerea por medio del tratamiento preventivo del cultivo con la formulación.

Description

WO 2021/258226 MULACION PARA EL CONTROL DE BOTRYTIS CIIPCT/CL2020/050067 COMPRENDE UN BIOCONTROLADOR DE. BACILLUS SUBTILIS Y UN ADYUVANTE DE ORIGEN NATURAL
Memoria descriptiva
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
La presente invención corresponde a una formulación para el control del hongo patógeno Botrytis cinérea, donde dicha formulación está compuesta por un biocontrolador, correspondiente a la bacteria Bacíllus subtíllís cepa 110 y un adyuvante de origen natural correspondiente a un extracto de canelo contenido en un nanoagregado polimérico, donde a su vez, ambos se encuentran contenidos en un nanoagregado polimérico de alginato. Dicha formulación es útil en el tratamiento y control en cultivos infectados por Botrytis cinérea, particularmente, en cultivos de uva de mesa. En el alcance de la invención se incluye también un método para el control del hongo patógeno Botrytis cinérea, que comprende tratar el cultivo infectado por Botrytis cinérea con la formulación descrita. Se incluye además un método para prevenir la infección del hongo patógeno Botrytis cinérea por medio del tratamiento preventivo del cultivo con la formulación descrita.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona al área de la agricultura a en el control de fitopatógenos. La formulación comprende un biocontrolador y un adyuvante natural contenido en nanoagregados, que tienen como objetivo proporcionar una alternativa para el control el hongo patógeno B. cinérea sobre cultivos de uva de mesa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Botrytis cinérea, es un hongo patógeno importante en los cultivos, ya que es el causante de la enfermedad conocida como la podredumbre gris (Benito y cois., 2000). Esta enfermedad se manifiesta en los cultivos por la aparición
1
HOJAS DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de zonas necróticas con extenso crecimiento de hongos, teniendo una apariencia de moho gris (Govrin y cois. 2016). La infección que genera este hongo sobre los cultivos causa importantes pérdidas económica antes y después de la cosecha de estos, particularmente en la industria vitivinícola, debido a que esta infección afecta principalmente a las uvas (Benito y cois., 2000).
Este hongo (B. cinérea) presenta una variedad de mecanismos de ataque a su hospedero y diferentes sitios blancos, por lo que su control es difícil. Además, es capaz de sobrevivir en forma de micelios, conidios o esclerocios por periodos prolongados.
Actualmente se utilizan, principalmente, dos métodos de control de B. cinérea, el primero corresponde al control químico, el cual se basa en el empleo de fungicidas que son asperjados por periodos de tiempo determinados.Sin embargo, este método no es considerado como un proceso sostenible en el tiempo, debido a que el hongo tiene la capacidad de generar resistencia a estos compuestos químicos y, además, existe una creciente preocupación de la población al uso de compuestos químicos sobre la salud humana y el medio ambiente (Williamson and cois., 2007).
El segundo método de control consiste en el uso de microorganismos como hongos, bacterias y nemátodos que tienen una actividad antagonista sobre B. cinérea. Este método de control ha sido muy explorado, y ha tenido buenos resultados. Uno de ellos es el caso del uso del hongo Trichoderma harzianum, el cual ha presentado buenos resultados en el control de este hongo (B. cinérea)(Molina G y cois., 2006).
Por ello, el fin de generar alternativas naturales que no dañen los cultivos y el medio ambiente, ha permitido el estudio sobre el uso de compuestos naturales para el control de patógenos. Un ejemplo de esto, es el documento presentado por Williamson y cois, en el año 2017 donde presentan un estudio en que utilizan extracto de pomelo y quitosano para el control en el crecimiento de B. cinérea y controlar la pudrición post cosecha que se producen en cultivos de uvas.
Otra alternativa natural descrita para el control de patógenos, es por medio de la administración de extracto de Canelo {Drimys wínterí). El canelo ha sido estudiado debido a sus características antihistamínicas, antiinflamatorios y antinociceptivos . Los extractos producidos a partir de plantas de Canelo, han sido estudiado en plantas y se ha determinado que tiene incidencia en el crecimiento de estas, además de poseer actividades antimicrobianas e insecticidas (Robles-Kelly y cois., 2017).
Se ha descrito el estudio de compuestos naturales derivados del canelo (Drymis wínterí) para el control de patógenos. Tal es el caso del documento presentado por Muñoz-Concha y colaboradores en el año 2007, en el cual se describe que los compuestos naturales que pueden ser obtenidos de este árbol (Drimys wínterí) presentan actividad antimicrobiana sobre cepas bacterianas patógenas como Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae y Salmonella , como también actividad antinociceptiva . Por otro lado, autores como Carrasco y cois. (2017); Robles-Kelly y cois. (2017); describen el uso de componentes naturales obtenidos de canelo, particularmente poligodial y drimenol como agentes antifúngicos para combatir la infección producida por B. cinérea en cultivos.
Adicionalmente, existen documentos de patente en donde se divulga el uso de extractos naturales como agentes antifúngicos como es el caso de los documentos de patente W02013013178, US2015366890 en los cuales se presenta el uso de compuestos como terpenos, sesquiterpenos y otros tipos de compuestos y que presentan actividad antifúngica. en este sentido, y de manera particular, el documento CL201402052 describe el uso de compuestos naturales obtenidos de canelo, los cuales son utilizados para la preparación de una formulación con fines acuicolas, mientras que el documento EP2124575 por su parte, presenta una composición antimicrobiana que presenta un efecto sinérgico cuando es incluido en una matriz polimérica de polietilenglicol, encapsulando compuestos como poligodial y/o drimenol.
En otros documentos también se describe el uso de cepas bacterianas para el control biológico de B. cinérea. Ejemplo de esto es el documento de patente CN103563995 (B), CN102965320B, W09821964A1, CN104195071A, los cuales cual divulgan el uso de la bacteria Bacíllus subtílís y sus aplicaciones para el control de la infección por B. cinérea en cultivos.
Aun cuando existen propuestas para el control de Botrytis cinérea, estas corresponden a alternativas basadas en la aplicación de químicos tóxicos y perjudiciales para los humanos y el medio ambiente.
En la presente invención se presenta una formulación particularmente diseñada para la liberación controlada de principios activos de origen natural como un biocontrolador bacteriano (B. subtillis) y un adyuvante que corresponde a un extracto natural derivado de la planta de canelo, los cuales encapsulados en matrices poliméricas pueden disminuir el crecimiento y/o evitar la proliferación de la infección producida por B. cinérea en cultivos, principalmente cultivos de uva de mesa. Dicha formulación no es fitotóxica y puede controlar el crecimiento de B. cinérea tanto en pre -cosecha como post-cosecha, lo cual no ha sido descrito anteriormente.
DESCRIPCION DE FIGURAS
Figura 1. Evaluación de actividad antifúngica in vitro de extractos encapsulados en conjunto con el biocontrolador en un nanoagregado polimérico de alginato. En a) se presentan los porcentajes de inhibición de los diferentes tratamientos descritos en el eje X a las 24 ("·*), 48 ('*"') y 72 ("*")horas de acción. En b) se presenta el resultado representativo de los diferentes tratamientos a las 48 horas de ensayo.
Figura 2. Gráfica resumen correlación entre la concentración de extractos obtenidos en Valdivia y Osorno y los diferentes tipos de tratamiento. En este gráfico se presenta un ensayo en donde se evalúa el biocontrolador y el extracto encapsulado (¾¾Ü ), sin encapsular (M ), y sin biocontrolador (IIi).
Figura 3. Gráfica relación del efecto biocontrolador/principio activo sobre el crecimiento de Botrytis. a) Se presentan los valores de EC50 en relación a la concentración de biocontrolador, los cuales corresponden a 79 ppm y 109 UFC/mL respectivamente.
Figura 4. Espectro FT-IR de las microcápsulas de alginato.
En la imagen se presentan las bandas características del alginato a 3300 cnT1.
Figura 5. Imágenes microscopía electrónica de barrido de microcápsulas de alginato. En A y B se presentan imágenes representativas de las microcápsulas generadas. En C y D se presentan microparticulas core-shell
Figura 6. Ensayo de evaluación de fitotoxicidad de los compuestos y formulaciones generadas. Se presentan imágenes representativas de los resultados del ensayo de evaluación de fitotoxicidad sobre hojas de plantas de Tomate (Solanum lycopersicu ) cv. Cal Ace. a), b) y c) indican los dias de evaluación 0, 1 y 5 respectivamente, mientras que 1) corresponde al ensayo control, 2) ensayo con microparticulas de alginato, 3) ensayo con el biocontrolador, 4) ensayo con microparticulas de extracto en pluronic lmM y 5) ensayo de microparticulas de biocontrolador, extracto en pluronic lmM.
Figura 7. Ensayo de actividad antifúngica. En la figura se presenta de forma cualitativa el ensayo realizado sobre las bayas de uva Red Glove, sin aplicaciones previas de fungicidas, para evaluar la actividad antifúngica de la formulación y su efecto sobre la composición de las bayas.
Figura 8. Ensayo evaluación del efecto de la formulación sobre B. cinérea en uvas Thomson seedless incoculadas vía aspersión. En a) se presentan los resultados de uvas con heridas e inoculadas con el hongo como medida del diámetro de lesión. En b) se presentan los resultados observados en uva sin herida e inoculadas con el hongo, presentándose los resultados como % de pudrición.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una formulación que comprende un biocontrolador correspondiente a la bacteria Bacíllus subtíllís cepa 110 y un adyuvante de origen natural correspondiente a un extracto de canelo contenido en un nanoagregado polimérico. A su vez, dichos componentes se encuentran contenidos en un nanoagregado polimérico de alginato. Este sistema de nanoagregados poliméricos permite la liberación controlada del biocontrolador y adyuvante.
Esta formulación presenta características técnicas ventajosas y destacables para el control de B. cinérea con respecto a las tecnologías actuales utilizadas para el control de este patógeno en cultivos, particularmente, cultivos de uva de mesa. Los componentes particulares de esta formulación y su agrupación en sistemas de nanoagregados poliméricos permiten obtener un mayor efecto fungicida sobre B. cinérea utilizando una menor concentración del biocontrolador Bacíllus subtíllís. Particularmente se disminuye en 3 órdenes de magnitud la cantidad necesaria del biocontrolador. Particularmente, Si bien los valores de EC50 aumentan para los extractos encapsulados, se utiliza 30% menos de biocontrolador, lo que permitirla optimizar su actividad.
Por otro lado, cuando se evaluó el efecto de control preventivo, control curativo, y el efecto residual de control sobre el crecimiento micelial, se observó que la formulación permite un control tanto preventivo como curativo, pudiendo ser aplicada la formulación tanto en pre-cosecha como en post-cosecha (frutos). La composición particular de la formulación propuesta, permite tener una acción antifúngica incluso en post-cosecha, ampliando la ventana de acción del biocontrolador.
Es importante también reconocer que la formulación propuesta permite el control del hongo B. cinérea de forma natural por medio de principios activos que no son de síntesis química, como lo son el extracto natural derivado de Drimis winteri y el biocontrolador Bacíllus subtíllís 110. Al respecto, se comprobó que las formulaciones parte del alcance de la invención no son fitotóxicas y no afectan las características físicas de hojas y frutos.
Los extractos parte de la formulación pueden provenir de corteza del árbol canelo {Drymis winteri). El extracto puede ser extraído preferentemente desde corteza del árbol canelo (Drymis winteri) de la IX, X y XIV región de Chile. El extracto es incluido en un nanoagregado polimérico que aumenta su estabilidad, donde el polímero corresponde a Pluronic, en particular, Pluronic F-127.
El extracto de Drimis winteri (canelo) contenido en polímero pluronic F-127 se encuentra en una concentración de 20-80 ppm.
El biocontrolador corresponde a Bacíllus subtíllís cepa 110, la que se encuentra en la formulación en una concentración de lxlO5 a lxlO12 UFC/mL, particularmente de lxlO6 a lxlO9 UFC/mL.
Definiciones
A continuación, se presentan los términos utilizados en este documento, los cuales presentan el significado que se utiliza en el estado de la técnica de forma habitual, a menos que se indique lo contrario y cambie su significado.
En la presente invención cuando se hace referencia a "nanoagregado", "nanoagregado polimérico" o "nanocompuesto polimérico" corresponde a una matriz homogénea que comprende partículas de relleno de dimensiones nanométricas en el interior de la red polimérica.
Cuando se hace referencia a "control biológico" corresponde a un método que permite controlar plagas, enfermedades y/o malezas que afectan a cultivos, en donde tiene como finalidad el uso de organismos vivos.
Cuando se indica el término "Biocontrolador" se hace referencia a productos de origen no sintético que son utilizados para el control de plagas en cultivos, los que pueden ser otros organismos vivos o compuestos de origen natural . Cuando se hace referencia a "organismos para el control biológico", se refiere a microorganismos que presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de otro microorganismo y que son utilizados para el control de plagas.
Cuando se hace referencia al término "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que puede tener actividad en conjunto con otra sustancia para obtener un efecto deseado que puede o no ser potenciado. A su vez, el término "adyuvante de origen natural" comprende toda sustancia que puede complementar a otra para obtener un efecto deseado siendo esta obtenida de una fuente natural.
En la presente solicitud cuando se indica el término "EC50", hace referencia a la concentración efectiva media máxima, la cual se define como la concentración de una compuesto, sustancia, fármaco, anticuerpo o compuesto toxico que induce una respuesta media después de un tiempo especifico de exposición.
Cuando se establece que la "formulación es para el control de Botrytis cinérea" significa que la formulación presenta un efecto fungicida sobre B. cinérea, disminuyendo la cantidad de conidias/mL.
En la presente invención, cuando presenta en la memoria descriptiva y en el pliego de reivindicaciones el término "comprender" y las variaciones de este ("comprende y "que comprende") deben ser interpretadas en sentido abierto e inclusivo, es decir como "incluyendo, pero no limitando a".
Cuando en la presente invención se ha referencia al término "obtenido de" o "derivado de" corresponde a que una muestra tal se aísla o deriva de una fuente en particular.
Cuando se utiliza el término específico "una realización" es porque se indica características o estructuras particulares descritas en relación con la invención, descripción que incluye al menos una de las realizaciones de la presente invención.
En la presente invención, la formulación puede ser administrada por medio de asperjación sobre la parte aérea de la planta, pudiendo ser asperjada sobre hojas y frutos. Cuando en la presente invención se señala "tratar un cultivo infectado por Botrytis cinérea", esto corresponde a incluir, administrar o poner en contacto la formulación con el cultivo, ya sea hojas y/o frutos y/o flores.
El alcance de la solicitud se incluye la administración de la formulación de forma preventiva y curativa pudiendo ser aplicada en pre y post-cosecha sobre cultivos. Se prefieren cultivos de uva de mesa. Se incluye entonces un método para prevenir la infección del hongo patógeno Botrytis cinérea en un cultivo, el que comprende tratar el cultivo de forma preventiva con la formulación descrita, y luego, definir la carga de Botrytis cinérea en el cultivo infectado. El tratamiento o administración es por asperjación. Los métodos preventivos y curativos incluyen la asperjación foliar a frutos, hojas y flores.
Cuando en la presente invención se hace referencia a tratar el cultivo de forma preventiva con la formulación descrita quiere decir que se puede adicionar a los cultivos sin que estos estén contaminados o presenten evidencia de estar contaminados por Botrytis cinérea.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Obtención de extractos obtenidos de canelo y evaluación de su actividad antifúngica sobre cepas de B. cinérea. a.Obtención de material vegetal y obtención de extractos .
Se recolectó corteza del árbol nativo canelo (Drymis wínterí, desde la IX, X y XIV región de Chile. Particularmente, esta corteza fue obtenida desde las siguientes zonas:
- Gorbea, Ranquilco y Malleco, región de la Araucania.
- Rio negro, provincia de Osorno y Chiloé, región de los Lagos.
- Curiñanco de la región de los Ríos.
Las cortezas fueron secadas al aire durante 1 semana y posteriormente masadas. El material vegetal masado fue macerado con acetato de etilo (AcOEt) por un periodo de 3 a 4 dias utilizando un digestor metálico. Este procedimiento fue repetido 3 veces. La solución obtenida fue filtrada y concentrada a través de un sistema de destilación simple, para luego llevar a sequedad por medio de un rotavapor. Finalmente, con este procedimiento se obtiene el extracto semipolar de corteza, que se encuentra enriquecido con los metabolitos con actividad antifúngica (Robles-Kelly et al., 2017; Carrasco et al., 2017).
La determinación del rendimiento de la extracción de los componentes a antifúngicos a partir de la corteza de Canelo, se realizó de la siguiente manera:
%Rendimiento= Peso final extracto x 100 Peso corteza seca
Según esta fórmula, el porcentaje del rendimiento de la extracción de metabolitos comprende una variación del 10 al 12% (Tabla 1). Tabla 1: Determinación del rendimiento del proceso de extracción de metabolitos a partir de corteza de Canelo.
Figure imgf000013_0001
b.Evaluación de actividad antifúngica de extractos in vitro .
La evaluación de la actividad antifúngica de los extractos se realizó de la siguiente manera:
En placas de cultivo de 50 mm de diámetro se agregó 7 mL de medio Malta levadura (ML), el cual fue previamente preparado y alicuotado en tubos de ensayo. A cada tubo se adicionaron 50 pL de la solución de extracto a cada tubo y se homogenizo brevemente usando un vortex. La solución ML- extracto se vertió en las placas. Cuando las placas se encontraron listas, se inocularon con un disco de 5 mm de micelio de hongo (B. cinérea cepa B05.10 y la cepa resistente PN2) y se incubó por un periodo de 24, 48 y 72 horas entre 22 y 23°C. Por este mismo periodo de tiempo, se observó el tiempo de crecimiento del hongo presente en el disco de agar sobre la placa, para ello se realizaron mediciones del diámetro de crecimiento (mm). Con estos datos se pudo determinar la actividad antifúngica de los extractos, el cual fue expresado como el porcentaje de inhibición de crecimiento del extracto. A partir de esta información, se calculó la concentración efectiva para inhibir el crecimiento del 50% de la población (EC50) (Tabla 3).
Tabla 3. Determinación de valores de EC50 de los diferentes extractos obtenidos de canelo.
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En la tabla 3 se observa que todos los extractos presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de los aislados de B. cinérea en las diferentes concentraciones. Por otro lado, el efecto depende del área geográfica de donde se obtuvieron las cortezas. La mayor actividad presentada sobre en la inhibición de crecimiento de B. cinérea, se presentó en los extractos de Osorno y Chiloé, los cuales presentaron un EC50 de 79 y 84 ppm respectivamente para la cepa B05.10, mientras que la cepa PN2 (correspondiente a un aislado resistente) tuvo un menor crecimiento cuando se encontró sobre el extracto de Osorno, presentando un EC50 de 22 ppm. c.Evaluación de actividad antifúngica ín vitro de extractos_ encapsulados_ en_ conjunto_ con_ el biocontrolador en un nanoagregado polimérico de alginato
Por otro lado, se determinó el efecto de los extractos encapsulados en conjunto con el biocontrolador en un nanoagregado polimérico de alginato, según el protocolo previamente descrito. Particularmente se evaluaron los tratamientos: alginato + biocontrolador, alginato + extracto 20 ppm (Ext 20) + biocontrolador, alginato + extracto 40 ppm (Ext 40) + biocontrolador, alginato + extracto 80 ppm (Ext 80) + biocontrolador y alginato + extracto 160 ppm (Ext 160) + biocontrolador.
Se determinaron los porcentajes de inhibición de los diferentes tratamientos ya descritos a las 24, 48 y 72 horas de acción (figura la) y el resultado comparativo particular del tratamiento a las 48 horas (figura Ib). A partir de estos valores se calculó el valor de EC50 extractos encapsulados y no encapsulados (tabla 4).
Tabla 4. Valores EC50 extractos encapsulados y no encapsulados
Figure imgf000015_0001
*ND, Para el extracto de canelo de Osorno, no se logró determinar el valor de EC50, debido a que la inhibición es muy pareja, no presentando una dosis-dependencia en la inhibición del crecimiento.
Por su parte, en la figura 2 se presenta una gráfica resumen que establece la relación entre la concentración de los extractos (ppm) y los tratamientos con extractos obtenidos de Valdivia y Osorno en las diferentes presentaciones (encapsulado, sin encapsular, y sin biocrontrolador) . Si bien los valores de EC50 aumentan para los extractos encapsulados, se utiliza 30% menos de biocontrolador, lo que permitirla optimizar su actividad.
Ejemplo 2: Generación de la formulación con actividad antifúngica a.Determinación de la relación extracto/biocontrolador que inhibe el crecimiento de B. cinérea para generar una formulación con actividad antifúngica.
Con el propósito de encontrar la relación óptima entre biocontrolador/extracto, se procedió a probar mezclas de diferentes concentraciones de biocontrolador (Bacillus) con extracto.
Se utilizaron 5 diluciones seriadas del biocontrolador desde 105 UFC/mL a 109 UFC/mL usando cómo medio de dilución suero fisiológico estéril (NaCl 0,9%). Para el adyuvante extracto de Osorno, se evaluaron 4 concentraciones de trabajo diferentes: 20, 40, 80 y 160 ppm. Para esto, se utilizó un stock de extracto de 320 ppm diluido en 0,05% Tritón X-100 y mantenido en agitación constante por 24 horas, para asegurar su correcta disolución. Con las soluciones de biocontrolador y extracto, se prepararon mezclas diferentes mezclando 1 mL de biocontrolador y 1 mL de adyuvante. La tabla 5 resume en una matriz las condiciones evaluadas. Tabla 5. Matriz resumen con las condiciones evaluadas para determinar relación óptima biocontrolador/adyuvante
Figure imgf000017_0001
Previo a este ensayo, se determinó que el medio de cultivo apropiado para que coexistieran extractos, biocontrolador y hongo. Se probó agar-agua, papa dextrosa, malta-levadura, LB, siendo la papa dextrosa el que presentó mejores resultados .
Una vez obtenidas las respectivas mezclas, éstas fueron aplicadas en forma de monocapa sobre una superficie de medio de cultivo sólido, en este caso, papa dextrosa. Para ello, se agregó 100 pL de la mezcla y con ayuda de un asa de vidrio se esparció en la superficie de las placas de cultivo que contenían 7 mL de medio papa dextrosa agar y se dejó evaporar el excedente liquido durante 30 min.
Posteriormente se procedió a inocular en el centro de placa un disco de agar de 5mm de diámetro con micelio fresco de Botrytis cinérea B05.10. Las placas se dejaron en incubación por 72 horas, a 21°C en oscuridad. Se realizaron mediciones del crecimiento micelial del hongo a las 24, 48 y 72 horas post inoculación, registrando el diámetro de crecimiento. Los experimentos fueron realizados en triplicado y con 3 réplicas independientes. Con el valor de crecimiento micelial a las diferentes horas, se obtuvo el porcentaje de inhibición del crecimiento respecto al control. Utilizando la siguiente formula:
% de inhibición = 100 x [(control-tratamiento)/ control]
Con los porcentajes de inhibición se procedió a calcular los valores de EC50, usando el programa estadístico Origin8. Los resultados permiten señalar que la concentración óptima de biocontrolador es 109UFC/mL, y que el EC50 de la relación biocontrolador/extracto es de 40ppm a 109UFC/mL de biocontrolador, siendo el valor EC50 del extracto puro de 79 ppm (figura 3).
Comparativamente, el EC50 para B05.10 y PN2 (aislado resistente) del BC1000 un producto natural comercial es 110 ppm y 140 ppm respectivamente.
Ejemplo 3: Generación de micropartículas que contendrán al biocontrolador y adyuvante natural.
En sección, se describe la preparación de micropartículas poliméricas de alginato que incorporarán una mezcla conformada por el biocontrolador y el adyuvante, donde dicho adyuvante puede estar encapsulado previamente en un polímero.
- Determinación de condiciones de preparación micropartículas
En este ensayo se realizaron mezclas del biocontrolador y el adyuvante, las que se incorporaron en perlas de alginato de diferente tamaño. Para ello, se generaron 4 tipos de microcápsulas : 1.alginato-Biocontrolador (Bacíllus subtilis)
2.alginato-extracto de Osorno en Pluronic®
3.alginato-Biocontrolador (bacíllus subtilis) + extracto de Osorno en Pluronic®
4.alginato-Biocontrolador (bacíllus subtilis) + extracto de Osorno en aceite CORE-SHELL
El alginato de las micropartículas se preparó a como una solución al 1,5 %(m/v) pesando 3,3 g de alginato de sodio y adicionándolos a 200 mL de agua destilada. La mezcla es agitada vigorosamente por 24 horas a temperatura ambiente. Una vez preparada la solución se generan las microcápsulas.
Las microparticulas alqinato-Bacillus subtíllís se prepararon incorporando a 200 mL de una solución de alginato al 1,5 % (m/v) 10 mL de una suspensión de Bacíllus subtíllís 4,8 % v/v en NaCl 0,9 %. La mezcla se deja agitando por una hora. Luego, con esta mezcla se generan las respectivas microparticulas.
Para el caso de las microparticulas alginato-extracto de Osorno en Pluronic®, se prepararon 200 ppm de extracto de Osorno en Pluronic®. Para ello, se pesaron 32,7 mg de extracto de Osorno y se disolvió en 164 mL de Pluronic. Luego, a 150 mL de alginato 1,5 % (m/v) se le agregó 150 mL de extracto de Osorno en Pluronic al 50% v/v. La mezcla se deja agitando por 1 hora para posteriormente generar las microparticulas .
Las microcápsulas alqinato-baclllus subtíllís + extracto de Osorno en aceite fueron desarrolladas con la metodología core-shell. En esta metodología se preparan dos soluciones donde el core, corresponde a lo que se quiere en el centro de la microcápsula, mientras que la parte del shell es lo que rodea al core. Para el caso, el core es el extracto de Osorno disuelto en un aceite, mientras que el shell corresponde al alginato con bacíllus subtíllís (4.8 % v/v). Particularmente, para preparar el core (150 pm) se pesaron 0,06 g de extracto de Osorno y se disolvieron en 20 mL de aceite para obtener una solución 200 ppm. Para preparar el Shell (300 pm), esto se realizó según lo descrito para la preparación de alqinato-baclllus subtíllís ya descrito.
La producción como tal de todas las microparticulas se realizó en el equipo Encapsulator B-390 de Buchi, el cual se utilizó con una frecuencia de 800 Hz, un electrodo de 800 V y una presión de 500 mbar. Para obtener microcapsulas de 400 m aproximadamente, se utilizaron cabezales de 200 m. una vez obtenidas las microcapsulas, se filtraron y almacenaron en NaCl al 0,9% a una temperatura de 4°C. Se comprobó la viabilidad del biocontrolador sembrando las capsulas en medio nutritivo.
- Caracterización de las microparticulas obtenidas.
Para caracterizar las nanoparticulas se realizaron ensayos de microscopía infrarroja, microscopía electrónica de barrido y potencial zeta.
En los resultados de la microscopía infrarroja se muestran bandas que son características del alginato, a 3300 cnT1, es posible observar una banda correspondiente a la vibración de tensión de los grupos -OH, las bandas a 1630 cnT1 y 1420 cnT1 están asociadas a las vibraciones de los grupos carboxílicos simétrico y antisimétrico, respectivamente. Por otro lado, es posible observar una banda a 1050 cnT1 es característica de la vibración de tensión C-O, C-H. El mismo análisis de realizó para todas las partículas generadas (figura 4).
De acuerdo con la microscopía electrónica, se observó que el tamaño promedio de las microcápsulas varía entre 310-790 mpi (tamaño obtenido a partir de la longitud de Feret). En cambio, las microparticulas core-shell, compuestas de aceite-alginato, muestran una configuración esférica y no colapsadas. El tamaño promedio de éstas oscila entre 960 y 1180 pm (figura 5 A-D). El potencial zeta fue medido en un equipo Zeta Nanosizer (Malvern). Usualmente, este análisis se usa para estudiar cuantitativamente la carga eléctrica de microparticulas o macromoléculas. El valor medido para las microcápsulas de alginato fue de -5 mV; este valor está de acuerdo con las concentraciones estequiométricas usadas de alginato (carga negativa) y iones calcio (carga positiva), donde posiblemente hay un leve exceso de carga negativa relacionado con los carboxilatos libres del alginato (-COO-).
Cabe mencionar que, para el análisis de microscopía, las microparticulas fueron previamente secadas mediante liofilización . Luego del secado, las microparticulas fueron cubiertas con 15 nm de oro para facilitar su observación. Las imágenes se obtuvieron mediante el uso del microscopio de barrido de electrones Zeiss EVO MA10
Ejemplo 4: Evaluación in vltro de actividad antifúngica y fitotoxicidad de la formulación. a.Evaluación sobre plantas.
Se determinó la fitotoxicidad de las microparticulas generadas en base al extracto de canelo de Osorno encapsulado en 1 mM Pluronic F-127 y embebido en microcápsulas de alginato.
El ensayo se realizó en plantas de Tomate (Solanum lycopersícum) cv. Cal Ace cultivadas en tierra, bajo un fotoperiodo de 12 horas día y 12 horas noche a 28°C y 40 % de humedad relativa. Las plantas de tres semanas fueron asperjadas con 300 pL de: 1)Suero fisiológico (control);
2)micropartículas de alginato vacías;
3)micropartículas de alginato que contienen el biocontrolador;
4)micropartículas de alginato que contienen 80 ppm de Extracto Osorno en lmM Pluronic F-127;
5)micropartículas de alginato que contienen biocontrolador y 80 ppm Extracto Osorno en lmM Pluronic F-127 (tratamiento).
Tras el tratamiento, las plantas tratadas fueron cultivadas durante 5 días bajo un fotoperiodo de 12 horas día y 12 horas noche, a 28°C y 40 % de humedad relativa. Se fotografiaron las plantas cada 0, 1, 3 y 5 días post aplicación. Los experimentos fueron realizados por cuadriplicado (4 plantas por tratamiento). Se revisó el tejido aéreo de las plantas como indicador de fitotoxicidad, buscando señales de apariencia reseca en los bordes, sequedad o necrosis del tejido luego de la aplicación de los tratamientos, determinación del número de hojas afectadas en el caso que presentaran alguno de los signos anteriormente descritos.
De acuerdo con los resultados, el suero fisiológico como medio de almacenamiento de las cápsulas de alginato, produce un efecto negativo de sequedad en las hojas de las plantas. Las diferencias que se observan en el tratamiento son similares a las de las plantas control con suero fisiológico, lo que permite señalar que lo más probable es que el mismo suero fisiológicos es el responsable del daño que se observa en las hojas (figura 6). b.Evaluación sobre frutos.
En este ensayo se evalúa la actividad antifúngica y calidad e inocuidad en bayas y racimos de uva de mesa de los distintos componentes de las posibles formulaciones. Para esto se evaluaron las siguientes condiciones:
Tabla 6.- Condiciones de tratamiento evaluación in vitro de actividad fitotoxicidad sobre plantas.
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Para el ensayo se utilizaron 80 racimos de uva de mesa cv Red Globe, sin aplicaciones previas de fungicidas y cada 20 bayas, previamente purificadas, fueron colocadas en cámara húmeda, con un total de 3 repeticiones por tratamiento. Cada repetición fue asperjada y/o inoculada según las condiciones descritas.
El ensayo incluyó además la evaluación de 2 condiciones de tratamiento:
• Condición preventiva: aplicación 25 horas antes de la inoculación con B. cinérea
• Condición curativa: Inoculación con B. cinérea y aplicación 24 horas después. Los frutos se evaluaron 72 horas post inoculación o aplicación, respectivamente. Se midió el diámetro longitudinal de la lesión, medido en mm. Se evaluaron también a los dias 7 y 10 dias post aplicación posibles efectos detrimentales en la uva como mancha, russet quemazón, halos de color, etc. (figura 7).
A partir de los resultados es posible señalar que, en cuanto a condición preventiva, el tratamiento con mejor efecto fue el extracto de Canelo en concentración de 500 ppm, que logró una diferenciación respecto del tratamiento testigo. En cuanto a la condición curativa, el tratamiento con mejores resultados fue el extracto de Canelo + Pluronic F-127 500 ppm y Extracto de Canelo a una concentración de 100 ppm. No se detectó detrimento en la calidad e inocuidad de los racimos de uva (cambios de color, mancha, quemazón, etc.) con ninguno de los tratamientos y dosis utilizadas, siendo un indicativo de que las mezclas propuestas a las diferentes dosis no provocan daño al fruto. c. Ensayo sobre flores de vid.
Se colectaron 2000 flores en estadio de plena flor de uva de mesa cv. Red Globe, provenientes de un predio, los cuales no presentaban aplicación previa de fungicidas. Estas flores fueron llevadas a laboratorio en condiciones refrigeradas y el mismo día de la toma para su procesamiento. En el laboratorio, las flores fueron cortadas individualmente y sembradas en número de 50 flores por placa Petri de 150 mm. en medio Agar Agua. Se sembraron 100 flores por tratamiento, siendo los tratamientos los que se presentan en la Tabla 7. Posteriormente, las flores fueron asperjadas con extractos, principios activos y/o formulaciones correspondientes a los distintos tratamientos y luego de 24 horas post aspersión las flores fueron inoculadas con una concentración de 100.000 conidias / mL, utilizando la cepa de B. cinérea PN2. Las evaluaciones se realizaron cada 24 horas hasta que el tratamiento testigo inoculado presentara 100% de colonización por Botrytis. Los resultados de este ensayo se presentan en la siguiente tabla:
Tabla 7. Ensayos de actividad fungicida de diferentes formulaciones sobre flores de vid.
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Según los datos presentados en esta tabla, son considerados como buenos resultados, aquellos que indican que al final del proceso existió una incidencia de Botrytis menor a 50%. Es posible observar que el método de aplicación por aspersión de la mezcla de alginato, Bacillus y extracto de canelo, presenta buenos resultados en la disminución de la incidencia de Botrytis en flores de vid.
Ejemplo 5: Ensayo in vivo del efecto antibacteriano de la formulación cuando se administra por aspersión e inoculación en racimos y pámpanos de Thomson seedless.
Para evaluar la efectividad de la formulación presentada se utilizó el método de aspersión de la formulación sobre bayas de uva Thomson seedless. Para ello, se seleccionaron 8 racimos de esta uva los cuales fueron asperjados con los formulados que se presentan en la tabla 7. Para cada formulado se utilizaron 8 racimos.
Tabla 8.- Formulaciones para ensayos in vivo.
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Luego de la aspersión de las formulaciones, los racimos de uva fueron incubados por un periodo de 24 horas, luego del periodo de incubación, se obtuvieron 5 pámpanos por racimo y en cada uno de ellos se marcó 3 bayas a las cuales se les realizó una herida con jeringa estéril. Las bayas restantes correspondieron a bayas sin lesión. Cada pámpano en su totalidad, (considerando bayas con y sin herida) fueron inoculados mediante aspersión con la cepa multiresistente de Botrytis cinérea, correspondiente a la cepa PN2. Esta aspersión con el hongo sobre los pámpanos se realizó con una concentración de B. cinérea PN2 de 100.000 conidias/mL. Luego de esto, los pámpanos fueron colocados en cámaras húmedas y se incubaron en condiciones controladas de temperatura y luz.
El resultado de este ensayo permite señalar que el tratamiento con Bacillus 109 UFC/mL presentó diferencias significativas y que los tratamientos con extracto disminuyeron el diámetro de la lesión y el porcentaje de pudrición de la uva (figura 8 a y b)
En cuanto a calidad e inocuidad de los tratamientos y dosis utilizadas, no se detectaron cambios negativos en los racimos de uva (cambios de color, manchas, quemazón, etc.).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una formulación para el control de Botrytis cinérea CARACTERIZADA porque comprende: a) Una cepa bacteriana Bacíllus subítílís cepa 110 como biocontrolador y b) un adyuvante de origen natural correspondiente a extracto de Drimis winteri (canelo) contenido en polímero pluronic F-127,
Donde a su vez, ambos componentes a) y b) se encuentran contenidos en un nanoagregado polimérico.
2. Una formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque el nanoagregado polimérico que contiene a los componentes a) y b) corresponde a alginato.
3. Una formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 CARACTERIZADO porque
Bacíllus subítílís cepa 110 se encuentra en la formulación en una concentración de lxlO5 a lxlO12 UFC/mL.
4. Una formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 CARACTERIZADO porque
Bacíllus subítílís cepa 110 se encuentra en la formulación en una concentración de lxlO5 a lxlO9 UFC/mL.
5. Una formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 CARACTERIZADO porque el extracto de Drimis winteri (canelo) contenido en polímero pluronic F-127 se encuentra en una concentración de 20-500 ppm, particularmente a una concentración de 70-80 ppm.
6. Uso de la formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con las reivindicaciones 1-6
1 CARACTERIZADA porque sirve para el tratamiento y control en cultivos infectados por Botrytis cinérea, incluyendo cepas resistentes.
7. Uso de la formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con la reivindicación 7 CARACTERIZADA porque sirve para el tratamiento y control de Botrytis cinérea en cultivos de uva de mesa.
8. Uso de la formulación para el control de Botrytis cinérea de acuerdo con la reivindicación 7 CARACTERIZADA porque sirve para el tratamiento y control de Botrytis cinérea en cultivos antes de su cosecha y en post-cosecha.
9. Método para el control del hongo patógeno Botrytis cinérea, CARACTERIZADA porque comprende: a) Identificar un cultivo infectado por Botrytis cinérea. b) Tratar el cultivo infectado por Botrytis cinérea con la formulación descrita en las reivindicaciones
1-5, c) Definir la carga de Botrytis cinérea en el cultivo infectado.
10. Método para el control del hongo patógeno Botrytis cinérea, CARACTERIZADA porque en la etapa b) tratar el cultivo infectado por Botrytis cinérea con la formulación descrita en las reivindicaciones 1-6, la formulación se administra por medio de asperjación sobre la parte aérea de la planta, pudiendo ser asperjada sobre hojas y frutos.
11. Método para prevenir la infección del hongo patógeno Botrytis cinérea en un cultivo CARACTERIZADA porque comprende tratar el cultivo de forma preventiva con la
2 formulación descrita en las reivindicaciones 1-5 mediante asperjación.
3
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