DE69828245T2

DE69828245T2 - Chitinperlen, chitosanperlen, verfahren zu ihrer herstellung, daraus hergestellte trägermaterialien und verfahren von mikrosporen

Info

Publication number: DE69828245T2
Application number: DE69828245T
Authority: DE
Inventors: Masuhiro Tsukada; Akira Shirata; Shoji Hayasaka
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2018-05-14
Also published as: EP0913407A1; EP0913407A4; CN1226900A; CN1176949C; EP0913407B1; KR20000016757A; WO1998051711A1; WO1998051712A1; CA2255080A1; CA2255080C; KR100321665B1; DE69828245D1; US6156330A; JP3368323B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße, die mikrosporidale Sporen umfassen, deren Hauptzellwandsubstanz Chitin ist; Chitosanperlen, die N-deacetyliertes Chitin umfassen und eine gleichförmige und feine Partikelgröße aufweisen; Verfahren zum Herstellen dieser Perlen; ein diese Perlen umfassender Träger; und ein Verfahren zum Herstellen von mikrosporidalen Sporen.
Stand der Technik
Chitosan weist exzellente physikochemische Adsorptivität, Biokompatibilität und Biodegradierbarkeit auf und dementsprechend ist Chitin ein Biopolymer, das in verschiedenen industriellen Gebieten weitflächig eingesetzt werden konnte, beispielsweise als Material für Medikamente/medizinische Behandlung, Kosmetika, Klebstoffe/Farben und Lacke und Duplikation/Aufzeichnungs-Anzeige. Andererseits sind poröse Perlen, deren Partikelgröße nicht weit variiert, als Träger zur Immobilisierung von beispielsweise Enzymen in einer breiten Vielfalt industrieller Gebiete verwendet worden, wie etwa der chemischen Industrie, bei medizinischen Behandlungen, in der Nahrungsmittelindustrie und bei industriellen Verfahren. Aus diesem Grund können poröse Perlen aus Chitosan, falls sie mit einer gleichförmigen Partikelgröße bereitgestellt werden können, in verschiedenen Gebieten verwendet und eingesetzt werden.
Chitosanperlen wurden konventionellerweise durch beispielsweise das folgende komplizierte Verfahren hergestellt. Zuerst werden anorganische Substanzen aus Komponenten entfernt, welche das Exoskelett von Crustaceen bilden, um Chitosan zu ergeben und dann wird das sich ergebende Chitosan hinreichend in einer organischen Säure gelöst, um einen gleichförmigen Stoff zu ergeben. Dieser Stoff wird tropfenweise in eine basische Koagulationsflüssigkeit hinzugegeben oder ausgestoßen, um so Chitosanperlen zu ergeben (siehe Knorr, D., M. Daly: Mechanics and diffusional changes observed in multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules, Process Biochemistry, 1988, 4, S. 48-50).
Offenbarung der Erfindung
Beim vorstehenden konventionellen Verfahren werden die Partikelgröße und die Porosität der sich ergebenden Chitosanperlen weit variieren, abhängig von beispielsweise der Lösungsrate und den Raten von Penetration und Diffusion der koagulierenden Flüssigkeit in die sich ergebenden Perlen. Aus diesem Grund ist es recht schwierig, die Partikelgröße dieser Perlen gleichförmig zu machen, so dass die Herstellung von Chitosanperlen der gleichförmigen Partikelgröße komplizierte Herstellverfahren und Kenntnisse der Arbeiter erfordert und dies macht es dementsprechend schwierig, eine Massenproduktion derselben einzuführen. Somit bestand ein Bedürfnis an der Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von Chitosanperlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße nach solchen Herstellverfahren, die einfach ausgeführt werden können und die bezüglich Ausbeute, Effizienz und Ökonomie exzellent sind.
Die vorliegende Erfindung hat die vorstehenden, mit konventionellen Techniken assoziierten Probleme gelöst oder eliminiert, indem die Tatsache ausgenutzt worden ist, dass die Sporen von Microsporozoa, die eine gleichförmige und feine Partikelgröße haben und deren Hauptzellwandsubstanz Chitin umfasst, in Insektenkörpern oder mit kultivierten Zellen hoch effizient hergestellt werden können. Genauer gesagt, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zum effizienten und ökonomischen Herstellen von Chitinperlen, Chitosanperlen und mikrosporidalen Sporen, die alle eine gleichförmige und feine Partikelgröße haben, während die Tatsache ausgenutzt wird, dass Chitin der Hauptbestandteil der Zellwandsubstanz von Partikel-Mikrosporidalsporen ist, wie auch die Perlen mit der gleichförmigen und feinen Partikelgröße, die durch das Verfahren hergestellt sind, und ein Träger, der diese Perlen mit der gleichförmigen und feinen Partikelgröße umfasst.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um eine neue Technik zum Verwenden eines aus Insekten stammenden Biopolymers zu entwickeln. Die Erfinder haben sich der Tatsache bedient, dass die mikrosporidalen Sporen in Insektenkörpern oder Kulturzellen mit hoher Effizienz hergestellt werden können und dass jede der sich ergebenden so hergestellten mikrosporidalen Sporen eine gleichförmige Partikelgröße aufweist und die Form einer Kugel oder einer elliptischen Kugel aufweist und dass die Hauptzellwandsubstanz der mikrosporidalen Sporen Chitin ist; haben erstmalig herausgefunden, dass, falls eine Substanz wie etwa ein Antibiotikum oder eine physiologisch aktive Substanz auf den Chitinperlen oder den Chitosanperlen mit gleichförmiger Partikelgröße immobilisiert wird, die Perlen als Träger für eine verzögerte Freisetzung dieser Substanzen verwendet werden können und haben damit die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
Beim Inokulieren von mikrosporidalen Sporen in oder auf domestizierte Seidenraupen, Wildseidenraupen oder verschiedene Insekten oder kultivierte Zellen wird eine große Menge von mikrosporidalen Sporen proliferiert, deren Hauptzellwandsubstanz Chitin ist und die eine Partikelgröße in der Größenordnung mehrer Mikrometer (μm) aufweisen. Die Erfinder dieser Erfindung haben ebenfalls ein Verfahren zum Reinigen/Auftrennen der so erhaltenen proliferierten mikrosporidalen Sporen entwickelt, um Chitinperlen, Chitosanperlen oder mikrosporidale Sporen zu bekommen, die alle eine gleichförmige Partikelgröße aufweisen; und sie haben ein einfaches Verfahren zum Herstellen von Trägern aus diesen Perlen für die Immobilisierung von beispielsweise eines Antibiotikums oder einer physiologisch aktiven Substanz entwickelt.
Zu allererst haben die Erfinder dieser Erfindung die optimalen Bedingungen für eine effiziente Herstellung von mikrosporidalen Sporen abgeklärt, wie etwa Zeit oder Stadium eines Insekts, um mikrosporidale Sporen in oder auf Insekten oder kultivierte Zellen zu inokulieren, deren zu inokulierende Menge und das Verfahren zum Inokulieren derselben, wie auch Verfahren zum Reinigen und/oder Trennen der beispielsweise in den Insektenkörpern proliferierten mikrosporidalen Sporen.
Als Verfahren zum Inokulieren von mikrosporidalen Sporen in Insekten oder kultivierte Zellen sind beispielsweise bekannt gewesen, (i) ein orales Inokulationsverfahren, welches den Schritt des Zufügens der gewünschten mikrosporidalen Sporen zum Futter von Insekten umfasst; und (ii) ein direktes Inokulationsverfahren, welches den Schritt des perkutanen Inokulierens von mikrosporidalen Sporen in Insektenkörpern während ihrer Aufzucht umfasst.
Obwohl mikrosporidale Sporen eine Vielzahl von Formen haben können, behalten sie die gewünschten Perlenformen, abhängig von den Arten derselben, und die Hauptzellwandsubstanz ist ein Komplex von Chitin und Proteinen. Daher können diese Sporen in Form von (i) Chitinperlen, d.h. nach der Proliferation erhaltenen mikrosporidalen Sporen per se oder (ii) durch N-Deacetylieren des Chitins der mikrosporidalen Sporen erhaltenen Chitosanperlen verwendet werden. Alternativ können Chitosanperlen, bei denen die Oberfläche der feinen Partikel aus Chitosan besteht, gleichermaßen hergestellt werden, indem das Chitin auf der Oberfläche der mikrosporidalen Sporen einer N-Deacetylierungsbehandlung unterworfen wird. Darüber hinaus ist es auch möglich, Hohlperlen herzustellen, die feine, auf den Zellwänden der mikrosporidalen Sporen ausgebildete Poren aufweisen, indem die intrazellulären Substanzen aktiviert werden, um so dieselben durch die Zellwände nach außen freizusetzen.
Wie oben erläutert, sind die Chitinperlen gemäß der vorliegenden Erfindung solche mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße, aus Insektenkörpern oder kultivierten Zellen proliferierten mikrosporidalen Sporen, deren Hauptzellwandsubstanz Chitin ist, bestehend, während die Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung vorstehende Chitinperlen sind, bei denen das Chitin der Zellwandsubstanzen einer N-Deacetylierung unterworfen wird. Diese Chitinperlen und Chitosanperlen können solche sein, aus denen Proteine entfernt worden sind, d.h. nicht-immunogene. Die Entfernung der Proteine wird durch übliche Hydrolysebehandlung durchgeführt. Zusätzlich können die vorstehenden proliferierten mikrosporidalen Sporen bedarfsweise in ihren Zellwänden Poren aufweisen und die vorstehenden Chitinperlen und Chitosanperlen können Hohlperlen sein. Die Poren können durch eine Behandlung der Perlen mit Wasserstoffperoxid oder einer Lauge gebildet werden.
Der Träger gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Chitinperlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße, die aus den zuvor erwähnten proliferierten mikrosporidalen Sporen bestehen und deren Hauptzellwandsubstanz Chitin ist, oder Chitosanperlen, bei denen das Chitin als die Hauptzellwandsubstanz einer N-Deacetylierungsbehandlung unterworfen wird. Diese Chitin- und Chitosanperlen können solche sein, aus denen die Proteine entfernt worden sind, d.h. nicht-immunogene. Die Entfernung der Proteine wird durch die übliche Hydrolysebehandlung ausgeführt. Die vorstehenden proliferierten mikrosporidalen Sporen können, falls notwendig, Poren in ihren Zellwänden aufweisen und die vorstehenden Chitinperlen und Chitosanperlen können Hohlperlen sein. Die Poren können durch eine Behandlung der Perlen mit einer Lauge oder mit Wasserstoffperoxid gebildet werden.
Der Träger gemäß der vorliegenden Erfindung wird für die Immobilisierung oder Einführung von beispielsweise physiologisch aktiven Substanzen, Antibiotika, biologischen Zellen, Mikroorganismen wie etwa Bakterien, farblosen und gefärbten Substanzen, Medikamenten, Landwirtschaftsmitteln, Parfüms, Nahrungsmitteln und Futtermitteln verwendet werden.
Übrigens sind die Chitinperlen und die Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung Wünschenswerterweise nicht-immunogen, wenn sie beispielsweise in menschliche Körper eingebettet werden.
Das Verfahren zum Herstellen der gleichförmigen und kleinen Partikel (der Chitinperlen und der Chitosanperlen) gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte des oralen oder perkutanen Inokulierens von mikrosporidalen Sporen in einer Konzentration von 5×10² bis 5×10⁸ Sporen/ml, vorzugsweise 5×10² bis 5×10⁷ Sporen/ml, in einen Insektenkörper, um so die mikrosporidalen Sporen zu proliferieren, Ernten der proliferierten mikrosporidalen Sporen aus dem aufgezogenen oder gewachsenen Insektenkörper, Reinigen der Sporen, um somit gleichförmige und feine Partikel (Chitinperlen) zu erhalten und falls notwendig, N-Deacetylierung des Chitins der Chitinperlen, um gleichförmige und feine partikelförmige Chitosanperlen zu erhalten. In dieser Hinsicht ist, falls die Sporenkonzentration weniger als 5×10² Sporen/ml ist, die Infektionsrate des Insekts mit den Sporen niedrig und es wird eine Zerstreuung in der Infektionsrate beobachtet, während, falls sie 5×10⁸ Sporen/ml übersteigt, das Insekt vor der vollständigen Ausbildung von Sporen im Insektenkörper getötet wird und daher die Verwendung derselben in solch einer Konzentration im Hinblick auf den Profit unerwünscht ist. Vorzugsweise ist die Zeit zum Inokulieren von Mikrosporen in den Insektenkörper gerade nach dem zweiten Instar-Larvenstadium und das Sammeln der Sporen wird ab dem fünften Instar-Larvenstadium begonnen. Das Insekt ist vorzugsweise Larven von domestizierten Seidenraupen.
Das Verfahren zum Herstellen von mikrosporidalen Sporen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise die Stufe des Hinzufügens von kultivierten Zellen, die aus einem Insekt stammen, zu einem Zellkulturmedium, das basierend auf dem Gewicht des Zellkulturmediums, 5 bis 50 Gew.-% und vorzugsweise 10 bis 40 Gew.-% des Überstands von Hämolymphe oder Humor von Larven der domestizierten Seidenraupe enthält, Inokulieren von mikrosporidalen Sporen in das Kulturmedium, um die Zellen so zu proliferieren und dann Wiedergewinnen der mikrosporidalen Sporen aus den proliferierten Zellen. In dieser Hinsicht unterlaufen, falls die zugegebene Menge an Überstand von Hämolymphe von Larven der domestizierten Seidenraupe weniger als 5 Gew.-% ausmacht und sie 50 Gew.-% übersteigt, die Sporen kaum irgendeine Proliferation. Weiterhin würden die Sporen weiter effizient proliferiert werden, falls die Menge von hinzuzugebendem Überstand in den oben definierten bevorzugten Bereich fällt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrogramm des Trockenpulvers (Chitinperlen) wie in Beispiel 2 hergestellt, das mit dem von Chitin als Standardprobe beobachteten verglichen wird.
Bester Ansatz zum Ausführen der Erfindung
Die in der vorliegenden Verwendung verwendeten Microsporozoa sind nicht auf irgendwelche besonderen beschränkt, solange sie Sporen aufweisen, die eine gewisse, perlenartige Form haben und deren Hauptzellwandsubstanz Chitin ist. Spezifische Beispiele solcher, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sind, beinhalten mikrosporidale Organismen, die zu den Genera Nosema gehören, wie etwa Nosema bombycis, Nosema bombycis (Nr. 402), Nosema bombycis (Nr. 408), Nosema bombycis (Nr. 520), Nosema bombycis (Nr. 611) und Nosema sp. (M11), Nosema sp. (M14); Vairimorpha (M12), Plestophola (M25), Plestophola (M27) und Thelophania sp.
Wirte zum Proliferieren von mikrosporidalen Sporen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten eine große Vielzahl von Insekten wie etwa die domestizierte Seidenraupe, der große Kohlweißling (Pieris brassicae), Hyphantria cunea, Aporia crataegi, Spilosoma subcarnea Walker, Philosamia cynthia arrinda, Philosamia cynthia. Unter diesen Insekten sind insbesondere die domestizierte Seidenraupe wünschenswert, bei der das Verfahren zum Züchten und die Techniken zum Züchten gut eingeführt sind und die von allen Seiten synthetisch untersucht worden ist, d.h. genetisch, thremmatologisch, physiologisch und ökologisch. Die Verwendung von Larven der domestizierten Seidenraupe würde die Herstellung einer großen Menge von mikrosporidalen Sporen gestatten. Um die mikrosporidalen Sporen herzustellen, wenn domestizierte Seidenraupen als Wirte verwendet werden, wird es bevorzugt, dass mikrosporidale Sporen oral oder perkutan in deren 2. Instar-Larvenstadium in einer Menge, die von 5×10² bis 5×10⁷ Sporen/ml pro Seidenraupe reicht, inokuliert werden, und dass eine große Menge von bis zu ihrem 5. Instar-Larvenstadium proliferierten mikrosporidalen Sporen isoliert und gereinigt werden. Falls mikrosporidale Sporen in das erste Instar-Larvenstadium der domestizierten Seidenraupe inokuliert würden, würden nämlich die damit inokulierten Seidenraupen vor der Ausbildung von mikrosporidalen Sporen getötet werden. Andererseits, falls die Protozoa von Nosema bombycis per se der domestizierten Seidenraupe verabreicht würden, würde es am effizientesten sein, dass die Sporen in jede Seidenraupe (der 2. Instar-Larve) in solch einer Weise inokuliert würden, dass die Aufnahme pro Seidenraupe gleich 5×10² bis 3×10³ Sporen ist und dass die mikrosporidalen Sporen aus den Larvenkörpern nach etwa 12 Tagen ab der Inokulation geerntet werden. In diesem Stadium beginnen die Larven zu sterben.
Wie oben diskutiert wurde, gestattet die vorliegende Erfindung die Ernte einer großen Menge der gewünschten mikrosporidalen Sporen in Insektenkörpern und kultivierten Zellen. In dieser Hinsicht können die Wirte Insekten wie etwa die domestizierte Seidenraupe sein, oder die Sporen können gleichermaßen unter Verwendung von kultivierten Zellen, die aus Säugern und einer großen Vielzahl anderer Wirbeltiere oder Wirbellosen erhalten werden, hergestellt werden. Die Insekten können nach der Inokulation der Sporen anhand üblicher Verfahren bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 32°C und vorzugsweise 25 bis 28°C aufgezogen werden. Andererseits werden kultivierte Zellen nach Inokulation mit Sporen wünschenswerterweise bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 30°C und vorzugsweise 25 bis 28°C inkubiert.
Beispiele von kultivierten Zellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind wie folgt:
Beispiele kultivierter Zellen, die aus domestizierten Seidenraupen stammen, sind Bombyx mori S.P.C. Bm36, Bombyx mori Bm N-4 und Bombyx mori SES-BoMo-15A; Beispiele solcher, die aus Antheraea pernyi stammen, beinhalten Antheraea pernyi NIS ES-AnPe-428; und Beispiele solcher, die aus Philosamia cynthia stammen, beinhalten Philosamia cynthia pernyi NIS ES-SaCy-12. Darüber hinaus beinhalten Beispiele von aus Sgilosoma imparilis Butler stammenden kultivierten Zellen Silosoma imparilis FRI-Splm-1229; und Beispiele solcher, die aus Mamestra brassicae stammen, beinhalten Mamestra brassicae-SES-MaBr-4.
Unter den vorstehend kultivierten Zellen gestattet Antheraea pernyi NIS ES-AnPe-428 die hocheffiziente Proliferation von mikrosporidalen Sporen in den kultivierten Zellkörpern bei Inkubationstemperaturen im Bereich von 20 bis 30°C, vorzugsweise 25 bis 28°C, wenn Grace-Kulturmedium verwendet wird, das 5 bis 50 % des Überstandes der Hämolymphe aus den domestizierten Seidenraupen-Larven enthält. Andere kultivierte Zellen als Antheraea pernyi NIS ES-AnPe-428 können in Flüssigkulturmedium inkubiert werden, das üblicherweise auf diesem Gebiet verwendet wird (YOKOTA et al., Kyushu Sanshi, 1995, 34).
Wenn diese Sporen unter Verwendung kultivierter Zellen inkubiert werden, gestattet das Hinzufügen von Überstand der Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe zum Kulturmedium in einer vorgegebenen Konzentration die leichte Proliferation der mikrosporidalen Sporen in den kultivierten Zellen und die Ausbildung einer großen Menge der Sporen. Die Menge des Überstands an Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe, der dem Kulturmedium zugegeben werden soll, um ökonomisch und effizient die mikrosporidalen Sporen herzustellen, reicht vorzugsweise von 10 bis 40 Gew.-%, basierend auf der Menge des Kulturmediums. Die Inkubationsbedingungen können dieselben sein wie diejenigen, die verwendet werden, wenn dem Kulturmedium keinerlei Überstand zugesetzt wird. Ein simples und effektives Verfahren zum Sammeln der Hämolymphe kann die Schritte des Abschneidens der Beine der 5. Instar-Larve der domestizierten Seidenraupe mit Scheren und Sammeln der Hämolymphe in einem Glasteströhrchen, das eisgekühlt ist, umfassen. Es wird bevorzugt, dass die derart gesammelte Hämolymphe bei 60°C für 15 Minuten in einem Wasserbad erhitzt wird, um die in der Hämolymphe enthaltenen Proteine auszufällen, gefolgt vom Entfernen der Proteine durch Dekantieren, um so einen Überstand der Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe zu erhalten, die für den praktischen Einsatz bereit ist.
Die Verwendung von aus Insekten erhaltenen kultivierten Zellen gestattet die einfache und effiziente Produktion von mikrosporidalen Sporen durch Tank-Inkubation ohne jegliche Restriktion bezüglich beispielsweise dem Züchten und Sammeln von Insekten und deren Beschaffung.
Wenn die mikrosporidalen Sporen Antheraea eucalypti-Zellen verabreicht werden, die aus Wildtyp-Seidenraupen erhaltene kultivierte Zellen sind, ist es effizient, mikrosporidale Sporen in kultivierten Zellkörpern gemäß einem Verfahren herzustellen, welches das direkte Inokulieren von mikrosporidalen Sporen in Zellen umfasst, die in einem kommerziell erhältlichen Zellkulturmedium vorliegen (beispielsweise von der Gibco Company erhältlichen Grace-Kulturmedium), zu welchem der Überstand der Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe in einer Menge von maximal 40 % zugegeben wird.
Die durch Insekten oder durch aus Insekten stammenden kultivierten Zellen hergestellten Sporen, die mit dem mikrosporidalen Sporen inokuliert werden, haben eine starke Fähigkeit zum Infizieren der domestizierten Seidenraupe und daher werden die so gesammelten Sporen wünschenswerterweise durch ihre Behandlung mit Formalin oder einem Alkohol oder durch Einwirkung von Hitze entgiftet, um jegliche Kontamination der domestizierten Seidenraupen mit den Sporen zu verhindern. Die mikrosporidalen Sporen, die per se nach der Entgiftung derselben erhalten werden, können als feine Chitinpartikel (Chitinperlen) verwendet werden, die in Wasser unlöslich sind.
Die Reinigung der proliferierten mikrosporidalen Sporen beim Herstellen von Chitinperlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße gemäß der vorliegenden Erfindung kann wie folgt durchgeführt werden. Die Insektenlarven, in deren Körpern die mikrosporidalen Sporen proliferiert sind, werden beispielsweise in einer 0,85 %-igen wässrigen Natriumchloridlösung pulverisiert, gefolgt von einem Filtern der wässrigen Lösung durch eine absorbierende Baumwollschicht, um so die Sporen zu sammeln und dann zweifach wiederholtem Zentrifugieren unter Verwendung eines Zentrifugenseparators, dann Laden der Sporen auf eine Schicht Percoll (Handelsname), das von der Pharmacia Company, Schweden, erhältlich ist und Zentrifugieren bei 3000 upm für 30 Minuten, um so die mikrosporidalen Sporen zu reinigen.
Die N-Deacetylierungs-Behandlung zum Umwandeln von Chitin in Chitosan kann gemäß dem üblichen Verfahren ausgeführt werden, das beispielsweise die Schritte des Behandelns von Chitinperlen der mikrosporidalen Sporen in einer 30 bis 50 %-igen wässrigen Natriumhydroxidlösung bei Temperaturen im Bereich von 80 bis 120 °C für mehrere Stunden umfasst, um Chitin als eine Zellwandsubstanz zu deacetylieren und damit die Chitinperlen in Chitosanperlen umzuwandeln. Bei diesem Verfahren können konventionell vorbekannte Reagenzien und Bedingungen für die N-Deacetylierung verwendet werden, wie etwa der pH (Brine et al., Comp. Biochem. Physiol., 1983, 69B, S. 283).
Die Zellwandsubstanzen der Chitinperlen und der Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen aus nicht-immuogenem Chitin, Chitosan und Glukan, wie auch aus immunogenen Proteinen. Diese Proteine können mit einer Säure und/oder einer Lauge hydrolisiert werden, um sie so herauszulösen und zu entfernen, ohne dass die Perlen eine Veränderung ihrer Form während der Behandlung erfahren. Die Hydrolysebehandlung wird bei Temperaturen im Bereich von 5 bis 35 °C für 1 bis 25 Stunden, vorzugsweise 20 bis 25 °C für 8 bis 15 Stunden und bevorzugtererweise bei Raumtemperatur für 10 bis 12 Stunden unter Verwendung von 0,1 bis 3N, vorzugsweise 0,5 bis 2N und bevorzugtererweise 0,9 bis 1,3N wässriger Lösung von Natriumhydroxid oder Wasserstoffchlorid ausgeführt, um so nicht-immunogene Perlen zu erzeugen. Die Hydrolysebehandlung kann zuerst mit einer wässrigen Säurelösung und dann mit einer wässrigen Laugenlösung ausgeführt werden oder die Behandlung kann zuerst mit einer wässrigen Laugenlösung und dann mit einer wässrigen Säurelösung ausgeführt werden. Es ist wünschenswert, einen Zyklus zumindest mehrere Male (vorzugsweise 5 mal) zu wiederholen, wobei jeder Zyklus eine Säurebehandlung und eine Laugenbehandlung umfasst. Schließlich werden die sich ergebenden Sporen mit Wasser gewaschen und dann mit Ethanol in einer Konzentration von nicht weniger als 95 Gew.-% für eine vorgegebene Zeit gewaschen, um die Sporen zu sterilisieren und dehydrieren. Somit können die Proteine als Zellwandsubstanzen der mikrosporidalen Sporen vollständig eliminiert werden.
Um Antibiotika, Bakterien, physiologisch aktive Substanzen, Medikamente und lebende Zellen auf den mikrosporidalen Sporen zu immobilisieren oder in die Sporen einzuführen, würde es effektiv sein, feine Poren auf oder durch die Zellwände der mikrosporidalen Sporen auszubilden. Diese feinen Poren können in den mikrosporidalen Sporen nach irgendeinem Verfahren ausgebildet werden, das nicht besonders beschränkt ist, wobei aber die folgenden zwei Verfahren bevorzugt werden:

(i) Ein Verfahren, welches den Schritt des Mischens gleicher Mengen einer 1-6 Gew.-%igen H₂O₂-Lösung und einer Sporensuspension umfasst; und
(ii) Ein Verfahren, welches die Schritte des Eintauchens von mikrosporidalen Sporen in eine 0,2N KOH-Lösung, die bei 25 °C für 30 Minuten gehalten wird, und dann Einstellen des pH-Werts der Eintauchlösung auf ein neutrales Niveau durch Hinzufügen eines Phosphatpuffers mit einem pH von 7,2 in kleinen Portionen umfasst.

Falls die zellulären Substanzen in den Sporen durch Behandlung der mikrosporidalen Sporen mit einer wässrigen Laugenlösung aktiviert werden, werden die intrazellulären Substanzen aus den Sporen nach außen freigesetzt, um so feine Poren auf oder durch die Sporenwandung auszubilden, die einen Durchmesser in der Größenordnung von beispielsweise etwa 0,1 bis 0,3 μm abhängig von der Größe der Sporen aufweisen und die derart auf oder durch die Wand der mikrosporidalen Sporen ausgebildeten feinen Poren können entsprechend verwendet werden. Genauer gesagt werden die mikrosporidalen Sporen zuerst bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 20 °C für 30 Minuten unter Verwendung einer 0,2N wässrigen Lösung von Kaliumhydroxid behandelt, dann mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,2 neutralisiert, um die zellulären Substanzen, die in den Sporen vorhanden sind zu aktivieren. Somit werden feine Poren ausgebildet, wenn die in den Sporen vorhandenen intrazellulären Substanzen in das für die Inkubation der kultivierten Insektenzellen verwendete Kulturmedium freigesetzt werden.
Die mikrosporidalen Sporen per se wirken nach der Proliferation als Antigene, aber die Chitinperlen und die Chitosanperlen, aus denen die Zellwandsubstanzen, d.h. Proteine, durch die Säure und/oder Laugenhydrolyse entfernt worden sind, weisen keine Funktion als ein Antigen auf, wie oben diskutiert worden ist.
Wie oben beschrieben, gestattet die vorliegende Erfindung die Herstellung von Chitinperlen mit einer sphärischen Form oder einer elliptisch-sphärischen Form mit einer Größe im Bereich mehrerer Mikrometer (μm) und gleichförmiger und feiner Partikelgröße, wie auch die Herstellung von Chitosanperlen durch N-Deacetylierung der Chitinperlen, falls mikrosporidale Sporen verwendet werden, die dazu in der Lage sind, in Insektenkörpern oder kultivierten Zellen beachtlich proliferiert zu werden. Zusätzlich gestattet die vorliegende Erfindung auch die Herstellung von Perlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße, die nicht einfach gemäß konventionellen Verfahren hergestellt werden können, insbesondere von Perlen mit einer Partikelgröße in der Größenordnung von etwa 1 bis 6 μm und frei von jeglichem Streuung der Partikelgröße, wie auch hohlen Chitosanperlen. Die Chitinperlen und die Chitosanperlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße und hergestellt gemäß einem solchen Verfahren, können als Träger für Medikamentenzufuhrsysteme und Materialien für kosmetische Grundlagen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung gestattet die Herstellung dieser Chitinperlen und Chitosanperlen in einer Vielzahl von Größen, abhängig von den Arten von verwendeten Mikrosporozoen. Darüber hinaus können, falls Enzyme oder lebende Zellen auf den Chitosanperlen anhaften oder immobilisiert sind, die Perlen verwendet werden, um einen für die Nahrungsmittelindustrie und andere verschiedene industrielle Gebiete nützlichen Bioreaktor zu bilden.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen hochreaktive chemische Komponenten und daher kann ein Enzym oder ein immunologischer Antikörper chemisch oder physikalisch an der Oberfläche dieser Perlen angebunden werden. Falls beispielsweise Antigen-/Antikörper wie Immunoglobulin auf der Partikeloberfläche und/oder im Inneren der Partikel immobilisiert wird, kann das sich ergebende Produkt als ein immunologischer Träger verwendet werden. Darüber hinaus sind modifizierte Chitinperlen, die durch Umwandeln der Chitingruppe derselben durch eine chemische Reaktion in Glykolchitin und Carboxymetylchitin umgewandelt werden, hinsichtlich ihrer Feuchterückhalteeigenschaft exzellent und können daher als Material für Kosmetika verwendet werden. Falls eine Vinylkomponente auf den mikrosporidalen Sporen oder den Chitinperlen implantiert wird und dann ein Enzym wie etwa α-Amylase auf den implantierten Chitinperlen immobilisiert wird, gestatten darüber hinaus die Perlen nicht nur die Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität, sondern gestatten auch das Ausführen noch einer weiteren effizienten Enzymaktivität, während das beste aus den charakteristischen Eigenschaften der feinen Partikel gemacht wird, d.h. eine sehr große effektive Oberfläche.
In dem Fall, dass die Chitinperlen und die Chitosanperlen aus Insekten stammen, bestehen die nach der Hydrolysebehandlung erhaltenen Zellwandsubstanzen dieser Perlen aus beispielsweise Chitin, Chitosan und Glucan, was alles Komponenten sind, die schwerlich als Antigene dienen, wie oben diskutiert worden ist. Aus diesem Grund sind diese Chitinperlen und die Chitosanperlen frei von jeglicher Antigen-/Antikörperreaktion, selbst wenn man sie in Tierkörper einschließlich menschlicher Körper als Träger für eine verzögerte Freisetzung einbettet. Dies liegt daran, dass die mikrosporidalen Sporen, aus denen die Proteine in den Zellwandsubstanzen entfernt werden, ihre Immunogenität verlieren. Darüber hinaus würden die Chitinperlen und die Chitosanperlen sich durch die Wirkung der in den Körpern vorhandenen Enzyme nach einer gewissen Zeitperiode zersetzen und können daher als sichere Materialien verwendet werden, die dazu in der Lage sind, in lebenden Körpern zersetzt zu werden.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung können Hohlperlen sein, die einen leeren Raum in sich umfassen und in diesem Fall werden feine Poren auf dem und/oder durch das Zellwandgewebe ausgebildet. Dementsprechend können lebende Zellen, Bakterien, Antibiotika, biologisch aktive Substanzen in diese feinen Poren in einer unter einem verminderten Druck gehaltenen Umgebung eingeführt werden. Wenn Mikroorganismen wie etwa Bakterien in die Perlen eingekapselt werden, werden die darin eingekapselten Mikroorganismen nicht leicht durch externe Faktoren, die zum Modifizieren von Proteinen in der Lage sind, wie etwa ultraviolette Lichtstrahlen, beeinträchtigt, und daher können diese Perlen als Materialien zum Schützen der natürlichen Feindmikroorganismen vor der Wirkung solch externer Faktoren verwendet werden.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung können beispielsweise als Trägersubstanz für die Affinitätschromatographie, Träger für Zellkultur und Hilfsagenzien für Medikamente verwendet werden und zeigen exzellente charakteristische Eigenschaften als Basismaterialien zum Einkapseln, von Medikamenten, biologisch aktiven Substanzen, Hormonen, Vakzinen in Mikrokapseln. Mikrokapseln, bei denen beispielsweise landwirtschaftliche Chemikalien oder Düngemittel in die mikrosporidalen Sporen, die Chitinperlen oder die Chitosanperlen eingekapselt werden, können als Bodenkonditionierer verwendet werden und solche, die durch Einkapseln von Futterverbindungen oder Nahrungsmitteln, die ihre Wirkung in extrem kleiner Menge oder einer Spurenmenge zeigen, in die Chitinperlen oder Chitosanperlen erhalten werden, können als Zuführmittel für Haustiere oder für Fischkulturen verwendet werden. Zusätzlich weisen mikrosporidale Sporen, Chitinperlen oder Chitosanperlen, in welchen Bakterien eingekapselt sind oder auf welchen sie immobilisiert sind, einen Schutzeffekt für diese Bakterien gegenüber Bestrahlung mit ultravioletten Lichtstrahlen auf und demgemäss können sie als Materialien zum Schützen von Organismen verwendet werden. Insbesondere falls die Chitinperlen und die Chitosanperlen eine gleichförmige Partikelgröße aufweisen, können sie in speziellen Anwendungen beispielsweise auf dem Gebiet der Feinchemikalien verwendet werden. Darüber hinaus können die Chitin- und Chitosankomponenten gemäß der vorliegenden Erfindung umfassenden Mikrokapseln, wenn sie auf drucksensitives Kopierpapier aufgebracht werden, die Trocknungscharakteristiken des Papiers während Schmierverfahren verbessern und auch eine beachtliche Verbesserung der Farbentwicklungs- und Druckcharakteristiken des Kopierpapiers gestatten.
Somit können die Chitin- und Chitosanfeinpartikel wirksam in einer großen Vielzahl von Gebieten wie etwa Landwirtschaft, Industrie, Medizinwissenschaft und Nahrung eingesetzt werden.
Wie oben diskutiert, können beim Bestrahlen mit Ultraviolettlichtstrahlen mikrosporidale Sporen, die Chitinperlen und die Chitosanperlen, in denen Mikroorganismen, wie etwa Bakterien, oder physiologisch aktive Substanzen eingeschlossen sind, das Chitin und Chitosan als Hauptzellwandsubstanzen die Energie von ultravioletten Strahlen durch Absorption der ultravioletten Strahlen blockieren. Dementsprechend können sie die biologischen und physiologischen Aktivitäten von beispielsweise den Mikroorganismen wie etwa Bakterien und physiologisch aktiven Substanzen, die in den mikrosporidalen Sporen, den Chitinperlen und Chitosanperlen eingebettet sind, über eine lange Zeitperiode erhalten. Somit sind die mikrosporidalen Sporen, die Chitinperlen und die Chitosanperlen effektiv beim Hemmen jeglicher Verminderung der Aktivität von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien, und physiologisch aktiven Substanzen, die in ihnen eingeschlossen sind.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung, aus denen die Proteine entfernt worden sind, wirken kaum als Antigene, selbst wenn sie in lebende Gewebe eingebettet sind, und beeinträchtigen den lebenden Körper nicht negativ. Daher kommt es zu überhaupt keinem Problem aufgrund einer Antigen-Antikörperreaktion, selbst falls ein Medikament mit physiologischer Aktivität auf den Perlen immobilisiert wird und die sich ergebenden Perlen in lebende Körper wie etwa menschliche Körper eingebettet werden. Aus diesem Grund können dien Chitinperlen und die Chitosanperlen, in denen ein Medikament, insbesondere eines, das einen Antikrebseffekt zeigt, eingekapselt ist, in einem medizinischen Frontgebiet als Geschossträger zum Behandeln spezifischer Läsionen verwendet werden.
Darüber hinaus gestatten diese Perlen die einfache Steuerung der verzögerten Freisetzungsrate, der verzögerten Freisetzmenge und das Ausmaß der Biodegradierung von beispielsweise Medikamenten, physiologisch aktiven Substanzen und Antibiotika, die in den Perlen eingekapselt oder getragen sind, indem das Ausmaß der Hydrolyse korrekt eingestellt wird oder der Grad von durch Aktivieren der zellulären Substanzen in den mikrosporidalen Sporen ausgebildeten feinen Sporen gesteuert wird, so dass die Sporen daher ihren Inhalt extrazellulär ausstoßen.
Beispiele:
Die vorliegende Erfindung wird untenstehend detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Arbeitsbeispiele und Vergleichsbeispiele beschrieben werden, aber die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf diese spezifischen Beispiele beschränkt. Übrigens sind verschiedene Spezies von Mikrosporozoen bekannt, aber in den nachfolgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen wurden aus Larven der domestizierten Seidenraupe stammende Nosema Bombycis Spezies verwendet, wenn nicht anders angegeben.
In den nachfolgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen wurden die Aktivität und Immunogenität gemäß den folgenden Verfahren evaluiert.
A. Evaluierung der bakteriellen Aktivität
Halbsynthetisches Wakimoto Kulturmedium oder King B Kulturmedium (15 ml), welches unter Erwärmen aufgelöst und dann bei 55 °C gehalten worden war, wurde mit 2 ml einer die Sporen von zu untersuchenden Bakterien enthaltenden Flüssigkeit (Konzentration 10⁹ bis 10¹⁰ Sporen/ml) gemischt und die sich ergebende Mischung wurde in eine Petrischale gegossen, um somit dieselbe in einer plattenartigen Form zu verfestigen. Eine Testprobe (10μl) wurde tropfenweise dem bakterienflüssigkeitsgemischten Plattenkulturmedium zugegeben, woraufhin die Temperatur desselben für 2 Tage bei 20 bis 25 °C gehalten wurde, und dann wurde die Evaluierung des Hemmungsgrads der Bakterienproliferation im Kulturmedium, das gerade unter der Testprobe vorhanden war, gemäß den folgenden 5 Stufenkriterien durchgeführt:

+++:: Starke Hemmung (die Bakterien proliferierten überhaupt nicht und die Transparenz des Kulturmediums war so hoch wie transparentes Glas);
++:: Fast starke Hemmung;
+:: Schwache Hemmung (die Bakterien durchliefen eine leichte Proliferation und die Transparenz des Kulturmediums lag zwischen Transparentglas und Milchglas;
±:: Etwas Hemmung (die Proliferation der Bakterien war etwa 1/5 und die Transparenz des Kulturmediums entsprach der von Milchglas);
-:: Die Bakterien waren hinreichend proliferiert und das Kulturmedium war opak.

B. Verfahren zum Inspizieren von Perlen auf antibakterielle Aktivität bei Schimmelpilzen
PSA Kulturmedium, welches unter Erwärmen gelöst und dann bei 55 °C gehalten wurde, wurde mit 2 ml einer die Sporen von zu untersuchendem Schimmelpilz enthaltenden Flüssigkeit gemischt (Konzentration 10⁵ bis 10⁶ Sporen pro ml) und dann wurde die sich ergebende Mischung in eine Petrischale gegossen, um so dieselbe in einer plattenartigen Form zu verfestigen, gefolgt von demselben Verfahren und derselben Beobachtung, wie sie bei der vorstehenden Evaluierung bakterieller Aktivität verwendet wurden.
C. Evaluierung der Immunogenität
Ein Antiserum gegen mikrosporidale Sporen wurde wie folgt hergestellt. Sporen, die unter Verwendung von Larven der domestizierten Seidenraupe erfolgreich gezogen worden waren, wurden nach Percoll-Dichtegradientzentrifugation gereinigt, einer Zentrifugation bei 2000 upm für 10 Minuten unterworfen, gefolgt vom Aufnehmen der präzipitierten Sporen in einer 0,85 %-igen NaCl-Lösung, um eine Sporensuspension (2×10⁸ Sporen/ml) zu ergeben, die als Antigen verwendet werden sollte, Mischen der Suspension mit einer gleichen Menge von Freundschem komplettem Adjuvans und intramuskulärem Injizieren von 2,0 ml der sich ergebenden Mischung einmal in jedes Kaninchen. Danach wurde 1 ml jeder der Sporenlösungen intravenös vier Mal in jedes Kaninchen injiziert, in Intervallen von einer Woche, und das Blut wurde sieben Tage nach der letzten Injektion gesammelt. Das Serum wurde bei 56 °C für 30 Minuten inaktiviert und bei –20 °C gelagert.
Das Antigen für die Agglutinationsreaktion wurde durch Behandeln der gereinigten mikrosporidalen Sporen mit 1 % Formaldehyd, dann Waschen mit destilliertem Wasser durch Zentrifugation und Aufnehmen der Sporen in einer 0,85 % NaCl-Lösung hergestellt (4×10⁷ Sporen/ml).
Das vorstehende Antiserum wurde mit einer 0,85 % NaCl-Lösung gemäß der Zweifachserienverdünnungsmethode verdünnt, dann mit einer gleichen Menge der Sporensuspension auf einem Objektträger gemischt, gefolgt davon, dass sie bei 37 °C für eine Stunde reagieren konnten, und Beobachten durch ein Umkehrmikroskop, um so den Agglutinintiter zu bestimmen. Das Verdünnungsverhältnis des Antikörpers (Antiserum) wurde auf 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 und 2040 eingestellt und die Evaluierung wurde gemäß den folgenden zweistufigen Kriterien ausgeführt:

+:: Es wurde eine Antigen-/Antikörperreaktion beobachtet;
-:: Es wurde überhaupt keine Antigen-/Antikörperreaktion beobachtet.

Beispiel 1
Verschiedene mikrosporidale Sporen wurden in Larven der domestizierten Seidenraupe inokuliert, gefolgt vom Inkubieren derselben, um so den Namen der Spezies verschiedener Arten von mikrosporidalen Sporen zu untersuchen, die aus den Larven der domestizierten Seidenraupe isoliert werden konnten, der Größe der Sporen und deren Immunogenität. Als Mikrosporozoen wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt, Nosema bombycis* (Standardspezies, Nosema bombycis Nageli, verwendet für den Vergleich der charakteristischen Eigenschaften mit solchen anderer Mikrosporozoen), Nosema bombycis (Nr. 402), Nosema bombycis (Nr. 408), Nosema bombycis (Nr. 520), Nosema bombycis (Nr. 611), Nosema sp. (M 11), Vairimorpha (M12), Nosema sp. (M14), Plestophola (M25), Plestophola (M27) und Thelophania sp. verwendet. Die durch die Untersuchung erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt.
Die verwendeten mikrosporidalen Sporen hatten allgemein elliptische Formen, wobei die Haupt- und Nebenachsen der Ellipse 3 bis 5 μm bzw. 1 bis 3 μm betrugen und es wurde festgestellt, dass Form und Größe der mikrosporidalen Sporen fast ganz durch die Art des entsprechenden Mikrosporozoons bestimmt war. Genauer gesagt gestattet die vorliegende Erfindung die willkürliche Produktion von Chitinperlen und Chitosanperlen mit gleichförmigen Formen durch geeignete Auswahl einer bestimmten Art von Mikroporozoon. Die Hauptachsen der verschiedenen Arten von mikrosporidalen Sporen haben maximal etwa 5 μm und demgemäss kann das für eine gewünschte Anwendung passende Mikrosporozoon ausgewählt und verwendet werden. Zusätzlich sind in Tabelle 1 auch die Parasitenorte in Seidenraupen aufgeführt. Tabelle 1
Die oben erwähnten Nosema bombycis* (Nosema bombycis Nageli als Standardspezies), Nosema sp. (M11) und Vairimorpha (M12) sind im Nationalinstitut für Serikulturen und Entomologische Wissenschaft des Ministeriums für Landwirtschaft, Forst und Fischerei unter den Registrierungsnummern 860001, 860004 und 860005 erhältlich und könnten vom Institut durch einen Fachmann zum Zeitpunkt des Prioritätsdatums dieser Anmeldung erhalten werden. Zusätzlich sind diese Mikrosporozoen bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA unter dem Budapester Abkommen am 23. März 1998 hinterlegt worden, wobei die Bezeichnungen der Hinterlegungen von Nosema bombycis Nageli: 209694, von Nosema sp. M11: 209693 bzw. von Vairimorpha M12: 209692 sind. Die derart hinterlegten Mikrosporozoen könnten von dritter Seite von der ATCC erhalten werden.
Beispiel 2
Unter Verwendung von Mikrosporozoenprotozoen von Nosema bombycis*, Nosema sp. (M11) und Plestophola sp. (M27), wie in der vorstehenden Tabelle 1 offenbart, wurden mikrosporidale Sporen (jeweils 3×10³ Sporen/ml) jedes Protozoon oral in jede der zweiten Instar-Larvenformen domestizierter Seidenraupen (Nichi (Japan) Nr. 135×Shi (China) Nr. 135) oral inokuliert, gefolgt von der Proliferation der mikrosporidalen Sporen innerhalb der Seidenraupenkörper, Herausholen der sich ergebenden Sporen aus den Seidenraupenkörpern, Lyophilisieren derselben bei –30 °C und dann Trocknen derselben in einer Lyophilisiervorrichtung, die von der Tozai Tsusho K.K. erhältlich ist, um ein Trockenpulver zu erhalten. Um kurz und qualitativ das aus der Sporenenthaltenden Flüssigkeit gewonnene Trockenpulver bezüglich der chemischen Komponenten zu inspizieren, wurde die Trockenpulverprobe mit Lithiumbromid gemischt, in ein Pellet oder eine Tablette umgewandelt, gefolgt von deren Inspektion bezüglich Infrarotabsorptionsspektra innerhalb des Wellenlängenbereichs von 900 bis 1200 cm^–1 unter Verwendung eines Infrarotspektrometers, das von der Nippon Bunko Kogyo K.K. erhältlich ist. Diesbezüglich wurde von der Wako Pure Chemical Co., Ltd. erhältliches Chitin als Standard- oder Kontrollprobe verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in 1 aufgezeichnet. In 1 zeigen das kommerziell erhältliche Chitin eine IR Absorptionsspektralkurve a und die aus Nosema bombycis, Nosema sp. und Plestophola sp. als Mikrosporozoenprotozoen erhaltene Chitinprodukte zeigen die IR Absorptionsspektralkurven b, c bzw. d. Im IR Absorptionsspektraldiagramm der sich ergebenden Chitinstandardprobe wurden Absorptionsbanden bei Wellenzahlen von 985, 1025, 1065, 1100, 1145 cm^–1 beobachtet. Es wurden praktisch identische Absorptionsbanden innerhalb praktisch dem gleichen Wellenzahlenbereich (1000 bis 1200 cm^–1) wie für die Chitinstandardprobe beobachtet, unabhängig von den Arten von Mikrosporozoenprotozoen. Dies zeigt klar an, dass Chitin eine Hauptkomponente ist, welche die Zellwand der verschiedenen Arten von mikrosporidalen Sporen bildet.
Darüber hinaus konnten dieselben Ergebnisse wie oben beobachtet selbst dann erhalten werden, wenn die orale Inokulation durch eine perkutane Inokulation ersetzt wurde.
Zusätzlich können mikrosporidale Sporen, deren Zellwand hauptsächlich aus Chitin besteht, wie die vorstehenden Sporen, erhalten werden, wenn als Wirte für die mikrosporidalen Sporen der große Kohlweißling (Pieris brassicae), Hyphantria cunea, Aproia crataegi, Spilosoma subcarnea Walker, Philosamia cynthia arrinda, Philosamia cynthia anstelle von domestizierten Seidenraupen verwendet werden.
Beispiel 3
Um kristalline Formen von denselben wie in Beispiel 2 verwendeten Mikrosporazoenprotozon erhaltenen getrocknetem Sporenpulver qualitativ zu analysieren, wurden Röntgendiffraktionsmuster unter Verwendung eines Röntendiffraktometers (erhältlich von der Rigaku Denki K.K.) erhalten. Die gemessenen interplanaren Abstände der sich ergebenden Proben sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammen mit solchen, die für die Standardchitinprobe beobachtet wurden, aufgeführt. Alle Röntgendiffraktionsmuster dieser Proben zeigten Diffraktionsmuster, die den interplanaren Abständen von 8,53, 6,70, 4,64 und 3,31 A entsprachen, aber sie waren alle von einer weiten Halobildung begleitet. Andererseits wurde im für die Chitinstandardprobe beobachteten Röntgendiffraktionsmuster eine Röntgendiffraktion entdeckt, die den interplanaren Abständen von 9,30, 6,90, 4,64, 3,36, 3,00 und 2,81 Å entsprachen und dies war den für die Sporen beobachteten Röntgendiffraktionsmustern ähnlich. Damit ist ebenfalls bestätigt, dass die, die Zellwände der mikrosporidalen Sporen bildende Hauptsubstanz Chitin ist. Tabelle 2
Beispiel 4
Die aus dem Mikrosporozoon Nosema bombycis* (das ATCC 209694 entspricht), das im Nationalen Institut für Serikultur- und Entomologische Wissenschaft des Ministerium für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei gelagert ist, erhaltenen Sporen wurden als Sporenprobe verwendet, die mikrosporidalen Sporen (3×10³ Sporen/ml) wurden in jede der zweiten Instarlarven der domestizierten Seidenraupe (Nichi (Japan) Nr. 135×Shi (China) Nr. 135) oral inokuliert. Eine sehr große Menge der mikrosporidalen Sporen wurden innerhalb der Larvenkörper der domestizierten Seidenraupe proliferiert, was zu Sporulation führte und demgemäss litten alle Larven der domestizierten Seidenraupe an Mikrosporidiosis und starben während des 5. Instar Stadiums an der Krankheit. Die getöteten Larven wurden in einer 0,85 %-igen wässrigen NaCl-Lösung pulverisiert und dann durch eine absorbierende Watteschicht gefiltert, um die gewonnenen Sporen zu sammeln. Die Aufreinigung der Sporen wurde durch Beladen von zwei Teilen einer Sporensuspension in einer 0,85 %-ige wässrige NaCl-Lösung auf acht Teile Percoll (Handelsname, erhältlich von Pharmacia in Schweden) und dann Unterwerfen einer Zentrifugation bei 3000 upm und 20°C für 30 Minuten durchgeführt.
Die Anzahl von aus einer Larve der domestizierten Seidenraupe erhaltenen Nosema bombycis-Sporen wurde als insgesamt etwa 1×10¹⁰ festgestellt. Die wässrige Suspension der Sporen wurde getrocknet, um 100 ml pulverförmiger Sporen zu ergeben.
Die oben erwähnten Nosema bombycis könnten vom Nationalen Institut für Serikultur- und Entomologische Wissenschaft im Ministerium für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei von einem Fachmann zum Zeitpunkt des Einreichungsdatums dieser Anmeldung erhalten werden.
Beispiel 5
Die Sporulierung des Mikrosporozoon Nosema bombycis* in kultivierten Antheraea eucalypti Zellen wurde wie folgt untersucht. Kultivierte Zellen von Antheraea eucalypti wurden in kommerziell erhältliche Zellkulturmedien (Grace Kulturmedium, von Gibco Company erhältlich) inokuliert, denen verschiedene Mengen von Serum domestizierter Seidenraupen (der Überstand der aus domestizierten Seidenraupen erhaltenen Hämolymphe) hinzugefügt wurden, gefolgt von Hinzufügen einer konstanten Menge der Sporen von Mikrosporozoon (Nosema bombycis), Inkubation derselben für eine vorgegebene Zeit und Bestimmung der in einem Einheitsvolumen des Kulturmediums (1 ml) enthaltenen Sporen unter Verwendung eines Hämozytometers durch mikroskopische Beobachtung. Die Beine der fünften Instarlarven der domestizierten Seidenraupe wurden mit Scheren abgeschnitten, gefolgt vom Aufnehmen der Hämolymphe in einem Glasteströhrchen, das eisgekühlt war, Erhitzen der aufgenommenen Hämolymphe bei 60 °C für 15 Minuten in einem Wasserbad, um damit die in der Hämolymphe enthaltenen Protein zu entfernen und damit einen Überstand der Hämolymphe zu ergeben, der in diesem Beispiel 5 verwendet wurde. Die Ergebnisse der Messungen sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, sind, falls der Überstand der Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe zum Kulturmedium in einer vorgegebenen Konzentration bei Proliferation der kultivierten Zellen zugegeben wird, die mikrosporidalen Sporen in den kultivierten Zellen leicht und beachtenswert proliferiert, um damit eine große Menge an Sporen zu bilden. Die Menge des Überstands der Hämolymphe der domestizierten Seidenraupe, die für eine ökonomische und effiziente Produktion der mikrosporidalen Sporen hinzugegeben werden sollte, ist in allgemeinen Bereichen von etwa 5 bis 50 Gew.-% und vorzugsweise etwa 10 bis 40 Gew.-%, basierend auf dem Gewicht des Kulturmediums. Tabelle 3
Beispiel 6
Die Proliferation von mikrosporidalen Sporen in den kultivierten Zellen wurde unter Verwendung von aus anderen als den in Beispiel 5 verwendeten Insekten erhaltenen kultivierten Zellen untersucht. Nosema bombycis* und Nosema sp. (M 11) wurden in verschiedene Arten von kultivierten Insektenzellen inokuliert, um so jegliches Anwachsen in der Zahl von in den kultivierten Insektenzellen proliferierten mikrosporidalen Sporen zu untersuchen. In dieser Hinsicht war das Verfahren zum Proliferieren der kultivierten Zellen dasselbe wie das in Beispiel 5 verwendete und Menge des zum Kulturmedium hinzuzugebenden Hämolymphe-Überstandes wurde auf 0 bis 20 % eingestellt, basierend auf dem Gewicht des Zellkulturmediums. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4
Beispiel 7
Chitosan-Mikrosporen wurden aus den Zellwandsubstanzen von Sporen von Mikrosporozoon Nosema bombycis* gemäß der nachfolgenden Methode hergestellt, die im vorstehenden Beispiel 4 hergestellt wurden. Zuerst wurden die mikrosporidalen Sporen in einer 40 %-igen Natriumhydroxidlösung bei 80 °C für 4 Stunden behandelt, gefolgt vom Hinzufügen von Wasser, um ein Auswaschen auszuführen. Als Ergebnis wurde das Chitin als Hauptkomponente der Zellwände der Mikrosporen einer N-Deacetylierungsbehandlung unterworfen. Als jede mikrosporidale Spore durch ein optisches Mikroskop und ein Rasterelektronenmikroskop untersucht wurde, wurde bestätigt, dass die mikrosporidale Spore nicht aufgelöst war, selbst wenn sie einer N-Deacetylierung unterworfen war, und auch die Form der Mikrospore erhalten geblieben war.
Beispiel 8
Es wurde ein Antibiotikum an das Zellwandgewebe von 2 mg der pulverförmigen Chitinsporen adsorbiert, die durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 4 behandelte Nosema bombycis Sporen waren, deren Gehalt an Sporen durch Hydrolyse gemäß dem nachfolgenden Verfahren entfernt worden ist. Die vorstehende Hydrolyse wurde ausgeführt, indem zuerst mit 1N NaOH behandelt wurde, das für 12 Stunden bei Raumtemperatur gehalten wurde, und dann mit einer 1N HCl für 12 Stunden (diese NaOH und HCl-Behandlungen bildeten einen Hydrolysezyklus). Nach Wiederholen von insgesamt 5 Hydrolysezyklen wurden die Sporen abschließend mit 95 % Ethanol für zwei Stunden behandelt, um sie zu dehydrieren. Damit waren die Proteine als Zellwandsubstanzen der mikrosporidalen Sporen vollständig aus den Sporen entfernt. Zusätzlich wurde die Adsorption des Antibiotikums auf den Sporen durch Einführen einer Lösung von 10 mg von Rifampicin oder Tetracyclin, die in 3 ml destillierten Wasser gelöst waren, und der vorstehenden Chitinsporen in ein Röhrchen, dreimaliges Wiederholen von Druckminderungsentgasungszyklen des Röhrchens unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe und weiterhin Anlegen von Ultraschall am Röhrchen für 10 Minuten ausgeführt, so dass das Antibiotikum in die Zellwandgewebe eindringen konnte. Dann wurde das Röhrchen bei 2500 upm für 20 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge zentrifugiert, um damit die Chitinsporen, welche die Antibiotikumsmoleküle enthielten, zu präzipitieren. Weiterhin wurden dem Röhrchen 10 ml destilliertes Wasser zugegeben, gefolgt von einer Zentrifugation, dem Entfernen des Überstands durch Dekantieren, um damit die Rifampicin oder Tetracyclin enthaltenden Chitinsporen zu isolieren.
Ob Rifampicin oder Tetracyclin auf den Nosema bombycis Sporen gehalten wurde oder nicht, wurde wie folgt bestätigt. Die durch dreimaliges gründliches Waschen mit Wasser und dann Wiedergewinnen durch Zentrifugation bei 3000 upm für 20 Minuten erhaltenen Nosema bombycis Sporen wurden hinsichtlich ihres Inhibitionsgrads der Proliferation eines Erregerbakteriums der bakteriellen Tomatenfäule (Clavibactor michiganensis pv michiganensis) inspiziert. Im Ergebnis konnten selbst die Nosema bombycis Sporen, die mehrfach mit Wasser gewaschen worden waren, jegliche Proliferation des Erregerbakteriums der bakteriellen Tomatenfäule vollständig hemmen und somit wurde beurteilt, dass das Antibiotikum auf den Sporen getragen wurde.
Beispiel 9
Eine ausschließlich Nosema bombycis Sporen umfassende kreisförmige Scheibe wurde wie folgt hergestellt, während das Verfahren zum Herstellen einer Probenscheibe zum Messen von IR Absorptionsspektra wie in Anspruch 2 offenbart, angewendet wurde, ohne jegliches Lithiumbromid zu verwenden.
Die in Beispiel 4 gewonnenen pulverförmigen Nosema bombycis Sporen (200 mg) wurden in eine Maschine zum Formen von Tabletten zur Verwendung bei IR Absorptionsspektralmessungen mit einem Durchmesser von 10 mm eingeführt, die von Nippon Bunko Kogaku Kogyo K.K. erhältlich sind, gefolgt vom Entgasen für 20 Minuten unter Verwendung einer Vakuumpumpe, Anlegen eines Drucks von 150 kg/cm² an der Tabletten-bildenden Maschine unter Verwendung einer hydraulischen Druckapparatur, Stehenlassen für 10 Minuten bei diesem Druck, um somit eine feste kreisförmige Scheibe mit einer Dicke von etwa 0,3 mm zu ergeben. Damit wurden die mittels der vorliegenden Erfindung hergestellten mikrosporidalen Sporen als Massenmaterialien verwendet.
Beispiel 10
Die in Beispiel 4 hergestellten pulverförmigen Nosema bombycis Sporen (200 mg) wurden in einen 50 ml Volumen Rundbodenkolben eingeführt, der mit einem Kondensator ausgestattet war, gefolgt vom Hinzufügen von 30 ml einer 40 Gew.-%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung und dann Behandeln in einem Ölbad bei einer Temperatur von 100 °C für 3 Stunden, um Chitosanperlen zu erhalten, die einen Deacetylierungsgrad von 93,6 % und eine gleichförmige und feine Partikelgröße aufweisen.
Beispiel 11: Effekt des Schützens von Mikroorganismen als natürliche Feinde (Effekt des Schützens von Bakterien gegenüber der Wirkung von ultravioletten Strahlen unter Verwendung von mikrosporidalen Sporen)
Bakterien wurden gemäß dem folgenden Verfahren in mikrosporidale Sporen eingekapselt. Genauer gesagt wurden in ein Zentrifugenröhrchen für eine Zellkultur 2 mg pulverförmiger Nosema bombycis Sporen eingeführt, die durch Entfernen des Inhalts der Sporen durch Hydrolyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 8 hergestellt wurden und dann Behandeln in derselben Weise wie in Beispiel 4 verwendet, gefolgt vom Hinzufügen von 2 ml einer Suspension, die Erregerbakterien für die bakterielle Fäule eines Blätterpilzes (Pseudomonas tolaasii) oder eines Erregerbakteriums bakterieller Tomatenfäule (Clavibactor michiganensis pv. michiganensis) in einer Konzentration von 10⁹ Bakterien/ml enthielt, Vermindern des Drucks im Röhrchen unter Verwendung einer Pumpe, die Leitungswasser verwendete, für 10 Minuten und dann Einführen von Luft, um den verminderten Druck aufzuheben. Diese Vorgehensweise zum Vermindern des Drucks und zum Einführen von Luft wurde dreimal wiederholt. Dann wurde das Röhrchen unter Verwendung einer Zentrifuge einer Zentrifugation bei 1000 upm für 10 Minuten unterworfen, um so die Sporen auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens zu sammeln. Die präzipitierten Sporen (die nachfolgend als "Sporen-enthaltender Abschnitt (S.C.S.)" bezeichnet werden) (0,2 ml) wurden dem Röhrchen entnommen und gleichförmig auf einem Agarkulturmedium in einer Glaspetrischale (Durchmesser 9 cm) unter Verwendung eines L-förmigen Spatels ausgestrichen. Die Sporen-enthaltende Flüssigkeit wurde auf dem Kulturmedium luftgetrocknet, bis die Flüssigkeit ihre wässrige Anmutung verlor, dann wurde das Kulturmedium in 20 cm Distanz vor einer UV-Lampe positioniert und für 10 Sekunden, 30 Sekunden, 1 Minute, 2 Minuten und 5 Minuten mit ultravioletten Lichtstrahlen bestrahlt. In diesem Zusammenhang wurde der UV-Lichtstrahlenbestrahlungstest in einer Reinbank ausgeführt und es wurde eine Germizidlampe, National GL-15 (15 W) als Lichtquelle verwendet. Nach drei Tagen UV-Bestrahlung wurde die Anzahl von auf 1/6 Oberflächenbereich der Petrischale erscheinenden Bakterien gezählt, um so den Effekt der mikrosporidalen Sporen auf den Schutz der Bakterien vor UV-Bestrahlung zu evaluieren. Die derart erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefasst. Davon getrennt wurde ein System, das komplett frei von mikrosporidalen Sporen war, ebenfalls durch Zentrifugation in einem Zentrifugationsröhrchen präzipitiert, um damit die Anzahl von Bakterien zu bestimmen, und dies wurde als eine Kontrolle verwendet (die nachfolgend als "sporenfreier Abschnitt (S.F.S.)" bezeichnet wird). Tabelle 5: Germizidlampenbestrahlungszeit und Effekt mikrosporidaler Sporen auf den Schutz von darin eingekapselten Bakterien
In Tabelle 5 bedeutet " riesige Anzahl", dass die Anzahl von auf 1/6 Fläche der Petrischale erscheinenden bakteriellen Kolonien zu groß für eine Bestimmung ist, während, falls die Zahl der Kolonien groß ist, aber quantitativ voneinander unterschieden werden kann, sie gemäß der Vier-Stufen-Evaluierung ausgedrückt wird, die sich von +++ bis – (keine) erstreckt.
Der Effekt der mikrosporidalen Sporen auf den Schutz von Bakterien gegenüber der Wirkung von UV-Bestrahlung wurde wie folgt quantitativ evaluiert. Unter Verwendung eines halblogarithmischen Zeichenpapiers wird der Logarithmus der Anzahl von Bakterien, die auf 1/6 der Fläche der Petrischalen erschienen, auf der Logarithmusachse geplottet und die Bestrahlungszeit (Einheit: Min) wird als Abszisse aufgezeichnet. Beim Bestimmen der zum Vermindern der auf der Petrischale erscheinenden Anzahl von Bakterien benötigten Strahlungszeit bis hinunter auf 20 aus dem Diagramm wurde als 30 Sekunden für den sporenfreien Abschnitt und 5 Minuten für den Sporen enthaltenden Abschnitt ermittelt.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass, falls die Erregerbakterien für bakterielle Fäule eines Blätterpilzes in den Nosema bombycis Sporen eingekapselt waren, die Rate der getöteten Bakterien bei den in den Sporen eingekapselten niedrig im Vergleich zu denen war, die für die sporenfreie Gruppe beobachtet wurden, selbst wenn sie mit UV-Lichtstrahlen bestrahlt wurden und der Schutzeffekt war ungefähr das zehnfache von dem für die sporenfreien Gruppe. Auch ist klar, dass im Falle der Erregerbakterien für die bakterielle Tomatenfäule deren Einkapselung in Sporen solch einen Schutzeffekt zeigt. Dieser Schutzeffekt aufgrund der Einkapselung zeigt an, dass die mikrosporidalen Sporen, in denen Bakterien, Enzyme, biologisch aktive Substanzen eingekapselt sind, beispielsweise als Träger zum Schützen von natürlichen Feindmikroorganismen nützlich sind.
Beispiel 12: Test der Absorption von Antibiotikum auf Chitinsporen
Chitinperlen wurden unter Verwendung einer Laugenlösung mit einer hohen Konzentration gemäß dem folgenden Verfahren zu Chitosanperlen modifiziert. Chitinperlen (100 mg) wurden in einen Rundbodenkolben eingeführt, der mit einem Rückflusskondensator versehen war, gefolgt vom Hinzufügen von 15 mg einer 30 Gew.-%igen wässrigen NaOH-Lösung und deren Behandlung in einem Ölbad bei 100 °C für zwei Stunden. Nach abschließender Reaktion wurde das Reaktionssystem mit einer hinreichenden Menge destillierten Wassers gewaschen und dann in einer Zentrifuge bei 3000 upm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Chitosanperlen zu erhalten. Dann wurden zu 0,2 ml einer wässrigen Lösung eines Antibiotikums, das durch Auflösen von 10 mg Rifampicin in 3 ml Wasser hergestellt wurde, 0,5 mg der vorstehenden Chitosanperlen zugegeben und dann wurde ein Entgasen mit einer Wasserstrahlpumpe fünfmal wiederholt, um eine Fraktion zu erhalten. Die derart hergestellten Chitosanperlen wurden bezüglich ihres Effekts des Hemmens der Proliferation des Erregerbakteriums für bakterielle Tomatenfäule gemäß demselben Verfahren wie Beispiel 8 untersucht und es wurde bestätigt, dass die Chitosanperlenfraktion, zu der Rifampicin hinzugefügt worden war, und ein Entgasen fünfmal durchgeführt worden war, das darauf adsorbierte Antibiotikum umfasste. Um zu prüfen, ob die Chitosanperlen der mikrosporidalen Sporen, auf denen Rifampicin adsorbiert war, als Träger verzögerter Freisetzung effektiv sind oder nicht, wurde ihr verzögerter Freisetzungseffekt unter Verwendung von Erregerbakterien für die bakterielle Tomatenfäule evaluiert.
Wie oben im Detail diskutiert worden ist, wurden 0,5 mg pulverförmiger Chitosanperlen von mikrosporidalen Sporen in 0,2 ml der vorstehenden wässrigen Rifampicinlösung dispergiert und die Dispersion wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Dann wurde die Dispersion bei 5000 upm für 3 Minuten zentrifugiert, um so die Präzipitate der mikrosporidalen Sporen vom Überstand zu trennen. Die Präzipitate (0,1 ml) wurden einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzugefügt, gefolgt vom Hinzugeben von 1 ml frischem destilliertem Wasser, und wiederum Unterwerten einer Zentrifugation, um damit Präzipitate der mikrosporidalen Sporen vom Überstand nach dem ähnlichen Verfahren zu trennen. Die Präzipitate und der so erhaltene Überstand wurden bezüglich des antibakteriellen Effekts auf die Proliferation des Erregerbakteriums der bakteriellen Tomatenfäule in vorgegebenen Zeitabschnitten inspiziert. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6
Die, die mikrosporidalen Sporen enthaltenden Präzipitate zeigten immer eine hohe antibakterielle Aktivität im Vergleich mit derjenigen für den Überstand und bewahrten ihre antibakterielle Aktivität auch nach sogar acht Tagen. Dementsprechend wurde beurteilt, dass die mikrosporidalen Sporen, auf denen das Antibiotikum absorbiert war, als verzögerte Freigabeträger für Antibiotika wirksam waren. Die verdünnten, als Kontrollen verwendeten Überstände wurden durch zehnfaches Verdünnen des Überstands entsprechend der verstrichenen Zeit von Tag Null als eine Ausgangslösung hergestellt, in Intervallen von zwei Tagen (d.h. die Ausgangslösung wurde zehnfach, hundertfach, tausendfach oder zehntausendfach bei jeder verstrichenen Zeit von 2, 4, 6 und 8 Tagen verdünnt). Falls die Ausgangslösung tausendfach verdünnt wurde, verlor der verdünnte Kontrollüberstand seine antibakterielle Wirkung, aber der jeder Probe entsprechende Überstand bewahrte seine antibakterielle Wirkung noch. Auch dies zeigt an, dass die mikrosporidalen Sporen zur Verwendung als verzögerte Freisetzungsträger für Antibiotika wirksam sind.
Beispiel 13: Herstellung von mikrosporidalen Sporen unter Verwendung von kultivierten Zellen
Als kultivierte Insektenzellen wurde die kultivierte Zelllinie von Antheraea eucalypti, die eine Art der Antheraea-Familie ist, und die kultivierte Bm36-Zelllinie verwendet, die aus Leptidopterus-Insekten stammt. Die kultivierte Zelllinie von Antheraea eucalypti und die kultivierte Brn36-Zelllinie wurden beide bei 26°C unter Verwendung eines Kulturmediums inkubiert, das durch Hinzufügen von 5 % jeweils des bei 60°C für 15 min hitzebehandelten Überstands der Hämolymphe von domestizierten Seidenraupenlarven und von fötalem Kalbsserum zu Grace-Kulturmedium erhalten wurde. Die mikrosporidalen Sporen wurden gemäß dem folgenden Verfahren in die kultivierten Zellen inokuliert. Genauer gesagt, wurden teilweise gereinigte mikrosporidale Sporen unter Verwendung von Percoll gereinigt, gefolgt von einer Behandlung mit einer 0,2 N KOH-Lösung bei 25°C für 30 min, und Mischen der sich ergebenden gereinigten Sporen mit den kultivierten Zellen, um so die Sporen in die Zellen zu inokulieren.
10 Tage nach der Inokulation wurden diese Zellen geerntet, gefolgt von einer Behandlung der Zellen mit einer Ultraschall-Waschvorrichtung, um eine Suspension zerbrochener Zellen zu erhalten, Laden der Suspension auf eine Percoll-Schicht und dann Auftrennen durch Zentrifugieren, um so eine große Menge an mikrosporidalen Sporen herzustellen.
Beispiel 14
Nicht-immunogene Chitinperlen wurden durch Entfernen der Proteine in den Zellwandsubstanzen der mikrosporidalen Sporen ähnlich wie bei den in Beispiel 1 verwendeten (Nosema bombycis) gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt.
Zuerst wurde die Hydrolyse durch Wiederholen von insgesamt 5 Zyklen durchgeführt. In dieser Hinsicht umfasste jeder Zyklus eine Behandlung von Sporen mit einer für 12 h bei Raumtemperatur gehaltenen 1N NaOH-Lösung und eine Behandlung derselben mit einer 1N HCl-Lösung für weitere 12 h. Danach wurden die Sporen schließlich mit 95% Ethanol für 2 h behandelt, um die Sporen so zu dehydrieren. Dann wurden die Sporen durch Zentrifugieren bei 2000 UpM für 20 min präzipitiert und dann wurde den erhaltenen Präzipitaten Wasser zugefügt. Diese Vorgänge zum Trennen der Sporen durch Zentrifugieren wurden siebenmal wiederholt, um so Chitinperlen zu erhalten, aus denen die Proteine als Zellwandsubstanzen der Sporen vollständig entfernt waren. Um die Antigen/Antikörper-Reaktion der sich ergebenden Chitinperlen durch Seerumreaktionen zu untersuchen, wurde das aus Kaninchen unter Verwendung unbehandelter mikrosporidaler Sporen hergestellte Antiserum als eine Testprobe verwendet, es wurden verdünnte Lösungen dieses Antiserums zum Vergleichen der Verdünnungsrate, bei der die unbehandelten Sporen (Probe aus der Kontrollgruppe) noch eine Serumsreaktion damit durchliefen, mit derjenigen, die für die behandelten Sporen (hydrolysierte Probe) beobachtet wurden, verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, wurde bei den unbehandelten Sporen (Probe der Kontrollgruppe) eine Serumsreaktion selbst bei einer Verdünnungsrate von 1024 fach beobachtet, während die behandelten Sporen (hydrolysierte Probe) selbst bei einer Verdünnungsrate von 16-fach keinerlei Antiserumsreaktion durchmachten. Somit waren die Proteine unter den Zellwandsubstanzen der Sporen, die als Antigene dienen, durch die Hydrolyse vollständig entfernt und die sich ergebenden Chitinperlen wurden entsprechend als nicht-immunogen eingestuft.
Auch die Röntgendiffraktionsintensitätsbestimmung bewies, dass die Proteine unter den Zellwandsubstanzen der Sporen durch die Säure- und/oder Laugebehandlungen entfernt wurden, während der Gehalt an Chitin als Hauptkomponente relativ anstieg. Wenn die in eine Kollodium-Schicht eingebetteten mikrosporidalen Sporen einer Röntgendiffraktionsmusterbestimmung unterworfen wurden, werden Diffraktionsringe (Interferenzringe) von R₁, R₂, R₃ und R₄ beobachtet, wie sich aus den in Tabelle 2 aufgeführten vorstehenden Daten ergibt, aber sie sind alle lose Diffraktionsringe. Falls nur die Proteine unter den Zellwandsubstanzen durch eine Säure und/oder eine Lauge entfernt wurden, stiegen jedoch die Intensitäten der Diffraktionsmuster R₁ bis R₂ des in den Sporen vorhandenen Chitins and dies zeigt klar an, dass der Chitingehalt der Chitinperlen steigt.
Zusätzlich wurde, wenn die hydrolysierte Probe mit einer 1 % Ninhydrin-Lösung bei 25°C für 20 Std. reagiert wurde, überhaupt keine Farbreaktion festgestellt und das weist klar darauf hin, dass die Probe überhaupt keine Aminosäuren enthält.
Beispiel 15: Chitinperlen und Chitosanperlen mit feinen Poren
Eine Suspension derselben mikrosporidalen Sporen (Plestophola M27), die in Beispiel 1 verwendet wurden, wurde in eine 0,2N wässrige Kaliumhydroxidlösung eingeführt und die sich ergebende Mischung durfte bei 25°C für 30 min stehen. Nach einer Stunde wurde die sich ergebende Probe mit einem von Wako Pure Chemicals Industries Co., Ltd. erhältlichen Phosphatpuffer (pH 7,2) nach Biochemiestandard neutralisiert. Es wurde durch Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop bestätigt, dass die in den mikrosporidalen Sporen vorhandenen zellulären Substanzen durch eine solche einfache Behandlung aktiviert wurden, der Zellinhalt von den Sporen ausgestoßen oder freigesetzt wurde und während eines solche Prozesses eine Pore mit einer Größe von etwa 0,3 μm gebildet wurde. Die nach Ausstoßen der intrazellulären Substanzen erhaltenen mikrosporidalen Sporen hatten alle eine elliptische Sphäre mit einer Größe von 1,7 μm (Hauptachse)×0,9 μm (Nebenachse) und einer Zellmembrandicke von etwa 0,13 μm, wobei der gesamte verfügbare Raum innerhalb der Zellwand gebildet war und die nach dem Ausstoßen der intrazellulären Substanzen gebildete Pore an einem Ende der elliptische Sphäre längs der Hauptachse gebildet war. Die Anwesenheit einer solche Pore gestattet einfach das Verkapselns von beispielsweise Enzymen, Antibiotika, Metallionen, Medikamenten, Viren und biologisch aktiven Substanzen innerhalb des freien Raums der mikrosporidalen Sporen durch Vermindern des Umgebungsdrucks um die mikrosporidalen Sporen oder Freisetzen des verminderten Drucks. Daher sind die Chitinperlen und die Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung von gleichförmiger Größe und von feinen Partikelzuständen und sind als verzögerte Freisetzungsträger für diese pharmazeutisch wirksamen Komponenten nützlich.
Beispiel 16: Chitinperlen und Chitosanperlen mit feinen Poren
Es wurden dieselben wie in Beispiel 15 verwendeten Verfahren wiederholt, außer dass Nosema bombycis Nr. 520 die in Beispiel 15 verwendeten mikrosporidalen Sporen ersetzte. Die so nach Ausstoßen von intrazellulären Substanzen erhaltenen mikrosporidalen Sporen hatten alle eine elliptische Sphäre mit einer Größe von 2,6 μm (Hauptachse)×1,4 μm (Nebenachse) und eine Zellmembrandicke von etwa 0,13 μm, wobei der gesamte freie Raum innerhalb der Zellwand gebildet war und es wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie bestätigt, dass eine Pore mit einer Größe von etwa 0,1 μm an einem Ende der elliptische Sphäre längs deren Hauptachse gebildet war. Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung würden aufgrund der Anwesenheit einer solche Pore in jeder Spore als verzögerte Freisetzungsträger für pharmazeutisch wirksamen Komponenten wie die Perlen des Beispiels 15 wirksam sein.
Beispiel 17
Die Sicherheit der mikrosporidalen Sporen, aus denen lediglich die Proteine aus den Zellwandsubstanzen derselben entfernt worden waren, wurde gemäß dem folgenden Verfahren untersucht.
Eine Sporensuspension (4×10⁸ Sporen/ml), die durch Unterwerten der in Beispiel 1 hergestellten mikrosporidalen Sporen unter eine Hydrolyse unter Verwendung einer Säure hergestellt wurde, wurde jedem Kaninchen in Intervallen von einer Woche viermal intravenös injiziert, gefolgt von der Beobachtung des Wachstumsprozesses jedes der Kaninchen. Sechs Monate nach der Inokulation wurden weder Gewichtsveränderungsabnormalitäten noch Anmutungsabnormalitäten der behandelten Kaninchen, in welche die Sporen injiziert worden waren, beobachtet, wie bei den Kontrollkaninchen ohne irgendwelche Sporeninjektion.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Chitinperlen und Chitosanperlen mit gleichförmiger und feiner Partikelgröße gemäß der vorliegenden Erfindung können als Träger für Medikamentenzufuhrsysteme wie auch als Ausgangsmaterial für kosmetische Grundlagen verwendet werden. Falls Enzyme oder lebende Zellen an den Chitosanperlen angeheftet oder immobilisiert werden, kann das sich ergebenden Produkt darüber hinaus verwendet werden, um einen Bioreaktor zu bilden, der in der Nahrungsindustrie und verschiedenen anderen industriellen Gebieten effektiv ist.
Falls ein Enzym oder ein immunologischer Antikörper mit der Oberfläche oder dem Inneren der Perlen oder mit beidem verbunden ist, kann das sich ergebende Produkt beispielsweise als ein immunologischer Träger verwendet werden. Darüber hinaus sind modifizierte Chitinperlen, die durch Umwandeln des Chitin-Rests derselben in Glykolchitin und Caboxymethylchitin modifiziert sind, bezüglich ihrer Feuchterückhalteeigenschaften exzellent und können daher als Materialien für Kosmetika verwendet werden. Falls darüber hinaus eine Vinylverbindung auf der mikrosporidalen Spore oder der Chitinperle implantiert wird und dann ein Enzym auf den implantierten Chitinperlen immobilisiert wird, gestattet das sich ergebende Produkt nicht nur eine Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität, sondern gestattet auch die Darstellung noch weiterer effizienter Enzymaktivität, während es das Beste aus den charakteristischen Eigenschaften der feinen Partikel mit einer sehr großen effektiven Oberfläche macht.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung, die einer Behandlung zum Entfernen der darin enthaltenen Proteine unterworfen werden, sind frei von jeglicher Antigen/Antikörper-Reaktion, selbst wenn sie in Tierkörper einschließlich des menschlichen Körpers eingebettet werden und daher können sie als verzögerte Freisetzungsträger verwendet werden. Darüber hinaus würden die Chitinperlen und die Chitosanperlen durch die Wirkung von in den Körpern vorhandenen Enzymen nach dem Verstreichen einer gewissen Zeitperiode zersetzt oder abgebaut werden und können daher als sichere Materialien verwendet werden, die in lebenden Körpern zersetzt oder abgebaut werden können. Die Chitinperlen und Chitosanperlen wirken kaum als Immunogene, selbst wenn sie in lebende biologische Gewebe eingebettet werden. Aus diesem Grund können die Chitinperlen und Chitosanperlen durch Immobilisierung eines Medikaments mit physiologischen Wirkungen und Einbettung der Medikamentimmobilisierten Perlen in lebende Körper verwendet werden. Insbesondere können die Chitinperlen und Chitosanperlen, in die eine einen Antikrebseffekt zeigende Medizin eingekapselt ist, in einem medizinischen Frontgebiet als Geschossträger verwendet werden.
Die Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß der vorliegenden Erfindung können Hohlperlen sein, die in sich freie Räume umfassen und in diesem Fall wird eine freie Pore oder werden freie Poren auf oder durch das Zellwandgewebe gebildet. Dementsprechend können lebende Zellen, Bakterien, Antibiotika, oder biologisch aktive Substanzen durch diese feinen Poren in die freien Räume eingeführt werden. Die in den Perlen eingekapselten Substanzen werden nicht leicht durch äußere Faktoren zur Proteinmodifizierung (wie etwa ultraviolette Lichtstrahlen) beeinträchtigt und daher gestatten diese Perlen das Aufrechterhalten der biologischen Aktivität der Substanzen über einen langen Zeitraum. Somit können die Perlen auch als neuartige Materialien zum Schützen beispielsweise von natürlichen Feindesmikroorganismen verwendet werden.
Die mikrosporidalen Sporen gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch exzellente Basismaterialien als Mikrokapseln zum Einkapseln von Medikamenten, physiologisch aktiven Substanzen, Hormone, Vakzinen und Mikrokapseln, in denen beispielsweise Landwirtschaftschemikalien oder Düngemittel in den mikrosporidalen Sporen eingekapselt sind, können als Bodenkonditionierer verwendet werden. Zusätzlich können solche, die durch Einkapseln von Nahrungskomponenten erhalten werden, als Fütterung für Haustiere oder solche für Fischkulturen verwendet werden.
Darüber hinaus gestatten gemäß der Erfindung diese Perlen die einfache Steuerung der verzögerten Freisetzungsrate, der verzögerten Freisetzungsmenge und des Grads der Biodegradierung von Substanzen wie Medikamenten, physiologisch aktiven Substanzen und Antibiotika durch Einstellen des Hydrolysegrads oder durch Steuern des Grads der auf der Zellwand der mikrosporidalen Sporen gebildeten feinen Poren. Weiterhin können die Chitinperlen und Chitosanperlen gleichermaßen als biodegradierbare Materialien verwendet werden, da sie von den in den lebenden Körpern vorhandenen Enzymen graduell zersetzt werden.

Claims

Chitinperlen, die in Insektenkörpern oder kultivierten Zellen vermehrte mikrosporidale Sporen umfassen, mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße, deren Zellwandsubstanz hauptsächlich aus Chitin besteht; und Chitosan-Perlen, in denen das Chitin als Zellwandsubstanz einer N-Deacetylierung unterworfen ist.
Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß Anspruch 1, wobei die Chitinperlen und Chitosanperlen solche sind, aus denen die Proteine entfernt sind und die daher nicht immunogen sind.
Chitinperlen und Chitosanperlen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die vermehrten mikrosporidalen Sporen solche sind, die durchgehend oder auf der Zellwand gebildete Poren aufweisen, und wobei die Chitinperlen und Chitosanperlen Hohlperlen sind.
Träger, umfassend Chitinperlen, die in Insektenkörpern oder kultivierten Zellen vermehrte mikrosporidale Sporen umfassen, mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße, deren Zellwandsubstanz hauptsächlich aus Chitin besteht; oder Chitosan-Perlen, die dadurch erhalten werden, dass das Chitin als Haupt-Zellwandsubstanz einer N-Deacetylierung unterworfen wird.
Träger gemäß Anspruch 4, wobei die Chitinperlen und Chitosanperlen solche sind, aus denen die Proteine entfernt sind und die daher nicht immunogen sind.
Träger gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die vermehrten mikrosporidalen Sporen solche sind, die durchgehnde oder auf der Zellwand gebildete Poren aufweisen, und wobei die Chitinperlen und die Chitosanperlen Hohlperlen sind.
Träger gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der Träger zur Immobilisierung oder Einführung einer physiologisch aktiven Substanz, eines Antibiotikums, einer lebenden Zelle, eines Mikroorganismus, eines Farbstoffs, einer Medizin, einer Landwirtschaftschemikalie, eines Duftstoffs, eines Ausgangsmaterials oder eines Nahrungsmittels verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße, umfassend die Schritte des Vermehrens mikrosporidaler Sporen durch orales oder perkutanes Innokulieren der Sporen in Insektenkörper in einer Konzentration von 5×10² bis 5×10⁸ Sporen/ml, Ernten der vermehrten mikrosporidalen Sporen aus den gewachsenen Insektenkörpern und dann Reinigen der resultierenden Sporen, um Chitinperlen als gleichförmige feine Partikel zu ergeben.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße gemäß Anspruch 8, wobei die Zeit zum Innokulieren der Sporen in Insektenkörper gerade nach den zweiten Erscheinungsformen (Instars) der Seidenwurmlarven ist und die gewachsenen Insekten fünfte Erscheinungsformen der Seidenwurmlarven sind.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Insekt eine Larve des Zuchtseidenwurms ist.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße, umfassend die Schritte des Vermehrens mikrosporidaler Sporen durch orales oder perkutanes Innokulieren der Sporen in Insektenkörper in einer Konzentration von 5×10² bis 5×10⁸ Sporen/ml, Ernten der vermehrten mikrosporidalen Sporen aus den gewachsenen Insektenkörpern, Reinigen der resultierenden Sporen, um Chitinperlen als gleichförmige und feine Partikel zu ergeben und dann Unterwerfen des Chitins in den Chitinperlen einer N-Deacetylierung, um Chitosanperlen zu ergeben.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße gemäß Anspruch 11, wobei die Zeit zum Innokulieren der Sporen in Insektenkörper gerade nach den zweiten Erscheinungsformen der Seidenwurmlarven ist und die gewachsenen Insekten fünfte Erscheinungsformen der Seidenwurmlarven sind.
Verfahren zur Herstellung von Chitinperlen mit einer gleichförmigen und feinen Partikelgröße gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das Insekt eine Larve des Zuchtseidenwurms ist.
Verfahren zum Herstellen von mikrosporidalen Sporen, umfassend die Schritte des Hinzugebens von aus einem Insekt erhaltenen kultivierten Zellen zu einem Zellkulturmedium, das 5 bis 50 Gew.-% eines Überstands der Hämolymphe von Zuchtseidenwurmlarven enthält, Innokulieren von mikrosporidalen Sporen in das Kulturmedium, um so die Sporen zu vermehren, und Isolieren der mikrosporidalen Sporen aus den vermehrten Zellen.