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VERFAHREN ZUR HERSTELLUNC- EINES FESTEN NäHRBODENS ZUR
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ZÜCHTUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLENKULTUREN VVN MAKROORGANISMEN
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin und Biologie,
und insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung eines Nährbodens für die Züchtung
von Mikroorganismen und Zellenkulturen von Makroorganismen.
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Gegenwärtig werden in der mikrobiologischen Praxis feste Nährboden
auf der Basis des Agar-Agar-Naturgels umfassend eingesetzt. Dieser Naturstoff ist
jedoch kostspielig und äusserst defizitär. Deswegen sind die mit der Schaffung von
Nährböden auf der Basis von synthetischen Gelarten, die den Agar-Agar in der mikrobiologischen
Praxis ersetzen könnten, verbundenen Entwicklungen nach wie vor aktuell.
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Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung eines Nährbodens für die
Züchtung von Mikroorganismen, das die Copolymerisation des Acrylamid und N,N'-Mehtylen-bis-aerylamids
in einem wässerigem Medium mit anschliessendem Aus waschen des so hergestellten
Polyacrylamidsels von toxischen Ausgangsmonomeren mit Wasser, sein Durchtränken
mit einem Nährsubstrat mit anschliessender Sterilisation (SU-PS Nr. 659619) vorsieht.
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Der Hauptvorteil der Verwendung des Polyacrylamidgels als Grundlage
für den Nährboden besteht darin, dass es eine konstante Zusammensetzung aufweist,
nach seinem Auswaschen mit Wasser keine fremden Beimengungen und Stoffe enthält,
die das Wachstum von Mikroorganismen erschweren, ein hochtransparentes Material
darstellt und keine Aufhellung vor dem Gebrauch erfordert. Das in dem vorliegenden
Verfahren als feste Grundlage für den Nährboden zum Einsatz kommende Polyacrylamidgel
weist jedoch eine erhöhte Sprödigkeit, die auf einen hohen Quervernetzungsgrad des
Polyacrylamids zurückzuführen ist; diese Vernetzung erschwert die Diffusion der
Hochmolekularfraktionen des Nährsubstrats. Das Abnehmen von auf solchen Nährböden
gezüchteten Mikroorganismen erfolgt lediglich mittels Abspülen mit physiologischer
Lösung.
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Bekannt ist ebenfalls ein Polyacrylamidgel für biologische und medizinische
Zwecke und ein Verfahren für seine Herstellung (SU-PS Nr. 977466). Das erfindungsgemaSe
Polya rylamidgel kann als Grundlage für einen festen Nährboden eingesetzt werden.
Es wird mittels Copolymers station des Acrylamids mit N,N'-Methylen-bis-acrylamid,
genommen in einem Massenverhältnis von 0,5-40,0:2,5-12,0, in einer 0,5%igen Natriumchloridlösung
in Gegenwart eines Initiators von radikalischem Typ gewonnen.
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Das so hergestellte Polyacrylamidgel, das nach der Copolymerisation
maximal mögliche 11assermenge aufweist, wird mit einer 0,5%igen wässrigen Natriumchloridlösung
während 12 Stunden von den nichtunqesetzten Monomeren freigewaschen, indem man die
Lösung alle 4 Stunden auswechselt. Das genannte Polyacrylamidgel enthält in Masse%:
Polyacryl amid - 3,0-28,0 0s5%ige Natriumchloridlösung -72,0-97,0.
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Das gewaschene Gel wird mit Substraten für die Ernährung von Mikroorganismen,
beispielsweise Fleisch-Pepton--Bouillon, gesättigt.
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Der im bekannten Verfahren hergestellte feste Nährboden enthält keine
toxischen Monomere und kann für die Untersuchungder biologischen Eigenschaften von
Mikroorganismen, ier- und Menschenzellen verwendet werden.
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Der genannte feste Nährboden zeichnet sich durch eine hohe Verletzungeanfäll
igke it der Oberflächenschicht des Polyacrylamidgels infolge seiner Sprödigkeit
bei verschiedenen Manipulationen mit ihm aus, beispielsweise bei seiner Sterilisatlon,
bei der Inokulation von Mikroorganismen sowie bei dem Abnehmen von Kolonien mit
bakteriologisoher Schleife. Das Abnehmen von Mikroorganismen bei wiederholter Aussaat
ist lediglich durch das Abspülen mit physiologischer Lösung möglich, was bei den
meisten mikrobiologischen Arbeitsvorgängen nicht üblich ist. Besonders kompliziert
wird diese Arbeit bei einer langeren Züchtung von Mikroorganismen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren zur Herstellung
eines festen Nährbodens für die Züchtung von Mikroorganismen und Zellenkulturen
durch Änderung
seiner technologisohen Vorgänge auf solche Weise
zu vervollkommnen, daß dieser feste Nährboden verbesserte physikalisch-mechanische
Eigenschaften besitzt, die die Möglichkeit seiner Verwendung für mikrobiologische
Zwecke erweitert.
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Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Herstellung
eines festen Nährbodens zur Züchtung von Mikroorganismen und Zellenkulturen von
Makroorganismen vorgeschlagen wird, das eine Copolymerisation von Acrylamid auf
N,N' Methylen-bis-acrylamid in physiologischer Lösung in Gegenwart eines Initiators
von radikalischem Typ bis zur Entstehung eines Polyacrylamidgels und sein anschließendes
Auswaschen mit der physiologischen Lösung vorsieht, in dem erfindungsgemäß die Copolymerisation
des Acrylamids mit X,N'-Methylen-bis-a rylamid bei ihrem Massenverhältnis 15,0-20,0
: 0,019-0,132 durchgeführt wird und das nach dem Auswaschen angefallene Polyacrylamidgel
in der physiologischen Lösung bis zu einer Massenvergrößerung auf das 2,8-4,5fache
mit anschließender Behandlung mit flüssigem Nährboden gehalten wird beziehungsweise
das nach dem Auswaschen angefallene Polyacrylamidgel der Aufquellung in einem flüssigem
Nährboden bis zu einer Massenvergrößerung auf das 25-35fache ausgesetzt wird.
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Der in erfindungsgemäßem Verfahren hergestellte Nährboden ist gegenüber
verschiedenen Einwirkungen beständig und wird bei versohiedenen Manipulationen mit
ihm nicht beschädigt, seine Dichte nähert sich der Dichte von Agar-Agar.
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Er ist elastisch, weist gute Adhäsionseigenschaften auf (hält sich
gut in der Petri-Schale). Im Unterschied zum bekannten festen Nährboden bewirkt
der erfindungsgemäß hergestellte feste Nährboden das gute Gleiten-der bakteriologischen
Schleife bei der Inokulation und Abnahme von Mikroorganismen, ohne seine Oberfläche
zu beschädigen.
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Kulturen der Mikroorganismen verteilen sich an der Oberfläche des
festen Nährbodens, ohne in denselben einzuwachsen; dabei werden optimale Bedingungen
für die Lebenstätigkeit der Mikroorganismen gesichert, was die Ausbeute
an
Biomasse zu erhöhen ermöglicht. Zweckmäßigerweise soll die Copolymerisation zur
Erhöhung der Qualität des festen Nährbodens bei einem Massenverhältnis des Gemisches
aus Acrylamid und N,N'-Methylen-bi¢-acrylamid zur physiologischen Lösung gleich
1:4 bzw. 1:7 durchgeführt werden.
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Das genannte Verhältnis der Komponenten im Polymerisationsgemisch
schafft optimale Bedingungen für die Ausbildung eines solchen dreidimensional vernetzten
Gebildes des herzustellenden Polyacrylamidgels, welches gute physikalischwechanische
Eigenschaften des auf seiner Grundlage zubereiteten Nährbodens gewährleistet.
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Zur Erweiterung der Möglichkeiten der Anwendung des festen Nährbodens
in der mikrobiologischen Praxis ist es zweckmäßig, als physiologische Lösung eine
0,85%ige wässerige Natr iwachloridlös ung oder Ringer-Locke-Lösung, Earl-Lösung,
Hanks-Lös ung bez iehungswe ise eine ziege wässerige Glykoselösung und als flüssigen
Nährboden - Trypsin-Verdauungsmittel nach Hottinger, Marten-Bouillon, Fleisch-Pepton-Bouillon,
Pepton-Wasser, Kaseinhydrolysat, Würze oder Medium 199 zu verwenden.
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Zur Züchtung von Gonokokken soll zweckmäßigerweise das in der physiologischen
Lösung aufgequollene Polyacrylamidgel mit flüssigem Nährboden behandelt werden;
als solcher wird ein Gemisch aus inaktiviertem sterilem Menschenblutserum und Plasmol,
genommen in einem Masseverhältnis 1:1, verwendet.
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Ein solcher fester Nährboden gewährBeistet eine hohe Oualität des
Wachstums der Gonokokkenkultur unter Beibehaltung ihrer morphologischen, Färbungs-,
Kultur- und anderer biologischer Eigenschaften. Die Anwendung des genannten Nährbodens
wird diagnostische Möglichkeiten der Bakteriologie bei der Nachweisung von Gonorrhoe,
insbesondere bei chronischen und torpid verlaufenden Formen, erhöhen. Die Dauer
der Zubereitung eines solchen festen Nährbodens wird auf einen Bruchteil aegenüber
der Zubereitungsdauer eines aszitischen 91eìsch-Peptbn-Agars, Baily-Atlars Serum-Agars,
die für die Züchtung von Gonokokken eingesetzt werden, reduziert; es wird außerdem
die Notwendigkeit der Anwendung von kostspieligen Komponenten für seine Zubereitung
ausgeschlossen.
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Für die Erweiterung der Möglichkeiten der Anwendung des erfindungsgemäßen
festen Nährbodens ist das Polyacrylamidgel zweokmaßigerweise bei der copolymerisation
alszwel flachaStred fen zu gestalten, von denen einer Vertiefungen aufweist, die
koaxial und/oder in Schachanordnung angebracht werden. Dann sind die Streifen mit
einer Lösung zu durchtränken, die Acrylamid und N,N' -Methylen-bis-acrylamid bei
einem Massenverhältnis 15,0-20,0 :0>019-0,132 aufweist, und so zusammenzuführen,
daß geschlossene Hohlräume für die nächstfolgende Züchtung von Mikroorganismen beziehungsweise
Zellenkulturen von Makroorganismen entstehen, diese Streifen bis zur Entstehung
eines einheitlichen Blocks mit seiner anschließenden Trennung in Teile zu halten,
Von denen in jedem mindestens ein obengenannter geschlossener Hohlraum vorhanden
ist. Dann werden diese Streifen einer Aufquellung in der physiologischen Lösung
ausgesetzt und mit flüssigem Nährboden behandelt.
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Die herausgebildeten Teile mit geschlossenen Hohlräumen können als
Diffusionskammern bezeichnet werden, die eine gute Festigkeit, Elastizität und Wärmebeständigkeit
infolge der Eigenschaften des Polyacrylamidgels aufweisen. Sie sind leicht reproduzierbar
und lassen sich längere Zeit lagern und sterilisieren. Ein solcher fester Nährboden,
ausgeführt in Form von Diffusionskammern, wird in Systemen in vivo und in vitro
eine umfassende Anwendung finden. Diese Diffusionskammern sind bei ihrer Transplantation
in einen Organismus atraumatisch (beispielsweise in die-Bauchhöhie von Tieren).
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Sie sind inert für den Organismus, was bei der Untersuchung des Einflusses
verschiedenen Faktoren der Umwelt auf die in die Höhlen der Kammern eingebrachten
Objekte von großer Bedeutung ist.
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Dank der Eigtenschaften des PolyaQrtlamidgels weisen die aus ihm
hergestellten Diffusionskammern gute Diffusionseigenschaften auf, was den ffiåhr-
und anderen Stoffen gestattet, in die zu untersuchenden Zellenkulturen von Makro-beziehungsweise
Mikroorganismen, die in die Hohlräume der Kammern eingebracht sind, leicht einzudringen
und auf diese verschiedenartigen Einfluß auszuüben. Außerdem sind sie
transparent;
die zu untersuchenden Mikroorganismen beziehungsweise Zellenkulturen lassen sich
leicht mikroskopisch beobachten, was die Möglichkeit gibt, eine Vorstellung über
ihre Organisation zu erhalten.
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Fester Nährboden Sür die Züchtung von Mikroorganismen wird wie folgt
zubereitet. Zunächst wird ein Reaktionsgemisch zubereitet, das Lösungen von Ausgangsmonomeren
in physiologischer Lösung enthält. Das Massenverhältnis Acrvlamid zum N,N'-Methylen-bis-acrylamid
im Reaktionsgemisch beträgt (15,0-20,0) : (0,019-0,132).
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Als physiologische Lösung, genommen vorzugsweise zum Monomergemisch
in einem Verhältnis von 4:1 -wird eine 0,85ige wässerige Natriumchloridlösung' eine
O,9%ige wässerige Natriumchloridlösung, eine ziege wässerige Glykoselösung, RInar-Locke-Lösung,
Hanks- adkr Earl-Löeung verwendet. Durch das Variieren des Massenverhältnisses der
Ausgangsinonomere zur physiologischen Lösung kann man Polyacrylamidgelarten gewinnen,
die eine erhöhte Elastizität im Vergleich zu den bekannten aufweisen, welche die
weitere Bearbeitung des jeweiligen Gels erleichtert und in weiterem gute Qualität
des Nährbodens bewirkt.
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Die Copolymerisation der Ausgangsmonomere kann ohne Erwärmung beziehungsweise
unter Erwärmung des Reaktionsgemischer und unter Zugabe bekannter Initiatoren erfolgen.
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Die Copolymerisation des Reaktionsgemisches kann in einem Reaktor
mit vorgegebener Form, in Glas-, Metall-, Keramikbehältern sowie Behältern aus synthetischen
Materialien zustandekommen. Das bei der Copolymerisation anfallende Polyacrylamidgel
wiederholt die Form und die Abmessungen des jeweiligen Reaktors. Nach der Copolymerisation
erfolgt die Auswaschung des hergestellten Polyacrylamidgel8 mit einer entsprechenden
physiologischen Lösung. Dann wird das ausgewaschene Polyacrylamidgel dem Aufquellen
in der phyr siologischen Lösung bis auf seine Massevergrößerung auf das 2,8-4,5fache
ausgesetzt und das entstandene Gel mit.flüssigem Nährboden behandelt. Als solcher
wird Trypsin-Verdauungsfttittel nach Hottinger, Marten-Bouillon, Fleich--Pepton-Bouillon,
Peptonwasser, Kaseinhydrolysat, Würde oder
Medium 199 eingesetzt.
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Nach der zweiten Variante der Gewinnung des Nährbodens kann man das
mit der physiologischen Lösung ausgewaschene Polyaczylamidgel der Quellung in dem
flüssigen Nährboden mit der obengenannten Zusammensetzung unmittelbar bis auf die
Massenvergrößerung des Gels auf das 2,5-3,5fache aussetzen. Hinterer wird das aufgequellene
Polyacrylamidgel der ßterilisation unterworfen und der feste Nährboden ist somit
anwendungsfertig. Ein solcher Boden fördert die Vergrößerung der Ausbeute an Biomasse.
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Die Zusammensetzung der flüssigen Nahrböden wird nach dem Ernährungsbedarf
konkreter Gruppen oder Arten von Mikroorganismen beziehungsweise Zellenkulturen
von Makr w ganismen ermittelt. Für die Sättigung und Aufquellung des erfindungsgemäßen
Polyacrylamidgels können flüssige Nährböden eingesetzt werden, die den Ernährungsbedarf
praktisch aller bekannten Arten von Mikroorganismen und Zellen gewährleisten, einschließlich
von Natur-, halbsynthetischen und synthetischen Substrat zusammensetzungen oder
ihre Gemischen.
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Der feste Nährboden für die Züchtung von Mikroorganismen und Zellenkulturen,
der erfindungsgernäß hergestellt wurde, besitzt -gute Adhäsionseigenschaften (hält
sich gut in der Petri--Schale), ist gegenüber verschiedenen Einwirkungen stabil,
läßt sich nicht bei verschiedenen Manipulationen mit ihm beschädigen und sichern
ein gutes Gleiten der bakteriologischen Schleife bei der Inokulation und bei der
Abnahme von Mikroorganismen, ohne seine Oberfläche zu beschädigen.
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Mikroorganismen-Kulturen verteilen sich an der Oberfläche des festen
Nährbodens, ohne in ihn einzuwachsen. Dabei werden die optimalen Bedingungen für
die Lebenstätigkeit der Mikroorganismen gewährleistet, was die Erhöhung der Ausbeute
an Biomasse ermöglicht.
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Da die obenaufgeznhlten Eigenschaften des festen Nährbodens durch
die Eigenschaften des aufgequollenen Polyacryl amidgels bedingt sind, kann es, wie
diesseits festaestellt wurde, für die Zubereitung des festen Nährbodens für die
Züchtung von Gonokokken erfolgreich verwendet werden. Das in der physiologischen
Lösung aufgequollene Polyacrylamid-
gel, vorzugsweise bis zur Vergrößerung
seiner Masse auf das 4,5fache, wird mit dem Nährboden behandelt. Als solcher wird
ein Gemisch aus inaktiviertem sterilem Menschenblutserum und Plasmol eingesetzt,
die in einem Massenverhältnis 1:1 genommen werden.
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Plasmol stellt ein Arzneipräparat dar, das aus Menschenblut gewonnen
wird. Es ist eine farblose beziehungsweise etwas gelbliche durchsichtige oder leicht
osaleszierende Flüssigkeit nit spezigischen Geruch.
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Für eine differenzierte Diagnostik von Gonorrhoe werden folgende
Untersuchungen durchgeführt.
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Auf die in der physiologischen Lösung bis zur Massenvergrößerung
bis auf das 4,5fache aufgequollenen Polyscrylamidgel-Scheiben, die sich in Petri-Schalen
befinden und der Sterilisation in an sich bekannter Weise ausgesetzt werden, wurden
0,25-0,5 ml Menschenblutserum und 0,25-0,5 ml Plasmol mit einer Pipette aufgetragen
und im bekannten Verfahren der Inaktivierung unterworfen. Dann erfolgte die wiederholte
Inokulation der ausgesonderten Tageskultur der Gonokokken von 20 Patienten mit akuter.Gonorrhoe,
die auf einem festen Nährboden, dem Agar-Serum, gewonnen und der als Vergleichboden
verwendet wurde (I.M.Ovchinnikov "Labordiagnostik von Geschlechtskrankheiten", Moskau,
Verlag "Meditsina", 1969, Seiten 67-69), auf den auf die obenbeschriebene Weise
zabereiteten Boden. Die Schalen mit dem Inokulum wurden in einem Exsikkator untergebracht
und in einem Thermostaten bei einer Temperatur von 37°C während 24 Stunden gehalten.
Die auf dem Serumboden mit dem Polyaerylamidgel aufgewachsenen Kolonien von Gonokokken
verteilten sich in Form von Tautropfen mit glatter Oberfläche; sie waren farblos
und transparent. Bei der Bakterioskopie der aus diesen Kolonien zubereiteten . Abstriche,
die nach Gram und nach dem "Verfahren zur differenzierten Diagnostik von Gonorrhoe
und der bakteriellen Urethritis" (SU-PS Nr.826208) gefärbt werden, wurden gramnegative
bohnenartige Diplokokken nachgewiesen.
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In der zweiten Variante der Untersuchungen erfolgte die Inokulation
von Ausscheidungen aus dem Ureter von 30
Patienten mit akuter Gonorrhoe
und mit chronischer Gonorrhoe auf den erfindungsgemäßen Boden nach der Bestätigung
der Diagnose im bakterioskopischem Verfahren (Färbung nach Gram und nach SU-PS Nr.
826208) und im bakteriologischen Verfahren(Inokulation auf Serum-Agar-Boden). Auf
dem erfindungsgemäßen Nährboden gelang es immer, gutes Wachstum von Gonokokken zu
erreichen.
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Im Ergebnis der Untersuchungen wurde in den Tayesl-ulturen ein intensiveres
Wachstum von Gonokokken auf dem erfindunggemäseh festen Nährboden im Vergleich zum
Wachstum auf den jekannten sTahrbruen Weobachtet. Gonokokken haben beim Wachstum
auf dem erfindungsgemäßen Nährboden morphologische, Tinktur- und Kultureigenschaften
aufrechterhalten. Die Anwendung eines solchen Nährbodens für die Züchtung von Gonokokken
wird die Möglichkeiten der diagnostischen Methoden für die Diagnose von Gonorrhoe,
insbesondere bei chronischen und torpide verlaufenden Formen bedeutend erweitern.
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Zur Züchtung und Untersuchung der Wechselwirkung von Mikroorganismen
und Zellenkulturen von Makroorganismen sowie zur Untersuchung des Wirkungsmechanismus
derselben in vivo und in vitro kann man den Nährboden wie folgt hergestellen.
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Ein Gemisch aus Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-scTylamid und einem
Initiator von ~radikaZischem Typ, beispielsweise emn Gemisch aus N,N,N',N'-Tetramethyläthvlendiamin
und Ammoniumperoxidsulfat, das auf physiologischer Lösung zubereitet wird, gießt
man in einen Reaktor ein. Das Polyacrylamidgel wird bei der Copolymerisation zu
zwei flachen Streifen geformt, von denen einer Vertiefungen aufweist, die koaxial
beziehungsweise in Schachanordnung angebracht sind. Die Streifen werden mit einer
Lösung durchtränkt, die Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-aerylamid bei einem Massenverhältnis
15,0-20,0:0,019-0,132 enthält, und dann auf eine solche Weise zusammengeführt, daß
sie geschlossene Hohlräume für die nachfolgende Züchtung von Mikroorganismen beziehungsweise
Zellenkulturen von Makroorganismen in denselben bilden, wonach die Streifen bis
zur Entstehung eines einheitlichen Blocks mit seiner anschließenden Trennung in
Teile gehalten
werden, von denen jeder mindestens einen obengenannten
geschlossenen Hohlraum aufweist.
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Diese Teile mit den geschlossenen Hohlräumen können als Diffusionskammern
bezeichnet werden, die in einer physiologischen Lösung gehalten werden, Das Polyacrylamidgel,
aus dem sie hergestellt sind, quillt auf und vergrößert sich in seiner Masse auf
das 2,5-4,fache. Dann wird es mit flüssigem Nährboden in Abhängigkeit von dem zu
untersuchenden Mikroorganismus beziehungsweise Zellenkultur eines Makroorganismus
behandelt. Das gleiche mengenmaß"ige Verhältnis der Komponenten in dem zur Herausbildung
von Streifen verwendenden Reaktionsgemisch und im Gemisch zur Durchtränkung der
Streifen gewahrleistet die Homogenität der Struktur der Wandungen der entstehenden
Diffusionskammern, was eine gleichmäßige Diffusion von Stoffen ermöglicht und den
technologischen Prozeß ihrer Herstellung vereinfacht.
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In Abhängigkeit von der Anordnung der Vertiefungen auf einem Streifen
kann man Kammern mit einem Hohlraum und mit mehreren Hohlräumen erhalten. Der Abstand
zwischen den Vertiefungen und die Stärke der Streifen werden in Abhängigkeit von
der Zweckbestimmung einer Klammer variiert. So werden die Vertiefungen auf einem
Streifen bei der Herstellung von Kammern mit mehreren Hohlräumen in Schachanordnung
wünschenswerterweise mit einem Abstand von 0,5-2 mm voneinander angebracht, der
den optimalen Diffusionsprozeß zwischen den abgeschlossenen Hohlräumen dieser Kammern
gewährleistet. Sie geben die Möglichkeit, gleichzeitig Mehrkomponentensysteme in
ihrer Wechselwirkung untereinander sowie unter dem Einfluß der Faktoren eines lebenden
Organismus beziehungsweise der Umwelt zu untersuchen. Für die Herstellung von Kammern
mit einem Hohlraum werden die Streifen mit Vertiefungen herausgebildet, die koaxial
angeordnet werden.
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Die Kammern wurden für die Züchtunq von Makro-und Mikroorganismuszellen
in vivo und in vitro eingesetzt. Mit diesem Ziel wurden in den Hohlraum einer Kammer
mit Hilfe einer Spritze mittels Durchstechen der
Wandung mit Nadeln
Zellen lymphoider Organe und anderer (beispielsweise Milz, Lymphknoten, Thymus,
Knochenmark) eingetragen. Dann wurden die Kammern in den Organismus von Rezipienten
implantiert. Nach einer bestimmten Zeit wurden sie herausgenommen und mikroskopisch
untersucht.
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Dabei wurde die Zellenorganisation und der Charakter der Kolonien
untersucht. Mittels Durchstechen der Kammerwandung wurden aus dem jeweiligen Hohlraum
Zellen herausgenommen und ihre morphologische Struktur sowie die funktioneilen Eigenschaften
untersucht. Bei Züchtung von Knochenmarkzellen in vivo ist es gelungen, Wachstum
und Entwicklung von Zellen myeloider Reihe während 1 Monates und darüber hinaus
zu unterhalten, was die übliche oberlebensdauer dieser Zellen in Diffusionskammern
aus anderen Werkstoffen bedeutend übertrifft.
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Nachstehend werden konkrete Beispiele für die Realisierung der erfindungsgemäßen
Erfindung angeführt.
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Beispiel 1 Für die Herstellung des Polyacrylamidgels werden drei
Lösungen (A, B und C) nach folgender Methodik zubereitet: (die genannten Mengen
der Ausgangskomponenten werden, bezogen auf 1000 ml Lösung, gegeben): 1. Zubereitung
der Lösung A 5 ml N,N,N'-Tetramethyläthylendiamin werden in 995 ml 0,85%iger wässeriger
NaCl-Lösung aufgelöst. Die Lösung wird in vor Licht geschützten Gefäßen bei einer
Temperatur von 400 aufbewahrt.
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2. Zubereitung der Lösung B 0,594 g N, Nt-2ethylen-bis-acrylamid
werden in 500 ml 0,85g0iger wässeriger NaCl-Lösung aufgelöst, auf 600C erwärmt und
dann werden 470 g Acrylamid hinzugefügt, das bis zur vollständigen Auflösung vermischt
wird. Die hergestellte Lösung wird gefiltert und mit 0,8Soiger NaCl-Lösung bis auf
1000 ml gebracht. Diese Lösung wird in vor Licht geschützten Gefäßen bei 40C aufbewahrt.
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3. Zubereitung der Lösung C 1,78 g Peroxysulfat werden in 100 ml
0,85yOiger wässeriger NaCl-Lösung aufgelöst. Die Lösung wird in vor Licht
geschützten
Gefäßen aufbewahrt.
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Aus den drei zubereiteten Lösungen (A,B und C) wird ein Reaktionsgemisch
hergestellt. Hierfür werden die Lösungen A, B und C bei folgendem Volumenverhältnis
hintereinander vermischt: A : B: 0 = 16 : 31 : 52.
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Das Reaktionsgemisch weist.Monomere mit einem Massenverhältnis von
Acrylamids und N,NI -Met4ylen-bis-aetylamid gleich 15,0:0,019 auf, wobei das Massenverhältnisses
ihres Gemisches zur physiologischen Lösung 1:6 beträgt.
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Das Reaktionsgemisch wird in einen Reaktor von 200 ml Fassungsvermögen
eingegossen. Man bildet Scheiben aus Polyacrylamidgel mit vorgegebenem Durchmesser
heraus. Die Copolymerisation verläuft 40 Minuten. Die erhaltenen Scheiben werden
mit physiologischer Lösung ausgewaschen und in 0,85iiger NaCl-Lösung bis zu ihrer
Masseverqrößerung auf das 4,5fache gequollen. Nach der Quellung weist das Polyacrylamidgel
(Masse%) auf: copolymer aus Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid - 3,3 physiologische
Lösung -Das genannte Gel wird als Grundlage für die Herstellung des festen Nährbodens
nach Hottinger verwendet. Die Scheiben werden in einem Glasbehälter untergebracht,
mit Typ sinverdauangmittel nach Hottinger übergossen, das 200 mg% Aminstickstoff
enthält, ausgehend von 20 ml Bouillon je 1 Scheibe; und dann während 2-3 Stunden
zur Sättigung stehengelassen. Die durchtränkten Scheiben werden mit Dampf unter
Druck bei einer Temperatur von 12000 während 30 Minuten sterilisiert. Die gebrauchsfertigen
Nährböden werden angetrocknet und mit Test-Mikroorganismen inokuliert: St,aureus
209, B.coli K-12, E.coli M-17, Sh.flexneri, Bac.
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cereus 504, Bac. subtilis, Candida albicans.
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Als Kontrolle dienen die gleichen Kulturen von Mikroorganismen, die
auf Böden mit Polyacrylamidgel gezüchtet sind, das gemäß de SU-PS Nr. 977466 hergestellt
wurde. Die Inokulate werden in einem Thermostaten bei einer Temperatur von 3?oC
während 24 Stunden inkubiert.
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Der genannte Nährboden läßt sich während seiner Herstellung und Verwendung
nicht beschädigen, die Mikroorganismenkulturen weisen ein typisches Wachstum auf,
wachsen nicht in den Nährboden ein und lassen sich gut mit der bakteriologischen
Schleife abnehmen. Nachstehend ist die Tabelle 1 angeführt, in der die Ergebnisse
wiedergegeben sind, die die Intensität des Wachstums verschiedener Mikroorganismen
auf dem erfindungsgemäßen Nährboden und auf dem in der SU-PS 977466 beschriebenen
nährboden charakterisieren.
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Tabelle 1 Arten und Stamme Inokulum- Durchschnitts- Durchschnittsder
Mikroorganis- dosis anzahl der ge- anzahl der gemen (kolonien- wachsenen So- wachsenen
Kobildende lonien (gemäß lonien (ge-Einheiten) Beispiel 1) mäß SU-PS Nr.977466)
Staph.aureus 209 100 98 94 B.Coli S-12 100 96 92 E.coli M-lv 100 94 84 Sh.flexneri
100 82 Bac.cereus 504 100 86 Bacsubtilis 100 88 74 Candida albicans 100 78 70 Aus
der Tabelle l geht hervor, daß die Durchschnittsanzahl der auf dem erfindungsgemäß
hergestellten festen Nährboden gewachsenen Kolonien größer als auf den gemäß dem
in der SU-PS 977466 beschriebenen Nährboden ist.
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Beispiel 2 Die Lösungen A und C werden wie in Beispiel 1 zubereitet.
Für die Zubereitung der Lösung B löst man 0,844 g N,N1 -Methylen-bis-acrylamid in
500 ml einer 0,850igen wässerigen NaCl-Lösung, erwärmt auf 600C und fügt 470 g Acrylamid
hinzu. Die Lösung wird abfiltriert und mit einer 0,85%igen NaCl-Lösung bis zur Auffüllung
auf 1000 ml gebracht.
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Das Reaktionsgemisch wird wie in Beispiel 1 zubereitet.
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Das Reaktionsgemisch enthält AcTylamid und N,N -Methylen-bis-acrylamid
bei einem Massenverhältnis 15,0:0,027 Das Massenverhältnis des Cemisches derselben
zur physiologischen Lösung beträgt 1:?. Die CDpolymerisation verläuft wie in Beispiel
1. Die hergestellten Scheiben aus Polyaczylamidgel werden der Quellung in der physiologischen
Lösung nach Hanks bis zu ihrer Massevergrößerung auf das 3,2fache ausgesetzt. Nach
der Quellung weist das Polyacrylamidgel (Masse/%) auf: copolymer aus Acrylamid und
N,N1-Methylen-bis-acrylamid - 4,0 physiologische Lösung - 96,0.
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Zum Durchtränken des Gels wird in diesem Beispiel Fleisch-Pepton-Bouillon
verwendet. Das Durchtränken und die Sterilisation erfolgen wie in Beispiel 1. Als
Test-Mikro-Organismus dient die Kultur des Staphylococcus aureus Stamm 209 P. Als
Kontrolle dient die gleiche auf dem festen Nährboden (SU-PS 977466) und auf dem
Fleisch-Pepton-Agar gezüchtete Kultur. Nach der Inkubation der Inokulate in einem
Thermostaten bei einer Temperatur von 370C während 24 Stunden wird ein intensiveres
Wachstum der Staphylokokken-Eultur auf dem erfindungsgemaßen Nährboden im Vergleich
zu Kontrollinokulaten nachgewiesen.
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Die Staphylokokken-Kolonien sind typisch, rund, glatt, glänzend,
ölig mit einer intensiven Pigmentierung. Das Typische der Kultur wird durch mikroskopische
Untersuchung bestätigt. Die Kolonien werden mit der bakteriologischen Schleife ohne
Beschädigung der Oberfläche des festen Nährbodens Beispiel 3 Die Lösungen A und
C werden wie in Beispiel 1 zubereitet. Die Lösung B wird wie folgt zubereitet.
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In einen Meßkolben von 1000 ml-Inhalt werden 0,937 g N,N1 -Methylen-bis-ac;rylamid
eingebracht und 400 ml einer 0,85%igen NaCl-Lösung hinzugegossen. Nach der vollständigen
Auflösung des Monomeres wird die Lösung auf 600C erwärmt und dann 625 g Acrylamid
hinzugefügt. Die Lösung wird filtriert und mit einer 0,85g0igen NaCl-Lösung bis
zur Auffüllung
auf 1000 ml gebracht.
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Das Reaktionsgemisch enthält Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid
bei einem Massenverhältnis 20,0:0,03 und das Massenverhältnis des Gemisches derselben
zur physiologischen Lösung beträgt 1:4. Die Copolymerisa tion erfolgt wie in Beispiel
1.
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Die hergestellten Polyaorylamidgel-Scheiben werden der Quellung in
physiologischer Lösung, Earl-Lösung bis zu ihrer Massevergrößerung auf das 3,7fache.
Nach der Quellung weist das Polyacrylamidgel (Masse%) auf: Copolymer aus Acrylamid
und N,N'-Methylen-bis-ac:rylamid - 5,3 physiologische Lösung - 94,7.
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Als flüssiger Nährboden für das Durchtränken wird Würze verwendet,
das Durchtränken und die Sterilisation erfolgen wie in Beispiel l beschrieben. Nach
der Sterilisation verändert der feste Nährboden seine Eigenschaften nicht. Als Test-Mikroorganismus
diente eine Pilzkultur Busarium avenaceum. Nach 4 Tagen der Züchtung in einem Thermostaten
bei 280C sind typische Pilzkolonien mit charakteristischem buschigem Myzel aufgewachsen,
die rosige Färbung aufwiesen. Durch mikroskopische Untersuchung wurde die charakteristische
Struktur des Myzeliums nachgewiesen; es wurde Sporenbildung beobachtet. Die Kolonien
lassen sich gut mit der bakteriologischen Schleife ohne Beschädigung der Oberfläche
des Nährbodens abnehmen.
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Beispiel 4 Die Lösungen A und C werden wie in Beispiel 1 zubereitet.
Die Lösung B wird wie folgt zubereitet.
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4,125 g N,N1-Methylen-bis-acrylamid werden in 500 ml einer 0,85%eigen
wässerigen NaCl-Lösung aufgelöst, auf 600C erwärmt und dann werden 470 g Acrylamid
hinzugefügt und bis zur vo11ständigenAuf1ösung vermischt. Die hergestellte Lösung
wird flitriert und mit einer 0,85%gen wässerigen NaCl-Lösung bis zur Auffüllung
auf 1000 ml gebracht.
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Aus den zubereiteten Lösungen wird ein Reaktionsgemisch hergestellt
und man führt die Copolymerisation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen
durch,
Das Reaktionsgemisch enthält Acrylamid und N,N'-Methylen-bie-acrylamid
bei einem Massenverhältnis 15,0:0,132 Das Massenverhältnis des Gemisches derselben
zur physiologischen Lösung beträgt 1:5.
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Das genannte Polyacrylamidgel wird als Grundlage für den festen Nährboden
bei der Herstellung von Biomasse Staph-. aureus 209 P verwendet. Die erhaltenen
Scheiben werden mit einer 0,85%igen NaCl-Lösung ausgewaschen und in das Trypsinverdauungsmittel
nach Hottinger, das 200 mg70 Stickstoffamin enthält, bis zur Massevergrößerung des
Gels auf das 2,5fache getaucht.
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Die fertigen festen Nährböden werden mit Dampf unter Druck bei einer
Temperatur von 120 0C während 30 Minuten sterilisiert. Als Kontrolle dienen der
agarisierte Hottinger-Nährboden mit 200 mg% Stickstoffamin und der in der SU-PS
977466 beschriebene Nährboden. Staphylokokken werden auf eine Scheibe mit 60-63
mm Durchmesser bezogen auf 18 Mikrobenkörper je 1 ml, inokuliert. In Tabelle 2 sind
Angaben aufgeführt, die die Ausbeute an Biomasse des Staphylococcus aureus auf verschiedenen
festen Nährboden charakterisiert.
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Tabelle 2 Biomasse des Sapokokken in mg/cm<, hergestellt auf festen
Nährböden nach dem gemäß Beispiel 1 gemäß auf dem agarierfindungs- SU-PS " sierten
Nährgemäßen 977466 boden Beispiel 2,01 1,57 1,50 1,53 Nach der Quellung enthält
das Polyacrylamidgel (Masse%): Copolymer aus Acrylamid und N,N' -Methylen-bis-acrylamid
- 6,0 Tryps in-Verdauungsinittel nach Hottinger - 94,0, Beispiel 5 Das Polyac;ylamidgel
wird wie in Beispiel 1 hergestellt.
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Das genannte Polyaazylamidgel wird als Grundlage für den festen Nährboden
zur Züchtung des Pilzes Verticillium dahliae verwendet. Die in einer 0>85%0igen
NaCl-Lösung ausgewaschenen Scheiben werden in den flüssigen Nährboden, Würze, eingebracht
und der Quellung bis zu ihrer Massevergrößerung auf das 3,5fache ausgesetzt.
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Nach der Sterilisation werden die fertigen festen Nährböden mit Pilzkultur
geimpft. Als Kontrolle dient Pilskultur Verticillium dahliae, die auf dem agarisierten
mit Würze dzshtrankten Boden, der gemaß Beispiel 1 zubereitet wurde, gewachsen ist.
Die Inokulate werden bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.
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Auf dem gemäß Beispiel 5 zubereiteten Nährboden wird ein intensives
Wachstum des Pilzes mit charakteristisohen morphologischen und Kultureigenschaften
am dritten Tag und auf den gontrollnährböden ähnliches intensives Wachstum erst
am fünften Tag beobachtet.
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Beispiel 6 Das wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitete Reaktionsgemisch
wird in einen Reaktor eingegossen und das Polya rylanidgel wird zu 2 flachen Streifen
geformt.
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Ein Streifen weist Abmessungen l80ælOOxO?d mm, der zweite Streifen
Abmessungen 10xl00x2,5 mm mit Vertiefungen von 3x1,O mm auf, die in Schachanordnung
mit einem Abstand von 1 bis 1,5 mm voneinander angebracht sind. Die Sterilisation
erfolgt während 40 Minuten. Dann werden die hergestellten Streifen mit einem Gemisch
durchtränkt, das in seiner Zusammensetzung dem in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionsgemisch
ähnlich ist. Danach werden die Streifen auf eine solche Weise zusammengeführt, daß
sie geschlossene Hohlräume für die nachfolgende Züchtung der Zellenkulturen von
Makro-- und Mikroorganismen in denselben bilden. Sie werden darin während 40 Minuten
bis zur Entstehung eines einheitlichen Blocks gehalten. Dann wird dieser in Teile
getrennt, von denen jeder drei geschlossene Hohlräume aufweist,.das heißt, daß Diffusionskammern
entstehen, die in eine 0,85%0ige NaCl-Lösung eingebracht und bis zu ihrer Massevergrößerung
auf das 4,5fache gehalten werden. Dann werden die Kammern
während
1-1,5 Stunden sterilisiert und mit dem Nährboden 199 gesättigt.
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In einen der drei Hohlräume der Diffusionskammern wurden Knochenmarkzellen,
die sich im Nährboden 199 in einer Dosis von 2x106 befinden, in den zweiten - Suspension
des Staphylokokken des Cowan-Stammes in einer Dosis von 2kl05 in physiologischer
Lösung eingebracht. Dann wurden die Kammern in die Bauchhöhle von Syngen-Tieren
implantiert.
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In den ersten 3 Tagen waren in der Zone des Wachstums der Zellen
der myeloiden Reihe hauptsSchlich die Kolonien von Makrophagen und -granulozyten
überwiegend zu beobachten. Makrophagen hatten unterschiedliche Form und Abmess uen,
Am siebenten Tag vergrößerte sich die Anzahl der Kolonien von Makrophagen stark,
es begangen zwischen den Makrophagen und Lymphozyten zytoplasmatische Brücken, Zellen
von Verbindungs-Gewebetyp, Histiozyten sowie Zellen zu entstehen, die den Osteoblasten
ähnlich sind. Es bildeten sich Kolonien von retikulären Zellen und Neutrophylen
heraus.
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Im zweiten Hohlraum entstanden typische, runde, glatte Staphylokokken-Kolonien,
deren Anzahl sich mit der Zeit ihrer Beobachtung vergrößerte. Sie flieBen zusammen
und bildeten eine durohgehende Wachstumzone in dem Hohlraum.
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Beispiel 7 Die Lösungen A und C werden analog dem Beispiel 1 und
die Lösung B analog dem Beispiel 2 zubereitet.
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Das Reaktionsgemisch enthält Acrylamid und N,N'-Methylen-bie-acrylamid
bei einem Massenverhältnis von 15,0:0,027.
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Das Massenverhältnis des Gemisches derselben zur physiologischen Lösung
beträgt 1:7. Das Reaktionsgemisch wird in einen Reaktor eingegossen und das Polyacrylamidgel
wird zu zwei flachen Streifen geformt: ein Streifen weist Abmessungen von 120x75x1
mm und der zweite von120x75x2,2 em auf mit Vertiefungen von 4x1,2 mm, die koaxial
mit einem Abstand von 1,7 cm voneinander angebracht werden.
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Die copolymerisation erfolgt während 40-50 Minuten.
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Die hergestellten Streifen werden mit einem dem Reaktionsgemisch ähnlichen
Gemisch durchtränkt. Dann werden die Streifen so zusammengeführt, daß sie geschlossene
Hohlräume bilden. Sie werden während 60 Minuten bis zur B'ntstehung eines einheitlichen
Blocks gehalten. Dieser wird in Teile getrennt,von denen jeder einen geschlossenen
Hohlraum aufweist, das heißt daß Diffusionskammern entstehen, die mit physiologischer
Lösung ausgewaschen und dann in der physiologischen NaCl-Lösung bis zu einer Massenvergröerung
auf das 2,8fache gehalten werden. Danach werden die Kammern der Sterilisation während
1-1,5 Stunden ausgesetzt und mit dem Nährboden 199 gesättigt.
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Aus dem Oberschenkelknochen von intakten Syngene-Tieren wurde Knochenmark
entnommen. Die Knochenmarkzellen, die sich im Nährboden 199 in einem Volumen von
0,2 ml (4xlO6 Zellen) befinden, wurden in Diffusionskammern eingebracht, die in
die Bauchhöhle von Syngenerezipienten implantiert wurden.
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Nach der Züchtung von Zellen in vivo wurden die Diffusionskammern
aus der Bauchhöhle entnommen und unter einem Mikroskop wurde die Zellen-Monoschicht
(Wachstumszone, Zellenstruktur) sowie Abdrucknraparate, die aus den gewachsenen
Zellenkulturen hergestellt wurden, untersucht.
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Am dritten Tag der Züchtung von Zellen des Knochenmarks in den Diffusionskammern,
die in die Bauchhöhle von normalen Tieren implantiert wurden, wurde heterogene Zellenstruktur
nachgewiesen, die für das intakte Knochenmark kennzeichnend ist. Im weiteren (am
siebenten Tag) degenerierte ein Teil dieser Zellen, der andere Teil begann sich
in eine bestimmte Form zu transformieren. Man beobachtete verschiedene Stufen der
Differenzierung von Granulozyten. Metamyelozytäre Zellen verteilten sich in Gruppen
in der Nähe von schnell gewachsenen Fasern eines nichtdifferenzierten Gewebes und
hatten auf ihrer Oberfläche lbungen. Die reifen Granulozyte enthielten einen für
Neutrophyle charakteristischen Kern. Bei den Zwischenformen war eine ausgeprägte
Kernsegmentierung zu beobachten. In der Wachstumzone
bildeten sich
grosse Epithelzellen (40film) mit unbedeutenden Wucherungen an ihrer Oberfläche.
Sie verteilten sich in der Monoschicht in Gruppen und vereinzelt. Ihr Kern wies
eine verflachte Form auf, im Zytoplasma fehlten phagozytierte Einschlüsse.
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Ausserst lebensfähig erweisen sich Monozyte. Umfassende Phagozytenvakuolen
sind oft mit Inhalt ausgefüllt. Monozyte konnten nach der bohnenartigen Form des
Kernes, der oft exzentrisch liegt, gut identifiziert werden.
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Bei einer längeren Züchtung hat der Kern eine noch rundere Form angenommen.
Die Monozyte verteilten sich oft in der Nähe von den Epithelzellen, sie wiesen jedoch
keine Tendenz zur Aggregation auf.
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In den 21-tägigen Kulturen verteilten sich die wachsenden Zellen
in dem Hohlraum der Diffusionskammer und bildeten eine bestimmte Strukturorganisation
heraus. Die unmittelbar an die Oberfläche anliegende Schicht setzte sich aus Epithelzellen
zusammen, dann folgte eine Gruppe von monozytären Fettzellen und Junge Formen von
Neutrophylen.
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Reife Formen verteilten sich an der Peripherie. Die lymphozytartige
und Blastzellen lokalisierten sich innerhalb der Adhäsionsschicht. In der Wachstumszone
erschienen Fettzellen mit einem kleinen dichten Kern. Manchmal waren zwei kernige
Formen anzutreffen. Auf Elektronogrammen konnten sie gut nach kleinen Fettropfen
in Zytoplasma identifiziert werden, Lipideinschlüsse verteilten sich oft nestförmig
und flossen manchmal zusammen und bildeten Tropfen mit einem Durchmesser von 40
ßm Durch die Akkumulation von Fett erreichten diese Zellen manchmal Abmessungen
von 120 ßm. Eine vereinzelte Vakuolemembrane zeugt von intrazellulärer Lipidsynthese.
Ein Kern mit runder oder ovaler Form setzte sich aus kondensiertem Chromatin zusammen.
Das Zytoplasma der reifen Zellen weist -vielzählige Mitochondrione auf. In der Stufe
der früheren Akkumulation von Fett ist das Zytoplasma indifferenziert. Fettzellen
wiesen eine Tendenz zur Verteilung in Gruppen auf und bildeten umfassende Herde
zwischen den granulozytären Kolonien, behielten aber längere Zeit funktionelle Abhängigkeit.
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Beobachtet wurden auch Zellen der megakaryozytären Reihe. Diese großen
Zellen wiesen spharische Form, manchmal mit Wucherungen an der Oberfläche der Zytoplasmamembrane
auf. Es wurde keine Thrombozytopoese nachgewiesen.
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Beispiel a Die Lösungen A und C werden analog dem Beispiel 1 und
die Lösung B analog dem Beispiel 4 zubereitet.
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Das Reaktionsgemisch enthält Acrylamid und N,N-Methylen-bi£-acrylamid
bei einem Massenverhältnis von 15,C:0,132.
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Das Massenverhältnis des Gemisches derselben zur physiologischen Lösung
beträgt 1:5. Das Reaktionsgemisch wird in einen Reaktor eingegossen und das Polya
rylamidgel zu zwei flachen Streifen geformt. Ein Streifen weist Abmessungen vop
15ox8OxlZ2 mm auf und der zweite Streifen mit Sbmessungen von 1 r;0x80x2,5 mm hat
Vertiefungen von5x1,3 mm, die koaxial mit einem Abstand von 1,8 cm voneinander angebracht
sind. Die Copolymerisation erfolgt während 40 Minuten. Die hergestellten Streifen
werden mit einem dem Reaktionsgemisch ähnlichen Gemisch durchtränkt und auf eine
solche Weise zusammengeführt, daß sie geschlossene Hohlräume bilden. Sie werden
während 50 Minuten bis zur Entstehung eines Blockes gehalten, der geschlossene Hohlräume
aufweist. Dann wird der Block in Teile getrennt, die je einen geschlossenen Hohlraum
haben das heißt Diffusionskammern, die in die physiologische NaCl-Lösung bis zu
ihrer Massevergrößerung auf das 3,2fache eingebracht werden. Dann werden die Kammern
sterilisiert und mit Hanks-Lösung durchtränkt.
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Für die Züchtung von Leukozyten eines gesunden Menschen wurden in
den Hohlraum einer Diffusionskammer eine Leukozyten-Population eingeführt, die alle
Formen der Weißblutzellen in der Hanks-Lösung in einer Dosis von lxlO6 Leukozyten
aufweisen. Dann wurden die Diffusionskammern in den Organismus von Xenogen-Tiercn
implantiert und nach der erforderlichen Beobachtungsdauer herausgeholt.
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Die Versuche haben ergeben,daß die Lymphozyte während 20 Tage aufrechterhaiten
blieben. Ihre Anzahl jedoch ver-
ringerte sich von 79% auf 20%.
Lebensfähig blieben die Neutrophyle und Monozyte lediglich in den ersten 2-3 Tagen.
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Man beobachtete eine Vergrößerung der Anzahl von Makrophagen von 15%
am zweiten Tag auf 50X0 am zwanzigsten Tag.
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Am achten Tag begannen in der Kultur Blaste, fibroblastartige und
Übergangszellen zu erscheinen.