DE69534876T2

DE69534876T2 - Nematizides mittel und verfahren zur biologischen bekämpfung von nematoden

Info

Publication number: DE69534876T2
Application number: DE69534876T
Authority: DE
Inventors: Jesus Mena Campos; Gustavo Alberto De La Riva De La Riva; P. Ramon VASGUEZ MENDEZ; Marina Fernandez Machuca; Alberto Coego Gonzalez; Melba Garcia Gonzalez; Eulogio Pimentel Vasquez; Alina Lopez Quesada; Rolando Garcia Gonzalez; Zurima Zaldua Guerra; Juan Diego Mencho Ponce
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2015-08-11
Also published as: CO4600734A1; CA2197116C; EP0774906B1; EP1046338A1; EP0774906A1; WO1996004794A1; CA2197116A1; MX9700927A; PT774906E; BR9508533A; AU693919B2; AU3122795A; ATE320188T1; DE69534876D1; ES2257742T3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Mikrobiologie und insbesondere auf einen Corynebacterium-paurometabolum-Stamm, der aufgrund seiner nematiziden Wirkung nützliche Eigenschaften im landwirtschaftlichen Sektor hat, was seine Verwendung zur biologischen Bekämpfung von Nematoden in Kulturpflanzen oder landwirtschaftlichen Pflanzen von ökonomischem Interesse und in Tieren ermöglicht.
Nematoden gehören zu den bedeutendsten Schädlingen in der Landwirtschaft in tropischen, subtropischen und gemäßigten Zonen (Nickle W.R., 1991, Manual of Agricultural Nematology, N.Y.). Die wichtigste Gruppe unter den phytopathogenen Spezies ist Meloidogyne spp., die in den meisten tropischen Regionen Verluste verursacht, die zwischen 11% und 25% der Ernte geschätzt werden (Sasser J.N., 1979, Root knot nematodes, Hrsg. F. Lamberti & C.E. Taylor, Academic Press, London). Es gibt nur wenige Möglichkeiten, sie zu bekämpfen, wobei chemische Nematizide das Mittel sind, das am häufigsten verwendet wird, um Nematodenpopulationen zu bekämpfen. Verwendet wird auch eine Kombination der Einführung von weniger anfälligen Kulturpflanzensorten sowie Fruchtwechselstrategien und die integrierte Durchführung der Ernte. Dennoch bleibt die Bekämpfung von phytopathogenen Nematoden unbefriedigend (Atkinson, H.J., 1993, BCPC-Monographie Nr. 65; Opportunities for Plant Molecular Biology in Crop Production, Seite 257-266). Die Verwendung von chemischen Nematiziden ist eingeschränkt, da es sich um systemische Substanzen mit einem breiten Wirkungsspektrum handelt, wie phosphororganische Verbindungen und Carbamate, die ein hohes Maß an Toxizität aufweisen. Eine weitere Form des Angriffs, der gegen diese Parasiten verwendet wird, besteht darin, das Feld vor dem Aussäen mit Produkten zu desinfizieren, die nicht weniger toxisch sind, wie Methylbromid und Dichlorpropen. All dies gab Anlass zu intensiven Studien über die verschiedenen natürlichen Feinde von Nematoden im Hinblick auf ihre Verwendung als Biopräparate, die eine Bekämpfung des Schädlings erlauben und gleichzeitig die Gefahren reduzieren, die mit der übermäßigen Verwendung von Landwirtschaftschemikalien mit hohen Toxizitätsniveaus verbunden sind.
Die nematophagen Pilze, die denselben Lebensraum wie die Phytonematoden bewohnen, können ein vorbestimmtes biologisches Gleichgewicht aufrechterhalten und die Vermehrung der Nematoden bis zu einem gewissen Grad einschränken. Unter anderen natürlichen Feinden finden wir Anthrobotrys irregularis; andere sind Ovizide, wie Paecilomyces lilacinus und Verticillium chlamydosporum. Es wurden auch Studien über die Wirkung des Bakteriums Pasteuria penetrans durchgeführt, das Endosporen bildet, die sich an die Seite des Nematoden heften und beim Auskeimen in diesen eindringen und eine Atrophie aller Organe des weißen Nematoden bewirken.
EP-A-0 401 560 offenbart die Verwendung von chitinolytischen Stämmen einer Corynebacterium-Spezies und einer Achromobacter-Spezies als Nematizid sowie entsprechende Zusammensetzungen, die zum Beispiel Dünger als Träger enthalten können. Die Spezies sind nicht offenbart.
EP-A-0 303 246 und WO-A-93/19604 offenbaren verschiedene Stämme von Bacillus thuringiensis zur Verwendung als Nematizide gegen phyto- und zooparasitische Nematoden.
Zuckerman et al., J. Chem. Ecol. 15, 1947-1955 (1989), offenbaren die Isolierung von 446 Mikroorganismen, von denen neun eine nematizide Wirkung zu haben schienen.
Trotzdem ist die Bekämpfung von Nematodenpopulationen mit diesen Mitteln immer noch ineffektiv. Zu den Gründen, die die geringe Effektivität der existierenden Verfahren zur biologischen Bekämpfung bestimmen, gehören die folgenden:

– geringer Grad des Antagonismus zwischen dem Nematoden und seinem Antagonisten;
– erhöhte Spezifität des Antagonisten für eine besondere Art von Nematoden;
– Schwierigkeiten, große Volumina des Antagonisten zu erhalten;
– Schwierigkeiten in der Anwendung aufgrund der Lebensweise des Nematoden;
– Vielfalt in der Verteilung der Nematoden in der Umgebung;
– erhöhte Vermehrung der Nematoden.

Ein Ziel dieser Erfindung besteht in der Verwendung eines Bakterienstamms als Bionematizid für ein breites Spektrum zur Bekämpfung von Nematodenpopulationen in wichtigen landwirtschaftlichen Kulturpflanzen. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Stamms, der effektiv bei der Bekämpfung von Zoonematoden wie Haemonchus spp. und Trichostrongylus spp. ist, welche Indikatoren für eine mögliche Verwendung im Veterinärsektor sind.
Mit dieser Zielsetzung wurde ein neuer Stamm mit nematiziden Eigenschaften erhalten. Dieser neue Stamm wurde unter Verwendung des Referenzsystems API-50 CH (BIOMERIEUX SA, 69280 Marcy-I'Etoile, Frankreich) als Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 klassifiziert.
Der obige Stamm wurde am 8. August 1995 gemäß dem Budapester Abkommen beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer CBS 613.95 (Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur biologischen Bekämpfung von Nematoden bereit, das das In-Kontakt-Bringen von Boden, einer Pflanze oder eines Samens mit einer wirksamen Menge eines nematiziden Mittels umfasst, wobei es sich bei dem Mittel um eine Kultur, die vom Corynebacteriumpaurometabolum-Stamm C-924 erhalten wurde, oder um einen von diesem Stamm stammenden Metaboliten, der auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, in einem geeigneten Träger handelt.
Insbesondere wird das nematizide Mittel für die effektive Bekämpfung von Radopholus similis und Meloidogyne incognita bei Pflanzen verwendet.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfasst das nematizide Mittel eine Kultur des Corynebacterium-paurometabolum-Stamms C-924, die in einer Konzentration zwischen 10⁶ und 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml Medium hinzugefügt wird, wobei das Mittel alle drei Monate in einer Menge von ungefähr 14 Litern pro ha auf das betroffene Gelände aufgebracht wird.
Weiterhin gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines nematiziden Mittels zur Herstellung einer veterinärmedizinischen Zusammensetzung zur Bekämpfung von Zoonematoden an, wobei es sich bei dem nematiziden Mittel um eine Kultur, die vom Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 erhalten wurde, oder um einen von diesem Stamm stammenden Metaboliten, der auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, in einem geeigneten Träger handelt.
Insbesondere wird das nematizide Mittel zur Herstellung einer veterinärmedizinischen Zusammensetzung zur wirksamen Bekämpfung der Zoonematoden Haemonchus spp. und Trichostrongylus spp. bei Tieren verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Kultur von Corynebacterium paurometabolum bereit, wobei die Kultur die Kultur des Stammes C-924 von Corynebacterium paurometabolum oder einer davon stammenden Mutation, die gegen Nematoden aktiv ist, handelt.
In einer besonderen Ausführungsform enthält die Kultur zwischen 10⁶ und 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml Kulturmedium.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein nematizides Mittel für die wirksame biologische Bekämpfung von Nematoden bei Pflanzen bereit, das eine Kultur, die den Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 oder eine von dem Stamm stammende Mutation sowie einen beliebigen Wirkstoff oder Metaboliten, der auf der Basis dieses Stammes auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, sowie einen geeigneten Träger umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform eines solchen nematiziden Mittels zur Bekämpfung von Phytonematoden handelt es sich bei dem geeigneten Träger um ein Düngemittel, vorgepackte Erde, eine Saatabdeckungsvorrichtung, ein Pulver, Granulat, Vernebler, eine Suspension oder eine Flüssigkeit oder eine der angegebenen Varianten in einer eingekapselten Form.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein nematizides Mittel für die wirksame biologische Bekämpfung von Nematoden bei Tieren bereit, das eine Kultur, die den Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 oder eine von dem Stamm stammende Mutation sowie einen beliebigen Wirkstoff oder Metaboliten, der auf der Basis dieses Stammes auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, sowie einen geeigneten Träger umfasst.
Wenn ein nematizid wirksamer Metabolit und keine Kultur des Stammes verwendet wird, kann ein solcher nematizid wirksamer Metabolit durch jedes geeignete Verfahren erhalten werden, zum Beispiel kann er durch Isolierung aus seiner natürlichen Umgebung erhalten oder durch DNA-Rekombinationstechnik produziert oder durch chemische Synthese synthetisiert werden.
Ein anderer Stamm, auf den hier in den Beispielen Bezug genommen wird, ist ein Sphingobacterium-spiritivorum-Stamm C-926, der an demselben Datum und bei derselben Institution wie der Stamm C-924 unter der Nummer CBS 612.95 hinterlegt wurde. Der Stamm C-926 ist nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung von Bodenbakterienstämmen mit möglichen Wirkungen auf phytopathogene Nematoden.
In einem Gebiet mit starkem Vorkommen von Nematoden (Radopholus similis) wurden Bananenpflanzen, die einen starken Befall im Wurzelsystem aufwiesen, und andere, die einen viel geringeren Befall des Wurzelsystems aufwiesen, obwohl sie sich in demselben Gebiet befanden, ausgewählt. Der Unterschied in der Lebenskraft zwischen den beiden Gruppen war signifikant. Segmente der Wurzeln der ausgewählten Pflanzen mit 1 cm Breite sowie Proben des dazugehörigen Bodens wurden gesammelt. Die Bodenproben wurden getrennt unter Verwendung eines Nr.-40-Siebs gesiebt, und ein Gramm des gesiebten Materials wurde in 10 ml sterilem Wasser verdünnt und dann durch Rühren homogenisiert. Nachdem man fünf Minuten ruhen gelassen hatte, wurden 200 μl des Überstands auf Petri-Schalen mit LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) gegeben. Dann wurden die Proben 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert, und dann wurden die isolierten Kolonien neu ausgesät, aber getrennt, und 24 Stunden lang bei 28 °C kultiviert. Ein Vergleich der Morphologie der Stämme, die von jeder der Gruppen von analysierten Proben abgeleitet waren, führte zu der Beobachtung, dass einige der Stämme nur in der Gruppe vorhanden waren, die aus dem Boden stammte, der in den Wurzelkomplexen der kräftigeren Bananenpflanzen mit einem gesünderen Wurzelsystem enthalten war. Insgesamt wurden vier Stämme isoliert und sofort einer Aktivitätsanalyse in Bezug auf die Eier von Meloidogyne incognita unterzogen.
Beispiel 2: Klassifizierung des Bakterienstamms C-924 mit nematizider Aktivität
Der Bakterienstamm hat die Form eines kurzen Gram-positiven Bacillus. Er wurde nach dem API-50-CH-System (BIOMERIEUX SA, 69280 Marcy-I'Etoile, Frankreich) klassifiziert. Im Einklang damit wurde er als Corynebacterium paurometabolum C-924 bezeichnet. Die auf der Grundlage der durchgeführten chemischen Tests erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Reaktionen wurden mit dem API-Coryne-System (BIOMERIEUX SA, Marcy-I'Etoile/Frankreich) durchgeführt und gemäß diesem System als Corynebacterium paurometabolum C-924 klassifiziert:
Identitätsnummer gemäß dem Api-Coryne-System: 024000000000000000004. Die Identität entspricht Corynebacterium paurometabolum, wobei der Stamm als Corynebacterium paurometabolum C-924 bezeichnet wird.
Beispiel 3: Wirkung der Bakterienstämme auf die Eier und jungen Larven von Meloidogyne incognita unter "in-vitro"-Bedingungen.
Mehrere verschiedene Bakterienstämme wurden unter "in-vitro"-Bedingungen bezüglich ihrer Wirkung auf die Eier und Larven von Meloidogyne incognita bewertet. Die zu bewertenden Stämme wurden 24 Stunden lang bei 28 °C unter ständigem Rühren mit 100 U/min in einem LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert, mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, und die Zahl der lebensfähigen Proben wurde in jedem Fall bestimmt. Verdünnungen von 10⁶ Zellen/ml in dem LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) wurden hergestellt. Mit aufgenommen wurde eine negative Kontrolle, die ausschließlich aus dem LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) bestand. Vier Varianten und vier Replikate wurden verendet. Jedes Replikat wurde in einem "Syracuse"-Kolben mit 25 ml Kapazität gehalten. Ungefähr 1000 Eier des Nematoden wurden in jeden Behälter gegeben (insgesamt 24 Behälter), und 20 ml der Verdünnungen jedes Stammes, neben den negativen Kontrollen. Regelmäßige Beobachtungen wurden nach 24 und 48 Stunden gemacht, wobei die Zahl der geschlüpften Eier und die Mortalitätsrate unter den Larven bestimmt wurden.
Die Ergebnisse der Wirkungen der Bakterienstämme C-926 und C-924, die als Prozentsatz ausgedrückt sind, sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Anmerkung: V ist der Variationskoeffizient. Die Schlüpfraten gelten als gut für diese Art von "in-vitro"-Experiment. V = lebend, M = tot.

Beispiel 4: Wirkung von verschiedenen Bakterienstämmen auf Populationen von Meloidogyne incognita in Kürbispflanzen.
Ein Experiment wurde durchgeführt, bei dem man Kürbispflanzen verwendete, die in Töpfe von 7 cm Durchmesser mit 10 cm hoch Erde, die zuvor mit den Eiern von Meloidogyne incognita infiziert worden war, gepflanzt wurden. Eine schwarze karbonisierte Erde wurde verwendet, die gesiebt und eine Stunde lang in einem Autoklaven bei 1,5 Atmosphären sterilisiert worden war, und man ließ einen Monat verstreichen, damit sich die Mikroflora der Erde erholen konnte. Die Impfung wurde in jedem der Replikate (Töpfe) durchgeführt, wobei man 500 lebensfähige Eier des Nematoden in 2 ml destilliertes steriles Wasser gab. Die Eier wurden gleichmäßig in einer Tiefe von 4 cm abgelegt. Die Auftragung der Bakterienkulturen erfolgte 6 Stunden nach der Impfung, wobei in jedem Fall 50 ml mit 10⁷ Zellen pro ml aufgetragen wurden. 72 Stunden nach dem Auftragen wurde in jeden Topf ein vorgekeimter Kürbissamen eingepflanzt. Die Feuchtigkeit der Erde wurde in den Töpfen 60 Tage lang durch Gießen gleichmäßig gehalten. Sobald diese Zeit abgelaufen war, wurden die Pflanzen herausgezogen, und eine Bewertung der Beschädigung des Wurzelsystems, der durch den Angriff des Nematoden verursacht wurde, wurde gemäß der Zeck-Skala durchgeführt. Eine Kultur von E. coli MC1061 wurde als negative Kontrolle in dem LB-Medium ohne Bakterien verwendet. Zehn Replikate wurden verwendet. Der als C-926 bezeichnete Stamm zeigte einen höheren Grad der Wirkung bezüglich des Schutzes des Wurzelsystems der Indikatorpflanzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Anmerkung: V = Variationskoeffizient. Die Schlüpfraten unter den Bedingungen dieser Art von Experiment sind stets größer als diejenigen, die man bei "in-vitro"-Schlüpfexperimenten findet.

Beispiel 5: Wirkung der Bakterienstämme auf die Population von Radopholus similis in Bananenpflanzen.
Dieses Experiment wurde unter ähnlichen Bedingungen wie die oben beschriebenen in Töpfen von 10 cm Durchmesser und einer Tiefe von 20 cm durchgeführt. In einer Tiefe von 4 cm wurden 500 einzelne Radopholus similis in 3 ml destilliertem sterilem Wasser abgesetzt. Nach 5 Tagen wurden 50 ml mit 10⁷ Zellen/ml von jeder Variante aufgebracht. Nach 24 Stunden wurde in jeden Topf eine Bananenpflanze eingepflanzt. Die verwendeten Pflanzen stammten aus einer "in-vitro"-Ernte, die frei von Pathogenen war. Zwei Monate nach dem Einpflanzen wurden die Pflanzen in die Lageranlage übergeführt, und die Feuchtigkeit der Erde wurde mit zwei gleichmäßigen Gießvorgängen pro Tag aufrechterhalten. Die endgültige Bewertung des Experiments erfolgte nach Ablauf von fünf Monaten. Das Experiment wurde mit sieben Varianten und zehn Replikaten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 (Mittelwerte pro Behandlung)

* 5 Replikate

Die Populationen der lebenden Nematoden wurden einer statistischen Analyse (ANOVA, d.h. Analyse der Varianzen) unterzogen, die signifikante Unterschiede auf dem Fehlerniveau von 1 bis 5% zeigte: Tabelle 4a

+ signifikanter Unterschied, 5% Fehlerniveau
++ hochsignifikanter Unterschied, 1% Fehlerniveau

Beispiel 6: Bekämpfung von Radopholus similis unter Feldbedingungen unter Verwendung von Biopräparaten von nematiziden Stämmen.
Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Bekämpfung von Radopholus similis durch Biopräparate von Sphingobacterium-spiritivorum-Stamm C-926 und Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 in einer Plantage von grünen Bananen der "Macho-3/4"-Varietät unter Feldbedingungen zu überprüfen. Zu diesem Zweck wurde ein Plan von Blöcken angefertigt, die zufällig (7 Behandlungen mit drei Replikaten) in drei Reihen von Pflanzen, die in Parzellen von jeweils sechs Pflanzen unterteilt wurden, lokalisiert waren. Die angewendeten Behandlungen waren: Bacillus subtilis (negative Kontrolle, die wegen ihres möglichen Auftretens im Ökosystem verwendet wird, in einer Konzentration von 10⁷ Zellen pro ml Kultur), Nemacur^TM (ein chemisches Nematizid, das von Bayer AG hergestellt und vermarktet wird und in einer Konzentration von 12 Liter 40%ige Lösung pro Hektar verwendet wurde), Sphingobacterium-spiritivorum-Stamm C-926, Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924, LB(Luria Bertani)-Kulturmedium und der Pilz Paecilomyces lilacinus (ein Stamm, der zur Zeit in Kuba zur Bekämpfung von Nematoden verwendet wurde und der in einer Konzentration von 10⁷ Sporen pro ml Suspension, die durch Kultivierung in fester Phase erhalten wurde, verwendet wurde, der Dosis, die vom National Institute of Plant Health empfohlen wird). Die Anwendung der Stämme C-924 und C-926 bestand aus fünf Liter einer Verdünnung von 10⁷ Zellen (koloniebildende Einheiten, CFU) pro Milliliter, die aus Kulturen stammten, die zuvor 18 Stunden lang bei 28 °C in LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) fermentiert wurden. Die phytonematologischen Proben lieferten nach zwei bzw. drei Monaten der Behandlungen Ergebnisse, die Variationen in der Nematodenpopulation zeigten, wobei die ursprüngliche Population als Basis dient (100%). Anschließend wurde eine zweite Behandlung durchgeführt und zwei Monate später bewertet, wobei man die Ergebnisse der Probe mit denjenigen verglich, die vor der ersten Behandlung erhalten wurden. Die Ergebnisse ermöglichen die Beobachtung der Effektivität des untersuchten Stamms bei der biologischen Bekämpfung von Radopholus similis in Bananenpflanzen unter Feldbedingungen (Tabelle 5).
Tabelle 5
Beispiel 7: Bekämpfung von Haemonchus sp. unter Verwendung von Biopräparaten von Bakterienstämmen
Sammlung und Desinfektion der Eier:
Proben des Nematoden Haemonchus sp. wurden aus dem Unterleib eines Schafs (Widders) gesammelt, das zu diesem Zweck geschlachtet wurde. Die Weibchen dieses adulten Nematoden wurden eine Minute lang mit 0,5%igem "Hibitane" (ein kommerzieller Name für das Desinfektionsmittel Chlorhexidinacetat) behandelt und 24 Stunden lang bei 37 °C in NB-Medium (Nährbrühe) aufbewahrt. Von diesem Zeitpunkt an wurden alle Manipulationen unter aseptischen Bedingungen innerhalb einer laminaren Strömung durchgeführt.
Das Gesamtvolumen des NB-Mediums, das die Eier und die übrigen Nematoden enthielt (20 ml), wurde durch ein 60-μm-Sieb und dann ein 30-μm-Sieb gegeben. Die Eier der Nematoden wurden auf dem 30-μm-Sieb zurückgehalten, und das Sieb mit den Eiern wurde 3 Minuten lang in eine 0,1%ige Lösung von Natriumhypochlorit eingetaucht, und dann wurde sofort zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen.
Handhabung und Verteilung der Eier:
Die desinfizierten Eier wurden aus dem Sieb gelöst und vorsichtig wieder in einer Lösung von Mss-Medium suspendiert (minimales Volumen, in dem das Gewicht der Salze durch verschiedene Zucker ersetzt wurde), das aus einem Volumenteil des Mediums auf zwei Volumenteile destilliertes steriles Wasser bestand. Das Volumen wurde auf 500 Eier pro ml eingestellt, und auf diese Weise garantierte jede Probe von 100 μl einen Mittelwert von 50 Eiern. Zwei Kulturschalen mit 96 Näpfen wurden verwendet, und darin wurden die erhaltenen Proben von 100 μl abgelegt, so dass man eine gleichmäßige Verteilung der Nematodeneier erhielt.
Verwendete Nematizidbehandlungen:
12 Behandlungen wurden angewendet, wobei man die 100-μl-Proben einstellte, die mit den 100-μl-Proben, die die Eier enthielten, gemischt wurden, so dass man 200 μl für jeden Napf erhielt. Jede Behandlung beinhaltete 12 Replikate.
Negative Kontrollen:

– Mss-Medium, zweifach verdünnt (Behandlung Nr. 9)
– steriles destilliertes Wasser (Behandlung Nr. 5)
– Bacillus subtilis Stamm 6633 (Behandlung Nr. 2)
– Escherichia coli Stamm C-600 (Behandlung Nr. 6)

Positive Kontrollen:

– ** B. thuringiensis var. kurstaki H-10 (Behandlung Nr. 4)
– ** B. thuringiensis var. israelensis Bactimor^TM (Behandlung Nr. 1)
– ** B. thuringiensis var. israelensis Tecnar^TM (Behandlung Nr. 10)

Nematizide, die dem Test unterzogen wurden:

– * C-924 (Behandlung Nr. 3)
– * C-926 (Behandlung Nr. 8)
– * C-924 + C-926 (Behandlung Nr. 11)
– ** B. thuringiensis 9452 (Behandlung Nr. 7)
– ** B. t. 9499 (Behandlung Nr. 12)

*: Kulturen (50 ml) von Mss-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C, 100 U/min während 54 Stunden, und auf 10⁸ cfu/ml (koloniebildende Einheiten pro ml) verdünnt.
**: Kulturen (50 ml) von Mss-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C, 100 U/min während 5 Tagen (Bildung von Sporen), und zweifach verdünnt.

Die Kulturschalen wurden mit Parafilm abgedichtet, und die Eier in jedem Replikat wurden gezählt, bevor sie bei 28 °C in der Dunkelheit und in Ruhe in Erwartung der schlüpfenden Larven inkubiert wurden. Die geschlüpften Larven wurden 36 und 84 Stunden nach dem Beginn des Experiments gezählt, wobei man ein inverses Mikroskop verwendete.
Tabelle 6
Statistische Analyse der Ergebnisse:
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Larven nach 24 bis 48 Stunden schlüpften, wurde die statistische Analyse (ANOVA, Analyse der Varianzen) mit den Daten nach 36 Stunden durchgeführt. Tabelle 6a

– ohne signifikante Unterschiede
* signifikante Unterschiede, 5% Fehlerniveau
** hochsignifikante Unterschiede, 1% Fehlerniveau

Anmerkungen:
Das C-926 (Behandlung Nr. 8) zeigte eine ausgeprägte Wirkung auf die Eier, doch war dies bei C-924 (Behandlung Nr. 3) nicht der Fall. Letzteres kann auf die längere Wachstumszeit zurückzuführen sein, denen die Kulturen unterzogen wurden (54 Stunden).
Aus diesem Experiment wurden die besten Kontrollen (sowohl positiv als auch negativ) ausgewählt, und die anderen wurden unberücksichtigt gelassen, um in späteren Experimenten verwendet zu werden. Eine der negativen Kontrollen, die Schwierigkeiten aufwies, war E. coli aufgrund ihres kontinuierlichen Wachstums, das ein Hindernis bei der Beobachtung der Eier und Larven darstellt. Das destillierte Wasser war auch keine sehr gute Kontrolle, da viele der Eier die Entwicklung verlangsamten, wenn sie nach ihrer Behandlung mit Hypochlorit in dem Wasser aufbewahrt wurden. Natriumhypochlorit scheint für diese Art von Desinfektion nicht das ideale Desinfektionsmittel zu sein (obwohl dies berichtet wurde), da die Schlüpfraten (bei den negativen Kontrollen) über 50% betragen sollten.
Beispiel 8: Bekämpfung von Trichostrongylus sp. unter Verwendung von Biopräparaten der Bakterienstämme
Sammlung und Desinfektion der Eier:
Der Nematode Trichostrongylus sp. wurde aus dem Unterleib eines Schafs (Widders) gesammelt, das zu diesem Zweck geschlachtet wurde. Die Weibchen dieses adulten Nematoden wurden eine Minute lang mit 0,5%igem "Hibitane" (ein kommerzieller Name für das Desinfektionsmittel Chlorhexidinacetat) behandelt und 24 Stunden lang bei 37 °C in NB-Medium (Nährbrühe) aufbewahrt. Von diesem Zeitpunkt an wurden alle Manipulationen unter aseptischen Bedingungen innerhalb einer laminaren Strömung durchgeführt.
Das Gesamtvolumen des NB-Mediums, das die Eier und die übrigen Nematoden enthielt (20 ml), wurde durch ein 60-μm-Sieb und dann ein 30-μm-Sieb gegeben. Die Eier der Nematoden wurden auf dem 30-μm-Sieb zurückgehalten, und das Sieb mit den Eiern wurde 3 Minuten lang in eine 0,1%ige Lösung von Natriumhypochlorit eingetaucht, und dann wurde sofort zweimal mit LB-Medium gewaschen, das mit sterilem destilliertem Wasser zehnfach verdünnt war.
Handhabung und Verteilung der Eier:
Die desinfizierten Eier wurden aus dem Sieb gelöst und vorsichtig wieder in der 10fachen Verdünnung des LB-Mediums suspendiert. Das Volumen wurde auf 100 Eier pro ml eingestellt, und auf diese Weise garantierte jede Probe von 100 μl einen Mittelwert von 10 Eiern. Eine Kulturschale mit 96 Näpfen wurden verwendet, und darin wurden die erhaltenen Proben von 100 μl abgelegt, so dass man eine gleichmäßige Verteilung der Nematodeneier erhielt.
Verwendete Nematizidbehandlungen:
12 Behandlungen wurden angewendet, wobei man die 100-μl-Proben einstellte, die mit den 100-μl-Proben, die die Eier enthielten, gemischt wurden, so dass man 200 μl für jeden Napf erhielt. Jede Behandlung beinhaltete 8 Replikate.
Negative Kontrollen:

– LB-Medium, zehnfach verdünnt (Behandlung Nr. 5)
– Bacillus subtilis Stamm 6633 [10⁹ cfu/ml] (Behandlung Nr. 3)
– Bacillus subtilis Stamm 6633 [10⁶ cfu/ml] (Behandlung Nr. 8)

Positive Kontrollen:

– ** B. thuringiensis kurstaki H-10, zweifach verdünnt (Behandlung Nr. 4)
– ** B. thuringiensis kurstaki H-10, zehnfach verdünnt (Behandlung Nr. 9)
– ** B. thuringiensis kurstaki H-10, hundertfach verdünnt (Behandlung Nr. 12)

Nematizide, die dem Test unterzogen wurden:

– *** C-924 [10⁹ cfu/ml] (Behandlung Nr. 1)
– *** C-924 [10⁸ cfu/ml] (Behandlung Nr. 6)
– *** C-924 [10⁷ cfu/ml] (Behandlung Nr. 10)
– * C-926 [10⁹ cfu/ml] (Behandlung Nr. 2)
– * C-926 [10⁸ cfu/ml] (Behandlung Nr. 7)
– * C-926 [10⁷ cfu/ml] (Behandlung Nr. 11)

*: Kulturen (50 ml) von LB-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C, 100 U/min während 46 Stunden.
**: Kulturen (50 ml) von LB-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C, 100 U/min bis zur Sporenbildung.
***: Kulturen (50 ml) von LB-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C, 100 U/min während 22 Stunden.

Die Kulturschalen wurden mit Parafilm abgedichtet, und die Eier in jedem Replikat wurden gezählt, bevor sie bei 28 °C in der Dunkelheit und in Ruhe in Erwartung der schlüpfenden Larven inkubiert wurden.
Beobachtete Ergebnisse:
Die geschlüpften Larven wurden 48, 120 und 192 Stunden (8 Tagen) nach dem Beginn des Experiments gezählt, wobei man ein inverses Mikroskop verwendete. Die Beobachtung der Larven wurde anschließend (im ersten Sieb) in Bezug auf ihre Aktivität fortgesetzt.
Tabelle 7
Anmerkungen:
Die Stämme C-924 (Behandlungen Nr. 1, 6 und 10) und C-926 (Behandlungen Nr. 2, 7 und 11) zeigten in höheren Konzentrationen eine ausgeprägte Wirkung auf die Eier, doch war dies bei der niedrigeren Konzentration, wo die inaktive Reaktion der Larven beobachtet werden konnte, nicht der Fall. Die kombinierte Wirkung der Eier und Larven des ersten Stadiums sollten berücksichtigt werden. Natriumhypochlorit scheint zwar für diese Art von Arbeit nicht das ideale Desinfektionsmittel zu sein, doch waren die prozentualen Schlüpfraten der negativen Kontrollen annehmbar. Die Wachstumszeit dieser Stämme ist ein sehr wichtiger Faktor, der zu berücksichtigen ist, wie man erkennen kann, wenn man die Ergebnisse von Experiment Nr. 1 mit denjenigen von Experiment Nr. 2 vergleicht.
Beispiel 9: Bekämpfung von Trichostrongylus sp. unter Verwendung von Biopräparaten der Bakterienstämme, die zu verschiedenen Wachstumszeiten entnommen wurden
Sammlung und Desinfektion der Eier:
Der Nematode Trichostrongylus sp. wurde aus dem Unterleib eines Schafs (Widders) gesammelt, das zu diesem Zweck geschlachtet wurde. Die Weibchen dieses adulten Nematoden wurden eine Minute lang mit 0,5%igem "Hibitane" (ein kommerzieller Name für das Desinfektionsmittel Chlorhexidinacetat) behandelt und 24 Stunden lang bei 37 °C in LB-Medium (Luria-Bertani-Medium), das zehnfach verdünnt war, aufbewahrt. Von diesem Zeitpunkt an wurden alle Manipulationen unter aseptischen Bedingungen innerhalb einer laminaren Strömung durchgeführt. Das Gesamtvolumen des NB-Mediums, das die Eier und die übrigen Nematoden enthielt (20 ml), wurde durch ein 60-μm-Sieb und dann ein 30-μm-Sieb gegeben. Die Eier der Nematoden wurden auf dem 30-μm-Sieb zurückgehalten, und das Sieb mit den Eiern wurde 3 Minuten lang in eine 0,5%ige Lösung von "Hibitane" eingetaucht, und dann wurde sofort dreimal mit LB-Medium gewaschen, das zehnfach verdünnt war.
Handhabung und Verteilung der Eier:
Die desinfizierten Eier wurden aus dem Sieb gelöst und vorsichtig wieder in der 10fachen Verdünnung des LB-Mediums (Luria-Bertani-Mediums) suspendiert.
Das Volumen wurde auf 300 Eier pro ml eingestellt, und auf diese Weise garantierte jede Probe von 100 μl einen Mittelwert von 30 Eiern.
Eine Kulturschale mit 96 Näpfen wurden verwendet, und darin wurden die erhaltenen Proben von 100 μl abgelegt, so dass man eine gleichmäßige Verteilung der Nematodeneier erhielt.
Verwendete Nematizidbehandlungen:
16 Behandlungen mit 6 Replikaten wurden angewendet, wobei man die 100-μl-Proben einstellte, die mit den 100-μl-Proben, die die Eier enthielten, gemischt wurden, so dass man 200 μl für jeden Napf erhielt.
Verwendete negative Kontrollen:

– LB-Medium (Luria-Bertani-Medium), zehnfach verdünnt
– * B. subtilis Stamm 6633 [10⁷ cfu/ml], 8 Stunden Wachstum
– * B. subtilis Stamm 6633 [10⁸ cfu/ml], 16 Stunden Wachstum
– * B. subtilis Stamm 6633 [10⁸ cfu/ml], 20 Stunden Wachstum
– * B. subtilis Stamm 6633 [10⁸ cfu/ml], 24 Stunden Wachstum
– * B. subtilis Stamm 6633 [10⁸ cfu/ml], 36 Stunden Wachstum

Nematizidbehandlungen, die auf das Experiment angewendet wurden:

– * C-924 [10⁷ cfu/ml], 8 Stunden Wachstum
– * C-924 [10⁸ cfu/ml], 16 Stunden Wachstum
– * C-924 [10⁸ cfu/ml], 20 Stunden Wachstum
– * C-924 [10⁸ cfu/ml], 24 Stunden Wachstum
– * C-924 [10⁸ cfu/ml], 36 Stunden Wachstum
– * C-926 [10⁷ cfu/ml], 8 Stunden Wachstum
– * C-926 [10⁸ cfu/ml], 16 Stunden Wachstum
– * C-926 [10⁸ cfu/ml], 20 Stunden Wachstum
– * C-926 [10⁸ cfu/ml], 24 Stunden Wachstum
– * C-926 [10⁸ cfu/ml], 36 Stunden Wachstum

*: Kulturen (50 ml) von LB-Medium mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,05, kultiviert in einer Siebeinheit bei 28 °C mit 100 U/min.

Die Kulturschalen wurden mit Parafilm abgedichtet, und die Eier in jedem Replikat wurden gezählt, bevor sie bei 28 °C in der Dunkelheit und in Ruhe in Erwartung der schlüpfenden Larven inkubiert wurden.
Beobachtete Ergebnisse:
Die geschlüpften Larven wurden alle 24 Stunden bis zu 168 Stunden (während einer Woche) gezählt, und es wurden Beobachtung angestellt, um bei jeder Behandlung den Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem das Schlüpfen erfolgte. Tabelle 8

Kontrolle: LB (Luria Bertani), zehnfach verdünnt = Eier: 192. Geschlüpfte Larven: 142, ergibt 79,9% geschlüpft.
* letzte Zählung nach 168 Stunden
** Schlüpfen erfolgte ab 110 Stunden Inkubation
*** Schlüpfen erfolgte früher als 48 Stunden.

Anmerkungen:
Die Stämme C-924 und C-926 zeigten zu verschiedenen Zeiten des Wachstums eine ausgeprägte Wirkung auf die Eier, doch ist ganz klar, dass C-924 ab 16 Stunden Wachstum das Schlüpfen vollständig einschränkt, während die Wirkung von C-926 darin besteht, das Schlüpfen auf bis zu über 110 Stunden zu verzögern, grundsätzlich bei den Behandlungen von 24 und 36 Stunden Wachstum. Diese Verzögerung kann wirkungsvoll sein, um Nematoden "in vivo" zu bekämpfen, indem man den normalen Schlüpfzyklus durchbricht, der zwischen 24 und 48 Stunden liegt (bei den negativen Kontrollen dieses Experiments bestätigt).
Durch dieses Experiment wurde gezeigt, dass die Wachstumszeit der Stämme ein sehr wichtiger Faktor ist, der zu berücksichtigen ist, worauf wir bereits hingewiesen haben, als wir die Ergebnisse von Experiment Nr. 1 mit denen von Nr. 2 verglichen.
"Hibitane" erweist sich insofern als ausreichendes Desinfektionsmittel für diese Art von Arbeit, als die prozentualen Schlüpfraten bei den negativen Kontrollen zwischen 58,7 und 79,9 lagen.

Claims

Verfahren zur biologischen Bekämpfung von Nematoden, umfassend das In-Kontakt-Bringen von Boden, einer Pflanze oder eines Samens mit einer wirksamen Menge eines nematiziden Mittels, wobei es sich bei dem Mittel um eine Kultur, die vom Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 erhalten wurde, oder um einen von diesem Stamm stammenden Metaboliten, der auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, in einem geeigneten Träger handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das nematizide Mittel für die wirksame Bekämpfung von Radopholus similis und Meloidogyne incognita bei Pflanzen verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das nematizide Mittel eine Kultur des Corynebacterium-paurometabolum-Stamms C-924 umfasst, die in einer Konzentration zwischen 10⁶ und 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml Medium hinzugefügt wird, und das Mittel alle drei Monate in einer Menge von ungefähr 14 Litern pro ha auf das betroffene Gelände aufgebracht wird.
Verwendung eines nematiziden Mittels zur Herstellung einer veterinärmedizinischen Zusammensetzung zur Bekämpfung von Zoonematoden, wobei es sich bei dem nematiziden Mittel um eine Kultur, die vom Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 erhalten wurde, oder um einen von diesem Stamm stammenden Metaboliten, der auf natürlichem, rekombi nantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, in einem geeigneten Träger handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das nematizide Mittel zur Herstellung einer veterinärmedizinischen Zusammensetzung zur wirksamen Bekämpfung der Zoonematoden Haemonchus spp. und Trichostrongylus spp. bei Tieren verwendet wird.
Kultur von Corynebacterium paurometabolum, wobei die Kultur die Kultur des Stammes C-924 von Corynebacterium paurometabolum oder einer davon stammenden Mutation, die gegen Nematoden aktiv ist, handelt.
Kultur gemäß Anspruch 6, die zwischen 10⁶ und 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml Kulturmedium enthält.
Nematizides Mittel für die wirksame biologische Bekämpfung von Nematoden bei Pflanzen, das eine Kultur, die den Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 oder eine von dem Stamm stammende Mutation sowie einen beliebigen Wirkstoff oder Metaboliten, der auf der Basis dieses Stammes auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, sowie einen geeigneten Träger umfasst.
Nematizides Mittel gemäß Anspruch 8 zur Bekämpfung von Phytonematoden, wobei es sich bei dem geeigneten Träger um ein Düngemittel, vorgepackte Erde, eine Saatabdeckungsvorrichtung, ein Pulver, Granulat, Vernebler, eine Suspension oder eine Flüssigkeit oder eine der angegebenen Formen in einer eingekapselten Zubereitung handelt.
Nematizides Mittel für die wirksame biologische Bekämpfung von Nematoden bei Tieren, das eine Kultur, die den Corynebacterium-paurometabolum-Stamm C-924 oder eine von dem Stamm stammende Mutation sowie einen beliebigen Wirkstoff oder Metaboliten, der auf der Basis dieses Stammes auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg erhalten wurde, sowie einen geeigneten Träger umfasst.