CN105578883A - 植物免疫系统功能的调节 - Google Patents

Abstract

通过给予包含β-葡聚糖的组合物可以调节植物的免疫功能，其中β-葡聚糖包括未支化的β-(1,3)-葡聚糖。这种未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以获自眼虫藻，包括异养生长的眼虫藻。未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以是以副淀粉的形式和/或可以是藻粉的部分。组合物可以进一步包含肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、它们的组合、以及除了β-葡聚糖之外的一种或多种不同植物免疫系统调节剂。可以相应地改善植物种子、幼苗、成熟植物或收获的植物产品的健康。

Description

植物免疫系统功能的调节

相关申请的引用

本申请要求享有2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/782,254的权益。以上专利申请的全部公开内容通过引用结合于此。

技术领域

本技术涉及未支化的β-(1,3)-葡聚糖、对未支化的β-(1,3)-葡聚糖修饰、及其调节光合生物如陆地植物和水生植物的免疫功能的用途，包括将这种组合物作为叶片喷雾和液体产品向植物提供营养(feed)或施用于收获的植物材料。

背景技术

本部分提供了涉及本公开内容的、并非一定是现有技术的背景信息。

栽培光合陆地植物和水生植物是在整个世界上主要的经济活动，并切为大部分人提供了他们绝大部分的卡路里需求。除了农业生产外，生产许多类型的光合陆地植物和水生植物如花卉用于其他用途。栽培这些光合物种通常会因为植物疾病和病症搞得很复杂，这些疾病和病症可以显著降低农场的生产率。作物收获期间的损坏(例如，水果或块茎上的伤口)是这些疾病或致病性生物可能对生产者产生不利影响的另一时间。因此，农民会使用各种方法限制植物病症和疾病，包括化学处理，这涉及增加成本和破坏环境、当地生物多样性、农民健康和其他消费或与农业产品相互作用的人的潜在的可能。这些化学处理以及基因工程广泛用于改善植物抵抗疾病的能力并作为疾病的治疗方法，但在现代农业中对这些化学处理的过度依赖导致了广泛的耐药性并导致对促进植物的健康免疫功能的更自然的方式的期望。

植物病症可以定义为任何异常的植物生长或发育。受影响的植物不会存活生长至种植者的正常预期并且不能执行正常的生理功能达到最好的遗传潜力。生物病症更通常称为植物疾病并由感染性生物引起。一些最常见的植物疾病是由真菌、细菌、植原体、病毒和类病毒、线虫和寄生性更高等植物引起的。

为了使疾病发生，宿主植物必须对病原体或疾病生物易感。植物和收获的植物材料可能在包括根、叶、花或脉管系统在内的很多部位都易受攻击。在许多情况下，宿主植物必须处于疾病发作的某种生理状态下。例如，一些病原生物只攻击年幼的植物，其他的则攻击成熟或老化的植物，而一些生物可以攻击任何生长阶段的植物。在大多数情况下，病原体会利用应激的和具有削弱的免疫系统的植物。植物暴露于许多已经证明会影响健康、生长、死亡、免疫系统健康和植物整体健康的应激子。应激的源既可以是生物的，如拥挤、疾病和害虫，也可以是非生物的，如极端温度、极端天气、极端潮湿、极短光照、极端养分、贫瘠土壤(例如酸度或碱度、盐)、杀虫剂毒性、空气污染等。

通常，术语免疫可以被定义为生物承受微生物感染或疾病的能力。植物缺乏像大多数脊椎动物一样的自适应免疫系统，但具有基于病原体相关的分子模式(PAMP)的认知的活性先天免疫系统。这些是对某些微生物类独特的保守分子。例如，衍生自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，来自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌二者的肽聚糖，真细菌鞭毛蛋白，未甲基化的细菌DNA片段，以及真菌细胞壁衍生的葡聚糖、甲壳质、甘露聚糖和蛋白，都能够激发先天免疫应答。在植物细胞表面通过触发众多应答的模式识别受体(PRR)识别PAMP，这些应答中一些可以有助于植物削弱疾病或微生物入侵的影响。

尽管术语PAMP被广义地用于描述由免疫系统识别的化合物，但PAMPS也可以衍生自非病原性或非致病性微生物。当非致病性PAMP与植物接触时，植物免疫系统可以被活化，如同它在响应于真实的威胁，从而提高其整体的免疫应答。如果真实的疾病挑战或病原生物正在同时攻击该植物、或可能很快攻击植物，这可以赋予植物更大的保护。

β-葡聚糖是可以在不同生物如酵母、蘑菇、海藻、真菌、谷物谷粒等中发现的由β-糖苷键连接基连接的多糖。虽然已经对用作人膳食补充剂或作为动物饲料成分的β-葡聚糖完成了许多研究，但是使用β-葡聚糖促进植物的免疫系统健康还从未被广泛商业化。当今使用的大多数β-葡聚糖制品都衍生自酵母，并在极小程度上来自于蘑菇，这需要涉及β-葡聚糖提取的昂贵的生产方法。现有β-葡聚糖产品，作为β-葡聚糖是如何产生的和其化学结构的结果，对于用于植物而言太过昂贵。例如，2012年，这种β-葡聚糖的商业价值是约50至约100美元/kg，这个价格是商业上望而却步的。

一个与高成本β-葡聚糖有关的理由是来自酵母的β-葡聚糖是衍生自生物体的细胞壁。因此，用于生产β-葡聚糖的总生物质的所得到的β-葡聚糖含量通常小于百分之十至十五。而且，生物细胞壁中所含的β-葡聚糖一般必须经历昂贵的多级提取方法才能将β-葡聚糖与其他细胞物质分离。另一个问题是β-葡聚糖的化学组成。支化结构、分子量、来源生物和生产及提取方法的变化都可以影响不同β-葡聚糖制品的效力和适用性。例如，酵母来源的β-(1,3/1,6)-葡聚糖含有旨在刺激免疫系统活性的大多数商业β-葡聚糖产品。来自燕麦的β-(1,3/1,4)-葡聚糖已证明是降低胆固醇的有用产品，而仅仅这些类型的β-葡聚糖可以根据FDA法规进行标示。一些生物生产不同的β-葡聚糖结构，而并非所有的β-葡聚糖都同样有效。

发明内容

本技术包括涉及到通过向植物或收获的植物材料给予包含β-葡聚糖的组合物来调节植物的免疫系统功能的系统、方法、制造制品和组合物，其中β-葡聚糖含有未支化的β-(1,3)-葡聚糖。未支化的β-(1,3)-葡聚糖起到了刺激植物或收获的植物材料的免疫系统的PAMP的作用，但是为衍生自非致病性生物体(例如，眼虫藻(Euglena))并可以用于改善植物对感染和疾病的抗性。例如，未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以衍生自眼虫藻，可以是化学或机械修饰的，与另一个化学或痕量金属络合(复合，complex)的，和/或可以是其他添加剂，例如杀虫剂、肥料等的一部分。可以通过给予未支化的β-(1,3)-葡聚糖改善植物的健康或收获的植物材料的质量，其中“健康”包括增强以下方面中的一种或多种：生长速度、所需要的农产品(即、作物)的生产率、抗病性、抗应激性、降低的死亡率和改善的免疫功能，并且其中“收获的植物材料的质量”，包括由于收割、运输和储存所致的损坏降低，外观的改善和更长的保质期。

未支化的β-(1,3)-葡聚糖的来源可以是眼虫藻属的无毒的、非致病性藻类或原生生物。在某些方面，提供了一种改善任何光合生物(无论是陆生的或是水生植物)或与其相关的收获的组织的免疫功能的方法，其中方法包括向植物或收获的组织给予含有β-葡聚糖的组合物，其中β-葡聚糖包括未支化的β-(1,3)-葡聚糖。未支化的β-(1,3)-葡聚糖也可以称为直链β-(1,3)-葡聚糖。未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以衍生自眼虫藻并可以是衍生自异养生长的眼虫藻。在一些实施方式中，组合物中的β-葡聚糖可以基本上由未支化的β-(1,3)-葡聚糖构成。在某些实施方式中，组合物中的β-葡聚糖可以由未支化的β-(1,3)-葡聚糖构成。组合物中的β-葡聚糖也可以包括超过约90％的未支化β-(1,3)-葡聚糖。未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以是以副淀粉的天然形式，这是一种不溶于水的颗粒，或可以通过化学或机械修饰而制成水溶性的。

组合物可以进一步包含金属，如铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘及其组合。未支化的β-(1,3)-葡聚糖和金属可以形成络合物(复合物)。

给予组合物可以包括将以液体形式的组合物添加到植物，无论是作为针对叶子的叶片喷雾、在液体中加入到植物的地面附近(要么单独地，要么与由植物接受的其他液体如灌溉水、叶片喷雾、液体杀虫剂、液体肥料等组合)，或是添加到植物生长的液体中(这是水生生物或水培植物的情况)。此外，含β-葡聚糖的组合物可以作为细雾施加到植物任何部分或以可以施加到植物的任何部分或周围区域，包括损伤或伤口位置的凝胶形式。组合物也可以作为干粉末，要么施加到植物本身，要么施加到周边区域。未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以化学或机械修饰成水可溶性的或具有其他有利的性质。

本技术还证明，未支化的β-(1,3)-葡聚糖可以通过使用藻类或原生生物如眼虫藻属、使用受控生长的方法以低成本进行生产。这些β-葡聚糖的结构不同于使用其他生物生产的β-葡聚糖。一个主要的区别在于，尽管其他生物生产并入到其细胞壁中的β-葡聚糖，但称为眼虫藻属的原生生物可以已知为副淀粉的形式生产β-葡聚糖(包括微粒形式的β-葡聚糖)，其并未并入到细胞壁的结构中。相反，眼虫藻以水不溶性的颗粒将β-葡聚糖聚集于细胞质中，并利用这种形式的β-葡聚糖作为碳水化合物能量储存的一种形式。在优化的生长条件，就可能实现β-葡聚糖的浓缩，其中净β-葡聚糖的重量为大于20％至80％的生物质的总干重比例。本技术提供了最大化眼虫藻生长而同时最小化竞争微生物生长的手段。由眼虫藻生产的β-葡聚糖化合物与使用酵母和其他生物生产的其他产品不一样，但来自眼虫藻的β-葡聚糖可以有效调节免疫功能。眼虫藻生产的β-葡聚糖主要是未支化的β-(1,3)-葡聚糖。进一步的益处是β-葡聚糖生产成本可以小于使用酵母生产的β-葡聚糖的生产成本1/2至1/5。

在其他实施方式中，本技术包括含有有效量的由藻类或原生生物如眼虫藻生产的β-葡聚糖的组合物，其中组合物用于改善植物的健康或改善收获的植物材料的质量。因此，使用藻类生产的更低成本的β-葡聚糖为农学家提供了化学品和遗传工程的负担得起的并且天然的替代物。

根据本文所提供的描述可适用性的进一步的范围将变得显而易见。在本发明内容中的描述和具体实例旨在仅仅用于举例说明而并非旨在限制本发明公开的范围。

附图说明

本文所描述的附图仅用于所选实施方式而并非所有可能的实践的举例说明之目的，同时也并非旨在限制本发明公开内容的范围。

图1举例说明了显示出未支化β-(1,3)-葡聚糖结构的衍生自眼虫藻的的β-葡聚糖。

图2是根据本技术的发酵方法的实施方式的示意图。

图3是根据本技术的发酵过程的另一实施方式的示意图。

图4是相对于用蒸馏水(对照)处理的马铃薯块茎切片(potatotuberdisk)的用β-葡聚糖溶液(实验)处理的马铃薯块茎切片的描述，所示的实验和对照切片都是在各自处理之后的一个周时的情况。

具体实施方式

技术的以下描述在一个或多个本发明的主题、生产和用途的本质方面而言仅仅是示例性的，而并非意在限制在本申请或在如本申请要主张的优先权而提交的这种其他申请，或由其授予的专利中要求授权保护的任何具体发明的范围、应用或用途。关于所公开的方法，所提出的步骤的顺序本质上是示例性的，并且因此，在不同的实施方式中这些步骤的顺序可以是不同的。除非明确另外指出，否则本说明书中所有数值的量，包括反应的材料或条件的量和/或用途都应该理解为如在本技术最宽泛范围的描述中通过单词“约”修饰的那样。

本技术涉及衍生自眼虫藻的β-葡聚糖，包括未支化β-(1,3)-葡聚糖，及其用途。含有眼虫藻源性的未支化β-(1,3)-葡聚糖的组合物可以给予至植物以调节植物的免疫功能，其中这种调节可以促进免疫系统健康、防止疾病、降低病死率、减轻应激效应、提高生长速度或提高作物生产率。各类农业相关的产品，如谷物谷粒、油籽、水果和蔬菜、观赏植物、花卉等，都可以进行处理。取决于给予未支化β-(1,3)-葡聚糖的植物剂量或饲料添加比率可以不同。植物也可以在任何生命阶段进行处理。本发明的技术旨在包括，组合物，组合物的用途，以及如本文所描述增强光合生物的健康的各种方法。用于制备这种组合物的方法也包括在本技术之内。

对于衍生自酵母(例如，美国专利No.6,939,864)，蘑菇(例如，美国专利No.5,147,821)和燕麦(例如，美国公开No.2011/0123677)的β-葡聚糖用于各种应用的各种用途和效力已经证实，但对于衍生自藻类或原生生物来源的β-葡聚糖却研究较少。由藻类或原生生物如眼虫藻藻类生产的β-葡聚糖在一些方面类似于来自其他来源的β-葡聚糖，但藻类和原生生物源的β-葡聚糖在几个方式中也是独特的。一个方面，眼虫藻产生未支化的β-(1,3)-葡聚糖。这种类型的β-葡聚糖作为颗粒在细胞质中出现，称为副淀粉，而无需使用有害溶剂就可以更容易地分离和纯化。采用本文中所公开的技术，眼虫藻可以成本有效地生长以包含可以很容易地制成施用到植物的产品的含量非常高的β-葡聚糖。例如，由海藻和原生生物得到的β-葡聚糖的平均分子量也可以不同于其他来源的β-葡聚糖。为方便起见，本文称之为由藻类或原生生物(例如，眼虫藻)制备或来源的“β-葡聚糖”也应该理解为包括未支化的β-(1,3)-葡聚糖。

三维结构

未支化的β-(1,3)-葡聚糖的三维结构和折叠可以影响在免疫刺激应用中的生物利用度、表面积和整体效力。在直链的未支化β-1,3-葡聚糖链中，结构由糖苷连接基模式控制。由于吡喃葡萄糖基的椅形环是相当刚性的，则大部分葡聚糖链的灵活性都源于围绕糖苷连接基的键的旋转。X射线晶体学和光谱学技术表明，直链葡聚糖在固态具有三螺旋骨架。由眼虫藻生产的副淀粉被认为是结构上最简单的β-葡聚糖之一，几乎不具有糖基侧链。来自眼虫藻的直链未支化的β-(1,3)-葡聚糖的示例性结构如图1所示。

眼虫藻源性的β-葡聚糖的结构与具有朝着螺旋结构的外部暴露的1,4-或1,6-连接的侧链的昆布多糖、香菇多糖、硬葡聚糖、裂裙多糖(schizopylann)和酵母源的β-葡聚糖形成鲜明对比。未支化的β-(1,3)-葡聚糖的三重螺旋结构是由三种类型的氢键稳定的：(1)在相同x-y平面内不同链之间形成的分子间氢键；(2)在同一链中相邻的O原子之间形成的分子内氢键；和(3)在不同x-y平面中的不同链之间形成的分子间氢键。三重螺旋结构在中性pH值下、在宽的温度范围内是稳定的，产生水不溶性的聚合物。然而，氢键可以通过各种手段失稳以改变副淀粉聚合物的构象。例如，副淀粉可以在强离液剂(chaotropicagent)(例如，脲)的存在下，或通过将温度升高至超过三重螺旋的熔点(例如，～135℃)，溶于碱性溶液(例如，典型的0.2M或更强的NaOH)，非质子极性溶剂(例如，DMSO)中。

可以获得不同的免疫效果，这与未支化的β-(1,3)-葡聚糖构象相关，这三种构象为：处于天然状态的、变性的、或变性并复性的。处于这三种构象中的任一种的未支化β-(1,3)-葡聚糖可以起到增加或改善其功能的附加反应的构建块(结构单元，buildingblock)的作用。这些修饰中的一些可以产生功能化的β-(1,3)-葡聚糖并且将在本文中讨论一些其各自的应用。β-葡聚糖的构象及其产生的溶解度也可以影响它是如何递送的；例如，水溶性的未支化β-(1,3)-葡聚糖可以通过水性载体递送而颗粒的未支化β-(1,3)-葡聚糖可以作为固体或分散体递送。

粒径、分子量和表面积

粒径、分子量和表面积都是影响β-(1,3)-葡聚糖颗粒的功能和生物利用度的参数。在某些方面，优选β-(1,3)-葡聚糖粒子具有0.2和5微米之间的直径和高的表面积。例如，由眼虫产生的β-(1,3)-葡聚糖可以具有约200-500kDa的分子量。

β-葡聚糖的来源、结构和近似分子量如下表1中所示。

表1：β-葡聚糖的来源，结构和近似分子量

β-葡聚糖的纯度水平

β-葡聚糖化合物的纯度水平可以对功效产生影响，可能源于存在的影响β-葡聚糖和植物细胞之间的相互作用的其他物质。使用本文中描述的方法，副淀粉可以以颗粒的形式从眼虫藻细胞中分离出来。因此，副淀粉的纯度比由酵母和其他生物制备的β-葡聚糖相对较高。使用本文中的方法，可以获得超过99％的纯度(这通过检测β-葡聚糖的酶测定法测定，Megazyme)。相比较而言，最高等级的酵母源性的β-葡聚糖很少可以达到大于90％的纯度，而几种动物饲料行业中的商业产品仅仅规定约35％-60％的纯度。此外，由于眼虫藻缺乏细胞壁和副淀粉颗粒的方便回收所产生的分离方便性，制备高纯度的β-(1,3)-葡聚糖可以比酵母源性的葡聚糖实现了更高的成本有效性。最后，由于不需要苛刻的化学品(例如，强酸和强碱)回收副淀粉颗粒，β-葡聚糖可以以其天然形式回收而无需修饰其化学组成和构型。在一些情况下，相比于从其他生物获得、在提取过程被修饰的增溶和修饰的副淀粉或β-葡聚糖，使用纯的、未修饰的副淀粉可以是比较有利的。

用于眼虫藻属中生产副淀粉的方法

眼虫藻属可以生长于受控环境中，以使眼虫藻将保持为环境中的主要微生物。这并不容易实现，因为其他生物体通常可以竞争相同的生物资源(例如，营养素、微量营养素、矿物质、有机能量和/或光)。许多这些微生物通常具有更快的增长速度，并可以竞争性抑制缺少有利于眼虫藻属的几种受控生长机制的眼虫藻。这些生长机制可以包括一种或多种方法，如利用有利于眼虫藻的生长培养基，在有利于眼虫藻的温度下操作，添加有利于眼虫藻的酸和碱，加入对除了眼虫藻之外的竞争性生物有毒的化合物，选择性过滤或分离眼虫藻，和加入控制非眼虫藻的生物群体的微捕食者或病毒。所有这些方法都可以影响生长速率和眼虫藻生产β-葡聚糖的能力。为了达到藻类或原生生物的足够群体，生物可以在可选的可灭菌的大的好氧发酵容器中生长。

可以通过向眼虫藻生长培养基加入有机碳源，通过选择性加光，或这两者而增强β-葡聚糖的生产。而且，这些方面影响眼虫藻与其他生物竞争的能力。在一般情况下，在非受控环境中生长的眼虫藻不会显示出在更受控制的生长环境中可以表现出的眼虫藻生产的高β-葡聚糖浓度、快速生长速率和高效β-葡聚糖生产。用眼虫藻在受控的环境如发酵罐中生产β-葡聚糖会在几个方面降低β-葡聚糖生产的成本，包括以下几方面：首先，β-葡聚糖不是生物的细胞壁的一部分而不需要复杂的和/或昂贵的分级分离法或提取方法；其次，眼虫藻生物是相对较大的，并可以通过采用离心机、过滤器或其他分离设备从水中相对迅速地分离出来；第三，相比于其他生物，各体眼虫藻细胞都是由较大百分比的β-葡聚糖(如总细胞质量的百分比)，这获得有机糖向β-葡聚糖转化的高转化率和更容易回收β-葡聚糖；第四，由眼虫藻产生的β-葡聚糖结构上不同于其他β-葡聚糖并具有某些优点。

β-葡聚糖可以作为衍生自已经异养生长于一种或多种无菌生物反应器中的眼虫藻属的悬浮液、糊膏、提取物或干粉而提供。眼虫藻也可以以最佳的方式生长使得藻生物质的β-葡聚糖部分含有大于20％的藻生物质，这是基于干重测定的。生长和创制这种产品的方法的实例如图2和3中所示。

参照图2，示出发酵方法的一个实施方式。可以在发酵罐(1)中在无菌条件下在化学限定的培养基上生产藻类生物质。在发酵罐(1)中经过所需的时间量之后，发酵液可以转移至离心机(2)中而对发酵液脱水，以产生两个工艺流：湿藻粉，含有约75％水分；和已使用的培养基。任何脱水装置，如过滤器或膜，都可以代替离心机使用。湿藻粉包含完整藻类细胞、藻类细胞碎片和β-葡聚糖颗粒的混合物。在干燥之前，湿藻粉可以可选地转移到混合器(3)，如混合罐或任何可以混合的设备件(例如，螺条混合器)中，进行另外的处理。处理的实例可以可选地包括以下内容：可以通过在混合器(3)中加入酸或碱(A)调节湿藻粉的pH；可以加入可溶性金属盐(B)如ZnSO₄-H₂O的浓缩溶液，并与β-葡聚糖溶液剧烈混合1-120min；湿藻粉在离心之后可以进行加热或冷却。可以使用任何水溶性金属盐(B)。例如，金属盐(B)可以与β-葡聚糖混合而使最终产品可以是铜β-葡聚糖络合物、锌β-葡聚糖络合物、铁β-葡聚糖络合物、钴β-葡聚糖络合物、镁β-葡聚糖络合物、锰β-葡聚糖络合物以及它们的组合。

可溶性金属盐(B)溶液的制备可以涉及伴随混合加热金属盐(B)在水中的混合物。可选地，混合器(3)可以是加热的或冷却的。混合器(3)可以加热至巴氏杀菌物质和灭活酶活性所需的温度。当β-葡聚糖溶液和金属盐(B)溶液进行混合时，一定量的络合作用就会发生于金属离子和存在于湿藻粉中的β-葡聚糖之间而使最终产品可以当作是金属-β-葡聚糖络合物。

在进一步的实施方式中，湿藻粉可以经过加工处理而分离或提取β-葡聚糖；例如，通过超声处理、珠磨或其他机械破碎(4)的方式，或通过与各种化学品(例如，酸、碱、溶剂等)接触而溶解或以其他方式移除湿藻粉不需要的组分之后才使用。这个过程可以可选地发生于混合器(3)中。可以用水或合适的醇(乙醇，异丙醇)冲洗从细胞生物质中分离出来的β-葡聚糖以除去非β-葡聚糖物质。可以采用任何适合去除非β-葡聚糖物质的化学品进行另外的洗涤。必要时可以用酸或碱调节β-葡聚糖溶液的pH。

在所需量的处理之后，混合物可以转移到脱水器(5)中，这种脱水器可以是能够干燥物质的任何设备。例如，脱水器(4)可以是盘式干燥器、带式干燥机、转鼓式干燥机、喷雾干燥器等。一旦物料含有小于10％的水分时，它就可以可选地转移至研磨机(6)中，在其中其粒径可以降低至小于1000μm。更优选其粒径可以降低至小于250μm。一旦物料经过研磨，它就能包装(P)至合适尺寸和加有标签的容器中。可选地，可以省略向湿藻粉中加入金属盐(B)溶液并且所得到的产品将是藻粉或藻粉级分。

参照图3，示出发酵方法的另一实施方式。可以在发酵罐(7)中在无菌条件下、在化学限定的培养基上生产藻类生物质。也可以使用任何仅包含饲料级物质并不含有害物质(如，重金属、毒素、危险化学品)的培养基在无菌条件下的生长箱中生产藻类生物质。在发酵罐或生长箱(7)中持续所需时间量之后，发酵液可以被转移到混合器(8)，如混合罐或能够提供混合的任何设备(例如，螺条混合器)中。如果如此装备，则发酵罐可以起到混合器的作用。发酵液含有完整藻类细胞、藻类细胞碎片和β-葡聚糖颗粒的混合物。在非无菌生长箱的情况下，也可以存在低水平非藻类生物质。可选地，可以通过向混合器(8)中加入酸或碱的化学品(C)调节发酵液的pH值以裂解细胞，从而从细胞内释放出大部分的β-葡聚糖颗粒。例如，这可以通过向发酵罐液中添加碱(例如，NaOH)而完成。也可以通过裂解细胞的高压均化器或超声波细胞破碎器或发酵技术领域内精通的技术人员公知的任何方式进行机械加工处理发酵液。

应当理解的是，使用均化器可以创建良好分布的β-葡聚糖溶液。例如，在眼虫藻首先生长于发酵罐中并随后离心的情况下，β-葡聚糖可以从眼虫藻中提取出来，并干燥成粉末。碱性化学品随后可以用于溶解粉末，接着通过添加酸沉淀透明凝胶而形成碱破坏的β-葡聚糖。碱破坏的β-葡聚糖凝胶在中性pH下至少部分溶于水，而据发现在低浓度(如，100ppm)下充分分散于水性溶液中。当凝胶进行冲洗时，例如，它可以使用均质器悬浮于水中而获得乳液，或要不然是充分混合的水性溶液。均化的β-葡聚糖溶液然后可以装瓶以用于运输和终端使用。

发酵液可以调节至碱性pH，并随后在离心之前进行中和。在即使不是全部细胞、也是大多数细胞溶解的充足时间之后，将所得的混合物转移至发酵液脱水的离心机(9)中以产生两个工艺流：粗β-葡聚糖溶液(D)；和其他生物质材料的混合物(E)。粗β-葡聚糖溶液(D)可以转移到混合器(10)，如混合罐或能够提供混合的任何设备件(例如，螺条混合器)中。粗β-葡聚糖溶液(D)可以用水或合适的醇(乙醇，异丙醇)冲洗以除去非β-葡聚糖物质。可以采用适合除去非β-葡聚糖物质的任何化学品进行另外的洗涤。可以用酸或碱(F)调节粗β-葡聚糖溶液(D)的pH。可以制备可溶性金属盐(G)如ZnSO₄-H₂O的浓溶液并加入到混合罐(10)中，并与β-葡聚糖溶液剧烈混合1-120min。可以使用任何水溶性金属盐，使得最终产品可以是例如铜β-葡聚糖络合物、锌β-葡聚糖络合物、铁β-葡聚糖络合物、钴β-葡聚糖络合物、镁β-葡聚糖络合物或锰β-葡聚糖络合物。可溶性金属盐溶液的制备可以涉及连同搅拌在水中加热金属盐的混合物。可选地，混合器(10)可以进行加热或冷却。混合器(10)可以加热至巴氏杀菌物质和灭活酶活性所需的温度。当β-葡聚糖溶液和金属盐(B)溶液进行混合时，金属离子和存在于湿藻粉中的β-葡聚糖之间就会发生一定量的络合作用而使最终产品可以被认为是金属-β-葡聚糖络合物。可选地可以省略向湿β-葡聚糖物质中加入金属盐(G)溶液并且所得的产物将是纯的β-葡聚糖。

在所需量的混合之后，混合物可以转移到脱水器(11)中，这种脱水器可以是能够干燥物质的任何设备。例如，脱水器(11)可以是盘式干燥器、带式干燥机、转鼓式干燥机、喷雾干燥器等。一旦物料含有小于10％水分时，它就可以可选地转移至研磨机(12)中，在其中其粒径可以降低至小于500μm。更优选其粒径可以降低至小于250μm。一旦物料经过研磨，它就能包装(13)至合适尺寸和加有标签的袋中。非β-葡聚糖物料(E)含有部分水解的蛋白质和氨基酸，并可以转移到混合器(14)，如混合罐或能够提供混合的任何设备(例如，螺条混合器)。可以可选地用酸或碱(H)调节非β-葡聚糖物料(E)的pH。可以制备可溶性金属盐(I)如ZnSO₄-H₂O的浓溶液并加入到混合器(14)中，并与富含氨基酸的物质剧烈混合1-120min。可以使用任何水溶性金属盐，而使最终产品，例如，可以是铜蛋白盐、锌蛋白盐、铁蛋白盐、钴蛋白盐、镁蛋白盐、锰蛋白盐，以及它们的组合。可溶性金属盐溶液的制备可以涉及连同混合在水中加热金属盐(B)的混合物。可选地，混合器(14)可以进行加热或冷却。混合器(14)可以加热至巴氏杀菌物质和灭活酶活性所需的温度。当非β-葡聚糖溶液和金属盐溶液进行混合时，金属离子和存在的部分水解的蛋白和氨基酸之间就会发生一定量的络合作用而使最终产品可以被认为是金属蛋白盐。可选地，可以省略向非-β-葡聚糖物料中加入金属盐溶液(I)并且获得的产品将会是提取的藻粉。

在所需量的混合之后，混合物可以转移到脱水器(15)中，这种脱水器可以是能够干燥物质的任何设备。例如，脱水器(15)可以是盘式干燥器、带式干燥机、转鼓式干燥机、喷雾干燥器等。一旦物料含有小于10％水分时，它就可以可选地转移至研磨机(16)中，在其中其粒径可以降低至小于500μm。更优选其粒径可以降低至小于250μm。一旦物料经过研磨，它就能包装(17)至合适尺寸和加有标签的袋中。

可选地，可以省略向每个工艺流(D，E)中加入金属盐溶液并且所得的产品将是相对纯净的β-葡聚糖和部分水解的蛋白粉。将痕量金属和β-葡聚糖络合的优点包括与β-葡聚糖调节免疫系统的各方面结合的痕量金属的生物利用度的提高。例如，β-葡聚糖可以保护或屏蔽金属免于结合至激动剂。而且，因为一些痕量元素，如锌，在获得最佳免疫系统功能方面是很重要的，与免疫增强化合物如β-葡聚糖的组合在某些情况下可以是更优选的。

可选地，我们无需任何干燥而在湿状态下就可以储存、包装和使用纯化的湿β-葡聚糖(D)。它可以可选地进一步加工处理以改善β-葡聚糖的效力。

修饰来自眼虫藻属的β-葡聚糖的方法。

含β-葡聚糖的产品，包括如上生产的纯化β-葡聚糖，可以经过另外的反应以改善其功能。例如，可以用于改变β-葡聚糖化合物的结构而提高或改变免疫系统刺激的功效的反应包括(但不限于)：硫酸化、磷酸化、乙酰化和胺化。

裂解眼虫藻细胞和浓缩β-葡聚糖的简单方法与步骤可以获得可以超过95％纯度的β-葡聚糖的产品。这种分离的产品具有以下益处：更浓，具有较低的蛋白质含量以降低不需要的副反应，并还允许更长的保质期。这种分离的产品可以将其本身或连同另一种物质或方法，如肥料、杀虫剂结合，在灌溉、农作物收获和/或作物包装期间给予至植物。

修饰β-葡聚糖链长度的方法。

为了实现不同的或所需的性质，可能是有益的是使用酶、催化剂、热、超声处理、或它们的组合改变β-葡聚糖的链长度。此外，也可以是有益的是，以β-葡聚糖的高纯度直链源开始如衍生自眼虫藻类的β-葡聚糖，以获得最佳目标链长的所需范围。

获得具有较短链长度的β-葡聚糖的方法的一个非限制性实例包括以下步骤。

1.以衍生自眼虫藻的、具有500kDa的平均分子量的β-葡聚糖开始。葡萄糖为约140道尔顿，所以500kDa代表约3,000-4,000个葡萄糖亚单位的直链。

2.可选地，可能需要预制备的β-葡聚糖以解开(unwind)或释放(unzip)发生于衍生自眼虫藻的副淀粉中的结晶β-葡聚糖结构。

3.切割分子，其中目标分子量的一个实例包括约5至20kDa，或约30至250个糖苷亚单位。在某些情况下在解开或释放β-葡聚糖链的3D结构之前切割分子而使之暴露出糖苷亚单位之间的仅一部分键可能是有益的。切割技术可以包括：

a.酶切割，如通过使用β-葡聚糖酶或类似的酶。

b.超声，在孔板上或通过与超声的微粒子或纳粒子组合。

c.使用催化剂。

d.加热。

e.使用由设备发出的能量转移波长而使波被连接亚单位的键吸收，在这种情况下施加足够的能量打破一部分键。

4.可以实施可选的分离或纯化步骤，在这种情况下相对均匀的产品是合乎所需的并且切割的β-葡聚糖的所得链长度并不一致。β-葡聚糖的尺寸选择可以包括：

a.离心或沉降，其中较重的分子更致密，具有较低的相对表面积。

b.过滤，例如，使用Millapore型或其他过滤器或一系列这种过滤器，以分离或分出目标β-葡聚糖链长度。

c.色谱，如尺寸排阻色谱。

d.电泳，包括凝胶电泳。

修饰β-葡聚糖溶解度的方法

可以使用各种技术进行修饰β-葡聚糖的溶解度而使得可以使用水性媒介物给予β-葡聚糖。施加热是增加溶解度的一种方法。例如，范围为0.1％至10％(以质量进行测定)的β-葡聚糖的量可以与沸水或其他水性溶液混合至少10min，并冷却至室温。结果是溶解的β-葡聚糖溶液具有与β-葡聚糖含量相关的粘度。可以基于所得到的β-葡聚糖的链长和/或浓度调节粘度。例如，有可能加热β-葡聚糖水性溶液以对于某些应用提供约600g/cm²或更高的粘度。这种溶液可以具凝胶样的稠度(consistency)。

眼虫藻源的β-葡聚糖与其他物质的组合。

在一些实施方式中，眼虫藻源的β-葡聚糖可以与一种或多种其他类型的β-葡聚糖(例如，酵母源的β-葡聚糖)组合使用以提供免疫调节性能。眼虫藻源的β-葡聚糖也可以与各种其他物质组合用于给予至植物。这些其他物质的实例包括以下各项中的一种或多种：肥料、杀虫剂、除草剂、玉米粉、脱皮大豆粉、小麦麸、石灰石、磷酸单钙-二钙、盐、氧化锰、硫酸锰、氧化锌、硫酸亚铁、硫酸铜、碳酸钴、碘酸钙、亚硒酸钠、维生素A、维生素D、维生素E、甲基萘醌(Menadioane)硫酸氢钠络合物(维生素K络合物的来源)、核黄素补充剂、烟酸补充剂、泛酸钙、维生素B12、d-生物素、单硝酸硫胺、盐酸吡哆醇、叶酸、蛋氨酸、大豆油、矿物油、氨基酸、鸡肉粉、骨粉、钙、磷、软骨素、葡糖胺、ω3和ω6、甜菜浆、DHA(来自鱼油)、β胡萝卜素、鱼粉、维生素共混物、α-亚麻酸(linlenicacid)、氨基酸、花生四烯酸、抗坏血酸、牛肉粉、生物素、啤酒酵母(干的)、碳酸钙、纤维素、螯合矿物质、硫酸软骨素、钴、铜、玉米油、磷酸二钙、DL-蛋氨酸、十二碳六烯酸、干蛋产品、硬粒小麦面粉、乙氧喹、脂肪、碳水化合物、硫酸亚铁、纤维、鱼粉、鱼油、亚麻籽粉、叶酸、果寡糖、明胶、葡糖胺盐酸盐、甘油、磨碎大麦、磨碎玉米、磨碎高粱、瓜尔胶、肌醇、碘、铁、羊肉粉、L-肉碱、亚油酸、叶黄素、镁、氧化镁、锰、金盏花提取物、甘露寡糖、矿物质、混合生育酚、磷酸单钠、烟酸、金盏花提取物、蓝莓、干海带、磷、钾、氯化钾、碘化钾、山梨酸钾、蛋白质、盐酸吡哆醇、核黄素、大米、米粉、迷迭香、迷迭香提取物、木薯淀粉、牛磺酸、单硝酸硫胺、二氧化钛、维生素A、维生素B-1、维生素B12、维生素B-2、维生素B-6、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K、水、小麦、小麦谷蛋白、黄原胶、锌、氧化锌、硫酸锌、由美国饲料控制官员协会(AssociationofAmericanFeedControlOfficials)目前所列的任何成分，以及它们的组合。用于增强免疫系统活性的进一步的成分可以包括：维生素C、苜蓿、亚麻种子、香菜、小红莓、螺旋藻、小球藻、维生素A、维生素E、铜、锌、铬、铁、精氨酸、烷基甘油(alklyglcerol)、辅酶Q10、二甲甘油酸(dimethglycine)、植物营养素、β-胡萝卜素、精油、鱼油、香料和其衍生物，以及它们的组合。以上成分可以用于各种应用并用于刺激植物的免疫系统。

包含β-葡聚糖的组合物也可以配制成对于商业用途是足够储存稳定的和在使用前，例如，用水稀释的浓缩物。可替代地，组合物的每个组分都可以配制成单独的浓缩液用于在使用之前进行混合和稀释。组合物包括液体组合物，其是即用的，和固体或液体浓缩组合物，其在使用之前需要用溶剂，通常是水进行稀释。

包括β-葡聚糖的固体组合物可以是以颗粒剂或粉剂的形式，其中活性成分与精细粉化的固体稀释剂混合(例如，高岭土、膨润土、硅藻土(kieselguhr)、白云石、碳酸钙、滑石、粉末状氧化镁、漂白土(Fuller'searth)或石膏)。固体组合物还可以是可分散的粉末或颗粒形式，并可以包括润湿剂以促进粉末或颗粒分散于液体中。以粉末形式的固体组合物可以作为叶面粉剂施用。

液体组合物可以包括β-葡聚糖在水中的溶液、悬浮液或分散体，并也可以含有表面活性剂，或可以包含β-葡聚糖在水不溶性有机溶剂中的溶液或分散体，其作为液滴分散于水溶液中。组合物可以含有另外的表面活性试剂，包括例如表面活性试剂以增加如上讨论的浓缩组合物的相容性或稳定性。这类表面活性试剂可以是阳离子的、阴离子的、或非离子或两性类型或它们的混合物。阳离子试剂包括，例如，季铵化合物(例如，十六烷基三甲基溴化铵)。阴离子剂的实例包括皂类，硫酸的脂族单酯的盐，例如，十二烷基硫酸钠；和磺化芳香化合物的盐，例如，十二烷基苯磺酸钠，木质素磺酸钠、钙和铵，丁基萘磺酸盐和二异丙基和三异丙基酸钠盐的混合物。合适的非离子试剂是环氧乙烷与脂肪醇如油醇和十六烷醇的缩合产物，或与烷基酚如辛基或壬基酚或辛基甲酚的缩合产物。其他非离子试剂是衍生自长链脂肪酸和己糖醇酐的部分酯，例如山梨糖醇单月桂酸酯；部分酯与环氧乙烷的缩合产物；卵磷脂；和硅酮表面活性剂(具有含有硅氧烷链的骨架的水溶性的可分散表面活性剂，如SilwetL77^TM)。矿物油中的合适混合物是ATPLUS411F^TM。

本发明组合物可以进一步包括各种相容剂、消泡剂、螯合剂、中和剂和缓冲剂、缓蚀剂、染料、增香剂、铺展剂、渗透助剂、粘附剂、分散剂、增稠剂、凝固点下降剂、抗微生物剂等。组合物也可以包含其他组分，例如，除草剂、植物生长调节剂、杀真菌剂、杀虫剂等，并可以用液体肥料或固体颗粒状肥料载体如硝酸铵、尿素等进行配制。

组合物包括β-葡聚糖并进一步含有表面活性剂，其中表面活性剂降低液体的表面张力，允许更容易铺展。表面活性剂可以是洗涤剂、乳化剂(包括烷基聚葡糖苷甘油酯或聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、分散剂(包括氯化钠、氯化钾、硝酸钾、氯化钙或玉米淀粉)、发泡剂(包括酒石酸、苹果酸或醇的衍生物)、渗透促进剂、保湿剂(包括硫酸铵、甘油或脲)或离子或非离子型的润湿剂或这种表面活性剂的混合物。各类表面活性剂包括渗透促进剂、分散剂或乳化剂。

渗透促进剂包括加快β-葡聚糖通过植物角质层进入植物的摄取的化合物。摄取率，和/或提高吸收进入植物中的β-葡聚糖量。被称为渗透促进剂的各种类型的物质包括烷基磷酸盐，如磷酸三丁酯和磷酸三丙酯和萘磺酸盐。渗透促进剂的实例包括以商品名Dehscofix^TM出售的那些，包括蓖麻油和乙氧基化脂肪酸，如DehscofixCO95^TM(购自美国Huntsman)，包括来自蓖麻油的C18乙氧基化脂肪酸。

分散剂可以加入到包含β-葡聚糖的悬浮液中，通常是胶体，以改善颗粒的分离并防止沉降或结块。这种分散剂的实例包括以商品名TensiofixDp400可获得的产品(购自AjinomotoOmniChem)，基本上含有有机磺酸盐/酯和2-甲基戊-2,4-二醇。

可以加入乳化剂以稳定包含β-葡聚糖的乳液，即，两种或多种液体的混合物。实例包括以商品名吐温^TM20，其包括聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)，和Radia^TM，其基本上含有烷基多糖苷，可获得的那些。

各种表面活性剂的另外的实例包括以下各项中的一种或多种：蓖麻油乙氧基化物、油菜籽甲基酯(rapeseedmethylestr)、烷基磷酸酯、磷酸三丁酯、磷酸三丙酯、萘磺酸盐、有机磺酸盐/2-甲基戊-2,4-二醇、烷基聚葡糖苷、硅氧烷衍生物、烷基磺酸盐、聚羧酸盐木质素磺酸盐、烷氧基化甘油三酯、脂肪胺聚合物、二辛基磺基琥珀酸盐或聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20)，更优选表面活性剂是C18-蓖麻油-乙氧基化物(Dehscofix^TM)、有机磺酸盐/2-甲基戊-2,4-二醇(TensiofixDp40)或聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸(吐温^TM20)。

眼虫藻源的β-葡聚糖与杀真菌剂和杀细菌剂的组合。

β-葡聚糖可以与其他已知的防止植物中发病的化合物如杀真菌剂和/或杀细菌剂以组合物进行组合。杀真菌剂是指用于例如通过防止孢子形成，或它们的孢子来杀灭或抑制真菌或卵菌的化学或生物物质或组合物。杀真菌剂可以通过不同的作用方式发挥其生物学效应，例如，通过干扰核酸合成、有丝分裂和细胞分裂，呼吸，氨基酸和蛋白质的合成，信号转导，脂质和细胞膜的合成，胆固醇合成，病原体中的葡聚糖合成或通过诱导宿主植物防御。这种组合物可以作为粉末、喷雾提供或甚至溶解于水供给中并通过灌溉形式提供。可以与β-葡聚糖组合的天然杀真菌剂的例子包括茶树油、肉桂醛、肉桂精油、荷荷巴油、印度楝油、迷迭香油、单蜡素(monocerin)、牛奶、白粉寄生菌属(ampelomycessp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、单隔孢属(Ulocladiumsp.)、海带粉，以及它们的组合。可以与β-葡聚糖组合的其他杀真菌剂的实例包括膦酸盐/酯、苯甲酰胺、氨基甲酸盐/酯、二硫代氨基甲酸盐/酯、酞亚胺、三唑类、喹啉类、硫、氰基咪唑类，以及它们的组合。杀真菌剂的还有的例子包括酰基丙氨酸(苯霜灵)、苯胺嘧啶类(嘧菌环胺或嘧霉胺)、苯甲酰胺(氟吡菌胺或苯酰菌胺)、苯并咪唑类(麦穗宁、噻菌灵或苯均酮)、苯并噻二唑类(活化酯-S-甲基)、氨基甲酸酯类(苯噻菌胺、缬霉威或霜霉威)、羧酰胺类(啶酰菌胺)、氯腈类(百菌清)、氯苯基类(甲基立枯磷)、氰基乙酰胺肟类(霜脲氰)、氰基咪唑类(氰霜唑)、二甲酰亚胺(异菌脲)、二硫代氨基甲酸盐/酯(福美双、代森联、代森锰锌、代森锰或丙森锌)、胍类(多果定)、羟基苯胺类(hydroxyanilides)(环酰菌胺)、咪唑类(咪唑菌酮、抑霉唑或氟菌唑)、吗啉类(烯酰吗啉、丁苯吗啉、螺环菌胺或吗菌灵)、膦酸酯(三乙膦酸)、氧硫杂环己烯类(oxathiins)(氟酰胺)、噁唑类(噁唑菌酮或恶霉灵)、苯酰胺类(甲霜林或甲霜林-M)、苯基吡啶酰胺(氟啶胺)、苯基吡咯(咯菌腈)、酞亚胺类(克菌丹或灭菌丹)、喹唑啉酮(丙氧喹啉)、喹啉类(喹氧灵)、甲氧基丙烯酸酯类(strobilurins)(嘧菌胺、氟嘧菌酯、甲基克索敏(kresomin-methyl)、吡唑醚菌酯、三氟敏或啶氧菌酯)、噻吩类(硅噻菌胺)、三唑类(苯醚甲环唑、氧唑菌(epoxyconazole)、腈苯唑、氟硅唑、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、戊唑醇、四氟醚唑、三唑醇、灭菌唑或丙硫菌唑)、铜衍生物(氯氧化铜、氢氯化铜、氧化铜或硫酸铜)、硫、以及它们的组合。

本发明的组合物可以进一步包含一种或多种植物免疫系统调节剂，如氧化硅、铜、硫、铝、钒、钴、镍、铁、银、水杨酸及其衍生物(包括乙酰水杨酸、异烟酸、活化酯-S-甲基)、茉莉酸及其衍生物(包括茉莉酸甲酯)、乙烯及其衍生物、多糖(包括葡聚糖、木葡聚糖、甲壳素、壳聚糖、岩藻聚糖、半乳岩藻多糖、木聚糖、半乳聚糖、藻酸盐、半乳糖、芹半乳糖醛酸、果聚糖包括菊粉、甘露聚糖、木甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖)、海藻提取物(绿色藻类提取物包括石莼多糖(ulvans)、褐藻提取物包括昆布多糖、和红藻提取物包括卡拉胶)、寡糖(包括海藻糖)、肽(包括系统素、13-pep、flg-22、谷胱甘肽)、氨基酸、蛋白质(包括过敏蛋白(harpin)和鞭毛蛋白)、蛋白胨、牛肉提取物、精油(包括小茴香、茴香、薄荷、肉桂、百里香、罗勒、豆蔻、香菜、牛至、曼柴尼拉酒、丁香、荷荷巴油和茶树油)、脂质(包括麦角甾醇、两性霉素、鞘磷脂、脑苷脂)、糖脂(包括syringolids)、糖蛋白(包括隐地蛋白)、脂肽、脂蛋白(包括诱导素(volicitin))、酵母提取物(包括酿酒酵母、假丝酵母、毕赤酵母、黑酵母(短梗霉菌、Aureobasidium)、而尤其是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、无名假丝酵母菌(Candidafamata)、橄榄假丝酵母(Candidaoleophila)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)的提取物)、真菌提取物(包括木霉、疫霉病菌(Megasperma)、稻瘟霉(Pyricularia)、交链孢霉、腐霉、柄锈菌、毛盘孢菌、轮枝菌、稻瘟病菌(Magnaporthe)的提取物)、细菌提取物(包括大肠杆菌、根瘤菌、假单胞菌的提取物)、BABA、噻菌灵、isothianil、磷酸及其衍生物(包括三乙膦酸铝、钠和钾)、木贼提取物、碘化钾和硫氰酸钾、柑橘提取物、丝兰提取物、柳属提取物、和植物煎剂(包括荨麻汤)。

各种包含β-葡聚糖的组合物也可以与噬菌体或杀菌剂组合或共给予以向植物提供额外水平的保护。

纯天然组合物

在某些实施方式中，纯天然眼虫藻源的β-葡聚糖组合物可以是合乎需要的，如用于通常需要无杀虫剂和/或无合成化学认证的有机农事应用。在这种情况下，β-葡聚糖可以为植物提供纯天然源的免疫支持。此外，β-葡聚糖可以作为藻粉或部分分离的或部分纯化的藻粉的提供，在这种情况下除了β-葡聚糖之外，藻粉提供天然源的各种营养如氮、磷、钾、硫和还有的许多其他有价值的微量营养素或痕量金属。包含β-葡聚糖的组合物可以进行生产以符合有机标准，如需要由美国农业部有机认证和鉴定合格的那些；参见可在线[www.ams.usda.gov]获得的NationalOrganicProgram。例如，可以不使用辐射、污水污泥、合成肥料、禁止的杀虫剂、和遗传修饰的生物制备纯天然的眼虫藻源的β-葡聚糖组合物。

这种纯天然组合物由于添加β-葡聚糖作为PAMP可以开发为更有效。一种或多种下列成分可以与β-葡聚糖组合以获得所需的免疫刺激作用：益生菌(芽孢杆菌、尤其是枯草芽孢杆菌QST713菌株)、鱼肝油、植物源的油(玉米油、棉籽油、大蒜油、丁香油、印度楝树油)、精油(罗勒、牛至、百里香、迷迭香)。这些物质可以与惰性成分如水，月桂酸，聚甘油等物质一起溶解或混合。

向植物给予

本文中所描述的包含β-葡聚糖的各种组合物可以按照不同方式向植物给予。本发明组合物的给予速率可以取决于许多参数，包括，例如，活性成分、植物物种、植物物种的生长期和密度、配方和施用方法例如喷雾、加入到灌溉水中或其他常规手段。在一些实施方式中，给予可以是10至1000升组合物/公顷，其中某些实施方式包括使用100至200升组合物/公顷。

可以根据本领域内技术人员熟知的技术进行组合物的给予。组合物可以施用于整株植物，或施用于植物的叶、花、果实、种子和/或根，以及施用于植物生长或其期望生长的土壤或惰性基质(例如无机基质如沙、岩棉(rockwool)、玻璃棉；膨胀性矿物如珍珠岩、蛭石、沸石或膨胀粘土)、浮石、火山碎屑物质或材料、合成有机物质(例如、聚氨酯)、有机物质(例如，泥炭、堆肥、树木废弃产产品如椰子壳、木纤维或片、树皮)或施用于液体基质(例如，漂浮水培系统、营养膜技术、气栽法)。可以通过喷雾、淋透、浸泡、浸渍、注射等，或经由灌溉系统完成施用。也可以是有用的是，将组合物施加于繁殖物质如块茎或根茎，以及种子，幼苗，或幼苗的小苗单移和植物或植物的小苗单移。组合物也可以采收后施用而控制腐烂。例如，组合物可以施用于收获的作物或植物体，包括水果、蔬菜、谷物谷粒、块茎等。

这可以有益的是以最大化植物吸收β-葡聚糖的方式提供β-葡聚糖组合物。例如，较幼的或较潮湿的植物叶片可能更容易吸收β-葡聚糖。按照一定的时间提供β-葡聚糖也可以是有益的。例如，植物呼吸代谢途径在选择性暴露于光线、湿度、温度、土壤水分、养分负荷率或其他条件的合适组合期间可以是更具活性的。具体而言，施用于CAM或C4植物，在夜间或将植物暴露潮湿的条件下是更有益的。与β-葡聚糖一起提供激素或其他细胞信号而促进植物接收β-葡聚糖持续一段有限的时间，也可以是可能的。

对于某些应用，β-葡聚糖可以进行修饰或配制成凝胶。这对植物插枝，根部提供水分和稳定性，或水培植物降低蒸发也可以是有益的。例如，植物用于无性繁殖的插枝(cutting)或部分能用本文中描述的组合物进行处理。这种组合物，包括配制成凝胶的那些，要么通过确保激素维持物理上紧密接近植物，要么通过提供防止温度变化而导致激素降解或防止激素蒸发，也可以有助于促进植物激素，如生根激素的传输。

β-葡聚糖也可以水培施加于植物，而使之刺激根、茎、插枝或品种的免疫系统。这对正在由植物的特定基因菌株进行克隆的植物，如由植物育种者意图所向，是尤其有益的。β-葡聚糖也可以以藻粉形式给予，在这种情况下使用干藻粉或藻粉液化而送入植物中。例如，液化的全细胞藻浆，其除了提供免疫刺激源之外，也对植物提供丰富的营养素和微量营养素源具有受益。

实施例

β-葡聚糖支化分析：

由眼虫藻生产的β-葡聚糖在其物理特性上是独特的，而常被称为“副淀粉”。副淀粉由具有即使有也是极少侧链的几乎完全未支化的β-(1,3)-葡聚糖的直链聚合物构成。这种结构显著不同于已经最深入研究和商业化用于免疫支持应用的酵母源β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖包含每10-30个葡萄糖单元取代有β-(1,6)侧链(2-3个葡萄糖单元长)的β-(1,3)-葡聚糖骨架。副淀粉的未支化的性质，相比于其他来源的β-葡聚糖，在考虑其免疫支持应用的用途时，是一个重要的区别。在从完整眼虫藻细胞中分离出副淀粉之后，实施连接分析以测定葡萄糖单体之间每种类型的键的相对含量。

对于糖基连接分析，将样品全甲基化、解聚、还原、并乙酰化，而由此产生的部分甲基化的醛醇乙酸酯(PMAA)通过气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析，正如由约克等(Yorketal.MethodsEnzymol.1985，118:3-40)描述的那样。首先，将干样品悬浮于约300μL的二甲基亚砜中并置于磁力搅拌器上持续1-2周。样品随后通过文献CiukanuandKerek(1984)Carbohydr.Res.131:209-217的方法(用在干DMSO中的氢氧化钠和碘甲烷处理)进行全甲基化。样品经受NaOH碱持续10min，然后加入碘甲烷并静置40min。碱随后10min内加入，而最后加入更多的碘甲烷持续40min。这种加入更多的碘甲烷和NaOH碱是为了保证聚合物的完全甲基化。在样品的后处理(workup)之后，全甲基化物料采用2M三氟乙酸(在121C下在密封管中2h)进行水解，用NaBD₄进行还原并用乙酸酐/三氟乙酸乙酰化。所得的PMAA在接口到7890AMSD分析(质量选择性检测器，电子碰撞电离模式)的HewlettPackard5975CGC上进行分析；在30mSupelco2330键合相熔融石英毛细管柱上进行分离。

从眼虫藻藻类中提取出来的两个副淀粉样品的连接分析如表2中所示。

表2:由眼虫藻提取的两个副淀粉样品的连接分析

连接分析表明，两个副淀粉样品主要由3-连吡喃葡萄糖残基构成。例如，β-葡聚糖可以是超过约90％未支化的β-(1,3)-葡聚糖，而在某些情况下可以是超过约93％的未支化β-(1,3)-葡聚糖或超过约94％的未支化β-(1,3)-葡聚糖。连同可忽略量的3,6-连接的、末端和2,3,4-连接的吡喃葡萄糖残基，还发现有少量的4-连接的和2,3-连接的吡喃葡萄糖残基。这些数据证实，副淀粉主要由直链、未支化的β-(1,3)-葡聚糖构成的。β-(1,3)-葡聚糖是据信结合至哺乳动物免疫系统细胞表面的受体，如Dectin-1(如巨噬细胞的免疫系统细胞上的主要受体)和补体受体3的β-葡聚糖形式。可能的是，β-(1,3)-葡聚糖按照类似的方式与植物发生相互作用。

植物实验：

制备β-葡聚糖溶液：通过将12gNaOH溶解于0.3L蒸馏水中而制备1MNaOH。磨细的未支化β-1,3-葡聚糖粉(1g)加入到0.1L的1MNaOH中并和在室温下简单搅拌。溶解的β-葡聚糖然后定期搅拌下采用缓慢加入盐酸至pH为中性而进行沉淀。中和的浆料转移到50mL锥形管中并离心除盐。弃去上清液，将管填充蒸馏水至50mL标记，通过简单涡旋而混合，并再次离心。这个洗涤步骤重复共三次。洗涤过的1％(10,000ppm)凝胶通过加入10mL凝胶至容量瓶中并用蒸馏水填充至1L标记稀释至最终浓度0.01％(100ppm)。该100ppm溶液用于以下实验。

实验1：β-葡聚糖制剂对植物疾病的影响

方法：当黄瓜第一真叶2/3完全展开时将黄瓜植物(品种SMR58)用叶面喷雾处理。植物采用β-葡聚糖制剂或蒸馏水进行喷雾。喷雾一个星期后，用植物病原炭疽病(Colletotrichumorbiculare)的5μL真菌孢子液滴(浓度为100000个孢子/mL)接种每个片叶上20个位点。培养后一个星期，植物通过病变计数对疾病进行记分，如表3所示。

表3：病变计数

相对于对照，β-葡聚糖溶液显著降低了每片叶上发展的病变数。这表明，β-葡聚糖溶液向植物叶片施用可以降低对植物疾病的易感性

实验2：β-葡聚糖制剂对植物疾病的影响

方法：当黄瓜第一真叶2/3完全展开时将黄瓜植株(品种SMR58)用叶面喷雾处理。植物采用β-葡聚糖制剂或蒸馏水进行喷雾。喷雾一个星期后，用植物病原炭疽病(Colletotrichumorbiculare)的5μL真菌孢子液滴(浓度为100000个孢子/mL)接种每个片叶上10个位点。培养后一个星期，植物通过测定病变直径对疾病进行记分，如表4中所示。

表4：病变直径

相对于对照物，β-葡聚糖溶液看起来可以降低每个叶片上发展的病变尺寸。这表明，β-葡聚糖溶液施用至植物叶片上可以降低对植物疾病的易感性。

实验3：β-葡聚糖制剂对由接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)引起的马铃薯干腐病发展的影响

方法：由马铃薯块茎中央皮层组织制备(品种Snowden)块茎盘片(2cm直径×0.5cm厚)。用无菌水冲洗盘片3次，然后通过浸泡在β-葡聚糖溶液或蒸馏水中3分钟进行处理。盘片放置于培养皿中的无菌滤纸上允许静置2天。2天之后，盘片用来自接骨木镰刀菌培养基的菌丝的柱塞接种培养。在初始处理之后一周(接种后5天)进行拍摄图4所示的照片。

显而易见的是，用β-葡聚糖溶液处理的块茎盘片在并入真菌之后5天感染较少。这表明，向收获的植物材料比如马铃薯块茎施用β-葡聚糖溶液可以通过降低其对疾病的易感性而改善植物产品的质量。

提供示例性实施方式而使本公开内容将是透彻的，并将向本领域内技术人员充分传达范围。许多具体细节，如具体组分，设备和方法的实施例，提出而提供本发明实施方式的深入了解。这对本领域内的那些技术人员显而易见的是，具体细节不需要采用，示例性实施方式可以以许多不同的形式实现，并且不应解释为对本发明公开内容的范围进行限制。在一些示例性实施方式中，熟知的方法，众所周知的设备结构，以及著名的技术并没有详细描述。一些实施方式，材料，组合物和方法的等效变化，修改和变体都可以在本技术的范围内作出，而基本上具有类似的效果。

Claims (31)

1.一种调节植物的免疫功能的方法，所述方法包括：向所述植物给予包含β-葡聚糖的组合物，所述β-葡聚糖包括未支化的β-(1,3)-葡聚糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖衍生自眼虫藻。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖衍生自异养生长的眼虫藻。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖基本上由未支化的β-(1,3)-葡聚糖构成。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖由未支化的β-(1,3)-葡聚糖构成。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖包括超过约90％的未支化的β-(1,3)-葡聚糖。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡聚糖包括副淀粉。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物含有藻粉。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括液体组合物，在所述液体组合物中β-葡聚糖是以下状态中的一种：溶解的和悬浮的。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括干组合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括凝胶组合物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含选自由肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂以及它们的组合组成的组中的成员。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含除了β-葡聚糖之外的植物免疫系统调节剂。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含表面活性剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表面活性剂包括渗透促进剂、分散剂和乳化剂中的一种。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含金属。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述金属包括选自由以下组成的组中的成员：铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘以及它们的组合。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述β-葡聚糖和所述金属形成络合物。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述给予包括将所述植物的表面与所述组合物接触。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述给予包括将所述植物生长于其中的基质与所述组合物接触。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述给予包括用水和所述组合物灌溉所述植物。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是种子和幼苗中的一种。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是收获的植物产品。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述收获的植物产品是由水果、蔬菜、谷物粒和块茎组成的组中的成员。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是无性繁殖的植物的插枝和部分中的一种。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是水培生长的或气栽生长的。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物是针对美国农业部的有机认证制备的。

28.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述组合物而不使用辐射、污水污泥、合成肥料、合成杀虫剂和遗传修饰的生物。

29.根据权利要求所述的方法1，其中所述未支化的β-(1,3)-葡聚糖具有小于衍生自眼虫藻的未支化β-(1,3)-葡聚糖的天然平均分子量的平均分子量。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述未支化的β-(1,3)-葡聚糖的平均分子量是通过选自由以下组成的组中的方法获得的：超声、酶切割、化学反应、与催化剂接触、选择性过滤或色谱、选择性离心、加热、辐射以及它们的组合。

31.一种生产包含β-葡聚糖的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

提供包括未支化的β-(1,3)-葡聚糖的β-葡聚糖；

用碱溶解所述β-葡聚糖以形成溶解的β-葡聚糖溶液；和

使所述溶解的β-葡聚糖溶液和酸混合以形成碱破坏的β-葡聚糖凝胶。