ES2886426T3 - Uso de hidroxiapatita como vehículo de elementos nutricionales y extractos vegetales para el tratamiento de plantas - Google Patents
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Abstract
El uso de una hidroxiapatita sustituida con carbonato que tiene la siguiente fórmula: Ca(10)(PO4)(6-y)(CO3)y(OH)2 en donde y está comprendido entre 0,002 y 2, en combinación con al menos una sustancia bioactiva seleccionada del grupo que consiste en un ión de Mn, Mg, K, Fe y B y/o un extracto vegetal seleccionado del grupo que consiste en un extracto de: lignina, menta, tomillo, romero, sésamo, soja, clavo, ajo, limón, canela, Abies sibirica, Malpighia glabra, Achillea millefolium, Allium sativum, Medicago sativa, Aloe vera, Citrus sinensis, Artemisia annua, Arnica Montana, Ocimum basilicum, Betula pendula, Betula pubescens, Calendula officinalis, Matricaria chamomilla, Chamaemelum nobile, Cinnamomum verum, Centella asiatica, Chelidonium majus, Syzygium aromaticum, Allium cepa, Equisetum arvense, Curcuma longa, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia, Eucalyptus globulus, Hypericum perforatum, Fucus vesiculosus, Gentiana lutea, Lavandula angustifolia, Citrus limon, Melilotus officinalis, Melissa officinalis, Punica granatum, Mentha piperita, Vaccinium myrtillus, Orthosiphon stamineus, Urtica dioica, Olea europeae, Tabebuia impetiginosa, Plantago lanceolata, Hieracium pilosella, Pinus sibirica, Polypodium leucotoms, Citrus paradise, Quassia amara, Rheum Thais, Rosa canina, Rosmarinus officinalis, Ruscus aculeatus, Salix alba, Salvia officinalis, Camelia sinensis, Tilia tomentosa, Thymus vulgaris, Arctostaphylos uva-ursi, Valeriana officinalis, Solidago virgaurea, Loranthus europaeus y Zingiber officinale, en donde la sustancia bioactiva está adsorbida en la hidroxiapatita sustituida, para el tratamiento fitosanitario y/o nutricional de las plantas.
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de hidroxiapatita como vehículo de elementos nutricionales y extractos vegetales para el tratamiento de plantas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de una hidroxiapatita sustituida con carbonato en combinación con al menos una sustancia bioactiva, en particular extractos vegetales y/o elementos nutricionales, para el tratamiento fitosanitario y/o nutricional de plantas, preferiblemente vides.
Técnica antecedente
En la agricultura, existe un equilibrio frágil entre los agentes bióticos tales como hongos, bacterias, fitoplasmas, virus y parásitos y las defensas reales de la planta en cuestión.
De hecho, las plantas tienen generalmente una resistencia denominada resistencia pre-infección, en el sentido de que tienen barreras físicas, como las paredes de las membranas, o barreras químicas obtenidas mediante la producción y difusión de sustancias antimicrobianas. La resistencia de las plantas puede ser suficiente por sí misma, y por tanto no requerir ningún tratamiento.
Sin embargo, ciertos patógenos provocan un desequilibrio, y las plantas ya no son capaces de defenderse con sus propios mecanismos.
Para ayudar a que las defensas naturales de las plantas luchen contra las enfermedades, la administración de elementos nutricionales se está convirtiendo en una parte esencial de la estrategia de protección de las plantas, dirigida a mantener a la planta en el mejor equilibrio nutricional, requisito fundamental para prevenir el desarrollo de enfermedades. El potasio es un elemento clave, a través de la proporción potasio/nitrógeno, en la reducción de las enfermedades fúngicas, tales como la botritis, en la vid. Cuando los niveles de nitrógeno en las hojas son altos, se incrementa el crecimiento de la planta y se eleva la concentración de los exudados de la planta (p. ej. carbohidratos y aminoácidos) en el fruto. La combinación con niveles bajos de potasio (proporción N/K por encima de 2,5) estimula la diseminación de la enfermedad a las hojas y el fruto. El magnesio mantiene el crecimiento y desarrollo sano del cultivo. El magnesio es un constituyente de los tejidos estructurales, y está implicado en las funciones fisiológicas y los procesos bioquímicos. La aplicación de fertilizantes de magnesio dio como resultado la disminución de la necrosis de tallo del racimo. El hierro participa en actividades metabólicas importantes durante la respiración, la síntesis de ADN y la fotosíntesis. Todos estos procesos desempeñan papeles importantes en los sistemas de defensa contra las enfermedades de los cultivos. El manganeso puede posibilitar efectos directos e indirectos sobre el mecanismo de defensa de los cultivos, y está implicado en el metabolismo de los carbohidratos y del nitrato. El molibdeno está implicado en la síntesis o la regulación de hormonas, y su deficiencia limita el crecimiento de los cultivos. La contribución del boro a la lignificación y al metabolismo del fenol revela su beneficio en el mecanismo de defensa de los cultivos contra las enfermedades.
Cercana a esta aproximación, la aplicación de extractos de origen vegetal, también conocidos como "productos botánicos", se incluye entre las estrategias sostenibles de la protección de plantas.
Muchos extractos vegetales muestran un amplio espectro de actividad contra plagas de insectos y hongos patógenos de plantas que incluyen las actividades insecticidas, antialimentación, repelentes, disuasorias de la oviposición, reguladoras del crecimiento y antivectoriales.
Los extractos vegetales son una mezcla de sustancias naturales derivadas de diversas partes de las plantas, principalmente de las semillas, pero también de los frutos (oliva) y otras partes de las plantas (p. ej. las hojas). Son un grupo muy heterogéneo de productos de origen natural, en forma de polvo higroscópico, disolución alcohólica e hidroalcohólica. Algunas sustancias vegetales se incluyeron en el Anexo I de la Directiva 91/414/EEC con estipulaciones específicas (Directiva 2008/127/EC): extracto de colza como insecticida y acaricida, extracto de limoncillo como herbicida, y melaleuca alternifolia (extracto de árbol del té) como fungicida.
Otros extractos vegetales comestibles (cacahuete, cártamo, algodón, girasol, lino, maíz, oliva, cocotero, mostaza, sésamo, soja y uva) que deberían obtenerse de la extracción mecánica y manipularse exclusivamente mediante procesos físicos no se incluyeron en el Anexo I, y en Italia se pueden usar como bioestimulantes, reconstituyentes vegetales y potenciadores de las defensas naturales de las plantas (DL 55/2012).
En los campos de la protección de plantas y del tratamiento fitosanitario de las plantas, todavía existe la necesidad de mejorar la administración (y por tanto la biodisponibilidad) de extractos vegetales y elementos nutricionales a las plantas, con el objetivo de proteger la salud de las plantas mientras, al mismo tiempo, se reducen las dosis de administración de tales extractos, que son sustancias valiosas desde un punto de vista económico.
La hidroxiapatita se conoce bien en la técnica anterior en diferentes formas y para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, la hidroxiapatita sintética constituye un biomaterial excelente para aplicaciones biomédicas, en particular para la reconstrucción ósea.
Se puede producir hidroxiapatita e hidroxiapatita sustituida sintética mediante diferentes procesos, mediante síntesis húmeda, hidrotérmica, electroquímica, sol-gel o en estado sólido. Se puede hallar en diferentes formas estequiométricas, morfológicas y cristalinas.
Los vehículos de hidroxiapatita estequiométrica se conocen a partir del documento JPH0556105, que describe el uso de hidroxiapatita como vehículo para un ión metálico antimicrobiano seleccionado de plata, cobre y zinc para esterilizar una tierra contra la presencia del hongo patógeno de plantas Pythium. La acción del ión metálico antimicrobiano se limita a la tierra, ya que la publicación especifica que el agente apenas se absorbe en la planta.
El documento EP0640284 describe una arena antimicrobiana revestida con un vehículo de hidroxiapatita estequiométrica que contiene agentes antimicrobianos, tales como iones de plata, cobre o zinc. La arena antimicrobiana se mezcla con la tierra usada para cultivar plantas en floración, tales como orquídeas, ciclámenes, etc., para esterilizar la tierra contra los hongos: Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotinia y Pyshium.
El documento RO 122830 describe una composición fungicida, basada en sales de ácido N,N-etilen-bis-tiocarbámico, caracterizada por el hecho de que consiste en un 40-50% de N,N-etilen-bis-tiocarbamato de zinc o una mezcla del mismo con la sal de manganeso o la sal de manganeso y hierro, 30-50% de hidroxiapatita, 1,5-3% de SiO2 y 20-50% de acetato potásico.
Los documentos JPH0556105 y EP 0640 284 de la técnica anterior no describen el uso de hidroxiapatita sustituida como vehículo de principios activos. La técnica anterior no describe el uso de hidroxiapatita como vehículo de sustancias activas para el tratamiento de las patologías de las plantas mediante la aplicación del vehículo sobre la planta. La técnica anterior solamente enseña una manera de esterilizar la tierra usada para cultivar las plantas, en particular en las plantas en floración (no cultivos).
El documento RO 122830 de la técnica anterior no describe la hidroxiapatita como vehículo de elementos nutricionales, tales como K, Mg, Fe, Mn, Mo, B y Se y/o como vehículo de extractos vegetales, ni que se pueda sustituir la hidroxiapatita con iones metálicos en las posiciones de los iones Ca, PO4 y/o OH.
Sumario de la invención
Con respecto al uso conocido de la hidroxiapatita estequiométrica (es decir, hidroxiapatita basada en iones de calciofosfato sin sustituir con otros iones), que tiene la fórmula:
Ca10(PO4)6(OH)2
como vehículo de iones metálicos para esterilizar la tierra usada para cultivar plantas, la presente invención proporciona el uso de hidroxiapatita sustituida con carbonato que tiene la siguiente fórmula:
Ca(10)(PO4)(6-y)(CO3)y (OH)2
en donde y está comprendido entre 0,002 y 2, cargada con sustancias bioactivas elegidas de iones metálicos tales como Mn, Mg, K, Fe, B (que actúan como fertilizantes y elementos nutricionales), y extractos de origen vegetal, tales como extractos de: lignina, menta, tomillo, romero, sésamo, soja, clavo, ajo, limón, canela, Abies sibirica, Malpighia glabra, Achillea millefolium, Allium sativum, Medicago sativa, Aloe vera, Citrus sinensis, Artemisia annua, Arnica Montana, Ocimum basilicum, Betula pendula, Betula pubescens, Calendula officinalis, Matricaria chamomilla, Chamaemelum nobile, Cinnamomum verum, Centella asiatica, Chelidonium majus, Syzygium aromaticum, Allium cepa, Equisetum arvense, Curcuma tonga, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia, Eucalyptus globulus, Hypericum perforatum, Fucus vesiculosus, Gentiana tutea, Lavandula angustifolia, Citrus limon, Melilotus officinalis, Melissa officinalis, Punica granatum, Mentha piperita, Vaccinium myrtillus, Orthosiphon stamineus, Urtica dioica, Olea europeae, Tabebuia impetiginosa, Plantago lanceolata, Hieracium pilosella, Pinus sibirica, Polypodium leucotoms, Citrus paradise, Quassia amara, Rheum Thais, Rosa canina, Rosmarinus officinalis, Ruscus aculeatus, Salix alba, Salvia officinalis, Camelia sinensis, Tilia tomentosa, Thymus vulgaris, Arctostaphylos uva-ursi, Valeriana officinalis, Solidago virgaurea, Loranthus europaeus, Zingiber officinale.
Los extractos vegetales pueden tener tanto actividad nutricional como actividad antiparasitaria moderada.
La invención también proporciona el uso de la hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con una mezcla de los extractos vegetales enumerados anteriormente o una mezcla de los iones metálicos enumerados anteriormente o una mezcla de los iones metálicos y los extractos vegetales.
La invención también proporciona el uso de una composición de la hidroxiapatita sustituida con carbonato de la invención y una o más sustancias bioactivas según la invención para el tratamiento de plantas.
El uso de la hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia bioactiva según la invención se destina al tratamiento de plantas, preferiblemente al tratamiento fitosanitario y/o nutricional de plantas, en particular de las vides. Otras plantas que se pueden tratar según la invención son: tomatera (Solanum lycopersicum), trigo (género Triticum), peral (género Pyrus), manzano (Malus domestica), olivo (Olea europaea), kiwi (género Actinia) y hortalizas, tales como lechuga, espinaca, cucurbitáceas (por ejemplo melón, pepino, calabaza y sandía), cebolla, puerro, guisantes.
La sustitución con carbonato es en el sitio del fosfato de la hidroxiapatita (sitio B).
Según la presente invención, la hidroxiapatita usada como vehículo de sustancias bioactivas para el tratamiento de plantas es una hidroxiapatita sustituida con al menos un ión carbonato y ningún ión metálico adicional.
La hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia bioactiva se aplica sobre las plantas y penetra en las plantas a través de las aberturas naturales, como se explica con detalle a continuación, y por tanto se consigue un contacto íntimo con las células patógenas que pueden estar presentes tanto sobre la superficie de la planta como dentro de la planta.
La hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia bioactiva se usa para el tratamiento de plantas según la invención.
La sustitución con carbonato tiene la ventaja de reducir el grado de cristalinidad de la hidroxiapatita, que por tanto se hace más amorfa. El estado amorfo conduce a un incremento de la solubilidad de la hidroxiapatita sustituida con carbonato en un medio biológico, con la ventaja de que la liberación de sustancias bioactivas mejora y se hace más eficaz. Por tanto, se pueden usar dosis inferiores de las sustancias bioactivas con respecto a la administración de una sustancia bioactiva sin el vehículo de hidroxiapatita. La hidroxiapatita sustituida con carbonato que tiene las características anteriores comprende una sustancia bioactiva adsorbida en ella, y por tanto proporciona una hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia activa.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1 a 4 muestran los resultados de los ensayos incluidos en la sección "ejemplos A":
La Figura 1 muestra los resultados del primer ensayo de laboratorio con Agrobacterium vitis.
La Figura 2 muestra los resultados del segundo ensayo de laboratorio con Agrobacterium vitis.
La Figura 3 muestra los resultados del tercer ensayo de laboratorio con Botrytis cinerea.
La Figura 4 muestra los resultados del segundo ensayo de laboratorio con Botrytis cinerea.
Las Figuras 5 a 8 muestran los resultados de los ensayos incluidos en la sección "ejemplos B":
Las Figuras 5A-D muestran los resultados del ensayo de laboratorio con Botrytis cinerea.
Las Figuras 6A-D muestran los resultados del ensayo de laboratorio con Phaeomoniella chlamydospora.
Las Figuras 7A-D muestran los resultados del ensayo de laboratorio con Phaeoacremonium aleophilum.
Las Figuras 8A-B muestran los resultados del ensayo en invernadero con Plasmopara viticola.
Descripción detallada de la invención
"Hidroxiapatita sustituida", en la presente invención, pretende referirse a la hidroxiapatita de fórmula Ca10(PO4)6(OH)2, en la que los iones Ca, PO4 y/o OH están sustituidos, en la red cristalina de hidroxiapatita, con uno o más iones de la misma especie o de una especie diferente.
Para el alcance de la presente invención, "hidroxiapatita funcionalizada con una sustancia bioactiva" es una definición equivalente a decir que la sustancia bioactiva está "adsorbida" o "cargada" en la hidroxiapatita, y también es equivalente a decir que la hidroxiapatita es un vehículo de sustancias bioactivas.
"Extracto vegetal", en la presente invención, pretende referirse a una mezcla de sustancias naturales derivadas del tratamiento mecánico o químico de diversas partes de las plantas, principalmente las semillas, pero también los frutos (en particular la cáscara o la piel de los frutos) y otras partes de las plantas (p. ej. las hojas). Los extractos vegetales según la invención se preparan preferiblemente mediante el uso de un método químico para el tratamiento de las semillas, flores, hojas, frutos (en particular la cáscara o la piel de los frutos) (u otras partes de las plantas) con una disolución alcohólica y/o hidroalcohólica, y después se elimina el disolvente para obtener un polvo higroscópico. Los extractos vegetales de la invención se pueden usar en forma de un polvo o en forma de una disolución alcohólica o hidroalcohólica. "Sustancia bioactiva", en la presente invención, pretende referirse a las sustancias que tienen una actividad nutricional y/o una actividad fitosanitaria. "Tratamiento fitosanitario" o "actividad fitosanitaria" pretende referirse al tratamiento o la prevención de enfermedades de las plantas provocadas por parásitos tales como criptógamas, bacterias, hongos, fitoplasmas e insectos.
"Tratamiento nutricional" o "actividad nutricional" pretende referirse a las sustancias bioactivas que ayudan en el desarrollo de las defensas naturales de las plantas (y por tanto ayudan a las plantas a luchar contra las enfermedades), manteniendo la planta en el mejor equilibrio nutricional, requisito fundamental para prevenir el desarrollo de cualquier enfermedad.
La sustancia bioactiva usada en la invención puede tener tanto una actividad fitosanitaria como una actividad nutricional, y por tanto se puede usar tanto para el tratamiento fitosanitario como para el tratamiento nutricional de las plantas, dependiendo de la dosis usada.
La presente invención se refiere al uso de hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con una sustancia bioactiva para el tratamiento fitosanitario y/o para el tratamiento nutricional de plantas, en particular vides. La invención es adecuada para el tratamiento de todo tipo de plantas, especialmente para el tratamiento de vides. Otras plantas que se pueden tratar según la invención son: tomatera (Solanum lycopersicum), trigo (género Triticum), peral (género Pyrus), manzano (Malus domestica), olivo (Olea europaea), kiwi (género Actinia) y hortalizas, tales como lechuga, espinaca, cucurbitáceas (por ejemplo melón, pepino, calabaza y sandía), cebolla, puerro, guisantes.
Las enfermedades preferidas tratadas con el producto de la invención son: mildiú lanoso (provocado por Plasmopara viticola), mildiú polvoroso (provocado por Erysiphe nectar), moho gris (provocado por Botrytis cinerea), podredumbre negra (provocada por Guignardia bidwellii), agalla de la corona de la vid (provocada por Agrobacterium vitis), enfermedades de la madera de la vid o yesca (provocada por Botryosphaeriaceae, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum, Fomitiporia mediterranea), tizón tardío del tomate (provocado por Phytophthora infestans), fusariosis de la espiga de trigo (provocada por Fusarium graminearum y Fusarium culmorum), sarna del manzano (provocada por Venturia inaequalis), sarna del peral (provocada por Venturia pirina), mancha marrón de las peras (provocada por Stemfylium vesicarium), mildiú de la lechuga (provocado por Bremia lactucae), mildiú de la espinaca (provocado por Peronospora spinaceae), mildiú de las cucurbitáceas (provocado por Pseudoperonospora cubensis en melón, pepino, calabaza y sandía), mildiú de la cebolla (provocado por Peronospora schleideni), mildiú del puerro (provocado por Phytophtora porri), mildiú del guisante (provocado por Peronospora pisi), enfermedades provocadas por los insectos: polillas de la vid (Eupoecilia ambiguella) y cochinilla harinosa de la vid (Planococcus ficus).
La hidroxiapatita de la invención está sustituida con al menos un ión carbonato (y ningún otro ión metálico), y tiene la siguiente fórmula:
Ca(10)(PO4)(6-y)(CO3)y (OH)2
en donde y está comprendido entre 0,002 y 2.
La sustitución con carbonato puede ocupar el sitio B (iones fosfato PO43-) según las fórmulas generales anteriores.
En las estructuras de hidroxiapatita consideradas en la presente invención, la sustitución está en el sitio B, con un porcentaje de carbonato que ocupa el sitio B que es mayor o igual al 55% en peso, incluso más preferiblemente comprendido entre el 90 y 100% en peso del peso total de carbonato contenido en la hidroxiapatita.
El contenido total de carbonato en la hidroxiapatita según la invención puede ser del 1 al 20%, preferiblemente del 5 al 15% en peso de la estructura de hidroxiapatita total.
El ión carbonato, en el sitio B, es muy significativo ya que permite que la estructura completa de hidroxiapatita incremente su solubilidad en un medio biológico.
Según una realización preferida, la hidroxiapatita sustituida con carbonato anterior tiene un grado de cristalinidad comprendido entre el 25 y 75%, preferiblemente entre el 25 y 40%.
Preferiblemente, la hidroxiapatita sustituida con carbonato está en forma de partículas menores de 2 pm, preferiblemente de un tamaño entre 0,2 y 0,9 pm. Las partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato preferiblemente se unen entre sí para crear agregados de partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato (también denominadas en esta solicitud "agrupamientos" o "cristales" o "microcristales" o "agregados microcristalinos", y todos estos términos tienen el mismo significado que "agregados" según la invención). Estos agregados tienen dimensiones micrométricas, con un tamaño comprendido entre 0,5 y 25 pm, más especialmente entre 0,5 y 5 pm, y tienen un área superficial significativa. En particular, los agregados de hidroxiapatita sustituida con carbonato útiles según la presente invención tienen un área superficial comprendida entre 60 y 120 m2/g, más especialmente entre 70 y 90 m2/g.
Los agregados de hidroxiapatita sustituida con carbonato tienen la ventaja de tener un área superficial mayor con respecto a las partículas simples de hidroxiapatita sustituida con carbonato, y por lo tanto permiten adsorber más sustancias bioactivas y controlar su liberación al medio. Por tanto, para una pequeña cantidad de hidroxiapatita sustituida con carbonato, es posible transportar un número significativo de sustancias bioactivas, lo que permite incrementar adicionalmente la actividad y la eficacia biológica de las sustancias.
Las sustancias bioactivas adsorbidas en la hidroxiapatita sustituida con carbonato de la invención se eligen de iones metálicos tales como Mn, Mg, K, Fe, B (que actúan como fertilizantes y elementos nutricionales), y extractos de origen vegetal, tales como extractos de: lignina, menta, tomillo, romero, sésamo, soja, clavo, ajo, limón, canela, Abies sibirica, Malpighia glabra, Achillea millefolium, Allium sativum, Medicago sativa, Aloe vera, Citrus sinensis, Artemisia annua, Arnica Montana, Ocimum basilicum, Betula pendula, Betula pubescens, Calendula officinalis, Matricaria chamomilla, Chamaemelum nobile, Cinnamomum verum, Centella asiatica, Chelidonium majus, Syzygium aromaticum, Allium cepa, Equisetum arvense, Curcuma longa, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia, Eucalyptus globulus,
Hypericum perforatum, Fucus vesiculosus, Gentiana lutea, Lavandula angustifolia, Citrus limon, Melilotus officinalis, Melissa officinalis, Punica granatum, Mentha piperita, Vaccinium myrtillus, Orthosiphon stamineus, Urtica dioica, Olea europeae, Tabebuia impetiginosa, Plantago lanceolata, Hieracium pilosella, Pinus sibirica, Polypodium leucotoms, Citrus paradise, Quassia amara, Rheum Thais, Rosa canina, Rosmarinus officinalis, Ruscus aculeatus, Salix alba, Salvia officinalis, Camelia sinensis, Tilia tomentosa, Thymus vulgaris, Arctostaphylos uva-ursi, Valeriana officinalis, Solidago virgaurea, Loranthus europaeus, Zingiber officinale.
Los extractos vegetales pueden tener tanto actividad nutricional como actividad antiparasitaria moderada.
Las moléculas bioactivas se adsorben sobre la hidroxiapatita sustituida con carbonato, y por tanto se obtiene una hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia activa.
La absorción de tales sustancias sobre la hidroxiapatita sustituida con carbonato se puede llevar a cabo mediante todos los procesos conocidos para una persona experta en la técnica. El agregado de hidroxiapatita sustituida con carbonato cristalizada tiene una zona interna que es puramente cristalina y una zona periférica externa con cargas eléctricas que no son completamente neutras, lo que permite que se retengan las sustancias bioactivas.
En el caso de la adsorción de Mn, Mg, K, Fe, B sobre la hidroxiapatita sustituida con carbonato, la adsorción se puede obtener:
- para Mn partiendo de: Sulfato de manganeso.
- para Mg partiendo de: Sulfato de magnesio, óxido de magnesio.
- para K partiendo de: Cloruro de potasio, sulfato de potasio.
- para Fe partiendo de: Sulfato de hierro.
- para B partiendo de: Ácido bórico.
Para el uso según la invención, la hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia bioactiva preferiblemente se integra en una composición, preferiblemente en forma de agregados microcristalinos. Esta composición puede estar en todas las formas, en particular polvo, gránulos, líquido o gel. Según una realización preferida, los agregados de hidroxiapatita sustituida con carbonato se dispersan de una manera uniforme en agua. El pH de la composición en forma líquida es preferiblemente mayor de 5 para prevenir que los microcristales de hidroxiapatita sustituida con carbonato experimenten una hidrólisis parcial o total.
Tal composición líquida permite la aplicación foliar, en particular mediante pulverización. La estructura y el tamaño micrométrico de los cristales de hidroxiapatita permiten una dispersión uniforme de los cristales de hidroxiapatita sustituida con carbonato dentro del volumen de las gotículas micronizadas durante la pulverización, y por tanto permite una buena distribución en el volumen total usado para la aplicación, y por lo tanto una distribución más uniforme sobre la superficie de aplicación. Según el tipo de atomizador usado para la aplicación de la hidroxiapatita sustituida con carbonato, es posible obtener gotículas cuyo diámetro varía entre 50 y 800 gm. Para evitar o limitar el desplazamiento de las gotículas muy pequeñas y la descarga de las gotículas muy grandes, y para garantizar una mejor aplicación sobre la superficie a tratar, es posible usar medios de pulverización que permitan obtener gotículas de tamaños entre 150 y 250 gm.
Una vez aplicadas, las partículas agregadas se adhieren a la hoja sin la necesidad de usar agentes anti desprendimiento en la composición. De hecho, según su superficie, su tamaño, sus irregularidades morfológicas y sus características electrostáticas, los cristales de hidroxiapatita sustituida con carbonato se adhieren a la superficie de las hojas, y por tanto aseguran una resistencia de adhesión óptima contra las escorrentías, a diferencia de los productos existentes actualmente que son arrastrados por la lluvia o el rocío.
El uso de las composiciones, aplicadas por hectárea, se debe adaptar según las condiciones climáticas existentes, la estación y las estrategias de protección y nutrición de la tierra. A modo de ejemplo para un viñedo, un ejemplo adecuado de uso corresponde a una cantidad de agua usada del orden de 250 l/ha para plantas completamente desarrolladas, con una densidad del orden de 4000 tocones/ha, a una concentración variable, formulada del 2,5 al 5% de partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato en peso con respecto al peso total de la composición líquida.
Una vez aplicadas a la planta, las moléculas bioactivas se pueden liberar directamente o los microcristales de hidroxiapatita sustituida con carbonato pueden transportar estas sustancias a los espacios intercelulares. Las moléculas bioactivas se liberan por tanto mediante hidrólisis, cerca de los objetivos, en particular cerca de parásitos objetivo tales como hongos y bacterias.
De hecho, los agregados microcristalinos de hidroxiapatita sustituida con carbonato penetran en la planta según la difusión pasiva tras la descarga de fluidos, tales como dióxido de carbono y agua, a través de las aberturas naturales de los tejidos de la planta. Dentro de la planta, la hidroxiapatita sustituida con carbonato se comporta como un "solgel": no se estanca en un medio líquido, se mueve en el xilema y el floema siguiendo la linfa circulante. Por lo tanto, no existe riesgo de acumulación en la planta. Cuando la hidroxiapatita sustituida con carbonato encuentra un patógeno, el agregado se descompone, ya que la pared más ácida del microorganismo estimula la disolución y la liberación de
las sustancias bioactivas, que por lo tanto pueden actuar contra el patógeno.
Las moléculas bioactivas (por ejemplo, fósforo, calcio y carbonato) siguen el flujo linfático y ejercen su actividad en particular como fertilizantes para mejorar el desarrollo de la planta y/o para reforzar sus defensas naturales. A diferencia de los métodos convencionales, no existe por lo tanto ninguna acción sobre las rutas metabólicas intracelulares, sino una acción de contacto entre los elementos funcionales de los agregados de hidroxiapatita y los patógenos a nivel intercelular o en la superficie de las plantas.
Las sustancias bioactivas pueden actuar por lo tanto cuando se pulverizan sobre la superficie, pero también en profundidad en el núcleo de los tejidos vegetales tratados.
La hidroxiapatita sustituida con carbonato cargada con al menos una sustancia bioactiva también se puede usar para la aplicación sobre el tronco, sobre la madera de las plantas o sobre sus raíces, según el objetivo de la aplicación. Las partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato se cargan con al menos una sustancia bioactiva. En otras palabras, las partículas (o agregados) de hidroxiapatita sustituida con carbonato comprenden sustancias bioactivas adsorbidas en ellas. Las sustancias bioactivas son las enumeradas anteriormente.
Los agregados de partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato tienen un tamaño comprendido entre 0,5 y 25 gm, preferiblemente comprendido entre 0,5 y 5 gm.
Una composición que comprende al menos una partícula de hidroxiapatita sustituida con carbonato o al menos un agregado de partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato según la invención se carga con sustancias bioactivas. Preferiblemente, tal composición comprende entre el 5 y 70% en peso de partículas y/o agregados de hidroxiapatita sustituida con carbonato con respecto al peso total del material seco de la composición, incluso más preferiblemente entre el 6 y 60%.
La invención se ilustra a continuación mediante ejemplos de procesos de fabricación, ejemplos de composición y ejemplos de uso.
Ejemplo de fabricación 1
La hidroxiapatita sustituida con carbonato se sintetiza mezclando ácido fosfórico con una composición que comprende hidróxido cálcico y carbonato cálcico previamente dispersados en una cantidad adecuada de agua.
La reacción requiere alrededor de 12 a 48 horas, más en particular alrededor de 15 a 30 horas. T ras la suspensión de los microcristales, se añade una suspensión de extractos vegetales tales como extractos de menta, tomillo, romero, clavo, canela, limón y ajo, previamente disueltos en una cantidad adecuada de agua.
Una vez que se combinan estas dos disoluciones, se mezclan para permitir la adsorción de los extractos vegetales en la hidroxiapatita sustituida con carbonato.
La adsorción de la disolución de cobre requiere alrededor de 12 a 72 horas, más en particular de 24 a 60 horas. Ejemplo de fabricación 2
La hidroxiapatita sustituida con carbonato se sintetiza mezclando ácido fosfórico con una composición que comprende hidróxido cálcico y carbonato cálcico, previamente dispersados en una cantidad adecuada de agua.
La reacción requiere alrededor de 12 a 48 horas, más en particular alrededor de 15 a 30 horas.
Tras la suspensión de los microcristales, se añade una formulación de microelementos tales como ácido bórico y óxido de magnesio dispersados en un volumen adecuado de agua.
Una vez que se combinan estas dos disoluciones, se mezclan para permitir la adsorción de los iones metálicos en la hidroxiapatita sustituida con carbonato.
La reacción requiere alrededor de 2 a 10 horas, más en particular alrededor de 4 a 6 horas.
Ejemplo de fabricación 3
La hidroxiapatita sustituida con carbonato se sintetiza mezclando ácido fosfórico con una composición que comprende hidróxido cálcico y carbonato cálcico, previamente dispersados en una cantidad adecuada de agua.
La reacción requiere alrededor de 12 a 48 horas, más en particular alrededor de 15 a 30 horas. T ras la suspensión de los microcristales, se añade una suspensión de extractos vegetales tales como el extracto alcohólico o hidroalcohólico (en forma de polvo higroscópico) de Citrus paradisi, Loranthus europaeus, Medicago sativa y Solidago virgaurea, dispersados en un volumen adecuado de agua.
Una vez que se combinan estas dos disoluciones, se mezclan para permitir la adsorción de los extractos en la
hidroxiapatita sustituida con carbonato.
La reacción requiere alrededor de 2 a 10 horas, más en particular alrededor de 4 a 6 horas.
Ejemplos de composiciones
Una composición basada en selenio puede comprender la siguiente formulación:
- 10% de hidroxiapatita de selenio (hidroxiapatita sustituida con carbonato con iones selenio adsorbidos en ella) - 83% de agua destilada
- 1 % de goma de xantano
- 4% de glicerina
- 2% de ácido benzoico
Una composición basada en boro puede comprender la siguiente formulación:
- 10% de hidroxiapatita de boro (hidroxiapatita sustituida con carbonato con iones boro adsorbidos en ella) - 83,5% de agua destilada
- 1 % de goma de xantano
- 4% de glicerina
- 1,5% de ácido benzoico
Una composición según la invención también puede ser una composición que comprende una mezcla de las dos composiciones descritas previamente.
Ejemplo de uso
Para optimizar las propiedades funcionales y la estabilidad estructural de las composiciones líquidas que comprenden las partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato, se puede implementar un uso según las siguientes recomendaciones en particular:
- Agitar la composición antes del uso para volver a poner las partículas y/o los agregados de partículas en suspensión en la composición;
- Usar un atomizador que asegura la humectación completa y uniforme de la vegetación y que previene los volúmenes demasiado bajos o demasiado altos;
- Usar cantidades de agua que oscilan de 60 L/ha a 250 L/ha en plantas completamente desarrolladas, lo que evita las cantidades excesivas de agua que crean escorrentías;
- Reducir la cantidad de producto por hectárea en caso de aplicación manual;
- Controlar el pH de la disolución en agua de forma que sea mayor de 5.
Ejemplos A
Ensayos experimentales con enfermedades de la vid
1. Introducción
Se ensayaron varias formulaciones basadas en hidroxiapatita sustituida con iones carbonato y/o cobre y/o zinc, y cargada con extractos vegetales in vitro contra patógenos de la vid.
2. Agalla de la corona de la vid (Agrobacterium vitis)
Se determinó la eficacia biológica de los agentes de ensayo desde el punto de vista de la inhibición del crecimiento. Para este fin, se cultivaron in vitro 6 cepas de Agrobacterium vitis de diferentes áreas de cultivo de todo el mundo. Las cepas de A. vitis se inocularon en placas Petri que contuvieron PDA (agar de dextrosa de patata), en la proporción de aproximadamente 10 a 8 células. Después de colocar en las placas las bacterias, se taladraron 5 orificios (6 mm) en el sustrato (uno en el centro de la placa y 4 espaciados igualmente alrededor del orificio central). Cada placa se rellenó con 20 microlitros de la sustancia de ensayo a las concentraciones indicadas; para cada sustancia y concentración se establecieron 3 réplicas. El orificio central se rellenó con 20 microlitros de agua estéril, que representó el control sin tratar. Las placas se incubaron a 28 °C durante 2-5 días.
Tras la finalización del periodo de incubación, para cada cepa ensayada y para cada sustancia y concentración, se consideraron los diámetros de las zonas inhibitorias (media de dos diámetros ortogonales de cada área inhibitoria). Los datos recogidos se sometieron al análisis de la varianza ANOVA y a la comparación de las medias con una prueba SNK. En el primer ensayo, se compararon las eficacias biológicas de los siguientes tratamientos:
• NT - Control (agua): no se inhibió el crecimiento.
• CA - Hipoclorito Sódico (3% v/v): se inhibió completamente el crecimiento.
• C1: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10, obteniendo el efecto más similar al Agente de Control.
• C9: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10, obteniendo un efecto similar al de C1. La concentración más alta no es significativamente diferente de la concentración más alta de C1.
Véase la Fig. 1 para una vista esquemática de los resultados.
En el segundo ensayo, se compararon las eficacias biológicas de los siguientes tratamientos:
• NT - Control (agua): no se inhibió el crecimiento.
• CA - Hipoclorito Sódico (3% v/v): se inhibió completamente el crecimiento.
• C2: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10. La concentración más alta no es significativamente diferente de la concentración más alta de C3 y C7. •
• C3: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10. La concentración más alta no es significativamente diferente de la concentración más alta de C3 y C7.
• C4: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10.
• C5: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10.
• C6: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10.
• C7: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10. La concentración más alta no es significativamente diferente de la concentración más alta de C2 y C3.
• C8: se inhibió el crecimiento aumentando el % de 1 a 10.
Véase la Fig. 2 para una vista esquemática de los resultados.
2. Moho gris ( Botrytis cinerea )
La evaluación de la eficacia biológica de los agentes de ensayo contra Botrytis cinerea se llevó a cabo solamente en laboratorio mediante un ensayo in vitro. Para este fin, se sumergieron varios portaobjetos de microscopio en un vaso de precipitados que contenía medio de agar agua y después se colocaron en placas Petri.
El inóculo de los conidios se preparó seleccionando tres cultivos (placas Petri) de Botrytis cinerea: Se vertieron 10 ml de agua destilada en cada placa Petri y se extendieron mediante una espátula sobre toda la superficie del micelio. La suspensión de conidios obtenida se filtró a través de un tubo de plástico estéril relleno de fibra de vidrio para separar las partes del micelio de los conidios. La concentración de conidios se ajustó a 1*106 conidios/ml (mínimo) mediante un recuento en una cámara Thoma® al microscopio (aumento 40x), y finalmente se ajustó mediante dilución con agua destilada. Una vez que el medio de agar agua se solidificó sobre los portaobjetos de microscopio, se colocaron 50 pl de la suspensión de conidios en cada portaobjetos de microscopio, sobre lo que se añadieron 50 pl de la disolución que representó cada factor (agua, agente de comparación y agente de ensayo) en la superficie del agar. Finalmente, los portaobjetos de microscopio se cubrieron con cubreobjetos. Se prepararon seis placas Petri por cada factor. Las placas Petri se incubaron en una cámara húmeda a 25 °C (intervalos día/noche 12/12). Después de 48 horas se observaron al microscopio (aumento 40x). Se determinó la eficacia biológica de los agentes de ensayo desde el punto de vista de la germinación de los conidios, evaluando la proporción entre los conidios no germinados (inactivos o degenerados) y los conidios germinados (activos que habían producido el tubo germinativo) de cien conidios. En el primer ensayo, se compararon las eficacias biológicas de los siguientes tratamientos después de 20 horas:
• Control (agua): se observó un número absoluto muy alto de conidios germinados.
• Switch® (es decir, Ciprodinil y Fludioxonil) (0,194% p/v): se observó un número absoluto bajo de conidios germinados;
• C1: se observó un número absoluto muy bajo de conidios germinados, el efecto más similar al Agente de Control.
• C9: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
Véase la Fig. 3 para una vista esquemática de los resultados.
En el segundo ensayo, se compararon las eficacias biológicas de los siguientes tratamientos después de 20 horas:
• Control (agua): se observó un número muy alto de conidios germinados;
• Switch® (es decir, Ciprodinil y Fludioxonil) (0,194% p/v): se observó un número bajo de conidios germinados;
• C2: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
• C3: se observó un número absoluto muy bajo de conidios germinados, el efecto más similar al Agente de Control.
• C4: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
• C5: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
• C6: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
• C7: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
• C8: se observó un número absoluto bajo de conidios germinados.
Véase la Fig. 4 para una vista esquemática de los resultados.
3. Yesca o enfermedad de la madera de la vid
Se ensayaron in vitro muestras constituidas por agua y basadas en hidroxiapatita con carbonato (HCA) cargadas con extractos vegetales contra los patógenos relacionados con la yesca: Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum, Fomitiporia mediterranea.
El protocolo consistió en el crecimiento de los patógenos en un medio adecuado (PDA, Difco) como una muestra sin tratar, y el mismo medio con 3 concentraciones diferentes de los agentes de ensayo, al 1,2%, 2,4% y 4,8%; y el mismo medio con caldo bordelés basado en cobre (p.a. 0,02%) como agente de comparación.
El primer día (0) se inoculó cada patógeno colocando una colonia (0,5 cm de diám.) en el centro de placas Petri (6 cm de diám.) que contenían el medio ya preparado con los agentes de ensayo. Las placas Petri se cerraron con Parafilm y se colocaron en una cámara de incubación a 22 ± 1 °C alternando luz/oscuridad durante el periodo de incubación. Por cada patógeno se prepararon 11 placas Petri (3 muestras x 3 concentraciones 2 controles) y por cada uno de ellos, 10 réplicas.
Se realizó la medida del diámetro de la colonización semanalmente. Deduciendo respecto de estos valores, siendo el valor nominal de 0,5 cm correspondiente a la colonia inicial inoculada, se obtuvo el crecimiento efectivo de las colonias. Se calculó el índice de eficacia por cada producto considerando el crecimiento efectivo de las colonias fúngicas,
aplicando la fórmula siguiente:
donde muestra 1 = control
En las Tablas 1, 2 y 3 se resumen las medidas del crecimiento de las colonias, basándose en el diámetro de crecimiento de cada patógeno tras el periodo de incubación en el medio PDA sin ningún agente y con la adición de cada agente de ensayo a 3 concentraciones diferentes, y el agente de comparación. A su lado, se informan los valores de la eficacia.
En la Tabla 1 se enumera el diámetro medio y el valor de la eficacia para Fomitiporia mediterranea después de 7 y 14 días de incubación.
Todos los agentes de ensayo mostraron una acción inhibidora sobre el crecimiento fúngico a todas las concentraciones ensayadas y durante todo el periodo de incubación.
Tabla 1. Diámetros (diám.) en cm, de la colonia de Fomitiporia mediterranea (Fm) en PDA que contuvo los 3 agentes de ensayo a 3 concentraciones, 1,2%, 2,4% y 4,8%; detectando, después de 7 días y 14 días de incubación, la eficacia (E) en %. Como agentes de control se usaron PDA sin ningún agente y PDA con un agente basado en cobre al 0,02% p.a.
En la Tabla 2 se enumera el diámetro medio y el valor de la eficacia para Phaeomoniella chlamydospora (Pch) después de 7, 14 y 21 días de incubación.
Todos los agentes de ensayo han inhibido completamente el crecimiento fúngico después de 7 días de incubación. Todos los agentes de ensayo fueron eficaces al 100% contra Phaeomoniella chlamydospora (Pch) a la concentración del 4,8%.
Tabla 2. Diámetros (diám.) en cm de una colonia de Phaeomoniella chlamydospora (Pch) en PDA que contenía los 3 agentes de ensayo a 3 concentraciones de 1,2%, 2,4% y 4,8%; detectando, después de 7, 14 y 21 días de incubación, la eficacia (E) en %. Como agentes de control se usaron PDA sin ningún agente y PDA con un agente basado en cobre al 0,02% p.a.
En la Tabla 3 se enumera el diámetro medio y el valor de la eficacia para Phaeoacremonium aleophilum (Pal) después de 14, 21 y 28 días de incubación.
Tabla 3. Diámetros (diám.) en cm, de una colonia de Phaeoacremonium aleophilum (Pal) en PDA que contenía los 3 agentes de ensayo a 3 concentraciones de 1,2%, 2,4% y 4,8%; detectando, después de 7, 14, 21 y 28 días de incubación, la eficacia (E) en %. Como agentes de control se usaron PDA sin ningún agente y PDA con un agente basado en cobre al 0,02% p.a.
En conclusión, las tres muestras ensayadas, C3, C1, C9, mediante el presente ensayo in vitro, fueron eficaces contra los tres patógenos fúngicos relacionados con la yesca de la vid (GTD), inhibiendo su crecimiento en la mayoría de los casos en comparación.
Ejemplos B
Ensayos experimentales con enfermedades de la vid
1. Introducción
Se ensayaron varias formulaciones basadas en hidroxiapatita sustituida con iones carbonato y/o cobre y/o zinc, y funcionalizada con extractos vegetales in vitro e in vivo contra patógenos de la vid.
2. Moho gris ( botrytis cinerea) y yesca o enfermedad de la madera de la vid
Se ensayaron in vitro muestras constituidas por agua y basadas en hidroxiapatita con carbonato (HCA) cargadas con extractos vegetales contra los patógenos relacionados con la yesca y el moho gris: Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum, Botrytis cinerea. El protocolo consistió en el crecimiento de los patógenos en un medio adecuado (MEA - agar de extracto de malta) como una muestra sin tratar, y el mismo medio con 4 concentraciones diferentes de los agentes de ensayo, al 0,6%, 1,2%, 2,4% y 4,8.
Se midió el crecimiento fúngico, en la dirección diametral, desde el punto de inoculación. La medida se expresó en mm. Dada la diferencia excesiva de crecimiento de los tres hongos ensayados, las medidas se agruparon de manera distinta: Botrytis cinerea, con un crecimiento rápido, se monitorizó cada 24 horas durante los primeros cinco días, al final de lo cual el control había rellenado completamente la placa, mientras Phaeoacremonium aleophilum y Phaeomoniella chlamydospora se observaron cada 7 días durante cuatro semanas (a los 7, 14, 21 y 28 días).
Restando a los valores el valor diametral de 0,7 mm, correspondiente al inóculo inicial, se determinó el crecimiento real de la colonia; sin embargo, la eficacia del producto individual se calculó observando (Moghaddam et al, 2014) el porcentaje de inhibición del crecimiento en comparación con el control (abreviado % IC), mediante la fórmula:
% IC = [Valor de crecimiento de la muestra inoculada - Valor de crecimiento del control] / Valor de crecimiento del control
Para mejorar la información sobre los datos relacionados con el efecto de estos tratamientos, se sometieron a análisis de la varianza (ANOVA) y se ensayó la significación de las diferencias entre las medias de los tratamientos mediante la prueba HSD de Tukey. El paquete usado para el análisis estadístico de los resultados fue la versión 10 desarrollada por StatSoft Inc., Tulsa, OK 74104, EE.UU.
Resultados con MOHO GRIS (Botrytis cinerea) - Figuras 5A-D
El tratamiento con C8 muestra un efecto inhibitorio estadísticamente significativo a partir del 2° día a todas las concentraciones. La muestra C4 mostró un control similar al extracto previo, y también muestra en este caso inhibir el crecimiento del hongo por encima del 40%.
El tratamiento C6 también muestra un efecto inhibitorio a partir del 2° día. El tratamiento con C3 demuestra tener un efecto inhibitorio del crecimiento ya en el 2° día a todas las concentraciones, a diferencia de los tratamientos previos. Se observa que los tratamientos C5 y C7 tienen un efecto inhibitorio sobre el hongo, es decir, como en el caso C7, estadísticamente significativo en el 2° día. El tratamiento C2 inhibe significativamente el hongo a partir del 3er día.
Resultados con YESCA (Phaeomoniella chlamydospora) - Figuras 6A-D
El tratamiento C8 tiene un efecto inhibitorio, a las concentraciones muy altas, ya en el día 7. Este efecto se incrementa con el tiempo, para la concentración del 1,2%, en el día 2, al 27%. C4 y C6 muestran un efecto probiótico, inmediatamente observado en el día 7, que tiende a disminuir durante el día 21 del ensayo. Sobre el tratamiento C3, en el 28° día, tiene un efecto inhibitorio, que también supera el 40%, a las concentraciones del 4,8%, 1,2% y 0,6%. El tratamiento C7 muestra una tendencia similar al tratamiento previo. El tratamiento C5 mostró un desarrollo igual en los primeros 14 días, y el efecto de inhibición se observó solamente a las concentraciones más altas del 4,8% y 2,4%. El tratamiento C2 mostró un efecto inhibitorio de alrededor del 5% al final del cultivo que pudo indicar un efecto a largo plazo. Globalmente, los tratamientos revelaron un efecto probiótico en un periodo corto de tiempo, seguido después de una inhibición progresiva de los hongos en un periodo largo de tiempo: esto confirma el papel nutracéutico del extracto vegetal, aquí amplificado por la combinación con HCA.
Resultados con YESCA (Phaeoacremonium aleophilum) - Figuras 7A-D
El tratamiento C8 reveló un efecto probiótico a partir del día 14 a las concentraciones muy altas, en el día 21, mientras
al 1,2% se informó de un efecto inhibitorio constante. También se informó de la misma tendencia mediante los tratamientos C4 y C6, a la concentración del 0,6%. Para el tratamiento C3, la concentración del 0,6% se aparta de las otras, lo que supone una inhibición inicial que después se transforma en un efecto probiótico. La concentración del 1,2%, del tratamiento C7, inhibe el hongo hasta un 56% de IC en el día 14, mientras el tratamiento C5, a una concentración del 0,6%, tiene un efecto inhibitorio inmediatamente, pero que tiende a disminuir a lo largo del tiempo. Sobre el tratamiento C2, se observa que todas las concentraciones inducen un efecto probiótico que se incrementa hasta los 21 días, tras lo cual las concentraciones más altas disminuyen este efecto. Como se informó para Phaeomoniella chlamydospora, el efecto probiótico general a corto plazo observado para las concentraciones altas de los tratamientos confirma el papel nutracéutico de los extractos vegetales en el control del crecimiento de los hongos en el periodo a largo plazo, sin destruir la célula fúngica (como ocurre con algunos fungicidas sintéticos) pero interfiriendo con su fertilidad a lo largo del tiempo.
3. Mildiú lanoso (Plasmopara viticola)
Se ensayaron muestras constituidas de agua y basadas en hidroxiapatita con carbonato (HCA) cargada con varias sales de cobre (sulfato, sulfato tribásico, oxicloruro, hidróxido), sulfato de zinc y extractos vegetales in vivo contra Plasmopara viticola.
Se llevó a cabo el ensayo en invernadero para evaluar la eficacia protectora de los agentes de ensayo aplicados a una concentración del 1% v/v. Para llevar a cabo este ensayo, se emplearon 6 vides enmacetadas por cada tratamiento: control (agua), agente de comparación y agentes de ensayo.
Las vides enmacetadas se seleccionaron por una altura adecuada, buen estado de salud y número de hojas desplegadas (mínimo cinco). Se prepararon para el tratamiento atando el brote justo por encima de las primeras cinco hojas elegibles para la evaluación final de la enfermedad.
En el día "1" las vides enmacetadas se trataron con un rociador manual y después de 24 horas se llevó a cabo la inoculación del patógeno fúngico en las plantas tratadas. El inóculo se preparó recogiendo hojas con síntomas recientes y prominentes de Plasmopara viticola de vides enmacetadas infectadas cultivadas en el invernadero. Las hojas infectadas se lavaron con agua, pulverizada manualmente sobre la superficie inferior, para conseguir una disolución acuosa rica en esporangios. La concentración de esporangios se ajustó en una cámara Thoma® al microscopio (aumento 40x), a 1*106 esporangios/ml (mínimo). La suspensión de esporangios se pulverizó manualmente sobre las plantas tratadas teniendo cuidado de humedecer homogéneamente la superficie inferior de las cinco hojas por debajo del punto de atadura del brote.
Tras la inoculación, la mesa con las vides enmacetadas se cubrió con una lona de plástico negro y se dejaron en el sótano durante el primer día de incubación. Para evaluar la eficacia curativa de los agentes de ensayo, la inoculación con P. viticola se llevó a cabo el primer día, y después de 24 horas de incubación se llevaron a cabo los tratamientos (una vez que la superficie de las hojas estuvo lo más seca posible). El tercer día, las plantas tratadas, inoculadas e incubadas se descubrieron y se transfirieron y se cultivaron en el invernadero en condiciones de cultivo controladas.
El octavo día, las vides enmacetadas se humedecieron abundantemente, pulverizando agua sobre el follaje, y después, se cubrieron de nuevo con una lona de plástico negro y se transfirieron al sótano para favorecer la esporulación.
Después de 24 horas, las plantas se descubrieron. Se determinó la gravedad de la enfermedad observando las cinco hojas por debajo del punto de atadura del brote en cada vid enmacetada.
Para mejorar la información sobre los datos relacionados con el efecto de estos tratamientos, se sometieron a análisis de la varianza (ANOVA) y se ensayó la significación de las diferencias entre las medias de los tratamientos mediante la prueba HSD de Tukey. El paquete usado para el análisis estadístico de los resultados fue la versión 10 desarrollada por StatSoft Inc., Tulsa, OK 74104, EE.UU.
Resultados con MILDIÚ LANOSO (Plasmopara viticola) - Figuras 8A-D
Como se informó en las Figuras 4, el ensayo se consideró sumamente significativo debido a la alta expresión de la enfermedad en el control.
La HCA pura no interfirió significativamente con el crecimiento fúngico, incluso en valor absoluto, el tratamiento MS mostró una gravedad inferior de la enfermedad que el control.
Mientras la HCA con cada una de las cuatro sales de cobre combinadas con sulfato de zinc y extractos vegetales revelaron un buen control del crecimiento fúngico: la gravedad de la enfermedad fue especialmente baja en las plantas tratadas con T1 y T2. Ambas también mostraron la incidencia más baja de la enfermedad en comparación con el agente de control (Coprantol®). La enfermedad se controló parcialmente mediante T3 y T4.
Globalmente, el ensayo reveló un rendimiento muy bueno para T1 y T2 en el control de Plasmopara viticola, en el ensayo in vivo.
Claims (7)
1. El uso de una hidroxiapatita sustituida con carbonato que tiene la siguiente fórmula:
Ca(10)(PO4)(6-y)(CO3)y (OH)2
en donde y está comprendido entre 0,002 y 2, en combinación con al menos una sustancia bioactiva seleccionada del grupo que consiste en un ión de Mn, Mg, K, Fe y B y/o un extracto vegetal seleccionado del grupo que consiste en un extracto de: lignina, menta, tomillo, romero, sésamo, soja, clavo, ajo, limón, canela, Abies sibirica, Malpighia glabra, Achillea millefolium, Allium sativum, Medicago sativa, Aloe vera, Citrus sinensis, Artemisia annua, Arnica Montana, Ocimum basilicum, Betula pendula, Betula pubescens, Calendula officinalis, Matricaria chamomilla, Chamaemelum nobile, Cinnamomum verum, Centella asiatica, Chelidonium majus, Syzygium aromaticum, Allium cepa, Equisetum arvense, Curcuma longa, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia, Eucalyptus globulus, Hypericum perforatum, Fucus vesiculosus, Gentiana lutea, Lavandula angustifolia, Citrus limon, Melilotus officinalis, Melissa officinalis, Punica granatum, Mentha piperita, Vaccinium myrtillus, Orthosiphon stamineus, Urtica dioica, Olea europeae, Tabebuia impetiginosa, Plantago lanceolata, Hieracium pilosella, Pinus sibirica, Polypodium leucotoms, Citrus paradise, Quassia amara, Rheum Thais, Rosa canina, Rosmarinus officinalis, Ruscus aculeatus, Salix alba, Salvia officinalis, Camelia sinensis, Tilia tomentosa, Thymus vulgaris, Arctostaphylos uva-ursi, Valeriana officinalis, Solidago virgaurea, Loranthus europaeus y Zingiber officinale,
en donde la sustancia bioactiva está adsorbida en la hidroxiapatita sustituida, para el tratamiento fitosanitario y/o nutricional de las plantas.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde la hidroxiapatita sustituida con carbonato está en forma de un agregado de partículas de hidroxiapatita sustituida con carbonato, en donde el agregado tiene un tamaño comprendido entre 0,5 y 5 gm.
3. El uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el extracto vegetal está en forma de un polvo o una disolución alcohólica o hidroalcohólica.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la hidroxiapatita sustituida con carbonato en combinación con al menos una sustancia bioactiva está comprendida en una composición en una cantidad del 5-70% con respecto al peso total de material seco de la composición.
5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las plantas son vides, tomatera (Solanum lycopersicum), trigo (género Triticum), peral (género Pyrus), manzano (Malus domestica), olivo (Olea europaea), kiwi (género Actinia) y hortalizas, preferiblemente lechuga, espinaca, cucurbitáceas, cebolla, puerro, guisantes.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la sustancia bioactiva tiene una actividad antiparasitaria, preferiblemente contra criptógamas, bacterias, hongos, fitoplasmas e insectos y/o una actividad nutricional como fertilizante o potenciador del crecimiento.
7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la actividad antiparasitaria de la sustancia bioactiva es para la prevención y el tratamiento del mildiú lanoso (provocado por Plasmopara viticola), mildiú polvoroso (provocado por Erysiphe nectar), moho gris (provocado por Botrytis cinerea), podredumbre negra (provocada por Guignardia bidwellii), agalla de la corona de la vid (provocada por Agrobacterium vitis), enfermedades de la madera de la vid o yesca (provocada por Botryosphaeriaceae, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum, Fomitiporia mediterranea), tizón tardío del tomate (provocado por Phytophthora infestans), fusariosis de la espiga de trigo (provocada por Fusarium graminearum y Fusarium culmorum), sarna del manzano (provocada por Venturia inaequalis), sarna del peral (provocada por Venturia pirina), mancha marrón de las peras (provocada por Stemfylium vesicarium), mildiú de la lechuga (provocado por Bremia lactucae), mildiú de la espinaca (provocado por Peronospora spinaceae), mildiú de las cucurbitáceas (provocado por Pseudoperonospora cubensis en melón, pepino, calabaza y sandía), mildiú de la cebolla (provocado por Peronospora schleideni), mildiú del puerro (provocado por Phytophtora porri), mildiú del guisante (provocado por Peronospora pisi), enfermedades provocadas por los insectos: polillas de la vid (Eupoecilia ambiguella) y cochinilla harinosa de la vid (Planococcus ficus).
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