CN109952368A - 微生物的保存 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物保存的领域，尤其是提供一种两室系统，其包括第一室以及第二含水有机酸室，所述第一室包括微胶囊，所述微胶囊在微胶囊芯的非水组合物中包含有活微生物。本发明还提供了基于这些系统的用于保存微生物的方法以及这些系统用于保存微生物的用途。

Description

微生物的保存
发明领域
本发明涉及微生物保存的领域，尤其是提供一种两室系统，其包括第一室以及第二含水有机酸室，所述第一室包括微胶囊，所述微胶囊在微胶囊芯的非水组合物中包含有活微生物。本发明还提供了基于这些系统的用于保存微生物的方法以及这些系统用于保存微生物的用途。
发明背景
有益微生物作为益生菌在医学中的用途在过去几十年中得到了发展。为了确保这类益生菌的稳定性，需要对细菌进行干燥(例如冷冻干燥或喷雾干燥)以获得代谢失活条件。因此，它们能够在正确的储存条件(如湿度、温度等)下存活数十年。通过引入水，细菌粉末将重新活化，细菌就能够发挥其功能。迄今为止，大多数益生菌制剂已被用于胃肠道应用。最常见的制剂是胶囊和片剂，它们能够在无水情况下容易地储存，并且能够在诸如氮气或二氧化碳之类的惰性气体下进行密封，以设定良好的相对湿度而达到最大稳定性。
另一方面，在局部(或其他类型的含水性)制剂中使用益生菌也可能具有巨大潜力。一种选项可能是将这些益生菌配制在诸如软膏或油凝胶之类的无水物中，然而患者通常不接受那些制剂。更被接受的制剂是凝胶/乳膏/泡沫/洗剂的形式。然而，也就是说为了合适地配制成凝胶、乳膏、泡沫、洗剂、软膏等，这类局部制剂本身水程度高。显然，这些制剂中如此高的含水程度的存在给益生菌在其代谢失活条件下的储存造成了问题。
在这类含水性(例如局部)制剂中出现的第二个问题是，这些制剂通常含有与微生物的存活不相容的试剂；例如防腐剂、表面活性剂、乳化剂等，以防止这类制剂产生不需要微生物的生长以及为了形成稳定乳液。然而，这些试剂当然也会在有益微生物的制剂中形成主要问题。
因此，本发明的目的是提供一种允许长期储存微生物的系统，该系统在其使用时基本上不会伤害这类微生物。令人惊讶地发现，一种两室系统提供了上述问题的解决方案，所述两室系统包括第一室以及第二室，该第一室包括微胶囊，该微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；该第二室包含含水组合物(或由其组成)，该含水组合物包括一种或多种有机酸(其pH小于7.0且基本上不含缓冲剂)。特别地，发现这类系统使得微生物能够长期储存，因为在储存期间它们被包含在不含水的室中而防止其暴露于水。随后，在结合使用两个室的内容物后，令人惊讶地发现，用作储存防腐剂的有机酸不会立即伤害所释放的微生物，这些微生物由于所述第二组合物中的水成分而被活化。这与对微生物具有非常直接的作用机制的其他类型的防腐剂形成对比。
此外，尽管本发明的制剂特别适合益生菌的局部应用，但是本发明的概念也可以扩展到在含水环境中出现保存/稳定微生物的问题的其他领域。因此，通过在本发明所定义的两室系统中配制它们，这些问题就得以解决。
尽管已经披露了在两室系统中配制微生物的概念，但是现有技术没有提供当将两个室的内容物组合起来时会保护微生物的解决方案。特别地，活化微生物所需的含水成分通常对微生物非常残酷，主要包含与这类微生物的长期存活不相容的防腐剂、表面活性剂等。相比之下，由于选择有机酸作为防腐剂，我们发现不需要包括另外的防腐剂、表面活性剂或其他有害成分，同时保持了这类制剂所需的稳定性。
Antunes等,2013(Food Science and Technology 54:125-131)描述了一种微胶囊化工艺，其中将细菌悬液与甘油、麦芽糊精、吐温等一起固定在醋酸纤维素中。在喷雾干燥期间，在加热区域(100℃-200℃)使用单喷嘴来雾化细菌悬液。这样，悬液中的水就蒸发了，得到干燥的细菌粉末。所获得的粉末类似于含有所述微生物的基质，而不是包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物的微胶囊。
US2012263826描述了一种口服溶液，其包含至少一种水溶液以及包含了海藻酸盐、乳清蛋白和益生菌的胶状(jelly-like)胶囊。这类胶状胶囊实际上是1-fasic凝胶颗粒(即包含了益生菌的基质)，而不是如本文所披露的两室系统，其中益生菌被维持在所述胶囊的无水芯中。
发明概述
在第一方面，本发明提供了两室系统，其由以下组成：
-第一室，其包括微胶囊，该微胶囊包括不溶于水且不透水的壳，还包括所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；以及
-第二室，其包括pH小于7.0并包括一种或多种有机酸的含水组合物；
其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
在本发明的具体实施方案中，所述第二含水组合物具有小于5.5，优选小于5.0，更优选小于4.5的pH。
在另一具体实施方案中，所述一种或多种有机酸选自苯甲酸、山梨酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、草酸、甲酸、脱氢乙酸、富马酸、茴香酸、葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、磷酸和丙酸及其衍生物。
在进一步的实施方案中，所述微生物是益生菌微生物，更优选地选自包含戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的列表。
在具体实施方案中，所述第一室是(基本上)不透水和氧气的。
在另一具体实施方案中，本发明微胶囊的所述不溶于水且不透水的壳是由以下组成的：海藻酸盐、黄原胶、阿拉伯胶、结冷胶(gellan gum)、卡拉胶、明胶、纤维素或其衍生物；或者基于琼脂、蛋白质、多元醇、明胶、PVA(聚乙烯醇)、PLGA(聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物)、PLA(聚乳酸)及其衍生物、PCL、聚异己基氰基丙烯酸酯、丙烯酸酯衍生物或淀粉的聚合物，任选与壳聚糖组合；或者硬脂肪。
在具体实施方案中，本发明的两室系统是以包含所述微胶囊的凝胶、乳膏、泡沫、洗剂或软膏的形式。
在本发明的具体实施方案中，非水组合物选自包含以下的列表：植物油、矿物油、硅油或亲水性聚合物；特别是癸酸/辛酸甘油三酯、液体石蜡、聚乙二醇、硅酮(silicone)或硬脂肪。
在本发明的具体实施方案中，所述一种或多种有机酸用作防腐剂，且所述组合物基本上不含另外的防腐剂。
在进一步的方面，本发明提供了用于保存活微生物的方法，其包括：
-提供两室系统；
-将所述活微生物包括在第一室中，该第一室包括微胶囊，该微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；
-在所述两室系统的第二室的含水组合物中包括一种或多种有机酸，其量足以获得小于7.0的pH；其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
在进一步的方面，本发明提供了微胶囊和含水组合物组合的用途，该微胶囊包括包含有活微生物的非水组合物；该含水组合物包括pH小于7.0的一种或多种有机酸，其用于保存所述含水组合物而不伤害所述微生物。
附图简要说明
现在具体参考附图，要强调的是，所示出的细节是通过举例的方式并且仅用于说明性讨论本发明的不同实施方案的目的。提供它们是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和容易理解的描述。在这方面，没有试图去示出比基本上理解本发明所需的结构细节更详细的本发明的结构细节。就附图进行的说明是用来指导本领域技术人员实践中如何可以实施本发明的若干形式。
图1：微生物在硅酮中的稳定性；A)CF 1406，B)CF6570。
图2：微生物在油中的稳定性；A)葵花油，B)Miglyol 812N。
图3：微生物在极性介质中的稳定性；A)PEG400，B)甘油。
图4：微生物在硬脂肪中的稳定性；A)Whitepsol h15，B)Hydrobase 32/34。
发明详述
如本文以上已详述的，在第一方面，本发明提供了两室系统，其由以下组成：
-第一室，其包括微胶囊，该微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；以及
-第二室，其包括pH小于7.0并包括一种或多种有机酸的含水组合物；
其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
更具体而言，本发明提供了如本文所定义的两室系统，其由以下组成：
-具有不溶于水且不透水的壳和包含在所述壳芯的非水组合物中的微生物的微胶囊；以及
-pH小于7.0并包括一种或多种有机酸的含水组合物；
其中所述含水组合物基本上不含缓冲剂。
更为具体的是，本发明提供了如本文所定义的两室系统，其由以下组成：
-能够具有不溶于水且不透水的壳和包含在所述壳芯的非水组合物中的微生物的微胶囊；以及
-pH小于7.0并包括一种或多种有机酸的含水组合物；
其中所述含水组合物基本上不含缓冲剂。
在本发明的上下文中，术语“不溶于水”和“不透水”的微胶囊的意思被理解为防水。特别地，能够将防水胶囊描述为当悬浮在所述第二含水室中时不被降解。然而，本文所使用的微胶囊能够(并且通常就会)降解，例如在诸如盐浓度或机械剪切应力之类的某些应力条件下丧失其不溶性，从而释放其活性内容物，例如本文所描述的胶囊释放机制。
在本发明的上下文中，术语“含水组合物”是指包含水的制剂。具体而言，所述制剂包含大量水，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的水。因此，术语“非水组合物”是指不包含大量水的制剂，例如不超过10％，优选不超过5％，甚至更优选不超过2％，最优选的是它根本不含水，即0％。
在本发明的上下文中，术语“微生物”是指“活的”微生物，它们活着，意思就是不是其碎片、培养上清液或被杀死的形式。优选将所述活微生物冷冻干燥以便增加其保存。
在本发明的上下文中，术语“有机酸”是指酸性性质的有机化合物。显然，在本发明的上下文中，任何合适的有机酸都能使用，只要它能作为防腐剂。
发现这些有机酸对微生物具有缓慢的作用机制，当微生物与这些有机酸接触时，有机酸不会立即伤害(益生菌)微生物。在更长时间暴露于环境如皮肤后，有机酸失去其活性，从而在更长时间内也不伤害(益生菌)微生物。尽管优选使用有机酸作为防腐剂来进行本发明(因为发现它们在暴露于环境之后失去其活性)，但是也可以通过使用另一防腐剂来进行本发明，只要它具有缓慢的作用机制，例如需要至少24小时才变成有活性。
对于有机酸的使用，制剂优选基本上不含缓冲剂。缓冲剂的存在将使组合物在更长时间内保持在低pH，从而需要更长的时间来抑制有机酸的防腐作用，从而增加微生物与有机酸接触时伤害微生物的风险。尽管大多数成分都会具有很小的缓冲效果，但希望选择组合物的组分要使得它们基本上不会减少或增加失活有机酸所需的时间。
特别合适的有机酸选自包含以下的列表：苯甲酸、山梨酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、茴香酸、草酸、甲酸、脱氢乙酸、富马酸、葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、磷酸和丙酸及其衍生物。更具体而言，所述有机酸选自包含以下的列表：苯甲酸、山梨酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、草酸、甲酸、脱氢乙酸、富马酸、葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、磷酸和丙酸及其衍生物；例如山梨酸。
在本发明的具体实施方案中，根据本发明的第二含水组合物的pH小于5.5，优选小于5.0，更优选小于4.5、小于4.0或小于3.5。制剂的pH在本发明上下文内是高度相关的。一般来说，pH越低，其防腐效果越高，从而有助于本发明制剂的长期稳定性。通过复配有机酸获得所需的pH，从而在制剂中具有防腐剂的作用。由于这些有机酸的存在，我们发现不再需要包括额外的防腐剂，因此，本发明的制剂优选基本上不含除有机酸以外的其他防腐剂。此外，组合物当然也基本上不含其他对微生物有害的成分，如在局部制剂中经常使用的苯氧乙醇、bronidox、异噻唑啉酮和月桂基硫酸钠。
在优选实施方案中，本发明的活微生物是活的益生菌微生物。
在本发明的上下文中，术语“益生菌”的意思是包括在人类或兽医领域使用时提供健康益处的微生物。本发明的制剂高度适合于任何已知的益生菌微生物制剂，例如但不限于乳杆菌，更特别的是戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和/或植物乳杆菌。显然，本发明的制剂可以仅包含一个种的益生菌微生物或其组合，这取决于预期的用途。
为了增加第一室中微生物的稳定性，所述第一室优选(基本上)不透水和氧气。
在本发明的上下文中，术语“微胶囊化”或“微胶囊”是指通过微胶囊化工艺获得的产品。这个工艺中的微米级(微米范围)颗粒或液滴被包衣所包围而得到具有许多有用性能的小胶囊。在本发明的上下文中，将它用来混入益生菌微生物。在相对简单的形式中，微胶囊是其周围有均匀壁的小球体。微胶囊内部的材料被称为芯、内相或填充物；而壁被称为壳、包衣或膜。
本领域技术人员非常清楚存在用于制造微胶囊的几种方法，本发明不限于这些方法中的任一种。适合本发明上下文的微胶囊化方法包括但不限于锅包衣、空气悬浮包衣、离心挤压、振动喷嘴、喷雾干燥、离子凝胶化、凝聚相分离、界面缩聚、界面交联、原位聚合、基质聚合。
微胶囊化的最初目的是将芯与其周围分开，在本发明中尤其为了保护所包封的微生物免受周围有机酸的防腐作用，并防止它们在含水环境中被活化。显然，在使用时，微胶囊的壁需要破裂以释放微生物，并使得它们能够按需要起作用。这类破壁优选在使用期间(例如在将制剂应用于皮肤或其他局部区域时)通过低压、摩擦或剪切应力来获得。
在最简单的形式中，本发明的微胶囊包括不溶于水且不透水的壳，其中微生物包含在所述微胶囊芯的非水组合物中。然而，在适当情况下，微胶囊可以包含另外的层，例如额外的包衣层，以增加对内容物的保护。
在本发明的具体实施方案中，所述微胶囊包括不溶于水且不透水的壳；并且所述微生物包含在所述微胶囊芯的非水组合物中。水的存在足以使冷冻干燥的细菌重新活化，因此在没有水的情况下配制它们很重要，从而允许长期储存。所述不溶于水且不透水的壳可由任何合适的材料组成，例如但不限于海藻酸盐，黄原胶，阿拉伯胶，结冷胶，卡拉胶，明胶，纤维素或其衍生物；或者基于琼脂、蛋白质、多元醇、明胶、PVA(聚乙烯醇)、PLGA(聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物)、PLA(聚乳酸)的聚合物及其衍生物，PCL，聚异己基氰基丙烯酸酯，丙烯酸酯衍生物或淀粉，或者诸如witepsol或hydrobase之类的硬脂肪。
尽管这些成分可以以本身使用，但它们也可以彼此组合，或者可以与聚合物或壳聚糖交联。这类进一步的交联可以增强微胶囊的耐久性。此外，为了又进一步保护微胶囊的内容物(即微生物)不受水和空气的影响，胶囊可以任选用合适的包衣进行包衣。
如本文前文所述，微生物应当在无水条件下储存以确保长期储存。因此，本发明的微胶囊芯优选为无水介质，例如但不限于植物油、矿物油、硅油或亲水性聚合物；特别是癸酸/辛酸甘油三酯、液体石蜡、聚乙二醇、硅酮或者诸如witepsol或hydrobase之类的硬脂肪。
当然，防腐剂的存在对于制剂的长期储存是非常重要的，然而，对于微生物如益生菌的制剂却造成了严重的问题。作为其解决方案，我们已经发现(益生菌)微生物的微胶囊化以及在所提供制剂的这类微胶囊中包含有机酸就足以保证制剂的长期储存，而不会妨碍微生物活性。甚至在使用制剂并释放微生物时，后者也不受复配有机酸的阻碍，因为这些有机酸一旦使用就会例如由于皮肤的缓冲能力而迅速失去其活性。因此，本发明的有机酸旨在用作防腐剂，并且制剂基本上不含从微胶囊释放后可能妨碍微生物活性的另外的防腐剂。
因此，在本发明的具体实施方案中，所述有机酸用旨在作防腐剂，并且制剂基本上不含另外的防腐剂。
本发明的制剂特别适合于局部应用，因为这类制剂通常含水程度高。因此，在具体实施方案中，根据本发明的含水制剂是局部含水制剂。
在本发明的上下文中，术语“局部”意指在身体的具体位置处的局部递送，特别是应用于身体上或身体中的特定部位。具体而言，它包括通过含水性即非固体制剂例如乳膏、泡沫、凝胶、洗剂或软膏或者任何其他类型的含水制剂而应用到粘膜上。显然，术语“局部”并不打算包括诸如胶囊、片剂等固体制剂形式的递送。
本发明的局部益生菌制剂可以是任何合适的形式，例如但不限于包含所述微胶囊的凝胶、乳膏、泡沫、洗剂或软膏。
如本文以上所详述的，本发明的发现在于，使这些微生物不与两室系统中的水成分接触、结合使用有机酸的这种微生物制剂就足以使制剂长期储存而基本上不会伤害(益生菌)微生物。
因此在进一步的方面，本发明提供了用于保存活微生物的方法，其包括：
-提供两室系统；
-将所述活微生物包括在第一室中，该第一室包括微胶囊，该微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；
-在所述两室系统的第二室的含水组合物中包括一种或多种有机酸，其量足以获得小于7.0的pH；其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
在最后方面，本发明提供了包含有活的(益生菌)微生物的微胶囊和pH小于7的含水组合物中一种或多种有机酸的组合的用途；更具体而言用于保存含水组合物而不损害所述微胶囊中的所述微生物。
本发明的制剂尤其高度适合于局部给药，其包括直接应用于皮肤或粘膜如阴道。
合适的给药形式(根据给药方式，可以是半固体或液体)以及用于制备它们的方法和载体、稀释剂和赋形剂，对于技术人员来说将是清楚的；再次参考例如US-A-6,372,778、US-A-6,369,086、US-A-6,369,087和US-A-6,372,733，以及标准手册如Remington’sPharmaceutical Sciences的最新版。
这类制剂的一些优选但非限制性例子包括酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、软膏、乳膏、洗剂，它们可与本身适用于这类制剂的载体、赋形剂和稀释剂一起配制，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、聚乙二醇、纤维素、(无菌)水、甲基纤维素、食用油、植物油和矿物油或其合适的混合物。
本发明的制剂能够任选包含例诸如药物和/或益生元之类的其他成分，例如用于刺激微生物的生长。
制剂能够任选包含药物制剂中常用的其他物质，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、分散剂。然而，非常重要的是，这类另外的物质在组合物储存期间或在其使用时基本上不会伤害益生菌生物。
更具体而言，可将组合物配制在包含颗粒的药物制剂中，其由本发明微生物的固体分散体和一种或多种药学上可接受的水溶性聚合物组成。
术语“固体分散体”定义了包含至少两种成分的处于固态(而不是液态或气态)的系统，其中将一种成分或多或少均匀地分散在一种或多种其他成分中。
还可以方便地以微粒的形式配制微生物，该微粒具有吸附在其表面上的表面改性剂，其量足以维持约1-5000μm的有效平均粒径。合适的表面改性剂能够优选选自已知的有机和无机药学赋形剂。这类赋形剂包括各种聚合物、低分子量寡聚物、天然产物以及诸如非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂之类的表面活性剂。
现在将通过以下合成的和生物学的实施例阐明本发明，它们并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：用于第一室的非水组合物的选择
本实施例的目的是选择用于包括活微生物的合适非水组合物，这使得它能够长期稳定和存活。
材料和方法
稳定性研究
本稳定性研究中所使用的三种菌株：
-自己培养的戊糖乳杆菌(即lac4或Lp)
-自己培养的LGG(即lac7或LGG)
-购买的冻干LGG
在室温(+/-20℃)下测试了用来保存细菌的八种不同的无水悬浮介质。所使用的悬浮介质能够细分为4种类型，每组2种亚型比较如下：
●硅酮:
○化妆品液体1406(聚二甲基硅氧烷醇&聚二甲基硅氧烷)–来自Chemsil
○化妆品液体6570(二聚硅氧烷，三硅氧烷，环五聚二甲基硅氧烷&二甲硅油)–来自Chemsil
●油:
○葵花油–来自Everyday
○Migyol 812N–来自Hüls
●极性溶剂:
○PEG 400–来自Roth
○甘油-来自Fagron
●硬脂肪:
○Witepsol H15-来自VW chemicals
○ Hydrobase 32/34–来自Prod’hyg laboratoires
在9个预定时间点获得样品：
●T0＝悬浮于悬浮介质之前
●T1＝悬浮之后1天
●T2＝悬浮之后1周
●T3＝悬浮之后2周
●T4＝悬浮之后1个月
●T5＝悬浮之后2个月
●T6＝悬浮之后6个月
●T7＝悬浮之后12个月
●T8＝24个月
所使用过的所有材料在使用前都通过高压灭菌法进行灭菌。如果可能的话，所使用的所有成分、组分等都通过高压灭菌，否则在无菌环境中过滤。
T0 CFU测定
将Lac 4和Lac 7在液体MRS(de MAN,Rogosa&Sharpe)培养基(37℃)中培养至完全生长。将培养基在2780G下离心10分钟。弃去上清液，细菌沉淀进一步使用。
称取100mg，用生理水(0.85％NaCl)稀释得到10ml总体积。由三种菌株(lac4、lac7和LGG)制备稀释系列(10倍连续稀释)，根据平板涂布法(源自药典方法2.6.12和2.6.13)进行平板计数。测量重复三次。结果表示为cfu/克粉末。
细菌在悬浮介质中的悬浮
用不同的无水悬浮介质将所获得的细菌团进行均一的1/10稀释(m/m％)。在离心管(falcon tube)中称取1克所述悬浮液，并密封在铝袋中(RH＝20％)。每个样品包含100mg细菌用于进一步测试目的。每隔一定时间打开铝袋进行存活测试。
储存时间后的测试
将密封袋在一定时间点打开进行稳定性测试。通过加入1克乳化剂混合物(由聚山梨醇酯80和失水山梨醇倍半油酸酯组成)和8克生理水将包含1克无水物质的离心管进一步处理。这形成了细菌通过它可以与水接触并被重新活化的乳液。进一步的样品制备和平板计数按上述方法进行，其源自药典方法2.6.12：非无菌产品的微生物检查：微生物计数测试和2.6.13：非无菌产品的微生物检查：指定微生物的测试。
结果和讨论
冻干粉末的稳定性如所预期的那样远远优于“原(as such)”菌株。仅仅1个月后，平均就有3个对数减少，而冻干菌株则没有可检测到的减少。由此证明，重要的是要以合适的冻干(或其他干燥方法)粉末开始配制，以确保活微生物的长时间稳定制剂。
因此，将进一步讨论的只有冻干LGG菌株的结果。
对于硅混合物(图1)、油(图2)和硬脂肪(图3)，稳定性结果是相当的。在亲水性介质(图3)中，似乎只有PEG 400适合作为悬浮介质，而不是甘油，其对FD IGG的稳定性有负面影响。
对于不同的无水介质，经过1年的稳定后，平均有1个对数减少。这就留下了足够的活微生物来进行局部应用并对皮肤产生有益影响。
由此证明，与悬浮在无水介质中的合适冻干粉末一起，免受光、湿度和防腐剂的影响，就有可能获得带有稳定益生菌的相/室。该室能够是其中存在水相和无水相的原位混合的两相系统，或者作为悬浮在制剂中的胶囊。
实施例2：用于第二室的含水组合物的选择
目的是用活微生物制成能够应用到其中它们将发挥有益作用的皮肤上的局部制剂。局部制剂如乳膏通常含有油、水、防腐剂和乳化剂。乳化剂和防腐剂的存在可能对该冻干微生物的稳定性产生负面影响。保证一定保存期的方法是将冻干的益生菌悬浮在无水介质中(参见实施例1)。该无水悬浮液将为冻干的微生物提供良好的稳定性。为了防止局部制剂中其他成分的负面影响，所述无水悬浮液最好通过物理相分离或通过包封所述无水悬浮液而与制剂的其余部分分开。然后能够将胶囊悬浮在局部制剂中。
只要相分离了，就能获得带有活微生物的长效局部产品。在应用到皮肤上之前，如果两相是混合的，就可能出现问题。冻干的益生菌将通过从制剂中吸收水得到活化，但也会遇到所存在的乳化剂和防腐剂而杀死已活化的微生物，并阻止它们对皮肤产生有益效果。
本实验是筛选确定不同制剂对冻干益生菌存活的短期影响(10分钟->1天)。
1.方法
1.1实验A
该实验模拟了被稳定地包含在无水悬浮液中的冻干活微生物，然后与含有不同防腐剂和乳化剂的制剂混合。三种标准TMF制剂与10％(m/m)冻干LGG一起培养。TMF制剂是广泛使用的(比利时)，被认为是局部药物递送的安全且稳定的制剂。10分钟后从制剂取样，24小时后确定存活数，从而确定所述制剂的短期抗菌效果。局部益生菌的应用通常每天都进行。因此，24小时后没有取样。样品制备和CFU测定(平板计数)是根据平板涂布法(源自药典方法2.6.12和2.6.13)进行的。测量重复三次。结果表示为cfu/克粉末。
所测试乳膏的成分如下：
1.2实验B
为了扩展实验A的筛选平台，用含有不同防腐剂和乳化剂的市售制剂重复实验A。实验的进行与2.1中所描述的相同。以实验A的乳膏A为参比。筛选了其他药用乳膏基质(1-5)，并与市售化妆品制剂(6-11)进行了比较，详见下表：
2.结果
2.1实验A
对冻干LGG在上述制剂中悬浮10分钟后的存活似乎只有很小的影响。在24小时后，乳膏A几乎没有明显减少。注意到乳膏C略有减少(±0.5个对数)，乳膏B则大大减少(±3个对数)。乳膏A和C都含有有机酸山梨酸作为防腐剂，而与之相对，乳膏B则含有尼泊金酯作为防腐剂以及月桂基硫酸钠(已知具有抗菌性能的阴离子乳化剂)。
综上所述，能够得出结论，有机酸具有缓慢的作用机制(起效所需的时间是1-3天(数据未显示))，因此可被视为安全防腐剂用于局部制剂中与冻干微生物进行组合。制剂A被建议用于与冻干益生菌在局部制剂中的组合有关的进一步试验。
2.2实验B
*所使用的方法具有4个对数减少的检测限。CFU计数为0就意味着检测到了小于1.0E+07CFU/克粉末。
首先注意到药用乳膏基质(1-5)在短期内似乎不如所测试的化妆品制剂(6-10)抗菌。化妆品制剂是极度抗菌的(10分钟后大于4个对数减少)，其组分(乳化剂和防腐剂)被认为不适合配制目的。主要的问题组分已被鉴定为苯氧乙醇、bronidox、异噻唑啉酮和月桂基硫酸钠。具有抗菌性能的其他组分也存在，但重要性更低。
最佳制剂(24小时后)再次是缓冲的聚西托醇乳膏，其中山梨酸作为唯一防腐剂(24小时后±0.15个对数减少)。存活第二好的制剂是Nourivan药用基质，仅含山梨酸作为防腐剂。第三好的制剂是含有尼泊金酯的carbomeergel，第四好的制剂是含有山梨酸和苯甲酸作为防腐剂的pentravan乳膏。Lanette乳膏含有尼泊金酯和山梨酸作为防腐剂。
很明显，有机酸(以及尼泊金酯)是缓慢起作用的防腐剂，与那些在化妆品制剂中常见的防腐剂不同，在应用到皮肤上之后基本上不会伤害益生菌。只含有有机酸防腐剂的制剂1、4和5，在10分钟后显示了最小减少(the least reduction)。尽管尼泊金酯也可能适合用作防腐剂，但它们是已知的致敏剂，因此优选不在化妆品工业中使用。因此，结论就是有机酸防腐剂与益生菌复配是合适的选项。
实施例3：稳定性分析
我们的胶囊在含有益生菌的内芯周围形成了均一的壁(壳)。该壳保护了细菌，确保我们的胶囊悬浮在含水环境中时，它们不会被立即释放。
如下表中所显而易见的，我们能够在冷藏和室温下都提供良好的稳定性：
实施例4：包含有机酸作为防腐剂的乳膏中的存活测定
本实施例的目标是确定益生菌胶囊在不同浓度山梨酸防腐剂存在下悬浮在油/水乳膏中的功效。第二个目的是为了证明所选择的防腐剂适合于保护乳膏。根据欧洲药典(5.1.3)，通过对不同防腐剂浓度的乳膏(不含益生菌胶囊)进行的攻击测试证明了这一点。
材料和方法：
所使用的组合物
使用不含防腐剂/香料的基本乳膏作为进一步测试的基础。所测试的防腐剂为山梨酸(2,4-己二烯酸)，一种不同浓度下在25℃的pKa为4.76的有机酸。使用HCl/NaOH将所有测试条件的乳膏的pH值调节到4.5。
攻击测试&有机酸防腐浓度的功效
使用攻击测试来确定皮肤科产品的抗菌保存系统的功效。其目的是为了提高产品的安全性和耐久性。所测试的山梨酸浓度为0.5％-0.3％-0.1％-0％(对照)。
所攻击的微生物是大肠杆菌(DSM 1576)、铜绿假单胞菌(Ps.Aeruginosa)(DSM1128)、白色念珠菌(C.Albicans)(DSM 1386)、金黄色葡萄球菌(St.aureus)(DSM 799)、黑曲霉(As.Niger)(DSM 1988)。
所攻击的微生物的加入以106CFU/ML(在100克产品中)进行。在6小时、24小时、7-14天和28天之后取样。对于细菌如果在7天后可见至少3个对数减少，对于酵母/霉菌在14天后可见2个对数减少-4周后3个对数减少，则攻击测试成功。所显示的为取样4周后的结果。
益生菌胶囊在带有不同防腐剂的乳膏基质中的存活
将益生菌胶囊以15％(m/)悬浮在不同防腐剂浓度的乳膏基质中。为模拟益生菌的体内释放，在体外使用柠檬酸缓冲液。柠檬酸将溶解胶囊的膜，从而释放胶囊内的益生菌。通过将31.2g Na2HPO4和1.25g柠檬酸溶于971.54g无菌水中制成CA缓冲液。最终溶液为pH值7.4±0.2的等张溶液。
对样品乳膏双份取样，然后溶于CA缓冲液中。进一步制作1/10稀释系列，使用直径4mm的5个玻璃珠的“copacabana涂布平板法”将0.1ml涂布在MRS琼脂平板上。进行双份涂布，将结果(37℃培养3天后)计算为CFU/克乳膏。贮存温度为4℃和25℃。1-2-3个月后取样。所显示的结果是胶囊冷藏贮存3个月之后的稳定性。
结果
攻击测试结果
4周后对基础乳膏(不包括益生菌胶囊)的攻击测试结果。
*如果获得大于3的对数减少，则攻击测试成功。数字必须如下解释：与初始细菌负荷相比，3＝小于1个对数减少；2＝1和2个之间的对数减少；1＝在2和3个之间的对数减少；0＝大于3个对数减少。
益生菌胶囊在带有不同浓度山梨酸的乳膏中的存活
益生菌胶囊在存在不同山梨酸防腐剂浓度的基本乳膏中3个月后的存活。
浓度％ CFU/g 标准偏差 存活率％
空白 0 9.E+07 1.E+07 100
山梨酸 0.3 7.E+07 1.E+07 76
山梨酸 0.1 7.E+07 2.E+07 79
山梨酸 0.03 6.E+07 4.E+07 68
结论
有机酸(如山梨酸)是有价值的皮肤科制剂用防腐剂。山梨酸在低至0.1％的浓度下就具有良好的防腐效果。未添加山梨酸就导致攻击测试的失败，因为它似乎无法在可预见时间范围内杀死所有被测试的微生物。因此，当有机酸以合适浓度存在的话，使用有机酸作为制剂中唯一的防腐剂似乎适合于防止细菌、酵母或霉菌的腐败。
将益生菌胶囊(15％m/m)悬浮在用于攻击测试的同一基础乳膏中，显示益生菌胶囊不受不同防腐剂浓度的影响。包含不同防腐剂的乳膏的细菌CFU负荷与空白相比变化不超过32％(小于0.3个对数减少)。这完全在偏差之内并且没有显著差异。
这意味着益生菌胶囊提供了对抗该乳膏制剂的该试验中所测试有机酸的良好保护，同时防腐剂能够防止外源生物在乳膏中生长。

Claims (11)

1.两室系统，其由以下组成：
-第一室，其包括微胶囊，所述微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；以及
-第二室，其包括pH小于7.0并包括一种或多种有机酸的含水组合物；
其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的两室系统，其中第二室的所述含水组合物具有小于5.5、优选小于5.0、更优选小于4.5的pH。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的两室系统；其中所述一种或多种有机酸选自包含以下的列表：苯甲酸、山梨酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、茴香酸、草酸、甲酸、脱氢乙酸、富马酸、葡萄糖酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、磷酸和丙酸及其衍生物。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的两室系统；其中所述微生物是活的益生菌微生物，更优选地选自包含戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的列表。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的两室系统；其中包含微生物的所述第一室是不透水和氧气的。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的两室系统；其中所述不溶于水且不透水的壳是由以下组成的：海藻酸盐、黄原胶、阿拉伯胶、结冷胶、卡拉胶、明胶、纤维素或其衍生物；或者基于琼脂、蛋白质、多元醇、明胶、PVA(聚乙烯醇)、PLGA(聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物)、PLA(聚乳酸)及其衍生物、PCL、聚异己基氰基丙烯酸酯、丙烯酸酯衍生物或淀粉的聚合物，任选与壳聚糖组合；或者硬脂肪。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的两室系统；其是以包含所述微胶囊的凝胶、乳膏、泡沫、洗剂或软膏的形式。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的两室系统；其中所述非水组合物选自包含以下的列表：植物油、矿物油、硅油或亲水性聚合物；特别是癸酸/辛酸甘油三酯、液体石蜡、聚乙二醇、硅酮或硬脂肪。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的两室系统；其中所述有机酸用作防腐剂目的，且其中所述组合物基本上不含另外的防腐剂。
10.用于保存活微生物的方法，其包括：
-提供两室系统；
-将所述活微生物包括在第一室中，所述第一室包括微胶囊，所述微胶囊包括不溶于水且不透水的壳和包含在所述微胶囊芯的非水组合物中的微生物；
-在所述两室系统的第二室的含水组合物中包括一种或多种有机酸，其量足以获得小于7.0的pH；其中所述第二室基本上不含缓冲剂。
11.微胶囊和含水组合物组合的用途，所述微胶囊包括包含有活微生物的非水组合物，所述含水组合物包括pH小于7.0的一种或多种有机酸，其用于保存所述含水组合物而不损害所述微胶囊中的所述微生物。
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