DE68917541T2

DE68917541T2 - Verfahren zum Auswählen von Bakterien und deren Verwendung in der Feldbekämpfung des Unkrauts Dachtrespe.

Info

Publication number: DE68917541T2
Application number: DE68917541T
Authority: DE
Inventors: Lloyd F. Bakersfield California 93309 Elliott; Ann C. Pullman Washington 99163 Kennedy
Original assignee: United States Department of Commerce
Current assignee: United States Department of Commerce
Priority date: 1988-06-16
Filing date: 1989-06-16
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2009-06-17
Also published as: AU3771789A; EP0348120B1; ZA894557B; US5030562A; ATE109943T1; CA1338904C; EP0348120A3; DE68917541D1; AU624160B2; WO1989012691A1; EP0348120A2

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Isolierung, Auswahl und Anwendung neuer Bakterienstämme, die die Fähigkeit besitzen, das Unkraut Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten unter Kontrolle zu halten, ohne die Feldfrucht schädlich zu beeinflussen.

2. Beschreibung des Fachgebietes

Die Dachtrespe (Bromus tectorum) und die nahe verwandten Arten Japanische Trespe (B. japonicus) und Roggentrespe (B. secalinus), im folgenden gemeinschaftlich als Dachtrespe bezeichnet, sind einjährige Wintergrasunkräuter, die eine bedeutende Verringerung der Erträge bei Kleinkorn-Feldfrüchten verursachen, indem sie mit den Feldfrüchten um Feuchtigkeit, Platz und Nährstoffe konkurrieren. Dies führt zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen. Die Verbreitung dieser Unkräuter hat in den letzten Jahren zugenommen, da diese Unkräuter bei umweltfreundlichem Ackerbau schwieriger unter Kontrolle zu halten sind als bei konventionellem Ackerbau.
Die Dachtrespe ist ein Hauptunkraut der Wintergetreide insbesondere des Winterweizens. Sie kann auch ein Problem in Wintergerste sein, was aber von geringerer wirtschaftlicher Bedeutung ist, da die Wintergerstenanbaufläche relativ klein ist. Die Ertragseinbußen bei Winterweizen können bis zu 45% betragen bei 84-100 Dachtrespenkräutern/Yard², während bei einem reduzierten Dachtrespenbefall Verluste von 10% auftreten (Stahlman, Kansas Agricultural Experiment Station 87- 69-5, 1986). Eine über 80%-ige Dezimierung der Dachtrespe mit dem Herbizid Dicloflop ergab einen 129 bis 263% höheren Getreideertrag verglichen mit der Kontrolle (Thill et al. in: STEEP Conservation Concepts and Accomplishments, L. F. Elliott et al. (Hrsg.), Seiten 275-287, Washington State University Press (1987)). Jedoch ermöglicht kein gegenwärtig erhältliches chemisches Herbizid eine dauerhafte Kontrolle dieses Unkrauts.
Während über den Gebrauch antagonistischer Mikroorganismen zur biologischen Kontrolle einiger Unkräuter bereits berichtet wurde, ist zuvor noch kein Bakterienstamm gefunden worden, der das Unkraut Dachtrespe unter Kontrolle hält; außerdem wurde noch über kein Verfahren zur Selektion von Bakterien, die die Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten hemmen, berichtet. Weil die physiologischen Kennzeichen, die für einen Bakterienstamm zur Kontrolle von Unkräutern erforderlich sind, sehr spezifisch sind hinsichtlich (1) des unter Kontrolle zu haltenden Unkrauts; (2) der Wirkungsweise der Unkrautkontrolle; (3) der Aktivität und ökologischen Nische der Mikroorganismen; und (4) der Ackerbauverfahren und des Bodens sowie der klimatischen Bedingungen, die die Kontrolle begünstigen, können Informationen über die Behandlung mit Mikroorganismen zur Kontrolle von anderen Unkräutern als der Dachtrespe nicht dazu verwendet werden, Mikroorganismenstämme vorherzusagen, die die Dachtrespe unter Feldbedingungen verringern, oder Kriterien zur Auswahl solcher Stämme vorherzusagen.

ZUSAMMENFASSENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wir haben ein neues Bakterienscreeningverfahren zur Auswahl derjenigen Stämme entdeckt, die das Wachstum des Unkrautes Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten unter Feldbedingungen hemmen (die Häufigkeit oder die Stärke des Wachstums verringern), und ein praktisches und wirksames Anwendungsverfahren für die hemmenden Bakterien zur Unterdrückung des Dachtrespenwachstums auf dem Feld.
Die durch unser Verfahren ausgewählten Bakterien hemmen das Wachstum der Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten, wie Weizen, Gerste und verwandten Feldfrüchten, ohne die Feldfrucht schädlich zu beeinflussen. Beim Ausbringen als Spray oder auf Stroh haben die neuen, durch unser Verfahren erhaltenen Bakterien die Fähigkeit, die Dachtrespe unter Feldbedingungen zu hemmen.
Bei der Anwendung unseres Verfahrens haben wir ferner drei neue, anfangs als nicht-fluoreszierende Pseudomonaden bestimmte Stämme entdeckt, die wirksam das Wachstum der Dachtrespe bei auf dem Feld wachsendem Weizen hemmen.
Unser Screeningverfahren beinhaltet:
1. Die Isolierung von Bakterienstämmen mit dem Potential zur Hemmung der Dachtrespe von (a) der Wurzeloberfläche ("rhizoplane") oder der Rhizosphäre (die Wurzel unmittelbar umgebender Boden) oder sowohl von der Wurzeloberfläche als auch der Rhizosphäre der Dachtrespenpflanzen oder von (b) der Wurzeloberfläche oder Rhizosphäre oder von sowohl der Wurzeloberfläche als auch der Rhizosphäre der auf dem Feld zu schützenden Feldfruchtsorte (oder einer verwandten Feldfruchtsorte).
2. Screening der in Stufe 1 isolierten Bakterienstämme in vitro durch Ziehen der Dachtrespe auf Agar in Gegenwart einer Zellkultur, eines im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder eines zellfreien Kulturfiltrats des zu testenden Isolates; Ziehen einer Kontrolle der Dachtrespe in der gleichen Weise, jedoch ohne Zugabe der Zellkultur, des Überstands oder des Filtrats und Auswahl derjenigen Stämme als hemmende Bakterien, welche die Dachtrespe hemmen, wie durch Verringerung des Wurzelwachtums oder Verringerung der Keimung, verglichen mit der Kontrolle, gezeigt wird. Diese die Dachtrespe hemmenden Stämme werden dann in vitro gegen die Kleinkornfeldfrucht der zu schützenden Sorte getestet, indem die Kleinkorn-Feldfrucht auf Agar in Gegenwart einer Zellkultur, eines im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder eines zellfreien Kulturfiltrats des zu testenden Isolates gezogen werden; als Kontrolle Kleinkorn-Feldfruchtpflanzen in der gleichen Weise aber ohne Zugabe der Zellkultur, des Überstands oder des Filtrats gezogen werden und diejenigen Stämme ausgewählt werden, die das Wachstum der Kleinkorn-Feldfrucht nicht schädlich beeinflussen.
3. Erstes Screening in Boden der in Stufe 2 ausgewählten Bakterienstämme durch getrenntes Ziehen der Dachtrespenpflanzen und der Kleinkorn-Feldfrucht der zu schützenden Sorte in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus in Gegenwart des in Stufe 2 ausgewählten Bakterienstammes. Die verwendete Bakterienkonzentration ist diejenige, welche die Auswahl der Anzahl der Stämme mit dem Potential zur Hemmung der Dachtrespe auf dem Feld ohne schädliche Beeinflussung des vor der Dachtrespe zu schützenden Getreides maximiert und die Auswahl auf dem Feld unwirksamer Stämme minimiert; Ziehen einer Kontrolle der Dachtrespe und der Kleinkorn-Feldfruchtpflanzen auf gleiche Weise, aber ohne Zugabe des Bakterienstammes, und Auswahl derjenigen Stämme als hemmende Bakterien, welche die Dachtrespe hemmen, wie durch Verringerung des Wurzelwachstums oder Verringerung des Triebwachstums, verglichen mit der Kontrolle der Dachtrespenpflanzen, gezeigt wird, ohne die zu schützende Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen.
4. Screening der in Stufe 3 ausgewählten Bakterienstämme auf dem Feld durch getrenntes Ziehen der Dachtrespenpflanzen und der zu schützenden Kleinkorn-Feldfrucht auf dem Feld in Gegenwart des in Stufe 3 ausgewählten Bakterienstamms in einer Konzentration, die die Auswahl der Anzahl Stämme mit dem Potential zur Hemmung der Dachtrespe auf dem Feld ohne schädliche Beeinflussung des vor der Dachtrespe zu schützenden Getreides maximiert und die Auswahl auf dem Feld unwirksamer Stämme minimiert; Ziehen einer Kontrolle der Dachtrespe und der Kleinkorn-Feldfruchtpflanzen in der gleichen Weise, aber ohne Zugabe der Bakterien, und Auswahl derjenigen Stämme als auf dem Feld hemmende Bakterien, die die Dachtrespe hemmen, wie durch Verringerung im Bestand, Verringerung des Wurzelwachstums oder Verringerung des Triebwachstums, verglichen mit den Kontrollpflanzen, gezeigt wird, ohne die zu schützende Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen.
Die durch unser Verfahren ausgewählten Bakterienstämme haben die Fähigkeit, die Dachtrespe bei einem kommerziellen Einsatz zu hemmen, ohne die zu schützende Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen, wenn sie zur Behandlung auf einer zu schützenden Feldfruchtanbaufläche eingesetzt werden. Solche Behandlungen schließen das Sprayen einer hemmenden Menge der ausgewählten Bakterien oder die Ausbringung einer hemmenden Menge der ausgewählten Bakterien enthaltenenden Strohs auf der Feldfruchtanbaufläche nach dem Pflanzen ein. Beide Verfahren sind zur Kontrolle des Dachtrespenwachtums in Kleinkorn- Feldfruchtbeständen praktisch und wirtschaftlich. Das erstere Verfahren ist besonders geeignet für Feldfrüchte, die auf starken Rückständen wachsen, das letztere für Feldfrüchte, die auf Flächen mit wenig oder keinen Oberflächenrückständen wachsen.
Die Notwendigkeit einer biologischen Kontrolle der Dachtrespe auf Feldfruchtanbauland ist schon seit langem erkannt worden, da die Getreideverluste durch dieses Unkraut erheblich und eine Kontrolle durch Herbizide nicht durchführbar waren. Indem der Verfahrensablauf und die Bedingungen unseres Screeningverfahrens angewendet werden, können das Wachstum der Dachtrespe auf dem Feld hemmende Bakterienstämme ausgewählt werden. Durch Anwendung unseres Ausbringverfahrens, kann das Dachtrespenwachstum im kommerziellen Einsatz unter Kontrolle gebracht werden.
In Übereinstimmung mit dieser Entdeckung, ist es eine Aufgabe der Erfindung ein Mittel zum Screening von Bakterien anzugeben, um diejenigen Stämme auszuwählen, die die Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten unter Feldbedingungen hemmen, ohne die zu schützende Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ferner, mit Verwendung der mit unserem Verfahren ausgewählten Stämme ein Verfahren zur biologischen Kontrolle der Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten unter Feldbedingungen anzugeben.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren anzugeben, um wurzelkolonisierende, nicht-fluoreszierende Pseudomonaden zu identifizieren, die die Dachtrespe hemmen, und die ausgeprägte Wurzelkolonisierungsfähigkeit der Organismen, sich auf den Wurzeln der Dachtrespe im Feld zu verbreiten, zu nutzen. Ähnlich anderen Bakterienstämmen ist es wegen Variablen wie Bodenverhältnisse, Bodenfeuchtigkeit, Temperatur und dergleichen schwierig, diese Organismen aus der Wachstumskammer auf das Feld zu bringen. Bei Anwendung unseres Verfahrens ist es jedoch möglich, die Bakterien hinsichtlich ihrer Wirksamkeit im Feld zu bewerten und dachtrespenhemmende Bakterien zur Kontrolle der Dachtrespe in Kleinkorn-Feldfrüchten anzuwenden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, neue Pseudomonadenstämme anzugeben, die die Dachtrespe in auf dem Feld wachsendem Weizen hemmen, ohne den Weizen schädlich zu beeinflussen.
Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Screeningmethode beinhaltet:
Stufe 1. Isolierung potentiell hemmender Bakterienstämme.
Zur biologischen Kontrolle der Dachtrespe muß ein Bakterienstamm die Fähigkeit haben, sich in dem Mikrohabitat, in dem er dazu verwendet werden soll, das Wachstum des Unkrautes zu hemmen, anzusiedeln und zu vermehren. Das heißt, er muß die Fähigkeit haben, das Wurzelsystem der Dachtrespe zu besiedeln. Bei dieser Erfindung schließt der hier verwendete Ausdruck "Dachtrespe" drei eng verwandte Arten der Gattung Bromus ein, die Dachtrespe (Bromus tectorum), die Japanische Trespe (B. japonicus) und die Roggentrespe (B. secalinus). Solche Bakterien werden ausgewählt, indem man die Stämme von der Wurzeloberfläche ("rhizoplane") oder der Rhizosphäre (die Wurzeln unmittelbar umgebender Boden) oder sowohl der Wurzeloberfläche als auch der Rhizosphäre, von (a) Dachtrespenpflanzen oder (b) Kleinkorn-Feldfrüchten isoliert. Obwohl in dieser Stufe Stämme von der Wurzeloberfläche oder Rhizosphäre einer Dachtrespenart oder einem kleinen Korn (richtig: einer Kleinkorn-Feldfrucht) für die mögliche Verwendung zur Kontrolle einer anderen Art der Dachtrespe oder einer anderen Kleinkorn-Feldfrucht isoliert werden können, wird vorzugweise der Bakterienstamm von der zu hemmenden Dachtrespenart oder der zu schützenden Kleinkornsorte (richtig: Kleinkorn-Feldfruchtsorte) isoliert, da sie wahrscheinlich am besten im eigentlichen Biokontroll-Habitat funktionieren.
Es liegt im Rahmen der Erfindung, jeden Bakterientyp mit dem Potential zur Hemmung der Dachtrespe ohne schädliche Beeinflussung der zu schützenden Kleinkorn-Feldfrucht zu isolieren, jedoch sind nicht-fluoreszierende Pseudomonaden die Bakterien der Wahl, da sie (1) leicht isoliert, kultiviert und identifiziert werden können; (2) normalerweise den Rhizosphären- oder Wurzeloberflächenboden bewohnen, (3) hinsichtlich der Nährstoffe vielseitig sind, indem sie eine große Anzahl organischer Substrate nutzen können, einschließlich Wurzelexsudaten, (4) einige Stämme die Dachtrespe hemmende Toxine produzieren; und sie (5) erfolgreich in das Wurzelsystem von Kleinkorn-Feldfrüchten eingebracht werden und sich in der Rhizosphäre und auf der Wurzeloberfläche verbreiten können.
Winterweizen ist die Kleinkorn-Feldfrucht die am stärksten durch die Dachtrespe in Form einer Verringerung des Feldfruchtertrages und einem resultierenden wirtschaftlichen Verlust beeinträchtigt wird. Zur Beschreibung unseres Verfahrens wird Winterweizen als Beispiel für die zu schützende Feldfrucht angeführt, jedoch kann unser Verfahren auch aufandere Kleinkorn-Feldfrüchte angewendet werden, zum Beispiel Gerste, Hafer, Roggen, Triticale und verwandte Getreide.
Der Isolierungsvorgang verläuft wie folgt: Winterweizenpflanzen oder Dachtrespenpflanzen werden aus dem Feld ausgegraben und anhängender Boden wird sanft unter fließendem Leitungswasser von den Wurzeln abgewaschen. Die Wurzeln werden von den Sprossen abgetrennt. Die Bakterien werden durch Standardverfahren gesammelt und isoliert. Zum Beispiel können Bakterien der Gattung Pseudomonas isoliert werden, indem die abgetrennten Wurzeln in sterile, Glasperlen und steriles Wasser enthaltende Verdünnungsbehälter gegeben werden und die Mixtur kräftig geschüttelt wird, um auf der Wurzeloberfläche haftende Organismen zu entfernen. Dann werden Verdünnungsreihen präpariert und auf ein Pseudomonas-selektives Medium, wie etwa King's Medium B versetzt mit Novobiocin, Penicillin und Cycloheximid (KMB NPC) (Sands und Rovira, Applied Microbioloay 20 : 513-514 (1970)) ausplattiert und bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, z. B. bei 20ºC. Einzelne nicht-fluoreszierende Kolonien werden durch Betrachten der Platten unter ultraviolettem Licht identifiziert, und diejenigen Kolonien werden ausgewählt, die keine Fluoreszenz zeigen. Zur kurzzeitigen Lagerung während des Screeningverfahrens wird eine Impfkultur von einzelnen nicht-fluoreszierenden Kolonien auf einen KMB-NPC-Schrägagar übertragen.
Stufe 2. Screening der Bakterienstämme in vitro.
Die in Stufe 1 isolierten Bakterienstämme werden einem Screening unterworfen, um diejenigen Stämme zu isolieren, die das Wachstum der Dachtrespe in vitro hemmen, wie durch Verringerung des Wurzelwachstums oder der Keimung, verglichen mit Kontrollpflanzen, gezeigt wird. Die die Dachtrespe hemmenden Stämme werden dann gegen Weizen getestet; die das Weizenwachstum in vitro nicht schädlich beeinflussenden Stämme werden ausgewählt.
In dem In vitro-Screeningverfahren werden einzelne nicht-fluoreszierende Kolonien auf ein für das Ziehen der Kolonien geeignetes Medium überimpft, zum Beispiel auf ein Pseudomonas-Minimalsalzmedium (PMS), beschrieben von Gasson, Applied and Environmental Microbioloqy 39 : 25-29 (1980), und bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel um 20ºC, bis zum späten logarithmischen Wachstum (ungefähr 10&sup9; bis 10¹¹ Zellen pro ml Kulturmedium) gezogen. Die Zellen werden dann auf zumindest eine der folgenden Arten behandelt: (1) die Kultur wird direkt verwendet, (2) die Kultur wird zentrifugiert, um einen im wesentlichen zellfreien Kulturüberstand zu erhalten (nicht mehr als etwa 10- Zellen pro ml Überstand), oder (3) die Zellkultur wird zentrifugiert, und filtersterilisiert, um ein zellfreies Kulturfiltrat zu erhalten (keine Zellen vorhanden). Das erste Verfahren untersucht sowohl die Auswirkung des Organismus als auch die Auswirkung der Toxinproduktion des Organismus auf das Dachtrespenwachstum. Das zweite Verfahren ist eine schnelle Untersuchung zur Bestimmung der Auswirkung der Toxinproduktion des Organismus auf das Wachstum der Dachtrespe. Das dritte Verfahren untersucht nur die Auswirkung der Toxinproduktion des Organismus auf das Dachtrespenwachstum. Wir haben festgestellt, daß die Untersuchungen zur Toxinproduktion für eine bessere Auswahl wirksamer Stämme zu sorgen scheinen.
Die Hemmung des Dachtrespenwachstums wird bewertet, indem zu Petrischalen eine Standardmenge, gewöhnlich 2 ml, der Zellkultur, des im wesentlichen zellfreien Kulturüberstandes oder zellfreien Kulturfiltrates zugegeben wird. Eine Standardmenge, gewöhnlich 18 ml, eines 0,9%-igen geschmolzenen Agars (50ºC) wird zu jeder Schale zugegeben, der Inhalt vermischt, und man läßt ihn fest werden. Gewöhnlich werden für jeden getesteten Organismus 2 Schalen vorbereitet. Kontrollschalen werden vorbereitet, indem PMS statt der Zellkultur, des im wesentlichen zellfreien Überstandes oder des zellfreien Kulturfiltrates verwendet wird. Die Schalen werden mit vorgekeimten Dachtrespensamen bepflanzt - praktisch sind 15 Samen pro Platte, und man läßt sie bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 15ºC, wachsen. Bevor sich die Sämlinge nach etwa 3-6 Tagen im Wurzelwachstum gegenseitig stören, werden die Sämlinge aus dem Agar ausgezogen und Wurzellänge oder Keimung oder beides wird aufgezeichnet. Die Organismen, die eine signifikante Hemmung des Dachtrespenwachstums (Länge) oder der Keimung verglichen mit der Kontrolle zeigen, werden gegen das Wachstum von Winterweizensämlingen getestet. Man definiert bei dieser Erfindung als eine signifikante Hemmung der Dachtrespe in dem In vitro-Test eine zumindest 50%-ige Verringerung des Wurzelwachstums (Länge), verglichen mit der Kontrolle oder eine zumindest 20%-ige Verringerung der Keimung verglichen mit der Kontrolle.
Der oben ausgewählte Stamm wird wie folgt gegen Weizen bewertet: Testreagenzgläser erhalten eine Standardmenge, gewöhnlich je 1 ml, der Zellkultur, des im wesentlichen zellfreien Kulturüberstandes oder des zellfreien Kulturfiltrates, welches bei dem Dachtrespentest verwendet worden war, und eine Standardmenge von 0,9%-igem geschmolzenen Agar (50ºC), gewöhnlich ungefähr 9 ml, wird jedem Reagenzglas zugegeben, der Inhalt wird vermischt und die Reagenzgläser werden schräg gestellt. Im allgemeinen werden 10 Anzuchtreagenzgläser für jeden getesteten Organismus präpariert. Kontrollreagenzgläser werden in identischer Weise präpariert, außer daß PMS die Zellkultur, den im wesentlichen zellfreien Kulturüberstand oder das zellfreie Kultursubstrat ersetzt. Nach dem Festwerden werden vorgekeimte Winterweizensamen (einer pro Reagenzglas) auf die Neigungsmitte der Schrägagarflächen gepflanzt, und man läßt sie bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 15ºC, wachsen.
Bevor das Wurzelwachstum nach schätzungsweise 3-6 Tagen den Boden des Reagenzglases erreicht, werden die Sämlinge aus den Wachstumsreagenzgläsern ausgezogen, und die Wurzellänge wird aufgezeichnet. Ein Bakterienstamm wird als Winterweizen nicht schädlich beeinflussend bezeichnet, wenn die Verringerung im Wurzelwachstum des bakteriell behandelten Weizens im Vergleich zu den Kontrollweizensämlingen weniger als 10% beträgt.
Reinkulturen der Stämme, die das Wachstum der Dachtrespe signifikant hemmen mit wenig oder keiner Auswirkung auf das Winterweizenwachstum werden einzeln auf einem geeigneten Medium wie KMB-NPC ausgestrichen und ausgewählt und wieder ausgestrichen, bis der Stamm rein und stabil ist. Jeder einzelne Stamm wird aufgezogen und so aufbewahrt, daß er stabil gehalten wird, wie etwa durch Lagern in Glycerol bei -10ºC oder Lyophilisieren und Lagern bei -10ºC.
Stufe 3. Screening der Bakterienstämme in der Wachstumskammer.
Die in Stufe 2 isolierten Bakterienstämme werden einem ersten Screening in Boden unterworfen, indem Dachtrespenpflanzen und Weizenpflanzen getrennt in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus in Gegenwart des in Stufe 2 ausgewählten Bakterienstammes gezogen werden. In dieser Stufe werden diejenigen Stämme ausgewählt, die in einer bestimmten Konzentration die Dachtrespe hemmen, ohne den Weizen schädlich zu beeinflussen.
Bei diesem Test werden Töpfe mit Boden gefüllt und mit Dachtrespen- oder Weizensamen besät. Wir haben festgestellt, daß Plasiktöpfe mit 6,4 cm Durchmesser und 7,6 cm Tiefe angesät mit 10 Dachtrespensamen und Plastiktöpfe mit 7,6 cm Durchmesser und 15,2 cm Tiefe angesät mit 4 Winterweizensamen praktische Größen für Studien in der Wachstumskammer oder im Gewächshaus sind. Jeder für Studien in der Wachstumskammer geeignete Boden kann verwendet werden. Ein Beispiel für einen Boden ist Ritzville Schlufflehm, der mit 20 Gewichts-% Sand versetzt wurde. Es ist nicht erforderlich, eine Oberflächensterilisation der Samen vor dem Pflanzen durchzuführen.
Die Bakterienmenge pro Dachtrespensamen in den Testtöpfen wird so gewählt, daß die Auswahl auf dem Feld wirksamer Stämme optimiert und die Auswahl auf dem Feld unwirksamer Stämme minimiert wird. Bei nicht-fluoreszierenden Pseudomonaden haben wir festgestellt, daß im Bereich von 108 bis 1010 Kolonien bildender Einheiten (CFU) des Teststammes pro Dachtrespentesttopfauf die Bodenoberfläche ausgebracht wird. Eine praktische Methode ist, den Teststamm in eine Flüssigkeit wie destilliertes Wasser oder PMS zu geben und die Flüssigkeit auf die Bodenoberfläche zu tropfen. Weizensamen werden in Gegenwart von 10&sup8; bis 10¹&sup0; CFU des Teststammes pro Topf mit 4 Samen gezogen, um die Auswirkung des Bakteriums auf Weizen zu bestimmen. Getrennte Dachtrespen- und Winterweizenkontrollen werden auf zu den Testproben identische Weise präpariert, mit Ausnahme der bakteriellen Behandlung.
Der Boden wird angefeuchtet, um ein gutes Pflanzenwachstum zu ermöglichen, und die Töpfe werden in der Wachstumskammer inkubiert. Wir haben festgestellt, daß ein 14-Stunden-Tag bei 18ºC und eine 10-Stunden-Nacht bei 13ºC geeignet sind. Nach 3 bis 4 Wochen werden die Dachtrespen- und Weizensämlinge ausgezogen, und die Wurzeln werden mit Wasser gewaschen, bis sie frei von Boden sind. Die Wurzeln und die Triebe der Dachtrespen- und Weizensämlinge werden abgetrennt und die Wurzeln oder die Triebe oder beide werden getrocknet, um das Wasser zu entfernen, so daß ein Vergleich zu den Kontrollpflanzen gezogen werden kann. Trocknen bei 60ºC für 48 Stunden ist angemessen.
Auswertung der Sämlinge in dem Wachstumskammertest:
Um die bakterielle Behandlung auszuwerten, wird das Wurzel- oder Triebtrockengewicht der Dachtrespenpflanzen verglichen mit dem Wurzel- oder Triebtrockengewicht der Kontrolldachtrespenpflanzen. Bakterienstämme, die bei den behandelten Dachtrespensämlingen ein um mindestens 25% verringertes Wurzelwachstum (verringertes Wurzeltrockengewicht verglichen mit der Kontrolle) verursachen oder die bei den behandelten Dachtrespensämlingen ein um mindestens 25% verringertes Triebwachstum verursachen (verringertes Triebtrockengewicht verglichen mit der Kontrolle) werden in diesem Test als die Dachtrespe hemmend angesehen. Während die Verringerung der Keimung der Dachtrespe, verglichen mit der Kontrolle, nicht notwendig ist, haben wir festgestellt, daß das zusätzliche Kriterium der Auswahl von Stämmen, die eine 20%-ige oder größere Verringerung der Keimung zeigten, sinnvoll ist. Um Keimungswerte zu erhalten, wird die Emergenz der in Gegenwart des Teststammes gezogenen Dachtrespe gezählt und mit den Kontrollpflanzen verglichen.
Zur Auswertung der bakteriellen Behandlung des Weizens werden das Wurzeltrockengewicht oder das Triebtrockengewicht der Weizenpflanzen mit den Kontrollweizenpflanzen verglichen. Bei dieser Erfindung wird ein Bakterienstamm als Winterweizen nicht schädlich beeinflussend bezeichnet, wenn die Verringerung des Wurzelwachstums (Wurzeltrockengewicht) oder Triebwachstums (Triebtrockengewicht) des bakteriell behandelten Weizens kleiner als 10% ist, verglichen mit den Kontrollweizensämlingen.
Stufe 4. Screening des Bakterienstammes auf dem Feld.
Die in der vorhergegangenen Stufe ausgewählten Bakterienstämme werden als nächstes auf dem Feld getestet. Behandlungs- und Kontrollbeete werden angelegt. Wir haben festgestellt, daß Behandlungsbeete von einem Quadratmeter angemessen sind. Der Kontrollversuch (keine Behandlung) sollte in nächster Nähe zu dem vergleichbaren Behandlungsbeet sein, so daß Behandlungs- und Nichtbehandlungsbeete ähnliche Bodenbedingungen haben.
Für den Feldtest ist es zu bevorzugen, daß die Dachtrespenpflanzen auf Beeten gezogen werden, die im wesentlichen frei von anderen Unkräutern sind, so daß die durch die Gegenwart anderer Unkräuter verursachte Variabilität verringert wird. Dies kann durch Ausbringen chemischer Herbizide oder durch Begasung vor dem Pflanzen erreicht werden. Wir haben festgestellt, daß es nützlich ist, die Feldfruchtrückstände der vorhergehenden Kleinkornfeldfrucht, z. B. Gerste oder Weizen, auf der Bodenoberfläche zu belassen, da dies ein Substrat für die Impfkultur liefert. Eine praktische Beetgröße sind vier 1 Meter-Reihen Dachtrespe pro Behandlung mit einem Kontrollbeet, das nicht mehr als ungefähr 6 Meter von dem Behandlungsbeet entfernt ist. Die Beete werden mit Dachtrespe angesät, ungefähr 70 bis 150 Samen pro Quadratmeter. Einzelne zu testende Bakterienstämme werden auf dem Boden als Spraybehandlung oder auf Stroh ausgebracht. Die Behandlung wird direkt nach dem Pflanzen bis höchstens 4 Wochen später angewandt. Die Spraybehandlung ist wirtschaftlich und praktischer; Stroh bietet der Impfkultur bei widrigen Wetterbedingungen Schutz. Für die Spraybehandlung wird der Teststamm in einer Flüssigkeit, wie etwa destilliertem Wasser oder PMS, auf den Boden gesprüht, um eine Konzentration von ungefähr 10&sup7; bis 10¹² und vorzugsweise ungefähr 100&sup8; CFU des Teststammes pro Quadratmeter zu ergeben. Die Strohbehandlung wird vorbereitet, indem auf ungefähr 5 cm Länge gehäckseltes Stroh in einen Tank gefüllt und mit dem zu testenden Bakterienstamm beimpft wird. Das Wasserpotential des Strohs wird eingestellt, um für gutes Wachstum des Organismus zu sorgen. Danach wird das Stroh etwa einmal am Tag durchgemischt. Nach etwa 5 Tagen bei ungefähr 15-20ºC liegen die Bakterien bei etwa 10&sup9; bis 10¹&sup0; CFU des Teststammes pro Gramm Stroh. Das Stroh wird auf die Beete zugegeben, um 10&sup7; bis 10¹² und vorzugsweise etwa 10&sup8; CFU des Teststammes pro Quadratmeter zu ergeben. Kontrollbeete werden identisch zu den Testbeeten behandelt, außer daß keine Bakterien ausgebracht werden. Für statistische Signifikanz wird die Behandlung mit jedem Organismus mindestens dreimal wiederholt.
Die mit Winterweizen angesäten Beete (ungefähr 100 bis 150 Samen pro Quadratmeter) werden neben den Dachtrespenbeeten angesät, und die Testorganismen werden auf die Beete gesprüht, um eine Konzentration von ungefähr 10&sup7; bis 10¹² und vorzugsweise ungefähr 10&sup8; CFU des Teststammes pro Quadratmeter zu ergeben. Eine praktische Beetgröße ist ein Quadratmeter. Die Behandlung wird direkt nach dem Pflanzen bis höchstens 4 Wochen nach dem Pflanzen angewandt. Die Kontrollpflanzen erhalten eine identische Behandlung, außer daß keine Bakterien ausgebracht werden. Für statistische Signifikanz wird die Behandlung mit jedem Organismus mindestens dreimal wiederholt.
Auswertung der Sämlinge im Feldtest:
Um die Wirkung der bakteriellen Behandlung für die Hemmung der Dachtrespe auf dem Feld zu bestimmen, werden die Dachtrespenpflanzen, nachdem ein angemessenes Wachstum stattgefunden hat, z. B. etwa im 5-Blatt-Stadium, geerntet, die Wurzeln werden gewaschen, und zumindest eine der folgenden Größen wird erhalten: Wurzeltrockengewicht, Triebtrockengewicht oder Bestand (Anzahl der Pflanzen pro Meter Länge). Bakterienstämme, die bei den behandelten Dachtrespenpflanzen eine durchschnittliche Verringerung des Wurzelwachstums (Wurzeltrockengewicht), des Triebwachstums (Triebtrockengewicht) oder des Bestandes um mindestens 10%, verglichen mit den Kontrolldachtrespenpflanzen, bewirken, werden als die Dachtrespe im Feldtest hemmend betrachtet. Um die Auswirkung der bakteriellen Behandlung auf Winterweizen zu bestimmen, wird er geerntet, die Wurzeln werden gewaschen und zumindest eine der folgenden Größen wird erhalten: Wurzeltrockengewicht, Triebtrockengewicht oder Bestand (Anzahl der Pflanzen pro Meter Länge). Diejenigen Bakterienstämme, die bei Winterweizen eine durchschnittlich weniger als 10%-ige Verringerung des Wurzelwachstums (Wurzeltrockengewicht), Triebwachstums (Triebtrockengewicht) oder Bestands, verglichen mit Kontrollweizen, bewirken, werden als die Feldfrucht nicht schädlich beeinflussend definiert.

Anwendung von die Dachtrespe hemmenden Bakterien zur Kontrolle der Dachtrespe in einem kommerziellen Einsatz

Für eine praktische oder wirtschafliche Anwendung ist eine der beiden Methoden, abhängig davon, ob das Feld Oberflächenrückstände aufweist oder nackten Boden, dazu geeignet, die Dachtrespe in einem kommerziellen Einsatz zu kontrollieren. Die hemmenden Organismen wachsen gut in Stroh; wenn man die Dachtrespe in Weizen unter Kontrolle bringen will, der in die Rückstände der vorhergehenden Feldfrucht auf der Bodenoberfläche gesät wurde, kann das Sprayen des Organismus auf die Rückstände das praktischste Verfahren der Ausbringung sein. Am besten ist es, nach einem Regen oder kurz zuvor und während Perioden hoher Regenwahrscheinlichkeit zu sprayen. Wo ausgedehnte trocken-heiße Perioden vorkommen können, kann die Ausbringung auf beimpftem Stroh oder ähnlichem Material bessere Resultate ergeben. Die Ausbringung des Organismus sollte in beiden Fällen nach dem Säen bis spätestens 4 Wochen nach dem Säen erfolgen.
Einzelne Bakterienstämme, die die Dachtrespe in der Wachstumskammer und bei Feldtests gehemmt haben, ohne den Weizen schädlich zu beeinflussen, werden mit Standardmethoden über einen Zeitraum kultiviert, um genügend Bakterien zur Behandlung des Feldes zu ziehen, im allgemeinen etwa 48 Stunden für Spraybehandlungen oder ungefähr 5 Tage auf Stroh oder ähnlichem Material zur Strohbehandlung. Nachdem der Weizen auf das Feld gesät ist, wird der Organismus auf das Feld in einer zur Hemmung der Dachtrespe genügenden Menge ausgebracht. Bei nicht-fluoreszierenden Pseudomonaden beträgt diese Menge ungefähr 10&sup7; bis 10¹² CFU der hemmenden Bakterien pro Quadratmeter.
Hinterlegungserklärung: Anfänglich als nicht-fluoreszierende Pseudomonaden bestimmte Stämme, die durch den oben genannten Screeningtest gegangen sind, sind in der Agricultural Research Culture Collection (NRRL) in Peoria, Illinois 61604 hinterlegt und mit den folgenden Zugangsnummern versehen worden: NRRL B-18293, NRRL B-18294, und NRRL B-18295.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind lediglich dazu gedacht, die Erfindung weiter zu erläutern, und nicht dazu, den Schutzbereich der Erfindung einzugrenzen, der durch die Ansprüche bestimmt ist.

BEISPIEL 1

Isolation von Pseudomonasstämmen.
Winterweizen und Dachtrespenpflanzen wurden aus dem Feld ausgegraben und die Wurzeln wurden unter fließendem Leitungswasser von anhängendem Boden frei gewaschen. Die Wurzeln wurden abgetrennt und in einen sterilen Verdünnungsbehälter gegeben, der 95 ml deionisiertes Wasser und Glasperlen enthält. Die Mischung wurde auf einem Gelenkschüttler (wristaction shaker) kräftig geschüttelt und Verdünnungsreihen wurden präpariert und auf mit 45 mg Novobiocin, 45 mg Penicillin G und 75 mg Cyclohexamid (Sands und Rovira, siehe oben) versetztem King's Medium B ausplattiert. Nicht-fluoreszierende Pseudomonaden wurden durch Betrachten der Schalen unter ultraviolettem Licht nach 2-3 Tagen Inkubation bei 20ºC identifiziert.

BEISPIEL 2

Anfängliches Isolationsscreening

Einzelne durch das in Beispiel 1 skizzierte Verfahren erhaltene nicht-fluoreszierende Kolonien wurden wie folgt einem Sreening in vitro unterworfen: Einzelne Isolate wurden in PMS-Brühe (Gasson, siehe oben, KCl, 0,2 g; NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;, 1,00 g; H&sub2;O, 100 ml; auf pH 7,0 eingestellt, nach Autoklavieren werden 20 ml steriles 2%-iges MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 20 ml sterile 10%-ige Glucose zugegeben) bei 20ºC bis zum späten logarithmischen Wachstum gezogen (0,9 O.D. bei 500 nm auf dem Spektrophotometer). Die Kulturen wurden dann zum direkten Beimpfen der Dachtrespenprobe verwendet, zentrifugiert, um einen im wesentlichen zellfreien Kulturüberstand zu erhalten, oder zentrifugiert und filtersterilisiert, um ein zellfreies Kulturfiltrat zu erhalten.
Plastik-Petrischalen erhielten je 2 ml der Zellkultur, des im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder des zellfreien Kulturfiltrats. Kontrollschalen erhielten 2 ml frischer PMS. Dann wurden zu jeder Platte 18 ml 0,9%-iger geschmolzener Bacto-Agar (Difco) (50ºC) zugegeben und der Inhalt vermischt. Nach dem Festwerden wurden 15 vorgekeimte Dachtrespensamen in jede Schale gepflanzt, und man ließ sie bei 15ºC wachsen. Bevor sich die Sämlinge gegenseitig im Wurzelwachstum störten (5 Tage), wurden die Sämlinge aus dem Agar ausgezogen und Wurzel- und Trieblänge wurden aufgezeichnet. Die Organismen, die zumindest eine 50%-ige Verringerung des Wurzelwachstums, verglichen mit der Kontrolle, zeigten, wurden als die Dachtrespe hemmend bezeichnet und gegen das Wachstum von Winterweizensämlingen getestet. Testreagenzgläser erhielten je 1 ml der Zellkultur, des im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder des zellfreien Kulturfiltrats. Die Kontrollreagenzgläser erhielten 1 ml frischer PMS. Dann wurden zu jedem Reagenzglas 9 ml 0.9%-iger geschmolzener Bacto-Agar (50ºC) zugegeben, der Inhalt wurde vermischt und die Reagenzgläser wurden schräg gestellt. Nach dem Festwerden wurde ein vorgekeimter Weizensamen in die Neigungsmitte jedes Schrägagars gepflanzt, und man ließ ihn bei 15ºC wachsen. Bevor das Wurzelwachstum den Boden des Reagenzglases erreichte (3 Tage), wurden die Sämlinge aus den Wachstumsreagenzgläsern ausgezogen und Wurzel- und Trieblänge aufgezeichnet. Damit ein Bakterienstamm als nicht schädlich für Winterweizen angesehen wird, müssen die mit den Bakterien behandelten Weizensämlinge ein durchschnittlich um weniger als 10% verringertes Wurzelwachstum, verglichen mit den Kontrollpflanzen, haben.
Über 300 nicht-fluoreszierende Pseudomonaden sind auf Hemmung des Dachtrespenwachstums getestet worden. Von diesen zeigten ungefähr sechs Stämme eine starke Hemmung des Dachtrespenwachstums ohne Auswirkung auf das Winterweizenwachstum. Die Testergebnisse dreier Stämme, die den In-vitro- Screeningtest passiert haben, sind in Tabelle 1 gezeigt. Für weitere Studien zurückbehaltene Kulturen wurden einzeln ausgestrichen und ausgewählt und wieder ausgestrichen, bis der Stamm rein und stabil war und in sterilem wäßrigem Glycerol bei -10ºC aufbewahrt wurde. TABELLE 1 Isolat Dachtrespe Wurzellänge Verringerung des Wurzelwachstums verglichen mit der Kontrolle Winterweizen Kontrolle Keine

BEISPIEL 3

Screening von Bakterienstämmen in der Wachstumskammer.
Anfänglich als nicht fluoreszierend bestimmte Pseudomonadenstämme NRRL B-18293, NRRL B-18294 und NRRL B-19295 (richtig: 18295), die gegenüber der Dachtrespe hemmend, aber nicht schädlich für den Weizen sind, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden in der Wachstumskammer einem Screening unterworfen, um die Auswirkung der Isolate auf die in Boden gezogenen Testpflanzen zu bestimmen. Zehn Dachtrespensamen (B. tectorum) wurden in mit Ritzville Schlufflehm plus 20 Gewichts-% Sand gefüllte Plastiktöpfe mit 6,4 cm Durchmesser und 7,6 cm Tiefe gesät, und vier Winterweizensamen wurden in mit Ritzville Schlufflehm mit 20 Gewichts-% feinem Sand gefüllte Plastiktöpfe mit 7,6 cm Durchmesser und 15,2 cm Tiefe gesät. Ungefähr 108 CFU der hemmenden Pseudomonaden NRRL B- 18293, NRRL B-18294 oder NRRL B-18295 wurden auf die Bodenoberfläche auf die angesäte Fläche in den Dachtrespen- und Winterweizensaattöpfen getropft. Die Kontrollen erhielten das frische Medium ohne Zellen. Vier Wiederholungen jeder Behandlung wurden angeschlossen. Der Boden wurde bis zu einem Wasserpotential von -1/3 bar angefeuchtet, und die Töpfe wurden in der Wachstumskammer bei einem 14-Stunden-Tag bei 18ºC und einer 10-Stunden-Nacht bei 13ºC inkubiert.
Die Sämlingsemergenz wurde bestimmt. Nach 2 Wochen wurden die Sämlinge ausgezogen und die Wurzeln in Wasser gewaschen, bis sie frei von Boden waren. Die Wurzeln und Triebe wurden abgetrennt, 48 Stunden bei 60ºC getrocknet und das Trieb- und das Wurzeltrockengewicht wurden aufgezeichnet. Damit ein Bakterienstamm als die Dachtrespe hemmend, ohne den Weizen schädlich zu beinflussen, angesehen wird, müssen die mit den Bakterien behandelten Dachtrespensämlinge ein durchschnittlich um mindestens 25% verringertes Wurzelwachstum (Wurzeltrockengewicht), verglichen mit den Kontrolldachtrespensämlingen, haben, und die mit den Bakterien behandelten Winterweizensämlinge müssen ein durchschnittlich um weniger als 10% verringertes Wurzelwachstum (Wurzeltrockengewicht), verglichen mit den Kontrollweizensämlingen, haben. Die Testergebnisse für die Stämme sind in Tabelle 2 angegeben. Wie man anhand der Daten sehen kann, haben die Stämme den Wachstumskammertest passiert. TABELLE 2 Isolat Dachtrespe Wurzelgewicht/Topf Verringerung des Wurzelwachstums verglichen mit der Kontrolle Winterweizen Wurzelgewicht/Pflanze Kontrolle Keine

BEISPIEL 4

Feldscreening der Bakterien zur Hemmung des Dachtrespenwachstums.
Die Stämme NRRL B-18293 und NRRL B-18294, die den Wachstumskammertest passiert haben, wurden auf dem Feld in Pendleton, Oregon, während der Wachstumsperiode von 1987-1988 wie folgt getestet: PMS-Brühe wurde mit in Glycerol konservierten Stämmen beimpft und bei 20ºC für 2 Tage inkubiert. Agarschalen mit PMS-Medium wurden präpariert und mit je 1 ml des die einzelnen Stämme enthaltenden Kulturmediums PMS-Brühe beimpft. Ein ml der Impfkultur wurde auf der Glasschale mit einem sterilen Glasstab verteilt. Eine genügende Anzahl Platten wurde beimpft, um Organismen zur Aussaat der Feldbeete mit 10&sup9; CFU des Teststammes/m² zu liefern. Die Schalen wurden bei 15ºC für 3 Tage inkubiert, um ein maximales Wachstum zu erhalten. In die Schalen wurde steriles deionisiertes Wasser gegossen und die Organismen wurden in das Wasser durch Bewegung der Oberfläche der Schale mit einem Glasstab eingemischt. Das Spülwasser der Schalen wurde für jeden Stamm gesammelt. Die Suspension wurde mit sterilem, deionisiertem Wasser verdünnt bis zu einer optischen Dichte von 0,9 (bestimmt in einem Spectrophotometer bei 600 nm). Die für die Behandlung der Beetfläche erforderliche Menge dieser Lösung wurde in eine Gießkanne gegeben (ungefähr 7 Liter Inhalt) und die Kanne wurde durch Zugabe von Wasser gefüllt, um eine gleichmäßige Verteilung der Organismen auf das Beet zu erleichtern. Zum Beispiel wurde für ein 1 m² großes Beet die für einen Inhalt von ungefähr 10&sup9; CFU des Teststammes/m² erforderliche Menge der Lösung in die Gießkanne zugegeben.
Auf dem Feld befanden sich natürlich auftretende Rückstände. Vor dem Pflanzen wurden die Beete mit Methylbromid begast, um die Samen der Umgebungsunkräuter zu entfernen. Die Beete waren 1 Quadratmeter groß mit 1 Meter dazwischen und waren in einer statistischen Gesamtblockanordnung angeordnet. Jede Behandlung wurde viermal wiederholt (besprengt mit dem Teststamm oder einer Wasserkontrolle). Bevor die Organismen zugegeben wurden, wurde die Dachtrespe (B. tectorum) per Hand in Reihen auf die Bodenoberfläche der Beete gesät, indem man 10 Samen pro 25 cm pflanzte. Dann wurden die Organismen oder Wasserbehandlungen aufgesprengt.
Ein anderer Satz identischer Beete wie oben beschrieben wurde angelegt, wobei die Art der Ausbringung der getesteten Bakterien der einzige Unterschied war. Impfkulturen jedes Teststammes wurden wie vorher beschrieben durch Inkubation in PMS-Brühe präpariert. Gehäckseltes Stroh von ungefähr 5 cm Länge wurde in einen Plastikbehälter gegeben und bis zu einem Wasserpotential von ungefähr -1/3 bar befeuchtet. Dann wurde 1 ml der PMS-Impfkultur jedes Teststammes oder steriler PMS-Brühe pro 100 g Stroh zugegeben (je zu einem gesonderten Behälter mit Stroh) und eingemischt. Extreme Sorfalt wurde darauf verwendet, eine Kontamination von einem Gefäß zum anderen zu vermeiden. Die Mischungen wurden bei Umgebungstemperaturen inkubiert, die sich gewöhnlich um 22ºC am Tag bis ungefähr 12ºC in der Nacht bewegten. Nach 5 Tagen war die Zahl der ausgebrachten Mikroorganismen größer als ungefähr 10&sup9; CFU pro Gramm Strohtrockengewicht. Dies war die für die Behandlung von einem m² Beet gewünschte Menge. Die Menge Stroh ist zu klein, um sich leicht gleichmäßig über die Beete verteilen zu lassen; deshalb wurde es zur Erleichterung der Verteilung mit 49 g frischem Stroh vermischt, und das Stroh mit den Organismen wurde in einer Menge zugegeben, die 10&sup9; CFU pro m² Beet ergab. Die Organismen plus Stroh oder die Strohkontrolle wurden auf einem identischen Satz Beete in der gleichen Anordnung wie oben für die Organismen in Wasser oder die Wasserkontrollbehandlungen beschrieben angewendet.
Anfang April wurden 0,3 m der mittleren Reihe jedes Dachtrespenbeetes vorsichtig umgegraben, so daß keine Wurzeln verloren gingen. Die Wurzeln wurden vorsichtig unter fließendem Leitungswasser gewaschen, um den ganzen sichtbaren Boden zu entfernen. Sprosse und Wurzeln wurden abgetrennt und bei 60ºC für 48 Stunden getrocknet. Damit ein Bakterienstamm als die Dachtrespe im Feldtest hemmend angesehen wird, müssen die mit den Bakterien behandelten Dachtrespenpflanzen einen durchschnittlich um mindestens 10% verringerten Bestand, ein durchschnittlich um mindestens 10% verringertes Wurzelwachstum (Wurzeltrockengewicht) oder ein durchschnittlich um mindestens 10% verringertes Triebwachstum (Triebtrockengewicht) haben, verglichen mit den Kontrolldachtrespenpflanzen. Tabelle 3 zeigt die Hemmung der Dachtrespe durch die anfänglich als nicht-fluoreszierend bestimmten Stämme NRRL B-18293 und NRRL B-18294, die auf die Rückstände und die Bodenoberfläche aufgesprüht wurden (Spray) oder in Stroh inkubiert wurden, bevor sie auf die Bodenoberfläche ausgebracht wurden (Stroh). Wie Tabelle 3 Behandlung Organismus Pflanzenzahl Verringerung der Pflanzenzahl verglichen mit der Kontrolle Wurzeltrockengewicht Verringerung des Wurzelwachstums Triebtrockengewicht Verringerung im Triebtrockengewicht SPRAY Kontrolle Keine STROH
man aus den Daten ersehen kann, haben die Stämme den Feldtest passiert.
Auf Feldbeeten gezogener und mit den Stämmen NRRL B- 182 93 und NRRL B-18294 mit 10&sup9; CFU pro Quadratmeter behandelter Winterweizen zeigte in der Bestandszahl keinen Unterschied zum Kontrollwinterweizen, was zeigt, daß keiner der Teststämme Winterweizen schädlich beeinflußte.
In einem anderen Feldtest wurde NRRL B-18295 wie oben für die anderen Stämme beschrieben getestet. Die mit diesem Stamm behandelten Dachtrespenpflanzen wiesen einen um durchschnittlich 35% verringerten Bestand und ein um 45% verringertes Triebwachstum (Triebtrockengewicht) auf, verglichen mit den Kontrolldachtrespenpflanzen. Mit diesem Stamm behandelter Winterweizen zeigte keine Verringerung des Bestands oder Wurzelwachstums verglichen mit dem Kontrollwinterweizen.
Die vorangegangene detaillierte Beschreibung dient lediglich der Illustration und Modifikationen und Änderungen können vorgenommen werden, ohne den Gedanken und Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Screeningverfahren für Bakterien zur Auswahl von Stämmen, die das Wachstum der Dachtrespe in auf dem Feld wachsenden Kleinkorn-Feldfrüchten hemmen, ohne die Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen, enthaltend:

(a) Isolieren eines Bakterienstammes von der Wurzeloberfläche, der Rhizosphäre oder sowohl von der Wurzeloberfläche als auch der Rhizosphäre der Dachtrespe oder der auf dem Feld wachsenden Kleinkorn-Feldfrucht;

(b) Screening des in Stufe (a) isolierten Stamms zur Hemmung des Dachtrespenwachstums, ohne die Kleinkorn- Feldfrucht schädlich zu beeinflussen, in vitro wie folgt;

(1) Ziehen der Dachtrespe in vitro in Gegenwart einer Zellkultur, eines im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder eines zellfreien Kulturfiltrats des in Stufe (a) isolierten Stamms;

(2) Ziehen der Dachtrespe wie in Stufe (b) (1) ohne Zugabe des Stamms, des Überstands oder des Filtrats;

(3) Auswahl eines Stammes, der die Dachtrespe aus Stufe (b) (1) wenigstens zu einer mittleren Verringerung des Wurzelwachstums um 50% oder wenigstens eine Verringerung der Keimung um 20%, verglichen mit der in Stufe (b) (2) gezogenen Dachtrespe, veranlaßt;

(4) Ziehen der Kleinkorn-Feldfrucht der zu schützenden Sorte in vitro in Gegenwart einer Zellkultur, eines im wesentlichen zellfreien Kulturüberstands oder eines zellfreien Kulturüberstands des in Stufe (b) (3) ausgewählten Stamms;

(5) Ziehen der Kleinkorn-Feldfrucht der zu schützenden Sorte wie in Stufe (b) (4) ohne Zugabe des Stamms, des Überstands oder des Filtrats und

(6) Auswahl eines Stamms, der diese Kleinkorn-Feldfrucht von Stufe (b) (4) zu einer mittleren Verringerung des Wurzelwachstums von weniger als 10%, verglichen mit der in Stufe (b) (5) gezogenen Kleinkorn-Feldfrucht, veranlaßt;

(c) Screening des in Stufe (b) (6) ausgewählten Stamms zur Hemmung der Dachtrespe ohne schädliche Beeinflussung der Kleinkorn-Feldfrucht in einer Wachstumskammer wie folgt:

(1) Getrenntes Ziehen der Dachtrespe und der Kleinkorn-Feldfrucht der zu schützenden Sorte in der Wachstumskammer in Gegenwart des in Stufe (b) (6) ausgewählten Stamms in einer Konzentration von etwa 108 bis 1010 CFU dieses Stamms auf je 10 Dachtrespensamen und in einer Konzentration von etwa 108 bis 1010 CFU dieses Stamms auf je vier Samen der Kleinkorn-Feldfrucht;

(2) Ziehen der Dachtrespe und der Kleinkorn-Feldfrucht wie in Stufe (c) (1) ohne Zugabe des Stamms und

(3) Auswahl eines Stamms, der eine mittlere Verringerung von wenigstens 25% im Wurzel- und/oder Triebwachstum bei der Dachtrespe, verglichen mit dem Dachtrespenwachstum in Stufe (c) (2), verursacht, und der im Mittel eine Verringerung von weniger als 10% im Wurzelwachstum oder Triebwachstum der in Stufe (c) (1) gezogenen Kleinkorn-Feldfrucht, verglichen mit der in Stufe (c) (2) gezogenen Kleinkorn-Feldfrucht, verursacht;

(d) Screening des in Stufe (c) (3) ausgewählten Stamms zur Hemmung der Dachtrespe, ohne die Kleinkorn-Feldfrucht schädlich zu beeinflussen, auf dem Feld wie folgt:

(1) Getrenntes Ziehen von Dachtrespe und Kleinkorn- Feldfrucht der zu schützenden Sorte auf dem Feld in Gegenwart des in Stufe (c) (3) ausgewählten Stamms in einer Konzentration von etwa 10&sup7; bis 10¹² CFU des Stamms je Quadratmeter Dachtrespe und Kleinkorn-Feldfrucht;

(2) Ziehen von Dachtrespe und Kleinkorn-Feldfrucht wie in Stufe (d) (1) ohne Zugabe des Stamms und

(3) Auswahl des Stamms, der die Dachtrespe aus Stufe (d) (1) zu einer mittleren, wenigstens 10%-igen Verringerung des Bestands, des Wurzelwachstums oder des Triebwachtums, verglichen mit dem Dachtrespenwachstum in Stufe (d) (2), veranlaßt und der die in Stufe (d) (1) gezogene Kleinkorn- Feldfrucht zu einer mittleren Verringerung von weniger als 10% im Bestand, Wurzelwachstum oder Triebwachstum, verglichen mit der in Stufe (d) (2) gezogenen Kleinkorn-Feldfrucht, veranlaßt.

2. Verfahren zur Hemmung des Dachtrespenwachstums, enthaltend das Ausbringen des in Stufe (d) (3) nach Anspruch 1 ausgewählten Bakterienstamms auf die im Feld gezogenen Kleinkorn-Feldfrüchte der zu schützenden Sorte in einer Menge, die ausreichend ist, das Dachtrespenwachstum in der Feldfrucht zu hemmen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin dieser Stamm in einer Konzentration von etwa 10&sup7; bis 10¹² CFU je Quadratmeter ausgebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin der Stamm mittels Sprühbehandlung, den Stamm in einem flüssigen Träger enthaltend, ausgebracht wird und/oder als Strohbehandung, enthaltend den auf Stroh gezogenen Stamm, ausgebracht wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Dachtrespe Bromus tectorum und/oder die Kleinkorn- Feldfrucht Winterweizen ist.

6. Verfahren zur Hemmung des Dachtrespenwachstums in auf dem Feld wachsenden Kleinkorn-Feldfrüchten, enthaltend das Ziehen der Kleinkorn-Feldfrucht der zu schützenden Sorte in Gegenwart einer hemmenden Menge, bestimmt mittels Durchführung des Screentests nach Anspruch 1, einer Bakterienkultur, welche die Dachtrespe in der Kleinkorn-Feldfrucht unter Feldbedingungen hemmt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin die ausgewählte Bakterienkultur einen Pseudomonas-Stamm enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Pseudomonas-Stamm ausgewählt ist aus der aus NRRL B-18293, NRRL B-18294 und NRRL B-18295 bestehenden Gruppe.

9. Pseudomonas-Stamm, ausgewählt aus NRRL B-18293, NRRL B-18294 und NRRL B-18295.

10. Bakterienkultur, die das Dachtrespenwachstum in Kleinkorn-Feldfrüchten unter Feldbedingungen hemmt, die mittels Durchführung des Screentests nach Anspruch 1 bestimmt ist.

11. Screeningverfahren für Bakterien zur Auswahl von zur Heirimung des Dachtrespenwachstums geeigneten Stämmen ohne wesentliche schädliche Beeinflussung des Wachstums von auf dem Feld wachsenden Kleinkorn-Feldfrüchten, enthaltend das Prüfen von Bakterien, vorzugsweise aus der Wurzeloberfläche, der Rhizosphäre oder sowohl von der Wurzeloberfläche als auch der Rhizosphäre der Dachtrespe oder einer Kleinkorn-Feldfrucht unter Laborbedingungen zur deutlichen Hemmung des Dachtrespenwachstums, jedoch ohne wesentliche schädliche Beeinflussung des Wachstums der gewünschten Kleinkorn-Feldfrucht.

12. Zubereitung zur Hemmung des Dachtrespenwachtums in Kleinkorn-Feldfrüchten, enthaltend eine geeignete Menge von Bakterien, ausgewählt in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 11, gemeinsam mit einem landwirtschaftlich verträglichen Träger dafür.

13. Zubereitung nach Anspruch 12 zur Verwendung in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 2 bis 8.