ES2950497T3 - Conservación de microorganismos - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere al campo de la conservación de microorganismos, y en particular proporciona un sistema de 2 compartimentos que comprende un primer compartimento que comprende microcápsulas con microorganismos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas, y un segundo compartimento acuoso que contiene ácido orgánico. compartimiento. Proporciona además métodos para conservar microorganismos, basándose en dichos sistemas, así como usos de dichos sistemas para conservar microorganismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Conservación de microorganismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la conservación de microorganismos, y en particular proporciona un sistema de 2 compartimentos que comprende un primer compartimento, que comprende microcápsulas, que comprende microorganismos viables en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas, y un segundo compartimento acuoso que contiene ácido orgánico. Además, proporciona métodos para conservar microorganismos, sobre la base de tales sistemas, así como usos de tales sistemas para conservar microorganismos.
Antecedentes de la invención
El uso de microorganismos beneficiosos como probióticos en medicina se ha extendido en las dos últimas décadas. Para asegurar la estabilidad de dichos probióticos, las bacterias deben secarse (por ejemplo, liofilizarse o secarse por pulverización) para obtener una condición metabólicamente inactiva. Como tal, pueden sobrevivir durante décadas en las condiciones de almacenamiento correctas (por ejemplo, humedad, temperatura...). Mediante la introducción de agua, el polvo bacteriano se reactivará y las bacterias pueden ejercer su función. Hasta ahora, la mayoría de las formulaciones probióticas se han utilizado para aplicaciones gastrointestinales. Las formulaciones más comunes son cápsulas y comprimidos que pueden almacenarse fácilmente en ausencia de agua y que pueden sellarse bajo gases inertes tales como nitrógeno o dióxido de carbono para establecer una buena humedad relativa para la estabilidad máxima.
Por otro lado, el uso de probióticos en formulaciones tópicas (u otros tipos de acuosas) podría tener también un enorme potencial. Una opción podría ser formular estas en sustancias anhidras tales como pomadas u oleogeles, sin embargo, los pacientes generalmente no aceptan esas formulaciones. Las formulaciones más aceptadas son las que se presentan en forma de geles/cremas/espumas/lociones. Sin embargo, tales formulaciones tópicas contienen inherentemente un alto grado de agua, es decir, para formularse adecuadamente en un gel, crema, espuma, loción, ungüento... Evidentemente, la presencia de tales grados altos de agua en estas formulaciones plantea un problema para el almacenamiento de probióticos en su condición metabólicamente inactiva.
Un segundo problema que se produce en tales formulaciones acuosas (por ejemplo, tópicas) es que estos contienen generalmente agentes, que no son compatibles con la supervivencia de microorganismos; tales como conservantes, tensioactivos, emulsionantes... para proteger tales formulaciones contra el crecimiento de microorganismos no deseados, así como para formar emulsiones estables. Sin embargo, estos agentes también formarán un problema importante en la formulación de microorganismos beneficiosos.
Por lo tanto, era un objeto de la presente invención proporcionar un sistema que permita el almacenamiento a largo plazo de microorganismos, que no perjudica sustancialmente tales microorganismos al usar los mismos. Se encontró sorprendentemente que un sistema de 2 compartimentos que comprende un primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas; y un segundo compartimento que contiene (o que consiste en) una composición acuosa que comprende uno o más ácidos orgánicos (que tienen un pH de menos de 7,0 y que está libre de agentes de tamponamiento), proporciona una solución a los problemas mencionados anteriormente. En particular, se encontró que dicho sistema permite el almacenamiento a largo plazo de los microorganismos, ya que, durante el almacenamiento, están protegidos de estar expuestos al agua, estando contenido en un compartimento que no comprende agua. Posteriormente, y tras combinar el contenido de ambos compartimentos para su uso, se encontró sorprendentemente que los ácidos orgánicos, que sirven para el propósito del conservante para el almacenamiento, no dañan inmediatamente los microorganismos liberados, que se activan debido al componente de agua en dicha segunda composición. Esto contrasta con otras clases de conservantes que tienen un mecanismo de trabajo muy directo en microorganismos.
Además, aunque las formulaciones de la presente invención son particularmente adecuadas para aplicaciones tópicas de probióticos, el concepto de la invención también podría extenderse a otros campos en los que se produce el problema de conservar/estabilizar microorganismos en un entorno acuoso. Por lo tanto, formulándolos en un sistema de 2 compartimentos como se define en la presente invención, estos problemas se resuelven.
Si bien ya se ha descrito el concepto de formular microorganismos en un sistema de 2 compartimentos, la técnica anterior no proporciona una solución a la protección de microorganismos una vez que se combina el contenido de ambos compartimentos. En particular, el componente acuoso requerido para activar los microorganismos es a menudo muy duro para los microorganismos y, en su mayoría, contiene conservantes, tensioactivos... que no son compatibles con la supervivencia a largo plazo de dichos microorganismos. Por el contrario, debido a la selección de ácidos orgánicos como conservante, se encontró que no había necesidad de incluir conservantes adicionales, tensioactivos u otros componentes perjudiciales, mientras que se conservó la estabilidad requerida de tales formulaciones.
Antunes y col., 2013 (Food Science and Technology 54: 125-131) describe un proceso de microencapsulación en el que una suspensión bacteriana se inmoviliza en acetato de celulosa junto con glicerol, maltodextrina, Tween... Durante el secado por pulverización, la suspensión bacteriana se nebuliza usando una sola boquilla en un área calentada (100 °C-200 0C). Como tal, el agua en la suspensión se evapora y se obtiene un polvo bacteriano seco. El polvo obtenido se asemeja a una matriz que contiene dichos microorganismos en lugar de microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas.
El documento US2012263826 describe una solución oral que comprende al menos una solución acuosa y cápsulas de tipo gelatina que comprenden alginato, proteínas de suero y probióticos. Dichas cápsulas de tipo gelatina son, de hecho, una partícula de gel 1 -fásica (es decir, matriz que comprende probióticos) y no un sistema de 2 compartimentos como se describe en el presente documento, en donde los probióticos se mantienen en un núcleo anhidro de dicha cápsula.
El documento WO2008016214A1 describe una composición que comprende probióticos formulados como cápsulas y que el microorganismo se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable para preparar una solución de suspensión o dispersión, que llena cápsulas. Este documento describe además que las cápsulas pueden tener un recubrimiento entérico y, que la composición puede comprender además componentes adicionales tales como ácido glucónico. Sin embargo, el documento WO2008016214A1 se construye claramente alrededor de las composiciones farmacéuticas orales (por ejemplo, cápsulas), con un recubrimiento entérico contra la alta acidez del ácido del estómago y este documento no demuestra un sistema de dos compartimentos que contiene probióticos tal como se describe en el presente documento.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de 2 compartimentos que consiste en:
- un primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, que comprende además microorganismos viables en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas; y
- un segundo compartimento que comprende una composición acuosa que tiene un pH inferior a 7,0 y que comprende uno o más ácidos orgánicos;
en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
En una realización particular de la presente invención, dicha segunda composición acuosa tiene un pH de menos de 5,5, preferiblemente de menos de 5,0, más preferiblemente de menos de 4,5.
En otra realización particular, dicho uno o más ácidos orgánicos se seleccionan de la lista que comprende ácido benzoico, ácido sórbico, ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido deshidroacético, ácido fumárico, ácido anísico, ácido glucónico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fosfórico y ácido propiónico y derivados de los mismos.
En otra realización adicional, dichos microorganismos viables son microorganismos probióticos, más preferiblemente seleccionados de la lista que comprende Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus plantarum.
En una realización particular, dicho primer compartimento es impermeable al agua y al oxígeno.
En otra realización particular, dicha cubierta insoluble e impermeable al agua de las microcápsulas de la presente invención, se compone de alginato, goma xantana, goma arábiga, goma gellan, carragenina, gelatina, celulosa o derivados de los mismos; o polímeros basados en agar, proteínas, poliol, gelatina, PVA (poli(alcohol vinílico)), PLGA (poli(ácido láctico-co-glicólico), PLA (poli(ácido láctico)) y derivados de los mismos, PCL, poliisohexilcianoacrilato, derivados de acrilato o almidón, opcionalmente en combinación con quitosano o grasas duras.
En una realización específica, el sistema de 2 compartimentos de la presente invención está en forma de gel, crema, espuma, loción o ungüento que comprende dichas microcápsulas.
En una realización particular de la presente invención, la composición no acuosa se selecciona de la lista que comprende aceites vegetales, aceites minerales, aceites de silicio o polímeros hidrófilos; en particular triglicéridos cápricos/caprílicos, parafina líquida, polietilenglicol, siliconas o grasas duras.
En una realización particular de la presente invención, dichos uno o más ácidos orgánicos sirven para el propósito de conservante, y dicha composición está sustancialmente libre de conservantes adicionales.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la conservación de microorganismos viables que comprende:
- proporcionar un sistema de 2 compartimentos;
- incluir dichos microorganismos viables en dicho primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas;
- uno o más ácidos orgánicos en dicha composición acuosa en un segundo compartimento de dicho sistema de 2 compartimentos en una cantidad suficiente para obtener un pH de menos de 7,0; en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un sistema de 2 compartimentos según esta invención, para la conservación de dicha composición acuosa, sin dañar dichos microorganismos viables.
Breve descripción de las figuras
Con referencia específica ahora a las figuras, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las diferentes realizaciones de la presente invención solamente. Se presentan con el fin de proporcionar lo que se considera la descripción más útil y sencilla de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto no se hace ningún intento para mostrar detalles estructurales de la invención con más detalle de lo necesario para una comprensión fundamental de la invención. La descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo las varias formas de la invención pueden incorporarse en la práctica.
Fig. 1: Estabilidad de microorganismos en silicona; A) CF 1406, B) CF6570.
Fig. 2: Estabilidad de microorganismos en aceites; A) Aceite de girasol, B) Miglyol 812N.
Fig. 3: Estabilidad de microorganismos en medios polares; A) PEG400, B) Glicerina.
Fig. 4: Estabilidad de microorganismos en grasa dura; A) Whitepsol h15, B) Hydrobase 32/34.
Descripción detallada de la invención
Como ya se ha detallado anteriormente en el presente documento, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de 2 compartimentos que consiste en:
- un primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas; y
- un segundo compartimento que comprende una composición acuosa que tiene un pH inferior a 7,0 y que comprende uno o más ácidos orgánicos;
en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
Más específicamente, la presente invención proporciona un sistema de 2 compartimentos como se define en el presente documento que consiste en:
- microcápsulas que tienen una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dicha cubierta; y
- una composición acuosa que tiene un pH de menos de 7,0 y que comprende uno o más ácidos orgánicos; en donde dicha composición acuosa está exenta de agentes de tamponamiento.
Aún más específicamente, la presente invención proporciona un sistema de 2 compartimentos como se define en el presente documento que consiste en:
- microcápsulas que pueden tener una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dicha cubierta; y
- una composición acuosa que tiene un pH de menos de 7,0 y que comprende uno o más ácidos orgánicos;
en donde dicha composición acuosa está exenta de agentes de tamponamiento.
En el contexto de la presente invención, los términos microcápsulas “ insolubles en agua” e “ impermeables al agua” deben entenderse como resistentes al agua. En particular, se pueden describir cápsulas resistentes al agua como no degradadas cuando se suspenden en dicho segundo compartimento acuoso. No obstante, las microcápsulas tal como se usan en el presente documento pueden (y suelen) degradarse, es decir, perder su insolubilidad en determinadas condiciones de estrés, como concentraciones salinas o esfuerzos mecánicos de cizallamiento, liberando así su contenido activo, por ejemplo, el mecanismo de liberación de las cápsulas descrito en el presente documento.
En el contexto de la presente invención, el término “composición acuosa” se refiere a una formulación que contiene agua. En particular, dichas formulaciones comprenden una cantidad sustancial de agua, como al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de agua. Por consiguiente, el término “composición no acuosa” se refiere a una formulación que no contiene cantidades sustanciales de agua, como no más del 10 %, preferiblemente no más del 5 %, incluso más preferiblemente no más del 2 %, y preferiblemente no contiene agua en absoluto, es decir, 0 %.
En el contexto de la presente invención, el término microorganismos viables se refiere a microorganismos que están vivos, y no se refiere a fragmentos, sobrenadantes de cultivos o formas muertas de los mismos. Dicho microorganismo viable se liofiliza preferiblemente para aumentar su conservación.
En el contexto de la presente invención, el término “ácido orgánico” se refiere a un compuesto orgánico con propiedades ácidas. Evidentemente, en el contexto de la presente invención, cualquier ácido orgánico adecuado puede usarse en la medida en que pueda actuar como conservante.
Se encontró que estos ácidos orgánicos tienen un mecanismo de trabajo lento en microorganismos y que no dañan inmediatamente los microorganismos (probióticos) una vez que entran en contacto con estos ácidos orgánicos. Después de una exposición más prolongada al entorno, tal como la piel, los ácidos orgánicos pierden su actividad, por lo tanto tampoco restringen los microorganismos (probióticos) durante un periodo de tiempo más largo. Si bien la invención se realiza preferentemente mediante el uso de un ácido orgánico como conservante (ya que se encontró que estos perdieron su actividad después de la exposición al medio ambiente), también se puede realizar mediante el uso de otro conservante en la medida en que tenga un mecanismo de trabajo lento, tal como requiere al menos 24 horas para convertirse.
Con respecto al uso de ácidos orgánicos, las formulaciones están libres de agentes de tamponamiento. La presencia de un agente de tamponamiento mantendrá las composiciones a un pH bajo durante un periodo de tiempo más largo, tomando más tiempo para inhibir la acción conservante de los ácidos orgánicos y, por lo tanto, aumentar el riesgo de dañar los microorganismos una vez que entran en contacto con los ácidos orgánicos. Si bien la mayoría de los componentes tendrán un pequeño efecto de tamponamiento, se desea seleccionar los componentes de las composiciones de manera que no reduzcan o aumenten sustancialmente el tiempo requerido para la inactivación de los ácidos orgánicos.
Los ácidos orgánicos particularmente adecuados son los seleccionados de la lista que comprende ácido benzoico, ácido sórbico, ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido anísico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido deshidroacético, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fosfórico y ácido propiónico y derivados de los mismos. Más específicamente, dichos ácidos orgánicos se seleccionan de la lista que comprende: ácido benzoico, ácido sórbico, ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido deshidroacético, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fosfórico y ácido propiónico y derivados de los mismos; tal como ácido sórbico.
En una realización particular de la presente invención, el pH de la segunda composición acuosa según la presente invención es inferior a 5,5, preferiblemente inferior a 5,0, más preferiblemente inferior a 4,5, inferior a 4,0 o inferior a 3,5. El pH de las formulaciones es altamente relevante dentro del contexto de la presente invención. En general, cuanto menor sea el pH, mayor su efecto conservante, contribuyendo así a la estabilidad a largo plazo de las formulaciones de la presente invención. El pH deseado se obtiene por los ácidos orgánicos coformulados, que por lo tanto tienen el propósito del agente conservante en las formulaciones. Debido a la presencia de estos ácidos orgánicos, se encontró que no había más necesidad de incluir conservantes adicionales, por lo tanto, la formulación de la presente invención está preferiblemente sustancialmente libre de otros conservantes que los ácidos orgánicos. Además, la composición no contiene otros componentes perjudiciales para los microorganismos, como fenoxietanol, bronidox, isotiazolinonas y lauril éter sulfato de sodio; que se usan muy a menudo en formulaciones tópicas.
En una realización preferida, los microorganismos viables de la presente invención son microorganismos probióticos viables.
En el contexto de la presente invención, se entiende que el término “probiótico” incluye microorganismos viables que proporcionan beneficios para la salud cuando se utilizan en el ámbito humano o veterinario. Las formulaciones de la presente invención son muy adecuadas en la formulación de cualquier microorganismo probiótico viable conocido, tal como, pero sin limitarse a, lactobacilos, más en particular Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus y/o Lactobacillus plantarum. Evidentemente, las formulaciones de la presente invención pueden comprender solo una especie de microorganismos probióticos viables, o combinaciones de los mismos, dependiendo del uso previsto.
Para aumentar la estabilidad de los microorganismos en el primer compartimento, dicho primer compartimento es preferiblemente impermeable al agua y al oxígeno.
En el contexto de la presente invención, los términos “ microencapsulado” o “ microcápsulas” se refieren a los productos obtenidos mediante un proceso de microencapsulación. Este es un proceso en el que las partículas o gotas de tamaño micrométrico (intervalo de micrómetros) están rodeadas por un recubrimiento para dar pequeñas cápsulas, de muchas propiedades útiles. En el contexto de la presente invención, se usa para incorporar microorganismos probióticos. En una forma relativamente simple, una microcápsula es una esfera pequeña con una pared uniforme alrededor de la misma. El material dentro de la microcápsula se denomina núcleo, fase interna o carga, mientras que la pared se denomina cubierta, recubrimiento o membrana.
Un experto en la técnica es bien consciente del hecho de que existen varios métodos para la fabricación de microcápsulas, y que la presente invención no se limita a ninguno de dichos métodos. Los métodos de microencapsulación adecuados en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, recubrimiento en bandeja, recubrimiento por suspensión en aire, extrusión centrífuga, boquilla vibratoria, secado por pulverización, gelificación ionotrópica, coacervación-separación de fases, policondensación interfacial, reticulación interfacial, polimerización in situ, polimerización matricial.
El objetivo inicial de la microencapsulación es el aislamiento del núcleo de su entorno, en la presente invención en particular para proteger a los microorganismos encapsulados de la acción conservante de los ácidos orgánicos circundantes, y protegerlos de ser activados en un medio acuoso. Evidentemente, al usar las paredes de las microcápsulas deben romperse para liberar los microorganismos y permitirles actuar según se desee. Dicha ruptura se obtiene preferiblemente por tensión de baja presión, fricción o cizallamiento durante el uso, tal como tras la aplicación de las formulaciones a la piel u otras áreas tópicas.
En su forma más simple, las microcápsulas de la presente invención comprenden una cubierta insoluble e impermeable al agua con microorganismos contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas. Sin embargo, cuando sea apropiado, las microcápsulas pueden contener capas adicionales, tales como, por ejemplo, una capa de recubrimiento adicional para aumentar la protección del contenido.
En una realización particular de la presente invención, dichas microcápsulas comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua; y dichos microorganismos están contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas. La presencia de agua es suficiente para reactivar las bacterias liofilizadas, de ahí la importancia de formularlas en ausencia de agua, permitiendo así su almacenamiento a largo plazo. Dicha cubierta insoluble en agua e impermeable al agua puede componerse de cualquier material adecuado tal como, por ejemplo, alginato, goma xantana, goma arábiga, goma gellan, carragenina, gelatina, celulosa o derivados de los mismos; o polímeros basados en agar, proteínas, poliol, gelatina, PVA (poli(alcohol vinílico)), PLGA (poli(ácido láctico-coglicólico), PLA (poli(ácido láctico)) y derivados de los mismos, PCL, poliisohexilcianoacrilato, derivados de acrilato o almidón o grasas duras tales como, por ejemplo, witepsol o hydrobase.
Si bien estos componentes pueden usarse como tales, también pueden combinarse entre sí o pueden reticularse a polímeros o quitosano. Dicha reticulación adicional puede mejorar la durabilidad de las microcápsulas. Además, para proteger aún más el contenido de las microcápsulas (es decir, los microorganismos) contra el agua y el aire, las cápsulas pueden recubrirse opcionalmente con un revestimiento adecuado.
Como se indicó en el presente documento anteriormente, los microorganismos deben almacenarse en ausencia de agua para garantizar un almacenamiento a largo plazo. Por lo tanto, el núcleo de las microcápsulas de la presente invención es preferiblemente un medio libre de agua, tal como, pero no limitado a, aceites vegetales, aceites minerales, aceites de silicona o polímeros hidrófilos; en particular triglicéridos cápricos/caprílicos, parafina líquida, polietilenglicol, siliconas o grasas duras tales como, por ejemplo, witepsol o hydrobase.
La presencia de un conservante es, por supuesto, muy importante para el almacenamiento a largo plazo de las formulaciones, sin embargo, plantea un grave problema para la formulación de microorganismos tales como los probióticos. Como solución hemos encontrado que la microencapsulación de microorganismos (probióticos) y el suministro de tales microcápsulas en una formulación que comprende ácidos orgánicos, es suficiente para garantizar el almacenamiento a largo plazo de las formulaciones, sin obstaculizar la actividad de los microorganismos. Incluso, tras el uso de la formulación y liberación de los microorganismos, este último no se ve obstaculizado por los ácidos orgánicos coformulados, ya que estos pierden rápidamente su actividad una vez utilizados, como debido a la capacidad tamponadora de la piel. Por lo tanto, los ácidos orgánicos de la presente invención pretenden servir el propósito del conservante, y la formulación está sustancialmente libre de conservantes adicionales que pueden dificultar la actividad de los microorganismos después de la liberación de las microcápsulas.
Por lo tanto, en una realización particular de la presente invención, dicho ácido orgánico sirve para el propósito del conservante, y la formulación está sustancialmente libre de conservantes adicionales.
Las formulaciones de la presente invención son particularmente adecuadas para la aplicación tópica, porque tales formulaciones contienen en general un alto grado de agua. Por lo tanto, en una realización particular, la formulación acuosa según la presente invención es una formulación acuosa tópica.
En el contexto de la presente invención, el término “tópico” se refiere a la administración local en un lugar específico del cuerpo, en particular la aplicación en un lugar concreto del cuerpo. En particular, incluye la aplicación a las mucosas mediante formulaciones acuosas, es decir, no sólidas, tales como cremas, espumas, geles, lociones o ungüentos, o cualquier otro tipo de formulación que contenga agua. Evidentemente, el término “tópico” no incluye la administración en forma de preparados sólidos tales como cápsulas, comprimidos...
Las formulaciones probióticas tópicas de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada tal como, pero sin limitación, un gel, crema, espuma, loción o ungüento, que comprende dichas microcápsulas.
Tal como se detalló anteriormente en el presente documento, el hallazgo de la presente invención es que la formulación de microorganismos, de manera que estos no entran en contacto con un componente de agua en un sistema de 2 compartimentos, en combinación con el uso de un ácido orgánico es suficiente para permitir el almacenamiento a largo plazo de la formulación sin dañar sustancialmente los microorganismos (probióticos).
Como tal, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la conservación de microorganismos viables que comprende:
- proporcionar un sistema de 2 compartimentos;
- incluir dichos microorganismos viables en dicho primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas;
- uno o más ácidos orgánicos en dicha composición acuosa en un segundo compartimento de dicho sistema de 2 compartimentos en una cantidad suficiente para obtener un pH de menos de 7,0; en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
En un aspecto final, la presente invención proporciona el uso de un sistema de 2 compartimentos según esta invención para la conservación de la composición acuosa sin dañar dichos microorganismos viables en dichas microcápsulas.
Las formulaciones de la presente invención son, en particular, muy adecuadas para la administración tópica, que incluye la aplicación directa a la piel, o membrana mucosa tal como la vagina.
Las formas de administración adecuadas -que pueden ser semisólidas o líquidas, dependiendo de la forma de administración-, así como los métodos y portadores, diluyentes y excipientes para su uso en la preparación de las mismas, serán evidentes para el experto; se hace referencia de nuevo, por ejemplo, a los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, US-A-6.369.087 y US-A-6.372.733, así como a los manuales habituales, como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos, de tales preparaciones incluyen elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, ungüentos, cremas, lociones, que pueden formularse con portadores, excipientes y diluyentes que son adecuados per se para tales formulaciones, como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, alginatos, tragacanto, gelatina, polietilenglicol, celulosa, agua (estéril), metilcelulosa, aceites comestibles, aceites vegetales y aceites minerales o mezclas adecuadas de los mismos.
Las formulaciones de la presente invención pueden contener opcionalmente otros componentes tales como fármacos y/o prebióticos, por ejemplo para estimular el crecimiento de los microorganismos.
Las formulaciones pueden contener opcionalmente otras sustancias que se usan comúnmente en formulaciones farmacéuticas, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes dispersantes. Sin embargo, es muy importante que dichas sustancias adicionales no dañen sustancialmente los organismos probióticos durante el almacenamiento de la composición, ni tras su uso.
Más en particular, las composiciones pueden formularse en una formulación farmacéutica que comprende partículas consistentes en una dispersión sólida de los microorganismos de la invención y uno o más polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables.
El término “dispersión sólida” define un sistema en estado sólido (por oposición a un estado líquido o gaseoso) que comprende al menos dos componentes, en el que un componente está disperso más o menos uniformemente en el otro componente o componentes.
Además, puede ser conveniente formular los microorganismos en forma de micropartículas que tengan un modificador de superficie adsorbido en la superficie de las mismas en una cantidad suficiente para mantener un tamaño medio efectivo de partícula de aproximadamente 1 - 5000 μm. Los modificadores de superficie adecuados pueden seleccionarse preferentemente entre excipientes farmacéuticos orgánicos e inorgánicos conocidos. Dichos excipientes incluyen diversos polímeros, oligómeros de bajo peso molecular, productos naturales y tensioactivos, tales como tensioactivos no iónicos y aniónicos.
La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos de síntesis y biológicos, que no limitan en modo alguno el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Selección de composición no acuosa para el primer compartimento
El objetivo de este ejemplo fue seleccionar una composición no acuosa adecuada para incluir microorganismos viables, lo que permite la estabilidad a largo plazo y la viabilidad de los mismos.
Material y métodos
Estudio de estabilidad
Se usaron tres cepas en este estudio de estabilidad:
- L. pentosus autocultivado (es decir, lac4 o Lp)
- LGG autocultivado (es decir, lac7 o LGG)
- LGG liofilizado adquirido
Se probaron ocho medios de suspensión sin agua diferentes para conservar las bacterias a temperatura ambiente (+/-20 0C). El medio de suspensión usado se puede subdividir en 4 tipos, para los cuales en cada grupo, se compararon 2 subtipos de la siguiente manera:
• Siliconas:
◦ Fluido cosmético 1406 (dimeticonol y dimeticona) - de Chemsil
◦ Fluido cosmético 6570 (disiloxano, trisiloxano, ciclopentasiloxano y dimeticona) - de Chemsil
• Aceites:
◦ Aceite de girasol - de Everyday
◦ Migyol 812 N -de Hüls
• Disolventes polares:
PEG 400 - de Roth
◦ Glicerina - de Fagron
• Grasas duras:
◦ Witepsol H15 - de VW chemicals
◦ Hydrobase 32/34 - de Prod'hyg laboratoires
Las muestras se obtuvieron en 9 puntos de tiempo predefinidos:
• T0 = antes de la suspensión en el medio de suspensión
• T1 = 1 día después de la suspensión
• T2 = 1 semana después de la suspensión
• T3 = 2 semanas después de la suspensión
• T4 = 1 mes después de la suspensión
• T5 = 2 meses después de la suspensión
• T6 = 6 meses después de la suspensión
• T7 = 12 meses después de la suspensión
• T8 = 24 meses
Todos los materiales usados se esterilizaron antes de su uso en autoclave. Todos los componentes, ingredientes,... utilizados se esterilizaron en autoclave si fue posible y, en caso contrario, se filtraron en circunstancias estériles.
Determinación de UFC en T0
Lac 4 y Lac 7 se cultivaron en medio líquido MRS (de MAN, Rogosa & Sharpe) (37 °C) hasta su crecimiento completo. El medio se centrifugó durante 10 minutos a 2780 G. El sobrenadante se desechó y el sedimento bacteriano se utilizó posteriormente.
Se pesaron 100 mg y se diluyeron con agua fisiológica (0,85 % de NaCl) para obtener un volumen total de 10 ml. A partir de las tres cepas (lac 4, lac 7 y LGG), se hicieron series de diluciones (diluciones seriadas de 10 veces) y se procedió al recuento en placa según el método de propagación en placa (derivado de los métodos 2.6.12 y 2.6.13 de la Farmacopea). Las mediciones se repitieron por triplicado. Los resultados se expresan como ufc/gramo de polvo.
Suspensión de las bacterias en el medio de suspensión
Con las masas bacterianas obtenidas, se realizó una dilución homogénea 1/10 (m/m %) con los diferentes medios de suspensión anhidra. Se pesó 1 gramo de dicha suspensión en un tubo falcon y se selló en una bolsa de aluminio (HR = 20 %). Cada muestra contenía 100 mg de bacterias para fines de prueba adicionales. Las bolsas de aluminio se abrieron en determinados intervalos de tiempo para el ensayo de viabilidad.
Prueba después del tiempo de almacenamiento
Las bolsas selladas se abrieron en determinados puntos de tiempo para la prueba de estabilidad. El tubo falcon que contenía 1 gramo de sustancia anhidra se procesó posteriormente añadiendo 1 gramo de una mezcla emulsionante (compuesta por polisorbato 80 y sorbitan-sesquioleato) y 8 gramos de agua fisiológica. Esto formó una emulsión a través de la cual las bacterias podrían entrar en contacto con el agua y se reactivaron. Se produjo una preparación adicional de la muestra y un recuento de placas tal como se describió anteriormente y se derivó del método 2.6.12 de la farmacopea: Examen microbiológico de productos no estériles: pruebas de enumeración microbiana y 2.6.13: Examen microbiológico de productos no estériles: prueba de microorganismos específicos.
Resultados y discusión
La estabilidad del polvo liofilizado fue muy superior, como era de esperar, a la de las cepas “tal cual” . Después de sólo 1 mes, se observa una reducción media de 3 log, mientras que no se detecta ninguna reducción en la cepa liofilizada. De este modo, se demuestra que es importante empezar a formular con un polvo liofilizado (u otro método de secado) adecuado para garantizar una formulación estable de microorganismos viables a lo largo del tiempo.
Por lo tanto, sólo se analizarán los resultados de la cepa LGG liofilizada.
Los resultados de estabilidad fueron comparables para las mezclas de silicona (fig. 1), aceites (fig. 2) y grasas duras (fig. 3). De los medios hidrófilos (fig. 3), sólo el PEG 400 parece adecuado como medio de suspensión, a diferencia del glicerol, que influye negativamente en la estabilidad del FD IGG.
Hay un promedio de 1 log reducción después de 1 año de estabilidad para los diferentes medios anhidros. Esto deja suficientes microorganismos viables para ser aplicados tópicamente y ejercer un efecto beneficioso sobre la piel.
De este modo se demuestra que trabajando con un polvo liofilizado adecuadamente, suspendido en un medio anhidro, protegido de la luz, la humedad y los conservantes, es posible obtener una fase/compartimento con probióticos estables. Este compartimento puede estar o bien en un sistema de 2 fases, donde hay mezcla in situ de la fase acuosa y anhidra o bien como cápsulas suspendidas en una formulación.
Ejemplo 2: Selección de la composición acuosa para el segundo compartimento
El objetivo es elaborar una formulación tópica con microorganismos viables que pueda aplicarse sobre la piel, donde ejercerán un efecto beneficioso. Una formulación tópica, tal como una crema, suele contener aceite, agua, conservantes y emulgentes. La presencia de emulsionantes y conservantes podría influir negativamente en la estabilidad de los microorganismos liofilizados presentes. Una forma de garantizar una determinada vida útil es suspender los probióticos liofilizados en un medio anhidro (véase también el ejemplo 1). Esta suspensión anhidra
proporcionará una buena estabilidad a los microorganismos liofilizados. Para evitar una influencia negativa de otros componentes de la formulación tópica, lo mejor es separar dicha suspensión anhidra del resto de la formulación, ya sea mediante separación física de fases o encapsulando dicha suspensión anhidra. Las cápsulas se pueden suspender en una formulación tópica.
Siempre que las fases se separen, puede obtenerse un producto tópico duradero con microorganismos viables. Puede producirse un problema cuando las 2 fases se mezclan, antes de la aplicación sobre la piel. Los probióticos liofilizados se activarán a través de la absorción de agua de la formulación, pero también se encontrarán con emulsionantes y conservantes presentes, que matarán a los microorganismos activados e impedirán que ejerzan un efecto beneficioso para la piel. Este experimento es un cribado para determinar el efecto a corto plazo (10 minutos -> 1 día) de diferentes formulaciones sobre la supervivencia de los probióticos liofilizados.
1. Método
1.1 Experimento A
Este experimento es una simulación en la que microorganismos viables liofilizados se mantienen estables en una suspensión anhidra y se mezclan después con una formulación que contiene distintos conservantes y emulsionantes. Se incuban tres preparaciones convencionales de TMF con un 10 % (m/m) de LGG liofilizado. Las formulaciones TMF se usan ampliamente (Bélgica) y se consideran formulaciones seguras y estables para la administración tópica de fármacos. Se toma una muestra de la formulación a los 10 minutos y a las 24 horas para determinar la viabilidad y, por tanto, el efecto antibacteriano a corto plazo de dichas formulaciones. La aplicación de probióticos tópicos se produce típicamente cada día. Por lo tanto, no se tomaron muestras después de 24 horas. La preparación de la muestra y la determinación de las UFC (recuento en placa) se realizaron según el método de la placa extendida (derivado de los métodos 2.6.12 y 2.6.13 de la Farmacopea). Las mediciones se repitieron por triplicado. Los resultados se expresan como ufc/gramo de polvo.
La composición de las cremas probadas es la siguiente:
1.2 Experimento B
Para ampliar la plataforma de cribado del experimento A, éste se repitió con formulaciones disponibles en el mercado que contenían distintos conservantes y emulsionantes. El desarrollo del experimento es el mismo que el descrito en el punto 2.1. La crema A del experimento A se tomó como referencia. Se examinaron otras bases de crema farmacéuticas (1 -5) y se compararon con formulaciones cosméticas disponibles en el mercado (6-11), como se detalla en la tabla siguiente:
2. Resultados
2.1 experimento A
La supervivencia de LGG liofilizado parece verse mínimamente afectada tras ser suspendido durante 10 minutos en las formulaciones anteriores. En el caso de la crema A, no se aprecia prácticamente ninguna disminución al cabo de 24 horas. Se observó una ligera disminución (± 0,5 log) en la crema C y una gran disminución (± 3 log) en la crema B. Tanto la crema A como la C contienen el ácido orgánico ácido sórbico como conservante, a diferencia de la crema B que contiene parabenos como agente conservante y lauril sulfato de sodio (un emulsionante aniónico con conocidas propiedades antimicrobianas).
En general, puede concluirse que los ácidos orgánicos tienen un mecanismo de acción lento (el tiempo necesario para que sean eficaces es de 1 a 3 días (datos no mostrados)) y, por tanto, podrían considerarse un conservante seguro para su uso en formulaciones tópicas en combinación con microorganismos liofilizados. Se sugiere la formulación A para futuros ensayos relativos a la combinación de probióticos liofilizados en una formulación tópica.
2.2 Experimento B
A primera vista, las bases de crema farmacéuticas (1-5) parecen ser menos antibacterianas a corto plazo que las formulaciones cosméticas (6-10) probadas. Las formulaciones cosméticas son extremadamente antibacterianas (> 4 log de reducción tras 10 minutos) y sus ingredientes (emulsionantes y conservantes) no se consideran adecuados para fines de formulación. Los principales ingredientes problemáticos son fenoxietanol, bronidox, isotiazolinonas y lauril éter sulfato sódico. También están presentes otros ingredientes con propiedades antibacterianas, pero son de menor importancia.
La mejor formulación (después de 24 horas) es de nuevo la crema de cetomacrogol tamponada, con ácido sórbico como único conservante (reducción de ± 0,15 log después de 24 horas). La formulación con la 2a mejor supervivencia es la base farmacéutica Nourivan, que sólo contiene ácido sórbico como conservante. La tercera mejor formulación es el carbomeergel que contiene parabenos y la cuarta mejor formulación es la crema pentravan que contiene ácido sórbico y ácido benzoico como conservantes. La crema Lanette contiene parabenos y ácido sórbico como conservantes.
Está claro que los ácidos orgánicos (y los parabenos) son conservantes de acción lenta, a diferencia de los que se encuentran habitualmente en las fórmulas cosméticas, y no perjudican sustancialmente a los probióticos tras su aplicación en la piel. Las formulaciones 1, 4 y 5, que sólo contienen conservantes ácidos orgánicos, muestran la menor reducción después de 10 minutos. Aunque los parabenos también pueden utilizarse como conservantes, son agentes alergénicos conocidos, por lo que es preferible no utilizarlos en la industria cosmética. Por lo tanto, se concluye que los conservantes ácidos orgánicos son una opción adecuada para coformular con probióticos.
Ejemplo 3: Ensayos de estabilidad
Las cápsulas forman una pared homogénea (cubierta) alrededor del núcleo interno que contiene las bacterias probióticas. Esta cubierta protege a las bacterias y se asegura de que no se liberen inmediatamente en el medio acuoso una vez que nuestras cápsulas están suspendidas.
Se puede proporcionar una buena estabilidad tanto a temperatura ambiente como refrigerada, como se desprende de la tabla siguiente:
Ejemplo 4: Ensayos de viabilidad en cremas que contienen ácidos orgánicos como conservante
El objetivo de este ejemplo era determinar la eficacia de las cápsulas probióticas, cuando se suspenden en una crema de aceite/agua en presencia del conservante ácido sórbico en diferentes concentraciones. Un segundo objetivo era demostrar que los conservantes elegidos son adecuados para proteger la nata. Esto se comprobó realizando una prueba de provocación en la crema (sin las cápsulas probióticas) con las diferentes concentraciones de conservantes, de acuerdo con la Farmacopea Europea (5.1.3).
Material y métodos
Composiciones usadas
Se usó una crema básica sin conservantes/perfume como base para pruebas adicionales. El conservante probado fue el ácido sórbico (ácido 2,4 hexadienoico), un ácido orgánico con pKa 4,76 a 25 0C en diferentes concentraciones. El pH de la crema para todas las condiciones probadas se ajustó a 4,5 usando HCl/NaOH.
Pruebas de exposición y eficacia de las concentraciones de conservantes ácidos orgánicos
Las pruebas de exposición se utilizan para determinar la eficacia del sistema de conservación antimicrobiano para productos dermatológicos. El objetivo es aumentar la seguridad y durabilidad del producto. Se probó ácido cítrico en concentraciones : 0,5 % - 0,3 % - 0,1 % - 0 % (Control).
Los organismos expuestos fueron E. coli (DSM 1576), Ps. Aeruginosa (DSM 1128), C. albicans (DSM 1386), St. aureus (DSM 799), As. Niger (DSM 1988).
La adición de los organismos expuestos (en el producto de 100 gramos) se produce en 106 UFC/ml. El muestreo se realiza después de 6 horas, 24 horas, 7-14 y 28 días. Una prueba de exposición es satisfactoria si se observa una reducción de al menos 3 logaritmos al cabo de 7 días en el caso de las bacterias y de 2 logaritmos en el caso de las levaduras/mohos al cabo de 14 días y de 3 logaritmos al cabo de 4 semanas. Los resultados mostrados son después de 4 semanas de muestreo.
Viabilidad de las cápsulas probióticas en la base de crema con diferentes conservantes
Las cápsulas probióticas se suspenden un 15 % (m/) en la base de crema con las diferentes concentraciones de conservantes. Para simular la liberación de los probióticos in vivo, se usó el uso de un tampón de ácido cítrico in vitro. El ácido cítrico disolverá la membrana de la cápsula y liberará así los probióticos que contiene. El tampón CA se preparó disolviendo 31,2 g de Na2HPo4 y 1,25 g de ácido cítrico en 971,54 g de agua estéril. La solución final es isotónica con un pH de 7,4t 0,2.
Las cremas de muestra se muestrean por duplicado después de lo cual se disuelve en tampón de CA. Se realiza otra serie de diluciones 1/10 y se extienden 0,1 ml en placas de agar MRS utilizando el “ método de esparcimiento copacabana” con 5 perlas de vidrio de 4 mm de diámetro. El recubrimiento se produce por duplicado y los resultados (después de 3 días de incubación 37 0C) se calculan como UFC/gramo de crema. El almacenamiento se produce a 4 0C y 25 0C. El muestreo se produce después de 1-2-3 meses. Los resultados mostrados son la estabilidad de las cápsulas después de 3 meses durante el almacenamiento en frío.
Resultados
Resultados de la prueba de exposición
Resultados de la prueba de exposición sobre la crema de base (excluyendo las cápsulas probióticas) después de 4 semanas.
* Una prueba de exposición tiene éxito si se obtiene una reducción logarítmica superior a 3. Los números deben interpretarse como sigue: 3 = menos de 1 log de reducción; 2 = entre 1 y 2 log de reducción; 1 = entre 2 y 3 log de reducción; 0 = mayor de 3 log de reducción en comparación con la carga bacteriana inicial.
Viabilidad de las cápsulas probióticas en la crema con diferentes concentraciones de ácido sórbico Supervivencia de cápsulas probióticas después de 3 meses en crema básica en presencia de diferentes concentraciones de conservante ácido sórbico.
Conclusión
Los ácidos orgánicos (tales como ácido sórbico) son un conservante valioso para formulaciones dermatológicas. El ácido bórico tiene un buen efecto conservante en concentraciones tan bajas como el 0,1 %. La adición de ácido sórbico no dio lugar al fracaso de la prueba de provocación, ya que parecía incapaz de eliminar todos los microorganismos probados en el plazo previsto. Por lo tanto, el uso de ácidos orgánicos como único conservante en una formulación parece ser adecuado para prevenir la descomposición por bacterias, levaduras o mohos, cuando está presente en una concentración adecuada.
La suspensión de las cápsulas probióticas (15 % m/m) en la misma crema base que se utilizó para las pruebas de provocación reveló que las cápsulas probióticas no se veían afectadas por ninguna de las diferentes concentraciones de conservantes. La carga bacteriana de UFC de la crema que contiene los diferentes conservantes varió no más del 32 % (reducción logarítmica inferior a 0,3) en comparación con el blanco. Esto está dentro de la desviación y no es una diferencia significativa.
Esto implica que las cápsulas probióticas ofrecen una buena protección contra los ácidos orgánicos probados en este experimento en esta formulación de crema, mientras que al mismo tiempo los conservantes son capaces de evitar el crecimiento de organismos exógenos en la crema.
Claims (11)
1. Un sistema de 2 compartimentos que consiste en:
- un primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo
de dichas microcápsulas; y
- un segundo compartimento que comprende una composición acuosa que tiene un pH inferior a 7,0 y que comprende uno o más ácidos orgánicos;
en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
2. El sistema de 2 compartimentos según la reivindicación 1, en donde dicha composición acuosa del segundo compartimento tiene un pH de menos de 5,5, preferiblemente de menos de 5,0, más preferiblemente de menos de 4,5.
3. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2; en donde dichos uno o más ácidos orgánicos se seleccionan de la lista que comprende ácido benzoico, ácido sórbico, ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido anísico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido deshidroacético, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fosfórico y ácido propiónico y derivados de los mismos.
4. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en donde dichos microorganismos viables son microorganismos probióticos viables, más preferiblemente seleccionados de la lista que comprende Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus plantarum.
5. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; en donde dicho microorganismo que contiene el primer compartimento es impermeable al agua y al oxígeno.
6. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; en donde dicha cubierta insoluble en agua e impermeable al agua se compone de alginato, goma xantana, goma arábiga, goma gellan, carragenina, gelatina, celulosa o derivados de los mismos; o polímeros basados en agar, proteínas, poliol, gelatina, PVA (poli(alcohol vinílico)), PLGA (poli(ácido láctico-co-glicólico), PLA (poli(ácido láctico)) y derivados de los mismos, PCL, poliisohexilcianoacrilato, derivados de acrilato o almidón, opcionalmente en combinación con quitosano; o grasas duras.
7. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; que está en forma de gel, crema, espuma, loción o ungüento que comprende dichas microcápsulas.
8. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; en donde dicha composición no acuosa se selecciona de la lista que comprende aceites vegetales, aceites minerales, aceites de silicio o polímeros hidrófilos; en particular triglicéridos cápricos/caprílicos, parafina líquida, polietilenglicol, siliconas o grasas duras.
9. El sistema de 2 compartimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; en donde dicho ácido orgánico sirve para el propósito de conservante, y en donde la composición está sustancialmente libre de conservantes adicionales.
10. Un método para la conservación de microorganismos viables que comprende:
- proporcionar un sistema de 2 compartimentos según la reivindicación 1
- incluir dichos microorganismos viables en dicho primer compartimento que comprende microcápsulas que comprenden una cubierta insoluble en agua e impermeable al agua, y microorganismos viables contenidos en una composición no acuosa en el núcleo de dichas microcápsulas;
- incluir uno o más ácidos orgánicos en dicha composición acuosa en un segundo compartimento de dicho sistema de 2 compartimentos en una cantidad suficiente para obtener un pH de menos de 7,0; en donde dicho segundo compartimento está libre de agentes de tamponamiento.
11. Uso de un sistema de 2 compartimentos según la reivindicación 1, para la conservación de la composición acuosa sin dañar dichos microorganismos viables en dichas microcápsulas.
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