DE3485964T2

DE3485964T2 - Landwirtschaftschemikalien produzierende endosymbiotische bakterien und verfahren zu deren herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE3485964T2
Application number: DE8484103792T
Authority: DE
Inventors: Peter Spikins Carlson
Original assignee: Crop Genetics International Corp
Current assignee: Crop Genetics International Corp
Priority date: 1983-04-13
Filing date: 1984-04-05
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2004-04-06
Also published as: DE3485964D1; AU2648184A; EP0125468A2; NZ207844A; EP0125468B1; CA1213228A; AU573738B2; JPH0697994B2; JPH06233675A; JPS6070071A; EP0125468A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien, insbesondere Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien, die in nicht-pathogene endosymbiotische Beziehungen mit Wirtspflanzen treten können, wodurch die Bakterien einige oder alle Anforderungen der Pflanze an Landwirtschaftschemikalien bereitstellen.
Die moderne kommerzielle Landwirtschaft ist stark abhängig von der Verwendung von Landwirtschaftschemikalien, um die Leistungsfähigkeit von Pflanzen zu steigern. Besonders zu erwähnen sind chemische Düngemittel, insbesondere stickstoffhaltige Düngemittel, die meistens den limitierenden Nährstoff für die Produktivität von Feldfrüchten darstellen und die teuerste Einzelzugabe für den Landwirt sind. Andere Landwirtschaftschemikalien werden vielfach mit hohen Kosten angewendet, um Pflanzenschädlinge zu töten, Krankheiten zu verhindern oder die Wachstumsumgebung der Pflanze zu verbessern. Wieder andere Landwirtschaftschemikalien können wachsenden Pflanzen oder geernteten Feldfrüchten zugesetzt werden, um natürliche Eigenschaften zu vermindern oder zu verstärken, oder um das Erscheinungsbild oder die sensorische Anziehung der Pflanze oder der Feldfrucht zu verändern oder zu verbessern. Landwirtschaftschemikalien umfassen auch natürliche oder synthetische Pflanzenwachstumsregulatoren, einschließlich z. B. Hormone. Solche Chemikalien sind dem auf dem Landwirtschaftssektor tätigen Fachmann wohl bekannt und werden im folgenden allgemein als "Landwirtschaftschemikalien" bezeichnet.
Mikroorganismen, wie Bakterien, sind eine natürliche Quelle für Landwirtschaftschemikalien. Zum Beispiel erhalten Leguminosepflanzen, wie Sojabohnen, Alfalfa und Klee einige Anteile ihres gebundenen Stickstoffbedarfs durch symbiotische Beziehungen mit Bakterien der Gattung Rhizobium. Spezielle Arten von Rhizobium infizieren die Wurzeln von Leguminosepflanzen, was zu Knöllchen führt, in denen die Bakterien vor Sauerstoff geschützt sind und mit Kohlenhydratnährstoffen versorgt werden. Bei diesem anaeroben Verfahren fixieren die Rhizobien atmosphärischen Stickstoff, der dann der Verwendung durch die Pflanze zugängig ist.
Bakterien sind auch Quellen von Landwirtschaftschemikalien geworden, die vom Menschen synthetisiert oder hergestellt wurden und durch z. B. Versprühen auf Felder, wachsende Pflanzen oder geerntete Feldfrüchte angewendet wurden. Zum Beispiel sind Antipilzantibiotika, antibakterielle Antibiotika und insektizide Antibiotika von verschiedenen Bakterien hergestellt worden. Antipilzantibiotika umfassen Blastizidin S, das von Streptomyces griseochromogenus hergestellt wird, Kasugamycin, das durch Streptomyces kasugaensis hergestellt wird, und Polyoxine, die von Streptomyces cacaoi var. asoensis hergestellt werden. Antibakterielle Antibiotika umfassen Streptomycin, hergestellt von Streptomyces griseus, und Tetracyclin, hergestellt von Streptomyces viridifaciens. Insektizide Antibiotika umfassen Tetranactin, hergestellt von Streptomyces aureus Stamm S-3466, und die β- und δ-Endotoxine, hergestellt von Bacillus thuringiensis. Siehe K. Aizawa, "Microbial Control of Insect Pests" und T. Misato und K. Yoneyama, "Agricultural Antibiotics" in Advances in Agricultural Microbiology, N.S.S. Rao, Herausgeber (1982).
Ähnlich sind Mikroorganismen Quellen von Antibiotika zur Verwendung als Herbizid geworden. Zum Beispiel zeigen Cycloheximid, hergestellt von Streptomyces griseus, und Herbizidin A und B, hergestellt von Streptomyces saganoensis, herbizide Aktivität. Siehe Y. Sekizawa und T. Takematsu, "How to Discover New Antibiotics for Herbicidal Use" in Pesticide Chemistry, J. Miyamoto und P.C. Kearney, Herausgeber (1983).
Weiterhin sind Mikroorganismen bekannt für das Herstellen von Pflanzenwachstum regulierenden Substanzen, wie verschiedene Vitamine, Auxine, Cytokinine, Gibberellin ähnliche Substanzen und andere stimulierende oder hemmende Substanzen. Brown schreibt in ihrer Arbeit über "Seed and Root Bacterization", unten zitiert, die Herstellung von solchen Substanzen den Arten von Azotobacter, Pseudomonas und Bacillus, einschließlich B. megaterium und B. subtilis, zu.
Von Mikroorganismen ist auch gefunden worden, daß sie antivirale Antibiotika, einschließlich Laurusin, das aus Streptomyces lavendulae isoliert worden ist, und Miharamycin, das aus Streptomyces miharuensis isoliert worden ist, herstellen. Siehe T. Misato, K. Ko und I. Yamaguchi, "Use of Antibiotics and in Agriculture" in Advances in Applied Microbiology, Band 21, (1977).
Von anderen Arten von Bakterien ist bekannt, daß sie die Fähigkeit besitzen, Phosphat löslich zu machen, das anderenfalls Pflanzen unzugänglich ist. Diese umfassen solche Bakterien, die zu den Gattungen Bacillus und Pseudomonas gehören. Versuche, diese Fähigkeit dieser Bakterien durch Beimpfen von Samen oder Pflanzen mit den Bakterien zu nutzen, haben inkonsistente Ergebnisse geliefert. Siehe N.S.S. Rao, "Phosphate Solubilization by Soil Microorganisms" in Advance in Agricultural Microbiology, N.S.S. Rao, Herausgeber (1982).
Wenige symbiotische Beziehungen zwischen Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien und wichtigen Arten von Feldfrüchten, wie Weizen und Mais, sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden. Die Entwicklung von symbiotischen Beziehungen zwischen solchen Bakterienarten und verschiedenen Feldfrüchten hätte viele Vorteile gegenüber der Synthese durch den Menschen und Anwendung der Chemikalie. Die Vorteile solcher Beziehungen sind insbesondere offensichtlich auf dem Gebiet von stickstoffhaltigen Düngemitteln, die hierin im folgenden ausführlich als Beispiel der Vorteile diskutiert werden, die durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung erreichbar sind. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die hierin enthaltenen Lehren betreffend die bakterielle Herstellung von stickstoffhaltigen Düngemitteln vom Fachmann auf andere bakteriell hergestellte Landwirtschaftschemikalien, wie die oben diskutierten, übertragen werden können.
Es wird geschätzt, daß die Entwicklung einer symbiotischen Beziehung zwischen stickstoffixierenden Bakterien und wichtigen Feldfruchtarten, die zumindest einen geringen Anteil, z. B. 10 bis 20 % der Anforderungen an gebundenen Stickstoff von nicht-leguminoseartigen Feldfrüchten, bereitstellen kann, einen wirtschaftlich wichtigen Ersatz der von Photosynthese stammenden Energie für fossile Brennenergie erzeugen würde, die zur Zeit für die Herstellung von Stickstoffdüngemittel verwendet wird. Gegenwärtig sind die Hauptquellen von gebundenem Stickstoff für nicht-leguminoseartige; wirtschaftliche Feldfrüchte vom Menschen hergestellte Produkte, wie wasserfreies Ammoniak, anorganische Stickstoffsalze und synthetische, organische Stickstoffverbindungen. Der gegenwärtige jährliche Verbrauch an Stickstoffdüngemitteln in den Vereinigten Staaten wird auf 12 Millionen Tonnen geschätzt. Solche Stickstoffdüngemittel werden im wesentlichen durch energieintensive Verfahren für die Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak hergestellt.
Eine Hauptstoßrichtung der Forschung betreffend Stickstoffixierung ist in den letzten Jahren auf die Isolierung, Charakterisierung, Transformation und Expression der stickstoffixierenden Gene von Rhizobia und anderen stickstoffixierenden Bakterien durch genetische Modifikation der Pflanzen selbst gerichtet gewesen. Diese Technik verlangt ein vollständiges Verstehen der Genetik und Biochemie der Stickstoffixierung, was schätzungsweise 10 bis 15 Jahre weiter in der Zukunft liegt. Siehe allgemein J.E. Beringer, "Micorbial Genetics und Biological Nitrogen Fixation", in Advances In Agricultural Microbiology, N.S.S. Rao, Herausgeber (1982), und G.P. Roberts et al., "Genetics and Regulation of Nitrogen Fixation", Ann. Rev. Microbiol., 35 : 207-35 (1981).
Von anderen Arten von Bakterien ist bekannt, daß sie die Fähigkeit zum Fixieren von atmosphärischem Stickstoff besitzen. Diese umfassen solche, die zu den Gattungen Azotobacter, Azomonas, Derxia und Be&ijlig;erinckia gehören, die Stickstoff aerobisch fixieren, und solche, die zu der Gattung Klebsiella gehören, die, wie Rhizobium, Stickstoff anaerobisch fixieren. Die Literatur ist voll mit Berichten über die nicht erfolgreichen Versuche, symbiotische Beziehungen, ähnlich zu Rhizobium- Leguminosen-Beziehungen, zwischen diesen Bakterien und nicht-leguminoseartigen Pflanzen zu entwickeln.
In den frühen 40er Jahren dieses Jahrhunderts ist z. B. in der Sowjetunion und anderswo vorgeschlagen worden, daß stickstoffixierende Bakterien als Inokulums für Böden verwendet werden könnten, um einige oder alle Anforderungen der Stickstoffixierung von nicht-leguminoseartigen Feldfrüchten bereitzustellen. Tatsächlich waren Ansprüche auf gesteigerte Feldfruchtausbeute, assoziiert mit solchen Inokulationen, weit verbreitet. Kritische Analysen der frühen Ausbeuteergebnisse zeigten jedoch, daß positive, signifikante Wirkungen nur in ungefähr einem Drittel der Versuche erfolgten. Es wurde später festgestellt, daß Ausbeutesteigerungen, die mit bakterieller Inokulation, einschließlich Inokulation mit Arten von Azotobacter, primär aufgrund der Änderungen in der mikrobiellen Rhizosphärenpopulation, Krankheitunterdrückung durch die Inokulums, Produktion von pflanzenwachstumsfördernden Substanzen und Mineralisierung von Bodenphosphaten beruhten. Es ist keine Fähigkeit gezeigt worden, eine assoziative, symbiotische Beziehung mit stickstoffixierenden Bakterien in nicht-leguminoseartigen Pflanzen zu etablieren. Siehe M.E. Brown, "Seed and Root Bacterization", Annual Review of Phytopathology, Band 12: 181-197 (1974).
Es ist gezeigt worden, daß eine künstliche Symbiose zwischen nicht-leguminoseartigen Pflanzenzellen in Gewebekultur und aeroben, stickstoffixierenden Bakterien, wie Azotobacter vinelandii, erzeugt werden kann. Das Aufzeigen umfaßte erzwungene Assoziation zwischen höheren Pflanzen- und Bakterienzellen und stellte keine Technik bereit, mit der eine symbiotische Assoziation zwischen solchen stickstoffixierenden Bakterien und wachsenden Pflanzen erzeugt werden könnte.
Siehe P.S. Carlson, et al., "Forced Association Between Higher Plant and Bacterial Cells In Vitro", Nature, Band 252, Nr. 5482, Seiten 393-395 (1974).
Ein anderer Versuch, höhere Organismen zu erzeugen, die ihren eigenen Stickstoff fixieren können, umfaßte z. B. Versuche, neue Organellen in höheren Organismen zu erzeugen, durch ähnliche erzwungene Assoziation von niedrigeren Formen von Organismen mit stickstoffixierenden Fähigkeiten. Solche Bemühungen, der theoretischen biologischen Entwicklung von bekannten Organellen zu folgen, umfaßten z. B. die Bemühungen von Burgoon und Bottino, die Aufnahme von stickstoffixierenden Gloecapsa sp. blaugrünen Algen durch Pflanzenzellen zu induzieren, die Bemühungen von Davey und Cocking, die Aufnahme von stickstoffixierenden Rhizobium sp. Bakterien in Pflanzenzellen zu induzieren, und die Bemühungen von Giles, die Aufnahme von stickstoffixierenden Azotobacter vinelandii Bakterien durch Ectomycorrhizapilze zu induzieren. Siehe A.C. Burgoon und P.J. Bottino, Journal of Heredity, Band 67, Seiten 223 bis 226 (1972); M.R. Davey und E.C. Cocking, Nature, Band 239, Seiten 455 bis 456 (1972) und K.L. Giles, "The Transfer of Nitrogen-Fixing Ability to Non-leguminous Plants", Plant Cell and Tissue Culture Principles and Applications, W.R. Sharp et al., Herausgeber (1979). Weder die Arbeit von Burgoon und Bottino noch die Arbeit von Davey und Cocking war erfolgreich in der Erzeugung von stickstoffixierenden höheren Organismen. Wären die Effekte von Giles erfolgreich gewesen, was nicht schlüssig festgestellt worden ist, würden sie bestenfalls zu Pilzen führen mit organellähnlichen Strukturen, die Stickstoff fixieren könnten, die nur außerhalb von Wurzeln von Forstarten leben könnten, anstatt endosymbiotisch mit wichtigen Feldfruchtpflanzen zu leben.
Ein weiterer Versuch, eine symbiotische Beziehung zwischen stickstoffixierenden Bakterien und nicht-leguminoseartigen Pflanzen zu erzeugen, umfaßte das Absuchen und die Selektion von Pflanzenhybriden in der Bemühung, einige Pflanzenarten zu identifizieren, die mit aeroben, stickstoffixierenden Bakterien, wie Azotobacter vinelandii, in dem Boden assoziieren konnten. Jedoch führten diese Bemühungen zu der Identifizierung von Pflanzenarten, die nur ungefähr 0,5 % so aktiv wie mit Rhizobia inokulierte Sojapflanzen waren, was nicht als wirtschaftlich nützlich angesehen wurde. Siehe S.W. Ela, et al., "Screening and Selection of Maize to Enhance Associative Bacterial Nitrogen Fixation", Plant. Physiol. Band 70 : 1564-1567 (1982).
Die zahlreichen gescheiterten Versuche, assoziative, symbiotische Beziehungen zwischen stickstoffixierenden Bakterien und nicht-leguminoseartigen Pflanzen zu erzeugen, haben zu der Entwicklung von zahlreichen Techniken zur genetischen Manipulation und Analyse geführt. Diese Versuche haben auch zu einer ziemlich ausführlichen Charakterisierung der genetischen Ausgestaltung von stickstoffixierenden Bakterien, wie Azotobacter, geführt. Zum Beispiel ist entdeckt worden, daß Mutantenstämme von Azotobacter vinelandii, denen das stickstoffixierende Gen fehlt, durch Einführung von genetischem Material von Rhizobiumarten zu Bakterien transformiert werden können, die die Fähigkeit zum Fixieren von Stickstoff besitzen. Siehe G.P. Roberts, "Genetics and Regulation of Nitrogen Fixation", Ann. Rev. Microbiol., Band 35 : 207-35 (1981). Weiterhin wurden neue Techniken zur Protoplastfusion, die das Fördern von genetischer Rekombination zwischen Arten durch Fusion von verschiedenen Zellen, deren Zellwand entfernt worden war, umfaßt, als Technik erkannt, die eine möglicherweise attraktive Technik für die Erzeugung von neuen Stämmen für kommerzielle Zwecke bereitstellt, ohne daß das Verständnis der zugrunde liegenden Genetik erforderlich ist. Es wurde in der wissenschaftlichen Literatur jedoch anerkannt, daß noch ermittelt werden muß, ob oder ob nicht Protoplastenfusion für genetische Untersuchungen von gramnegativen, stickstoffixierenden Bakterien verwendet werden kann. Siehe J.E. Beringer, "Microbial Genetics and Biological Nitrogen Fixation" in Advances in Agricultural Microbiology, N.S.S. Rao, Herausgeber (1982).
Tatsächlich ist es in Experimenten betreffend die Protoplastenfusion von stickstoffixierenden Bakterien vor der vorliegenden Erfindung nicht gelungen, einen Hinweis zu erbringen, daß nicht-pathogene, endosymbiotische Beziehungen zwischen höheren Pflanzen und Fusionsprodukten von stickstoffixierenden Bakterien hergestellt werden können. Zum Beispiel beschrieben Du Qian-you und Fan Cheng-Ying, "A Preliminary Report On the Establishment of Nitrogen Fixation System in the Crown Gall of Tomato Plant", Acta Botanica Sinica, Band 23, Nr. 6 (1981) einen Versuch, Protoplastenfusion zwischen Elternstämmen von Agrobacterium tumefaciens (Penr, Ti) und Azotobacter chroococcum (Pens, Nif&spplus;) zu bewirken. Die Hybriden wurden auf Stickstoffixierung und ihre Resistenz gegen Penicillin selektiert und wurden danach auf den Stiel einer Tomatenpflanze aufgebracht. Von den durch Inokulation erzeugten Wurzelhalsgallen oder Tumoren wurde gefunden, daß sie Nitrogenaseaktivität unter aeroben Bedingungen gemäß dem Acetylenreduktionstest besitzen. Die Fusionsprodukte des Experiments erzeugten eine pathogene Antwort in der Wirtspflanze, und es konnte nicht gezeigt werden, daß sie in eine endosymbiotische Beziehung mit der Pflanze eintreten können. Insbesondere konnte nicht sichergestellt werden, ob der in der Nähe der Tumoren erzeugte fixierte Stickstoff von der Pflanze als eine Quelle für Stickstoff verwendet wurde. Schließlich konnte nicht ermittelt werden, ob die beobachtet Nitrogenaseaktivität das Ergebnis eines pathogenen Hybrids oder einer penicillinresistenten Mutante von Azotobacter, die in einem gemischten Inokulum verblieb, war. Weiterhin ist mittlerweile entdeckt worden, daß die Bemühungen von Du Qian-you et al., den Knöllchenbildungsmechanismus der Rhizobium-Leguminosen- Wechselwirkung durch beabsichtigten Einschluß des tumorbildenden Ti-Plasmids in ihren Hybriden nachzuahmen, in die entgegengesetzte Richtung zu derjenigen angelegt waren, die erforderlich ist, hybride Bakterien herzustellen, die in erfolgreiche endosymbiotische Beziehungen mit Wirtspflanzen treten können.
Weitere fehlgeschlagene Versuche, den Umfang stickstoffixierender Rhizobiumarten auszudehnen, umfassen das Einführen des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens in ausgewählte Rhizobiumstämme. Siehe P.J.J. Hooykass, et al., J. Gen. Microbiology, Band 98, Seiten 477-484 (1977). Diese Untersuchungen führten zu Rhizobiumstämmen, die Gallen an nicht-leguminoseartigen zweikeimblättrigen Pflanzen erzeugen, die Stickstoff fixieren, aber nur unter anaeroben Bedingungen, die natürlicherweise nicht in solchen Pflanzen vorkommen. Die in den vorhergehenden Abschnitten erläuterte Kritik gilt auch für diese Arbeit.
Trotz beträchtlichem kommerziellem Anreiz war der Stand der Technik nicht in der Lage, hybride stickstoffixierende Bakterien herzustellen, die in endosymbiotische Beziehungen mit nicht-leguminoseartigen Wirtspflanzen treten können, oder ein anderes hybrides Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium herzustellen, das in endosymbiotische Beziehungen mit Wirtspflanzen treten kann.
Ein Verfahren zum Herstellen hybrider Landwirtschaftschemikalien produzierender Bakterien, die in nichtpathogene, endosymbiotische Beziehungen mit einem Pflanzenwirt treten können, ist gefunden worden, wobei es umfaßt:
(A) in beliebiger Reihenfolge:
(1) Identifizieren der Wirtspflanze;
(2) Identifizieren eines infizierenden Bakteriums, das die Wirtspflanze infiziert;
(3) Selektieren von Mutanten des infizierenden Bakteriums mit einer oder mehreren selektierbaren Eigenschaften zusätzlich zu der Fähigkeit, die Wirtspflanze zu infizieren; und
(4) Selektieren eines Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums mit einer oder mehreren selektierbaren Eigenschaften;
(B) Erzeugen von Fusionshybriden des infizierenden Bakteriums und des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums;
(C) Nacheinander Selektieren aus den Produkten des vorher durchgeführten Schritts oder Teilschritts in beliebiger Reihenfolge:
(1) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die mindestens eine der selektierbaren Eigenschaften des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums und mindestens eine der selektierbaren Eigenschaften des infizierenden Bakteriums besitzen;
(2) einer bakterielle Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die die Fähigkeit manifestieren, mit Pflanzengewebe auf die gleiche Weise wechselzuwirken, wie das infizierende Bakterium mit Pflanzengewebe während der Anfangsphase der Infektion in der Wirtspflanze wechselwirkt;
(3) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die bei der Anwendung auf den Wirt nicht Manifestationen einer Krankheit erzeugen;
(4) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die die Fähigkeit zum Herstellen der Landwirtschaftschemikalie besitzen, falls nicht zuvor darauf selektiert wurde;
(D) Selektieren aus den Produkten des zuletzt durchgeführten Schritts der Schritte (C) (1) bis (C) (4) solcher Hybride, die die Leistung der Wirtspflanze verbessern können im Vergleich zu entweder direkter Anwendung der Landwirtschaftschemikalie oder Anwendung des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums auf die Pflanze.
"Infizierende Bakterien", wie im Verlauf dieser Beschreibung verwendet, soll nicht nur Organismen suggerieren, die in die Pflanze eintreten und in ihr Leben und normalerweise Krankheitssymptome erzeugen, sondern auch Organismen, die in die Pflanze eintreten und in ihr symbiotisch oder kommensal leben. Tatsächlich werden viele der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakterien, die normalerweise pathogene Antworten in einigen Pflanzenwirten erzeugen, normalerweise solche Antworten nicht in sämtlichen Pflanzenwirten hervorrufen. Der Ausdruck "Bakterien", wie hierin verwendet, soll Bakterien, bakterienähnliche Organismen und deren Äquivalente umfassen, einschließlich grampositiver Bakterien, gramnegativer Bakterien, Actinomyceten und ähnliches. Die einzigen Beschränkungen der taxonomischen Klassifizierung der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Organismen bestehen darin, daß sie zur Protoplastenfusion fähig sind, um lebende, hybride Organismen zu erzeugen, die phänotypische Eigenschaften von beiden Eltern exprimieren, wie ausführlicher hierin beschrieben.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Bakterien können in Feldfruchtpflanzen durch eine Vielzahl von Mittel, einschließlich Injektion, eingebracht werden und können verwendet werden, landwirtschaftliche Samen zu überziehen, landwirtschaftliche Samen zu infizieren, zur Herstellung eines Bodenbeizmittels und ähnlichem. Die erfindungsgemäßen Bakterien sind durch Assoziation mit Feldfruchtpflanzen in der Lage, einige oder sämtliche Bedürfnisse der Pflanzen an Landwirtschaftschemikalien zu erfüllen. Landwirtschaftschemikalien, die von hybriden Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, umfassen insbesondere stickstoffhaltige Düngemittel; Antibiotika, einschließlich antibakterielle, antivirale, Antipilz-, insektizide, nematozide, mitizide und herbizide Agenzien; Pflanzenwachstumsregulatoren.
Das Verfahren ist in der Lage, Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien herzustellen, die in endosymbiotische Beziehungen mit einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen treten können. Für zweikeimblättrige Pflanzen sind infizierende Bakterien der Gattung Agrobacterium bevorzugt, wobei Stämme von Agrobacterium tumefaciens besonders bevorzugt sind. Arten der Gattung Erwinia, wie Erwinia carotovora, können auch verwendet werden, wie auch Arten der Gattung Pseudomonas, wie Pseudomonas solanacearum und Pseudomonas syringae, und der Gattung Xanthomonas, wie Xanthomonas campestris. Für einkeimblättrige Pflanzen sind Arten der Gattung Erwinia, wie Erwinia stewartii, bevorzugte infizierende Bakterien. Arten der Gattung Xanthomonas, wie Xanthomonas campestris; Arten der Gattung Azospirillum, wie Azospirillum lipoferum und Azospirillum brasilense; und Arten der Gattung Pseudomonas, wie Pseudomonas syringae, werden auch als verwendbar angesehen. Pseudomonas syringae gilt als besonders nützlich als ein infizierendes Bakterium für die Bildung von Fusionsprodukten, die auf Getreide anwendbar sind, einschließlich Getreide der gemäßigten Breiten und Reis.
Bevorzugte Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien und die Chemikalien und/oder Anwendungen, für die deren metabolische Produkte nützlich sind, sind in Tabelle I unten angegeben und umfassen Organismen mit der Fähigkeit, Düngemittel, einschließlich fixierten Stickstoff und Chemikalien, die Phosphate löslich machen können, Antibiotika, einschließlich antibakterielle Verbindungen, Antipilzverbindungen, antivirale Verbindungen, Insektizide, Nematozide, Mitizide und Herbizide, und Pflanzenwachstumsregulatoren herzustellen. Weiterhin können nützlich Organismen ausgewählt oder modifiziert werden, um andere als die oben definierten Landwirtschaftschemikalien herzustellen, einschließlich Aromastoffe und fraßverhindernde Agenzien.
Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu neuen, stabilen Fusionshybridbakterien mit der Fähigkeit, eine oder mehrere Landwirtschaftschemikalien herzustellen und in endosymbiotische Beziehungen mit einer Wirtspflanze zu treten. Von den erfindungsgemäßen stickstoffixierenden Produkten ist beispielsweise gezeigt worden, daß sie die Ausbeute von nicht-leguminoseartigen Feldfrüchten, die unter Bedingungen mit wenig gebundenem Stickstoff wuchsen, im Umfang von 10 bis 180 % verbessern, primär aufgrund, so wird angenommen, von gebundenem Stickstoff, der von den Hybriden aus stickstoffixierenden Bakterien und infizierenden Bakterien im Rahmen ihrer endosymbiotischen Beziehung mit der Wirtspflanze erzeugt wurde.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden teilweise in der folgenden Beschreibung fortgesetzt und werden teilweise aus der Beschreibung offensichtlich oder können aus der Ausführung der Erfindung gelernt werden. Die Gegenstände und Vorteile können erkannt und erreicht werden mittels des Instrumentariums und der Kombinationen, die insbesondere in den anhängigen Patentansprüchen aufgeführt sind.
Zum Lösen der Aufgabe in Einklang mit dem Zweck der Erfindung, wie hierin verkörpert und beispielhaft beschrieben, sind die hybriden Fusionsprodukte des oben beschriebenen Verfahrens vorzugsweise die Fusionsprodukte von Bakterien mit der gleichen Antwort auf Gramfärbung, vorzugsweise gramnegative Bakterien. Jedoch sind auch bestimmte grampositive Bakterien, insbesondere Mitglieder der Gattung Bacillus, auch besonders nützlich für die Bildung von hybriden Fusionsprodukten, die Landwirtschaftschemikalien herstellen können. Weiterhin können die hybriden Fusionsprodukte des oben beschriebenen Verfahrens weiter modifiziert werden durch natürliche oder künstliche genetische Techniken, um ihre Leistungsfähigkeit als Quelle einer Landwirtschaftschemikalie für die Wirtspflanze zu verbessern. Eine solche Modifikation könnte z. B. zu der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie, wie gebundener Stickstoff, auszuscheiden, einschließlich der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie in einer speziellen Form auszuscheiden, wie gebundener Stickstoff in der Form von Aminosäuren; zu der Fähigkeit, die Herstellung der Landwirtschaftschemikalie fortzusetzen, selbst in der Anwesenheit von adäquaten Mengen dieser Chemikalie aus anderen Quellen; zu einer Verringerung der Widerstandsfähigkeit des Hybrids gegenüber niedrigen Temperaturen (z. B. um nicht gewünschte Proliferation des Hybrids von Jahr zu Jahr zu verhindern); zur Steigerung der Fähigkeit des Hybrids Dürre, Krankheit oder anderen physiologischen Streß zu widerstehen; zu dem Einführen zusätzlicher Landwirtschaftschemikalien produzierender Funktionen; oder zur Modifikation des Hybrids, so daß es nicht außerhalb der Wirtspflanze wachsen kann, führen.
Während die Schritte des oben beschriebenen Verfahrens in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden können, ist es wünschenswert, daß das Verfahren zur Selektion auf Landwirtschaftschemikalien produzierende Fähigkeit und auf Fähigkeit, mit Pflanzengewebe auf die gleiche Weise wechselzuwirken, wie das infizierende Bakterium mit Pflanzengewebe während der Anfangsphase der Infektion in der Wirtspflanze wechselwirkt, zwei- oder mehrmals vor dem Schritt durchgeführt wird, der die Selektion von solchen Hybriden betrifft, die keine Symptome von Krankheit in der Wirtspflanze manifestieren.
Die selektierbaren Eigenschaften, die mit dem infizierenden Bakterium assoziiert sind, können beispielsweise Antibiotikaresistenz oder Bedarf für spezifische Nahrungsmittelergänzung (Auxotrophismus) sein. Die mit dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium assoziierten selektierbaren Eigenschaften können die Fähigkeit sein, eine Landwirtschaftschemikalie herzustellen, alleine oder in Kombination mit einer oder mehrerer der Fähigkeiten, die zuvor hinsichtlich des infizierenden Bakteriums erwähnt wurden. Die Wechselwirkung mit Pflanzengewebe, nach der in Schritt C (2) des oben beschriebenen Verfahrens abgesucht wurde, kann beispielsweise die Fertigkeit sein, Pflanzengewebe zu binden, oder die Fähigkeit, sich über das Gefäßsystem der Pflanze auszubreiten. Wo die mit der Anfangsphase der Infektion assoziierte Wechselwirkung das Binden an Pflanzenzellen ist, ist es wünschenswert, die aus Schritt C stammende bakterielle Untergruppe vor Schritt D weiter zu beschränken durch Selektion einer bakteriellen Untergruppe für das weitere Absuchen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, umfassend solche Hybride, die sich am leichtesten über die Wirtspflanze ausbreiten. Die Fusionsprodukte werden durch Protoplasten- oder Spheroplastenfusion erzeugt. Bei geeigneter Auswahl der infizierenden bakteriellen Komponente des Hybrids können Fusionshybride erhalten werden, die in endosymbiotische Beziehungen mit Getreiden, wie Weizen, Triticale, Gerste, Roggen, Reis und Hafer; Gräsern, wie Krespe, Viehgras, hohes Schwingelgras und Bermudagras, tropischen Gräsern, wie Zuckerrohr, Mais, Hirse und Sorghum; solanaceenartigen Pflanzen, wie Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Auberginen und Pfeffer; Kreuzblütlerpflanzen, wie Blumenkohl, Broccoli, Kohl, Grünkohl und Kohlrabi; anderen Gemüsen, wie Karotten und Petersilie, anderen landwirtschaftlich kultivierten Pflanzen, wie Zuckerrüben, Baumwolle, Obstbäume, Beerenpflanzen und Trauben; und wirtschaftlich bedeutenden Baumarten, wie Pinie, Fichte, Tanne und Espe, treten können. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erhaltenen Bakterien können auch verwendet werden, um einige oder sämtliche der Anforderungen an gebundenen Stickstoff oder andere landwirtschaftliche Chemikalien von Leguminosepflanzen, wie Sojabohne, Alfalfa, Klee, Feldbohnen, Mungbohnen, Erbsen oder anderen Hülsenfrüchten, zu erfüllen, z. B. als eine Ergänzung zu fixiertem Stickstoff, der von Arten von Rhizobium bereitgestellt wird, die mit Knöllchen auf ihren Wurzeln assoziiert sind.
Im folgenden wird ausführlich Bezug genommen auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, was zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dient, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Die Schritte des obigen erfindungsgemäßen Verfahrens können in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden. Vorzugsweise werden sie in der Reihenfolge ausgeführt, wie mit den nach in Schritt C (1) abgesuchten selektierbaren Eigenschaften der Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien angegeben, einschließlich der Fähigkeit des Hybrids, die fragliche Landwirtschaftschemikalie herzustellen, wie in dem Fall von gebundenen Stickstoff erzeugenden Bakterien. Wenn das Absuchen nach der Fähigkeit, die fragliche Landwirtschaftschemikalie herzustellen, nicht in dem ersten Schritt des Absuchens durchgeführt wird, dann ist es bevorzugt, ein solches Absuchen (Schritt C (4)) vor oder gleichzeitig mit dem Absuchen der Wirtspflanze durch Schritte C (2) und C (3) durchzuführen. Wenn in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt, müssen die Antibiotikaresistenzmarker oder ähnliches, die die mit dem infizierenden Bakterium assoziierten selektierbaren Eigenschaften darstellen, die anschließenden Absuchverfahren nicht überleben.
Die stabilen Fusionshybridbakterien, die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultieren, unterscheiden sich von bisher bekannten Organismen darin, daß sie sowohl die Fähigkeit zum Herstellen von Landwirtschaftschemikalien als auch die Fähigkeit, nicht-pathogene, endosymbiotische Beziehungen mit einer Wirtspflanze einzugehen, besitzen. Die endosymbiotische Beziehung, auf die Bezug genommen ist, ist eine, in der der Organismus tatsächlich innerhalb der Pflanze existiert und sich über die gesamte Pflanze oder einen Teil ausbreitet, ohne eine pathogene Antwort hervorzurufen, wobei er einige oder sämtliche seiner Energiebedürfnisse von Kohlenhydraten oder anderen Materialien, die von der Pflanze hergestellt werden, bezieht, und der Landwirtschaftschemikalien bereitstellt, die von der Wirtspflanze verwendet werden können, um solche zu ergänzen, die anders erhältlich sind.
Die Wirtspflanzen, mit denen die erfindungsgemäßen Mikroorganismen endosymbiotische Beziehungen etablieren können, können tatsächlich sämtliche wirtschaftlich wichtigen Feldfruchtpflanzen einschließen. Es ist gezeigt worden, daß das erfindungsgemäße Verfahren stabile Fusionshybridbakterien mit der Fähigkeit erzeugen kann, eine Landwirtschaftschemikalie herzustellen und in endosymbiotische Beziehungen mit einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzenwirten zu treten. Eine besonders wichtige Gruppe von Wirtspflanzen, für die die erfindungsgemäßen Produkte als endosymbiotische Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien dienen können, sind die Getreide, einschließlich Getreide der gemäßigten Breiten, wie Weizen, Triticale, Gerste, Roggen, Reis und Hafer. Gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugte endosymbiotische Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien können auch nützlich sein zum Ergänzen des Bedarfs an Landwirtschaftschemikalie, einschließlich fixiertem Stickstoff, von wirtschaftlich bedeutenden Gräsern und Futtergräsern, wie Krespe, Viehgras, hohes Schwingelgras und Bermudagras. Ähnlich haben die erfindungsgemäßen Organismen eine gezeigte Fähigkeit, die Ausbeuten an tropischen Gräsern, wie Zuckerrohr, Mais, Hirse und Sorghum zu steigern. Nachtschattengewächse, wie Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Auberginen und Pfeffer sind geeignete Wirtspflanzen, auf die die erfindungsgemäßen Organismen angewendet werden können, wie auch Kreuzblütlerpflanzen, wie Blumenkohl, Broccoli, Kohl, Grünkohl und Kohlrabi. Verschiedene Gemüse, wie Karotten und Petersilie; andere landwirtschaftlich kultivierte Pflanzen, wie Zuckerrüben, Baumwolle, Obstbäume, Beerenpflanzen und Trauben; und wirtschaftlich bedeutende Baumarten, wie Pinie, Fichte, Tanne und Espe können auch als Wirtspflanzen für die erfindungsgemäßen Organismen dienen.
Obwohl Pflanzen symbiotische Beziehungen mit Mirkoorganismen besitzen können, die Landwirtschaftschemikalien herstellen, wie Leguminosepflanzen mit Bakterien der Gattung Rhizobium, die atmosphärischen Stickstoff anaerob in Wurzelknöllchen fixieren, werden diese Pflanzen mit der höchsten Ausbeute erhalten, wenn sie mit ergänzenden Landwirtschaftschemikalienquellen durch Düngung oder auf andere Weise versorgt werden. Demzufolge kommt in Betracht, daß solche ergänzenden Landwirtschaftschemikalien, einschließlich ergänzendem fixiertem Stickstoff, für solche Pflanzen durch Mikroorganismen bereitgestellt werden können, die gemäß der Erfindung die Landwirtschaftschemikalien, einschließlich fixierten Stickstoff, herstellen können, und die in endosymbiotische Beziehungen mit diesen Leguminosepflanzen treten können.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium, das atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren und stabile Fusionshybride gemäß dem erfindungsgemäßen Fusionsverfahren bilden kann, kann vorzugsweise ausgewählt werden aus den Gattungen Azotobacter, Azomonas, Be&ijlig;erinckia und Derxia. Eine besonders bevorzugte Gruppe an Organismen sind solche von der Gattung Azotobacter, wie Azotobacter vinelandii, Azotobacter paspali, Azotobacter be&ijlig;erinckia und Azotobacter chroococcum. Azotobacter vinelandii ist besonders bevorzugt, da seine Genetik und Regulation der Stickstoffixierung extensiv untersucht worden sind, und weil es eine aufgezeigte Fähigkeit besitzt, genetisches Material von anderen Bakteriengattungen zu akzeptieren und aufzunehmen. Siehe G.P. Roberts, et al., "Genetics and Regulation of Nitrogen Fixation", Ann. Rev. Microbiol., Band 35 : 207-35 (1981).
Da Azotobacter und andere bedeutende aerob, stickstoffixierende Bakterien im allgemeinen gramnegative Bakterien sind, sind gramnegative stickstoffixierende Bakterien zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Jedoch ist es selbstverständlich, daß die im folgenden beschriebenen Fusionstechniken auch auf grampositive und gramnegative Bakterien anwendbar sind, und grampositive stickstoffixierende Bakterien werden als geeignet angesehen, gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet zu werden.
Andere Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die eine große Vielzahl von Antibiotika herstellen und stabile Fusionshybride gemäß dem erfindungsgemäßen Fusionsverfahren bilden können, oder die fähig sind, z. B. Pflanzenwachstum regulierende Verbindungen, andere Chemikalien zur Düngung als gebundenen Stickstoff, Aromastoffe, das Erscheinungsbild verstärkende Chemikalien oder fraßverhindernde Agenzien herzustellen. Tatsächlich wird jede Chemikalie oder chemische Wirkung, erzeugt durch ein hierin definiertes Bakterium, die als Landwirtschaftschemikalie von Wert wäre und die durch Organismen, die stabile Fusionshybride mit infizierenden Bakterien bilden, wie hierin beschrieben, und durch die Verfahren, wie hierin beschrieben, hergestellt werden, als gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar betrachtet. Die Auswahl solcher Landwirtschaftschemikalien produzierender Bakterien liegt in dem allgemeinen fachmännischen Können angesichts der hierin enthaltenen Lehren und Darstellungen.
Eine Tabelle von beispielhaften Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien, die als nützlich gemäß der vorliegenden Erfindung angesehen werden, und die Landwirtschaftschemikalie oder die sie produzierenden chemischen Wirkungen erscheinen in Tabelle I. Tabelle I. Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterien Gruppe Gattung Art Chemikalie/Anwendung Antibiotika Antipilzmittel Streptomyces cacaoi var. asoensis erzeugt Polyoxine, die Trockenfäule bei Reis verhindern griseus erzeugt Cycloheximid, das pflaumigen Mehltau bei Zwiebeln verhindert griseochromagenes erzeugt Blastizidin, ds Reisdürre verhindert hygroscopicus var. limoneus erzeugt Validamycin A, das Trockenfäule bei Reis verhindert kasugaensis erzeugt Kasugamycin, das Reisdürre verhindert kitazawaensis erzeugt Ezomycin, das Stielfäule bei Kidneybohnen verhindert Tendae Tu 901 erzeugt Nikkomycin, das gegen verschiedene Pilze wirksam ist Pseudomonas fluorescens Stamm B 10 verursacht, daß Eisen nicht verfügbar wird für andere Mikroorganismen, wie Pilze Gruppe Gattung Art Chemikalien/Anwendung Streptoverticillium rimofaciens erzeugt Mildiomycin, das wirksam ist gegen verschiedene pulverförmige Mehltaue Antibakterielle Streptomyces Agenzien chibaensis erzeugt Cellocidin, das bakterielle Blattfäule bei Reis verhindert griseus erzeugt Streptomycin, das verschiedene bakterielle Krankheiten verhindert lavendulae Nr. 6600 Gc-1 erzeugt Laurusin, das bakterielle Blattfäule von Reispflanzen verhindert spheroides erzeugt Novobiocin, das Tomatenkrebs verhindert venezuelae erzeugt Chloramphenicol, das bakterielle Blattfäule bei Reispflanzen verhindert viridifaciens erzeugt Tetracyclin, das verschiedene bakterielle Krankheiten verhindert Agrobacterium radiobacterial Stamm erzeugt Agrocin-84 Gruppe Gattung Art Chemikalie/Anwendung Nocardia sp. erzeugt Myomycin Antivirale Agenzien Streptomyces hygroscopicus var. aabomyceticus erzeugt Aabomycin A, das die TMV-Vermehrung im Tabakgewebe hemmt lavendulae Nr. 6600 Gc-1 erzeugt Laurusin, das die TMV-Vermehrung in Tabakgewebe hemmt mikaruensis erzeugt Miharamycin, das wirksam ist zum Kontrollieren von TMV, CMV PVX und RSV Insektizide Bacillus cereus beinflußt Hautflügler, Schmetterline, Käfer euloomarahae beeinflußt Käferlarven, insbesondere den japanischen Käfer fribougensis lentimorbus moritai beinflußt Saatkornmade popilliae Gruppe Gattung Art Chemikalie/Anwendung thuringiensis var. alesti dendrolimus entomocidus kurstaki sotto beeinflußt verschiedene Larven von Schmetterlingsschädlingen Clostridium bravidaciens beeinflußt Zeltraupe malacusomae Streptomyces Stamm B-41-146 erzeugt Milbemycin Nematozid Bacillus penetrans wirksam gegen Wurzelknollenematoden Mitizid Streptomyces aureus S-3466 erzeugt Tetranactin Herbizid Streptomyces griseus erzeugt Cycloheximid saganoensis erzeugt Herbizidin A, B sp. erzeugt Bialaphos erzeugt Anisymycin Pseudomonas syringae pv. atropourpurea erzeugt Coronatin, das Schokoladenfleckenkrankheit auf italienischem Roggengras verursacht Gruppe Gattung Art Chemikalien/Anwendung Düngemittel Stickstofffixierend Azotobacter be&ijlig;erinchia, enroococcum, paspali, vinelandii fixiert atmosphärischen Stickstoff Azomonas Be&ijlig;erinchia Derxia Phosphatlösend Bacillus circulans fluourescens, megaterium, mesentericus, mycoides, polymyxa, pulvitaciens subtilis löst gebundenes Phosphat Pseudomonas calcis, liquifaciens, putida, rathonia, striata Gruppe Gattung Art Chemikalien/Anwendung Pflanzenwachstumsregulatoren Azotobacter sp. erzeugt verschiedene Vitamine, Auxine, Cytokinine, gibberelinähnliche Substanz und andere Pflanzenhormone Agrobacterium sp. Pseudomonas sp. Bacillus megaterium subtilis
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Bakterium, das eine Wirtspflanze infizieren kann, kann ein beliebiges sein aus einer großen Vielzahl von Bakterienarten, die die in Betracht kommende Wirtspflanze infizieren und gemäß der im folgenden diskutierten Fusionstechniken stabile Fusionshybride bilden können. Vorzugsweise sollten die infizierenden Bakterien nach einer bekannten Methode mit der Wirtspflanze während der Anfangsphase der Infektion wechselwirken. Das infizierende Bakterium kann entweder eine pathogene, einschließlich latent pathogene, oder endosymbiotische Art sein. Beispielhafte Pathogene umfassen Arten der Gattungen Agrobacterium und Erwinia. Beispielhafte endosymbiotische Arten umfassen Arten von Azospirillum, von denen bekannt ist, daß sie in den Wurzeln von tropischen Gräsern, wie Zuckerrohr, und Gräsern der mittleren Breiten, wie Weizen, leben können, ohne Manifestationen von Krankheit zu verursachen. Im Falle von Pathogenen ist es bevorzugt, daß das Pathogen eine sichtbare Manifestation der mit ihm assoziierten Krankheit erzeugt.
Besonders bevorzugt ist als infizierendes Bakterium ein Stamm, der spezifisch oder nahezu spezifisch für die spezielle, in Betracht kommende Wirtspflanze ist, um das Potential zur Ausbreitung der erfindungsgemäßen Hybride auf andere Pflanzen als solche, mit denen sie in eine endosymbiotische Beziehung treten sollen, zu beschränken. Viele pflanzeninfizierende Bakterien und ihre Arten der Wechselwirkung mit Wirtspflanzen sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. In dieser Hinsicht wird besonders Bezug genommen auf M.S. Mount et al., Phytopathogenic Prokaryotes, Band I und II (1982).
Von vielen pathogenen Organismen ist bekannt, daß sie Organismenstämme bilden, die im wesentlichen nicht voneinander differenzierbar sind, außer ihrer Bevorzugung von speziellen Wirtspflanzen. Solche wirtsspezifischen Pathogenstämme sind als Pathovare für die beteiligte Wirtspflanze bekannt. Die vorliegende Erfindung wird als besonders nützlich angesehen, wenn Pathovare für die speziell in Betracht kommende Wirtspflanze verwendet werden, einschließlich Pathovare der Gattungen Agrobacterium, insbesondere Agrobacterium tumefaciens; Erwinia, insbesondere Erwinia stewartii und Erwinia carotovora; Pseudomonas, insbesondere Pseudomonas solanacearum und Pseudomonas syringae; Xanthomonas, insbesondere Xanthomonas campestris; und ähnliche Bakterien.
Besonders bevorzugte nicht-pathogene Endosymbionten umfassen Arten der Gattung Azospirillum, insbesondere Azospirillum lipoferum und Azospirillum brasilense. Infizierende Bakterien, die als geeignet zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung angesehen werden, umfassen die in Tabelle II aufgelisteten. Tabelle II Pflanzeninfizierende Bakterien Gruppe Gattung Art
Pathovare von Agrobacterium tumefaciens sind besonders bevorzugt zum Bilden von stabilen Fusionshybriden, die Landwirtschaftschemikalien herstellen und in endosymbiotische Beziehungen mit zweikeimblättrigen Wirtspflanzen treten können. Agrobacterium tumefaciens besitzt eine genau bekannte Wechselwirkung mit der Pflanze während der Anfangsphasen der Infektion, indem es an Pflanzenzellgewebe bindet. Die Fähigkeit von Agrobacterium tumefaciens an Pflanzenzellgewebe in vitro zu binden, ist aufgezeigt worden, und davon ist gezeigt worden, daß sie mit dem Wirtsbereich zur Tumorbildung durch Agrobacterium tumefaciens in vivo einhergeht. Siehe A.G. Matthysse, et al., "Plant Cell Range for Attachment of Agrobacterium tumefaciens to Tissue Culture Cells", Physiological Plant Pathology, Band 21: Seiten 381-387 (1982); A.G. Matthysse, et al., "Binding of Agrobacterium tumefaciens to Carrot Protoplasts", Physiological Plant Pathology, Band 20: Seiten 27-33 (1982).
Agrobacterium tumefaciens ist das bevorzugte infizierende Bakterium zum Verwenden bei der Durchführung der Erfindung mit Nachtschattengewächsen, wie Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Auberginen und Pfeffer; Kreuzblütlern, wie Blumenkohl, Broccoli, Kohl, Grünkohl und Kohlrabi; Gemüse, wie Karotten und Petersilie und anderen landwirtschaftlich kultivierten Pflanzen, wie Zuckerrüben, Baumwolle, Obstbäume, Beerenpflanzen und Trauben. Andere gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbare infizierende Bakterien umfassen Erwinia carotovora, Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syringae und Xanthomonas campestris.
Infizierende Bakterien, wie Pseudomonas syringae und Pseudomonas campestris werden als besonders geeignet angesehen, die Erfindung mit einkeimblättrigen Getreidepflanzen, wie Weizen, Gerste, Roggen, Reis und Hafer, wie auch mit Gräsern, wie Krespe, Viehgras, hohes Schwingelgras und Bermudagras, durchzuführen.
Stämme von Erwinia stewartii sind als infizierende Bakterien besonderes bevorzugt bei einkeimblättrigen Pflanzen, wie tropischen Gräsern, wie Zuckerrohr, Mais, Hirse und Sorghum, und niedrigen Getreidearten, wie Reis. Stämme von Pseudomonas syringae und Xanthomonas campestris werden auch als nützlich bei diesen Anwendungen angesehen.
Die oben angegebenen Stämme von Azospirillium werden als nützlich angesehen bei einkeimblättrigen Pflanzen, einschließlich tropischen Gräsern und Gräsern der gemäßigten Breiten, wie Zuckerrohr und Weizen, unter anderen.
Es ist selbstverständlich, daß die Auswahl eines speziellen, pflanzeninfizierenden Bakteriums und eines speziellen, Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums zum Verwenden gemäß der vorliegenden Erfindung im Bereich des Könnens eines Fachmanns liegt durch das Ausführen von routinemäßigen Experimenten angesichts der hierin enthaltenen Lehren und den aus der Offenbarung der vorliegenden Erfindung zu ziehenden logischen Folgerungen. Die Eigenschaften von Bakterien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren entweder als Landwirtschaftschemikalien produzierendes Bakterium oder infizierendes Bakterium als nützlich angesehen werden, können durch routinemäßiges Experimentieren oder durch Bezugnahme auf Standardlehrbücher, wie Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ermittelt werden.
Zum Verwenden in der vorliegenden Erfindung sollten Mutanten des gewünschten infizierenden Bakteriums ausgewählt werden, die zusätzlich zu der Fähigkeit, die in Betracht kommende Wirtspflanze zu infizieren, eine oder mehrere selektierbare Eigenschaften besitzen. Insbesondere sollten Mutanten des infizierenden Bakteriums ausgewählt werden, die Eigenschaften besitzen, die in vitro selektierbar sind. Solche Eigenschaften umfassen Antibiotikaresistenz oder das Bedürfnis nach spezieller Nährstoffergänzung (Auxotrophismus) oder Kombinationen davon, die rasches Absuchen der hybriden Fusionsprodukte in vitro erlauben, um diejenigen zu identifizieren, die genetisches Material von dem mutierten infizierenden Bakterium enthalten.
Antibiotikaresistenz ist die bevorzugte selektierbare Eigenschaft, und es ist besonders bevorzugt, daß die ausgewählte infizierende Bakterienmutante eine Resistenz gegen mindestens zwei Antibiotika aufweist. Zweifache Antibiotikaresistenz oder Redundanz von anderen selektierbaren Eigenschaften stellt sicher, daß das anfängliche Absuchen der Fusionshybride nur solche identifiziert, die genetisches Material von dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium und der ausgewählten infizierenden Bakterienmutante enthalten und verringert die Überlebensmöglichkeiten oder Bildung von mutierten antibiotikaresistenten Stämmen des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums. Zum Beispiel sind bei der Bildung von Landwirtschaftschemikalien produzierenden Hybriden, die fixierten Stickstoff erzeugen und in endosymbiotische Beziehung mit einkeimblättrigen Pflanzen treten können, Stämme von Erwinia stewartii, die Resistenz gegen Streptomycin und Tetracyclin aufweisen, bevorzugt. Bei der Bildung von Hybriden, die fixierten Stickstoff erzeugen und in endosymbiotische Beziehung mit zweikeimblättrigen Pflanzen treten können, sind Stämme von Agrobacterium tumefaciens, die gegen Streptomycin und Kanamycin resistent sind, bevorzugt. Solche Mutantenstämme von pflanzeninfizierenden Bakterien sind von Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen erhältlich, wie der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, oder sie können aus dem Wildtyp durch bekannte Techniken hergestellt werden.
Wo Hybride der Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien anfänglich nicht nach ihrer Fähigkeit, die fragliche Landwirtschaftschemikalie herzustellen, abgesucht werden, kann das in dem Fusionsschritt verwendete Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium eine Mutante sein mit einer oder mehreren zusätzlichen selektierbaren Eigenschaften, vorzugsweise in vitro selektierbare Eigenschaften, wie die oben hinsichtlich des infizierenden Bakterium erwähnten. Somit kann beispielsweise für den Fall, daß die Landwirtschaftschemikalie von Interesse ein Insektizid oder Nematozid ist, das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium eine Mutante sein, die eine selektierbare Antibiotikaresistenz oder -sensitivität oder einen selektierbaren Bedarf für spezielle Nährstoffergänzung besitzt. Es ist offensichtlich, daß diese Eigenschaften nicht identisch sein sollten mit den selektierbaren Eigenschaften des infizierenden Bakteriums, da anderenfalls das anfängliche Absuchen nicht-hybride Organismen nicht eliminieren könnte. Während die Anwesenheit von solchen zusätzlichen selektierbaren Eigenschaften der Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien in den Hybriden nicht die Anwesenheit der Landwirtschaftschemikalien produzierenden Fähigkeit in den Produkten des anfänglichen Absuchverfahrens garantiert, reichern sie die Population mit wahren Hybridorganismen ausreichend bis zu dem Punkt an, wo eine vernünftige Aussicht auf Erfolg darin besteht, diejenigen Hybridorganismen in einem anschließenden Absuchen zu identifizieren, die die Landwirtschaftschemikalie produzierende Fähigkeit besitzen.
Die erfindungsgemäßen Fusionshybride werden durch Protoplast- oder Spheroplastfusionstechniken gebildet, die den üblicherweise in dem Stand der Technik verwendeten Techniken folgen. Bekannte Protoplast- und Spheroplastfusionstechniken sind beschrieben in D.A. Hopwood, "Genetic Studies With Bacterial Protoplasts", Ann. Rev. Microbio., Band 35: Seiten 237-72 (1981), und in R.L. Weiss, "J. Bacteriol., Band 128, Seiten 668-70 (1976).
Auswahl einer Technik gemäß derer die erfindungsgemäßen Hybride erzeugt werden können, liegt im allgemeinen im Bereich des fachmännischen Könnens, basierend auf der oben angegebenen wissenschaftlichen Literatur und der durch das Studium der im folgenden ausgeführten Protoplastfusionsbeispiele gewonnenen Einsichten.
Allgemein umfaßt das Fusionsverfahren das Entfernen der Zellwand von den Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien und den infizierenden Bakterien, Fusion der infizierenden Bakterien- und Landwirtschemikalien produzierenden Bakterienzellen in einem fusionsinduzierenden Medium, wie Polyethylenglykol, und Regeneration der Zellwand der Fusionshybride, die genetisches Material von dem infizierenden Bakterium und dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium enthalten. Fusion und Regeneration der Zellwand werden bei niedrigen Temperaturen durchgeführt, so daß das Ausmaß an exprimierbarer genetischer Rekombination begünstigt ist im Vergleich zum Ausmaß von enzymatischer Zerstörung von genetischem Material in den neu gebildeten Hybriden.
Die auf die anfängliche Bildung von Fusionshybriden folgende genetische Ausstattung der bakteriellen Population ist für einen Zeitraum von 2 bis 3 Tagen relativ unstabil, während der offensichtlich umfangreiche genetische Rekombination erfolgt. Während dieser Zeitspanne werden solche stabilen Fusionshybride selektiert, die sowohl die eine oder mehrere selektierbare Eigenschaften, die mit dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium assoziiert sind, wie auch die eine oder mehrere selektierbaren Eigenschaften, die mit dem infizierenden Bakterium assoziiert sind, manifestieren können. Es ist besonders bevorzugt, daß die Landwirtschaftschemikalien produzierende Eigenschaft auch in diesem Schritt selektiert wird. Zum Beispiel werden Fusionsprodukte von Azotobacter vinelandii und Erwinia stewartii, die aus Stämmen von Erwinia stewartii gebildet wurden, die streptomycin- und tetracyclinresistent sind, in stickstofffreiem Medium kultiviert, das Streptomycin und Tetracyclin enthält. Somit werden nur solche Organismen, die die zwei- bis dreitägige Inkubationsperiode überleben, die genetisches Material enthalten, das mit der Stickstoffixierung von Azotobacter vinelandii assoziiert ist, und die genetisches Material, das mit Streptomycin- und Tetracyclinresistenz von Erwinia stewartii assoziiert ist, enthalten.
Die überlebenden Fusionshybride, die die mit dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium assoziierten selektierbaren Eigenschaften und die mit dem infizierenden Bakterium assoziierten selektierbaren Eigenschaften manifestieren, können dann nach ihrer Fähigkeit abgesucht werden, mit Pflanzengewebe auf die gleiche Weise wechselzuwirken, auf die das infizierende Bakterium mit Pflanzengewebe während der Anfangsphase der Infektion in der Wirtspflanze wechselwirkt. Wie oben bemerkt, ist die mit Agrobacterium tumefaciens assoziierte Anfangsphase der Infektion das Binden an Pflanzengewebszellen. Die Fähigkeit der Hybride, an Pflanzengewebszellen zu binden, kann in vitro ermittelt werden durch Techniken, wie bisher in der oben zitierten Literatur beschrieben, oder durch Techniken, wie in den folgenden Beispielen beschrieben.
Andere infizierende Bakterien, wie Erwinia stewartii, wechselwirken anfänglich folgend auf Infektion mit Pflanzengewebe durch Ausbreiten über das Gefäßsystem der Pflanze, ohne durch das krankheitsabwehrende System der Pflanze erkannt und zerstört zu werden. In der Literatur wird angenommen, daß diese Eigenschaft auf einem von dem infizierenden Bakterium erzeugten extrazellulären Polysaccarid beruht, das es ihm erlaubt, sich der normalen Abwehrreaktion der Pflanze zu entziehen. Die Fähigkeit der Fusionshybride, sich auf diese Weise über das Gefäßsystem der Pflanze auszubreiten, kann auf jede beliebige Weise ermittelt werden. Eine bevorzugte Absuchtechnik umfaßt die Infektion von Sämlingen der Wirtspflanze an einer speziellen Stelle der Pflanze. Nach einer Zeitspanne, z. B. von 4 Tagen, kann die Pflanze dann in eine Vielzahl von transversalen Abschnitten entlang der longitudinalen Achse der Pflanze zerlegt werden. Bakterielle Kulturen können aus den in jedem Abschnitt enthaltenen Bakterien regeneriert werden. Die Bakterien enthaltenden Abschnitte, die am weitesten von der Stelle der anfänglichen Infektion entfernt sind, werden solche Fusionshybride enthalten, die sich am besten über das Gefäßsystem der Pflanze ausbreiten können, wodurch die Selektion auf Hybride mit dieser Fähigkeit ermöglicht wird.
Es ist selbstverständlich, daß andere Techniken zum Absuchen nach dieser anfänglichen Wechselwirkung mit Pflanzengewebe von dem Fachmann angesichts der hierin enthaltenen Lehren in Betracht gezogen werden können. Weiterhin ist es selbstverständlich, daß andere Mechanismen der anfänglichen Wechselwirkung zwischen speziellen infizierenden Bakterien und speziellen Wirtspflanzen quantifiziert und auf solche Weise abgesucht werden können, die für den Fachmann anhand der hierin enthaltenen Lehren und bekannten Wechselwirkungen zwischen infizierenden Bakterien und ihren Wirtspflanzen offensichtlich sind.
Die Fähigkeit, sich über das Gefäßsystem der Pflanze auszubreiten, ist eine wünschenswerte Eigenschaft, selbst für Fusionshybride, die aus infizierenden Bakterien hergestellt wurden, deren anfängliche Wechselwirkung mit Pflanzenzellgewebe nach einem anderen Mechanismus, z. B. Bindung an die Zelle, erfolgt. Demzufolge ist es bevorzugt, die Fusionshybride weiter abzusuchen, von denen gefunden wurde, daß sie die Fähigkeit besitzen, eine Landwirtschaftschemikalie herzustellen, und die Fähigkeit besitzen, mit Pflanzenzellgewebe auf die gleiche Weise wechselzuwirken, in der das infizierende Bakterium mit der Wirtspflanze während der Anfangsphasen der Infektion wechselwirkt, um eine Untergruppe von Hybriden zum weiteren Absuchen gemäß der vorliegenden Erfindung auszuwählen, die auch fähig ist, sich rasch über das Gefäßsystem der Pflanze auszubreiten.
Weiterhin ist es beim Durchführen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, daß die aufgefundenen Fusionshybride, die die Fähigkeit zum Herstellen von Landwirtschaftschemikalien und die Fähigkeit besitzen, auf die gleiche Weise mit Pflanzenzellgewebe wechselzuwirken, wie das infizierende Bakterium mit Pflanzenzellgewebe während der Anfangsphasen der Infektion wechselwirkt, nach diesen Fähigkeiten zwei- oder mehrfach abgesucht werden. Solch wiederholtes Absuchen neigt dazu, Stabilität des Fusionshybridstammes sicherzustellen, und erlaubt auch Selektion einer handbaren Anzahl von Fusionshybriden zum weiteren Absuchen, die die besten Fähigkeiten in diesen zwei Bereichen aufweisen.
Die stabilen Fusionshybride, die die selektierbaren Eigenschaften des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums und die Fähigkeiten zur Wechselwirkung mit Pflanzengewebe manifestieren, wie oben beschrieben, können dann als Einzelkolonien kultiviert werden, in dem Fall von dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium, das Stickstoff fixiert, vorzugsweise auf stickstofffreiem Medium. Jede der erhaltenen Kulturen kann dann auf eine geeignete Weise, z. B. durch Injektion in Sämlinge der in Frage kommenden Wirtspflanze, angewendet werden. Nach einer angemessenen Inkubationsdauer, z. B. zwei oder drei Wochen, können solche Fusionshybride, die keine sichtbaren Manifestationen einer Krankheit in den Sämlingen der Wirtspflanze erzeugen, zu weiterem Absuchen ausgewählt werden. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Absuchen von 25 bis 30 der besten Fusionshybride normalerweise ausreicht, um fünf bis sieben Fusionshybride bereitzustellen, die keine sichtbaren Krankheitssymptome manifestieren, wie diejenigen, die mit dem ursprünglichen infizierenden Bakterium in der in Frage kommenden Wirtspflanze assoziiert sind.
Vorzugsweise werden solche stabilen Fusionshybride zum weiteren Absuchen ausgewählt, die den größten Bereich der Ausbreitung über das Gefäßsystem der Pflanze aufweisen, am deutlichsten frei sind von Krankheitssymptomen in der Wirtspflanze, und in dem Fall von Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien, die Stickstoff fixieren, diejenigen, die das stärkste Wachstum in stickstofffreiem Medium ergeben.
Falls nicht in dem anfänglichen Absuchen von Hybridorganismen durchgeführt, müssen die Hybridorganismen früher oder später direkt nach der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie von Interesse zu produzieren, abgesucht werden. Vorzugsweise sollte das Absuchen zu dem frühest möglichen praktikablen Punkt in dem Verfahren durchgeführt werden, was durch die Anzahl von Hybridorganismen, die bei einer bestimmten Phase des Verfahrens überleben, und der Wirksamkeit der Technik diktiert wird, die verwendet wird zum Absuchen nach Erzeugung der Landwirtschaftschemikalie von Interesse, um Landwirtschaftschemikalien produzierende Hybride in einem gemischten Inokulat zu identifizieren.
Im allgemeinen werden diese Absuchverfahren in eine von vier Kategorien fallen. Dies sind (1) Absuchen nach Überlebenden, wo die herzustellende Landwirtschaftschemikalie wesentlich ist zum Überleben des Hybrids und nicht durch die Kulturmedien bereitgestellt wird; (2) analytisch-chemisches Absuchen nach der Anwesenheit der herzustellenden Landwirtschaftschemikalie; (3) biologisches Absuchen nach den Manifestationen von biologischer Aktivität, die mit der herzustellenden Landwirtschaftschemikalie oder -chemikalien assoziiert ist; und (4) immunologische Absuchverfahren, wobei Organismen oder Gruppen von Organismen, die eine spezielle Landwirtschaftschemikalie erzeugen, durch Wechselwirkung mit einem Antikörper identifiziert werden, der für die fragliche Chemikalie spezifisch ist. Die Eignung einer speziellen Absuchtechnik oder Kombination von Techniken wird durch die fragliche Landwirtschaftschemikalie diktiert. Somit sind Absuchen nach Überlebenden besonders nützlich zum Identifizieren von Hybridbakterien, die ihren eigenen fixierten Stickstoff erzeugen können, durch Überleben auf Stickstoffmangelmedien. Biologisches Absuchen ist besonders nützlich zum Identifizieren von Hybridbakterien, die antibakterielle oder Antipilzmittel herstellen können. Eine besonders bevorzugte Absuchtechnik dieser Art umfaßt Überschichten einer Mischkultur von Hybriden mit einer Kultur von Organismen, die gegenüber den von den Hybridbakterien hergestellten Antibiotika sensitiv sind, und Identifizieren und Entfernen von Hybriden oder Hybridgruppen, die das Antibiotikum herstellen, von denjenigen Bereichen, wo der sensitive Organismus nicht wachsen kann, zum weiteren Absuchen. Immunologische Absuchtechniken sind besonders geeignet, wo die Landwirtschaftschemikalie von Interesse ein großes Molekül, wie ein Polypeptid ist. Auf jeden Fall kann biologisches Absuchen nach bekannten Wirkungen der fraglichen Landwirtschaftschemikalie durchgeführt werden unter Verwendung einzelner Kulturen der Hybridorganismen, sobald die Anzahl solcher Kulturen auf eine handhabbare Menge, z. B. 10² bis 10³ Kulturen, durch vorheriges Absuchen nach anderen selektierbaren Eigenschaften, die mit dem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium assoziiert sind, reduziert worden ist. Somit konnten z. B. Hybride, die insektizide Verbindungen herstellen, identifiziert werden durch die Unfähigkeit von sensitiven Insekten, auf einer Kultur des Hybrids zu überleben. Ein solches Absuchen hat den Nachteil, daß es das Absuchen einer größeren Anzahl von Kolonien und eine längere Zeitspanne verlangt, um Ergebnisse zu manifestieren, aber es ist trotzdem in der Lage, Hybride mit der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie von Interesse herzustellen, zu identifizieren.
Es ist selbstverständlich, daß das Absuchen nach einer speziellen Landwirtschaftschemikalien produzierenden Eigenschaft zum Verwenden gemäß der vorliegenden Erfindung in dem fachmännischen Können eines Durchschnittsfachmanns liegt durch das Ausführen von routinemäßigem Experimentieren angesichts der hierin enthaltenen Lehren und den aus der Offenbarung der vorliegenden Erfindung zu ziehenden logischen Schlußfolgerungen. Die Techniken, die als nützlich zum Absuchen der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie herzustellen, angesehen werden, können durch Bezugnahme auf Standardlehrbücher ermittelt werden.
Um zu bestimmen, welche der endgültigen Gruppe an Fusionshybriden in der Lage ist, in endosymbiotische Beziehungen mit der Wirtspflanze zu treten, wodurch die von dem Hybrid hergestellten Landwirtschaftschemikalien von der Pflanze als Ergänzung zu auf andere Weise erhältliche Landwirtschaftschemikalien verwendet werden können, ist es normalerweise notwendig, ein vorläufiges Absuchen nach erzielter Ausbeute oder ähnliches durchzuführen. Beispielsweise wird dies für stickstoffixierende Bakterien erzielt durch Kultivieren der Wirtspflanze in einer Umgebung, der die Landwirtschaftschemikalie, z. B. fixierter Stickstoff, fehlt, und Vergleichen der Trockengewichte nach einer angemessenen Kultivierungsperiode, z. B. sechs Wochen, mit dem Trockengewicht von ähnlichen Pflanzen in ähnlicher Umgebung, die jedoch mit den durch die vorgenannte Methode selektierten Fusionshybridbakterien infiziert, z. B. durch Injektion, worden waren. In dem Fall von Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien, die Stickstoff fixieren, hat die Erfahrung gezeigt, daß das Testen von fünf bis sieben der besten Fusionshybride zur Identifizierung von drei bis vier stabilen Fusionshybriden führt, die in der Lage sind, statistisch signifikante Ausbeutegewinne der Wirtspflanze zu erzeugen, die in stickstofffreiem Boden wächst, aufgrund, so wird angenommen, der Fähigkeit der stabilen Fusionshybride, atmosphärischen Stickstoff aerob zu fixieren und in endosymbiotische Beziehungen mit der Wirtspflanze zu treten.
Es ist beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens wünschenswert, obwohl nicht notwendig, daß das verwendete infizierende Bakterium und das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium dieselbe Antwort auf Gramfärbung zeigen. Weiterhin kommt es in Betracht, daß das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium weiter modifiziert wird durch natürliche oder künstliche genetische Techniken, um seine Leistungsfähigkeit als Quelle von Landwirtschaftschemikalien für Wirtspflanzen zu verbessern. Insbesondere können die Bakterien modifiziert werden, um ihre Widerstandskraft gegen niedrige Temperaturen zu verringern, wodurch unbeabsichtigtes Wachstum der Hybridbakterien von Jahr zu Jahr verhindert wird. Ähnlich können die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten endosymbiotischen Hybridbakterien modifiziert werden, um deren Stabilität gegenüber Trockenheit oder anderem physiologischen Streß zu steigern. In dieser Hinsicht ist die Stabilität des Hybrids unter Streßbedingungen und die Fähigkeit, die Wahrscheinlichkeit von spontaner oder erzwungener Reversion zu einem pathogenen Zustand zu minimieren, für ein kommerzielles mikrobiologisches Produkt wünschenswert. Idealerweise sollten die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Bakterien derart modifiziert sein, daß sie nicht außerhalb der Wirtspflanze wachsen können, wie durch die Selektion von Mutanten, die einer Nährstoffergänzung bedürfen, die spezifisch oder nahezu spezifisch durch die fragliche Wirtspflanze bereitgestellt wird. Techniken zur genetischen Manipulation und Mutantenselektion von z. B. Stämmen von Azotobacter sind in dem Stand der Technik bekannt und werden als geeignet angesehen, die oben beschriebenen und ähnliche genetische Manipulationen der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten stabilen Fusionshybride zu bewirken.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Fusionshybridbakterien mit der Fähigkeit, Landwirtschaftschemikalien herzustellen und in eine endosymbiotische Beziehung mit einer Wirtspflanze zu treten, können verwendet werden, um auf verschiedenen Wegen landwirtschaftliche Produkte herzustellen. Zum Beispiel können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Bakterien in Sämlinge injiziert oder verwendet werden, um beschichtete Samen der betroffenen Wirtspflanze, durch Assoziation der Bakterien mit einem biologisch abbaubaren Nährstoffträgermaterial, das auf den Samen aufgebracht wird, herzustellen. Ähnlich können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Bakterien verwendet werden, um infizierte Samenprodukte durch direktes Anwenden der Bakterien auf die Samen der Wirtspflanzen herzustellen. Alternativ kann eine landwirtschaftliche Bodenbeize hergestellt werden durch Mischen von gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Bakterien mit Wasser oder anderen geeigneten Beizmittelbestandteilen zum Anwenden auf Blätter, Stiel und Wurzeln von wachsenden Wirtspflanzen und umgebendem Boden durch Besprühen oder Ahnliches.
Es ist selbstverständlich, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezielles Problem oder spezielle Umgebung innerhalb des fachmännischen Könnens liegt angesichts der hierin enthaltenen Lehren. Beispiele für Verfahren aus dem Bereich der vorliegenden Erfindung und der daraus resultierenden bakteriellen Produkte erscheinen in den folgenden Beispielen.

Beispiel 1

Herstellen des Fusionshybridbakteriums aus Azotobacter vinelandii und Erwinia stewartii, das atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren und in eine endosymbiotische Beziehung mit Mais treten kann.
Ungefähr 10&sup8; Bakterien der Art Azotobacter vinelandii, von der bekannt ist, daß sie Stickstoff aerob fixieren kann, wurden ausgewählt. Ungefähr 108 Bakterien eines Stammes von Erwinia stewartii-Mutanten, von dem bekannt ist, daß er gegen Streptomycin und Tetracyclin resistent ist, wurden auch ausgewählt. Fusionshybride aus diesen zwei Arten von Bakterien wurden nach einer Variante des Verfahrens von Weiss, auf das oben Bezug genommen wurde, hergestellt.
Die in der mittleren logarithmischen Phase wachsenden Bakterien wurden mit Lysozym bei einer Konzentration von 100 ug/ml und mit DNA-ase bei einer Konzentration von 5 ug/ml in Medien mit EDTA bei einer Konzentration von 1 mM und Magnesiumchlorid in einer Konzentration von 5 mM mit einem pH von 7 und mit 12 % zugesetzter Sucrose behandelt. Nach 10 Minuten wurden Protoplasten und Spheroplasten der ursprünglichen Bakterien erzeugt. Die Temperatur wurde dann auf 0ºC erniedrigt, und die Protoplasten-bildende Lösung wurde ausgewaschen. Die erhaltenen Protoplasten wurden in eine 12 % Sucroselösung bei 0ºC eingebracht. Die Lösung wurde dann ergänzt auf 40 % Polyethylenglykol mit Molekulargewicht von ungefähr 6000, um Protoplasten- und Spheroplastenfusion für einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten zu induzieren. Die fusionierten Bakterien wurden in einer Zentrifuge abzentrifugiert und in 12 % Sucrose plus einem kompletten Kulturmedium für 4 Stunden bei 0ºC resuspendiert. Die Temperatur wurde dann auf 30ºC gesteigert und wurde dort für 2 Stunden gehalten, wonach die hybriden Fusionsprodukte in vollständiges Kulturmedium, das keine zusätzliche Sucrose enthielt, für 2 Stunden übertragen wurden.
Das anfängliche Selektionsverfahren wurde dann bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 30ºC durchgeführt. Die hybriden Fusionsprodukte wurden auf Burke's stickstofffreies Medium übertragen und kultiviert, wie beschrieben in Carlson, et al., "Forced Association Between Higher Plant and Bacterial Cells in Vitro", Nature, Band 22, Nr. 5482, Seiten 393-395 (1974). Das Medium war stickstofffrei und enthielt zugesetztes Streptomycin mit einer Konzentration von 100 ug/ml und Tetracyclin mit einer Konzentration von 50 ug/ml. Nur solche Fusionsprodukte, die die Fähigkeit zum aeroben Fixieren von atmosphärischem Stickstoff manifestieren, und die Streptomycin- und Tetracyclinresistenz manifestieren, die mit dem ursprünglich eingeführten Erwinia stewartii-Stamm assoziiert sind, überlebten auf diesem Medium nach einer Wachstumsperiode von ungefähr 3 Tagen.
Proben von gemischten Fusionshybriden aus dieser Kultur wurden verwendet, um Maissämlinge mit einer ungefähren Höhe von 3 bis 4 Fuß zu infizieren durch Injektion zwischen dem ersten und zweiten Knoten des Stielgewebes. Nach 4 Tagen wurden die Maispflanzen in transversale Abschnitte zerlegt, um Bakterien zu gewinnen, die zu dem oberen Ende (top) der Pflanze wanderten, da Erwinia stewartii mit Pflanzengewebe während der Anfangsphase der Infektion wechselwirkt durch Ausbreiten über das Gefäßsystem der Pflanze, ohne durch das krankheitsabwehrende System der Pflanze erkannt oder zerstört zu werden. Diejenige Fusionshybride mit der besten Fähigkeit, sich über das Gefäßsystem der Maispflanze auszubreiten, wurden im allgemeinen zwischen dem fünften und sechsten Knoten gefunden.
Die zwischen dem fünften und sechsten Knoten der Maispflanze gefundenen Fusionshybridbakterien wurden für 3 Tage auf Burke's stickstofffreiem Medium, wie oben durch Carlson et al. beschrieben, kultiviert.
Nach 3 Tagen wurde ein gemischtes Inokulum von dieser stickstofffreien Kultur wiederverwendet, um Maissämlinge mit einer ungefähren Höhe von 3 bis 4 Fuß zu infizieren durch Injektion zwischen dem ersten und zweiten Knoten des Stielgewebes. Nach ungefähr 3 Tagen wurde die Pflanze transversal zerlegt, wie oben beschrieben, um Bakterien zu gewinnen, die zu dem oberen Ende der Pflanze wanderten. Wiederum wurden diejenigen Fusionshybride mit der besten Fähigkeit, sich über das Gefäßsystem der Maispflanze auszubreiten, im allgemeinen zwischen dem fünften und sechsten Knoten gefunden.
Die aus diesem Abschnitt der Maispflanze gewonnenen Fusionshybridbakterien wurden dann als getrennte Kolonien auf Burke's stickstofffreiem Medium kultiviert. 25 der kräftigsten Kolonien wurden ausgewählt, und jede wurde verwendet, um eine von 25 Maispflanzen durch Injektion zu infizieren. Nach 3 Wochen wurden die Kolonien, die nicht zu einer sichtbaren Manifestation von Krankheit in den infizierten Maispflanzen führten, ausgewählt. Von diesen wurden sieben Kolonien zum vorläufigen Ausbeutetesten ausgewählt, die das kräftigste Wachstum auf stickstofffreien Medien, den weitesten Bereich der Ausbreitung über die Pflanze und das deutlichste Freisein von Krankheitssymptomen manifestieren, und diese wurden als Fusion Nr. 1 bis Fusion Nr. 7 gekennzeichnet.
In den vorläufigen Tests auf Ausbeute wurden auf Flächen (30 cm · 46 cm) mit 15 cm gewaschenem, sterilem Sand über 10 cm Perlite 24 Maissamen mit einem gleichen Abstand ausgesät. Die Flächen wurden in dem Gewächshaus gehalten (bei ungefähr 22-27ºC) und wurden zweimal täglich mit entionisiertem Wasser gewässert. Beginnend am zehnten Tag (um den Samenstickstoff zu erschöpfen) wurden die Sämlinge dreimal pro Woche mit einer Nährlösung gewässert. Ein Liter Lösung wurde verabreicht und durchlaufen gelassen. Die Lösung war ein modifizierter Long Ashton-Mix, der Nitrationen mit einer Konzentration von 6 uM als einziger Stickstoffquelle enthielt.
Der Long-Ashton-Mix wurde auch modifiziert, so daß er Nitrationen mit Konzentrationen von 6 mM und 0 enthielt und wurde in Vergleichsversuchen A bzw. C unten verwendet. Die Experimente wurden sechs Wochen lang durchgeführt, wobei nach dieser Zeit die Luftanteile der Pflanzen geerntet und für eine Woche bei 95ºC getrocknet wurden. Die Trockengewichtsdaten wurden dann gesammelt. Bei Flächen mit infizierten Pflanzen wurden die Bakterienstämme am zehnten Tag (zur gleichen Zeit, als die Düngung begonnen wurde) durch Injektion eingeführt. Jede Analyse wurde dreifach durchgeführt (drei Flächen mit 24 Pflanzen pro Behandlung), und die Daten wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Sieben verschiedene bakterielle Fusionen zwischen Erwinia stewartii und Azotobacter vinelandii wurden durch mehrfaches Absuchen ausgewählt (Fusionen Nr. 1 bis 7), wie oben beschrieben, und in dieser Arbeit verwendet. Daten über die tatsächliche Trockengewichtsausbeute pro Fläche (Durchschnitt der drei Flächen) lauten wie folgt: Inokulation NO&sub3;-Spiegel Durchschnittl. Trockengewicht pro Fläche Prozentuale Zunahme gegenüber der Kontrolle Keine Fusion Nr.
Ergebnisse mit Fusions-Nr. 1,3,5 und 7 sind statistisch signifikant.
Nicht-inokuliertes Vergleichsbeispiel A enthält den optimalen Nitratspiegel in Long Ashton-Nährlösung und zeigt Ergebnisse an, die zu erwarten sind mit Mais, der in gut Stickstoff-gedüngtem Boden wächst. Vergleichsbeispiel C, dem kein Nitrat zugesetzt wurde, zeigt die Ausbeuten, die erwartet werden können lediglich basierend auf in dem Samen des Mais enthaltenem Restnitrat. Vergleichsbeispiel B, das den Kontrollwert darstellt, mit Stickstoffspiegeln von ungefähr 6 uM, zeigt ein Wachstum an, das erwartet werden kann in schlecht Stickstoff-gedüngtem Boden. Die mit Fusionsprodukt Nr. 6 assoziierte Verringerung der Trockengewichts beruht offensichtlich auf nicht-sichtbaren pathogenen Effekten, obwohl keine der Pflanzen sichtbare Krankheitssymptome manifestierte. Die Ergebnisse des Fusionsprodukts Nr. 4 sind statistisch nicht signifikant. Die Ergebnisse der Fusionsprodukte 1,3,5 und 7 zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage war, mindestens vier stabile Fusionshybridprodukte bereitzustellen, die atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren können und in endosymbiotische Beziehungen mit Mais treten können, wodurch Mais, der unter Stickstoffstreßbedingungen kultiviert wurde, in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Fusionsprodukten Ausbeuten von 29 bis 108 % größer als eine Kontrolle lieferte, die keine erfindungsgemäßen Bakterien enthielt.

Beispiel 2

Herstellung eines Fusionshybridbakteriums aus Azotobacter vinelandii und Agrobacterium tumefaciens, das atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren und in eine endosymbiotische Beziehung mit Zuckerrüben treten kann.
Ungefähr 10&sup8; Bakterien der Art Azotobacter vinelandii wurden ausgewählt. Ungefähr 10&sup8; Bakterien eines Stammes von Agrobacterium tumafaciens-Mutanten, die resistent gegen Streptomycin und Kanamycin sind, wurden ausgewählt. Protoplastenfusion zwischen diesen Bakterien wurde wie in Beispiel 1 bewirkt. Die fusionierten Protoplasten wurden auf Burke's stickstofffreies Medium übertragen, wie in Beispiel 1 beschrieben, das durch Streptomycin mit einer Konzentration von 100 ug/ml und Kanamycin mit einer Konzentration von 50 ug/ml ergänzt war. Nach drei Tagen überlebten nur solche stabilen Fusionshybride, die atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren konnten und genetisches Material aus den pathogenen Bakterien enthielten, das mit Streptomycin- und Kanamycinresistenz assoziiert ist.
Ein gemischtes Inokulum aus dieser Kultur wurde in eine Suspensionskultur von Karottenpflanzengewebszellen auf die gleiche Weise eingebracht, wie beschrieben in A.G. Matthysse, et al., Physiological Plant Pathology, Band 20, Seiten 27-33 und Band 21, Seiten 381-387 (1982). Nach ungefähr drei Stunden wurden die Karottenzellen und die Fusionshybride, die Karottenzellen auf ähnliche Weise binden können, wie die anfängliche Wechselwirkung von Agrobacterium tumefaciens mit Pflanzengewebszellen während der Anfangsphasen der Infektion, von ungebundenen Bakterien abgetrennt durch dreimaliges Waschen in sterilem, destilliertem Wasser. Die Karottenzellen mit anhaftenden Hybridbakterien wurden zerkleinert und nochmals gewaschen. Die erhaltene Suspension wurde in einer Zentrifuge abzentrifugiert und das erhaltene Pellet, bestehend aus Zellwänden und anhaftenden Hybridbakterien, wurde auf Burke's stickstofffreies Medium für drei Tage gegeben.
Das Zellbindungsverfahren, wie oben beschrieben, wurde wiederholt, und die so ausgewählten Fusionshybride wurden als getrennte Kolonien auf stickstofffreien Medien kultiviert. Nach drei Tagen Wachstum wurden 25 der kräftigsten Kolonien ausgewählt.
Jede Kolonie wurde verwendet, um eine von 25 Zuckerrübensämlingen mit 8 bis 10 Inches Höhe zu infizieren durch Einführen einer Nadel, die in die Kolonie eingetaucht worden war, in den Bereich des Wurzelhalses zwischen der Wurzel und der Pflanze. Diejenigen Hybridkolonien, die keine Galle oder einen Tumor in dem Zuckerrübensämling nach drei Wochen erzeugten, wurden für weiteres Absuchen ausgewählt.
Die Wurzeln einer jeden infizierten Zuckerrübenpflanze, die keine sichtbaren Krankheitssymptome nach drei Wochen manifestierte, wurden dann in eine Anzahl von transversen Abschnitten zerlegt. Der Abstand wurzelabwärts der Pflanze, bis zu dem sich die Hybridbakterien ausgebreitet hatten, wurde notiert. 5 der 25 Fusionshybride wurden für vorläufige Ausbeutetests ausgewählt, basierend auf der Heftigkeit ihres Wachstums auf stickstofffreien Medien, der Abwesenheit von sichtbaren Manifestationen von Krankheit, assoziiert mit ihrer Injektion in die Pflanze, und der Fähigkeit, mit der sie sich über das Pflanzengewebe ausbreiten konnten. Diese 5 Fusionshybride, als Fusion Nr. 1 bis Fusion Nr. 5 bezeichnet, wurden einem vorläufigen Ausbeutetest wie folgt unterzogen.
Flächen (30 cm · 46 cm) mit 15 cm gewaschenem, sterilem Sand über 10 cm Perlite wurden mit 24 gekeimten Zuckerrübensamen im gleichen Abstand bepflanzt. Die Flächen wurden in dem Gewächshaus (bei ungefähr 22- 27ºC) aufbewahrt und zweimal täglich mit entionisiertem Wasser gewässert. Beginnend am zehnten Tag (um den Samenstickstoff zu erschöpfen) wurden die Sämlinge dreimal pro Woche mit einer Nährlösung gewässert. Ein Liter Lösung wurde verabreicht und durchlaufen gelassen. Die Lösung war modifizierte Long Ashton-Mix, der Nitrationen in einer Konzentration von 6 uM als seinen einzigen Stickstoff enthielt. Der Long Ashton-Mix war auch modifiziert, so daß er Nitrationen mit Konzentrationen von 6 mM und 0 enthielt und wurde in den Vergleichsbeispielen A bzw. C unten verwendet.
Experimente wurden über sechs Wochen durchgeführt, wobei nach dieser Zeit die Pflanzen geerntet und für eine Woche bei 95ºC getrocknet wurden. Bei Flächen mit infizierten Pflanzen wurden die Bakterienstämme am zehnten Tag (zu der gleichen Zeit, als die Düngung begonnen wurde) durch Injektion eingeführt. Jede Analyse wurde dreifach durchgeführt (drei Flächen mit 24 Pflanzen pro Behandlung), und die Daten wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Fünf verschiedene bakterielle Fusionen zwischen Agrobacterium tumefaciens und Azotobacter vinelandii wurden durch mehrfaches Absuchen ausgewählt, wie oben beschrieben, und in dieser Arbeit verwendet. Die Daten der tatsächlichen Trockengewichte pro Fläche (Durchschnitt von drei Flächen) lauten wie folgt: Inokulation NO&sub3;-Spiegel Durchschnittl. Trockengewicht pro Fläche Prozentuale Zunahme gegenüber der Kontrolle Keine (Kontrollwert) Fusion Nr.
Ergebnisse mit Fusions-Nr. 2,3,4 und 5 sind statistisch signifikant u
Nicht-inokulierte Vergleichsbeispiele A, B und C besitzen die gleiche Signifikanz, wo nicht-inokulierte Vergleichsbeispiele A, B und C in Beispiel 1 oben. Fusionsprodukt Nr. 3 schien das Ergebnis von nicht-sichtbaren pathogenen Effekten zu sein, obwohl keine sichtbaren Symptome von Krankheit bei einer der Pflanzen beobachtet wurden. Die vorläufigen Ausbeutedaten bestätigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage war, mindestens drei stabile Hybridbakterien (Fusions-Nr. 2, 4 und 5) herzustellen, die atmosphärischen Stickstoff aerob fixieren und in endosymbiotische Beziehung mit Zuckerrüben treten können, wodurch Zuckerrüben, die unter Stickstoffstreßbedingungen wuchsen, vermehrte Ausbeuten von 41 bis 180 % gegenüber denen erzeugten, die mit nicht-inokulierten Zuckerrüben erhalten wurden.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Fusionsprodukte auf Zuckerrüben gegeben wurden, die Stickstoff in der Form von Nitrat mit einer Konzentration von 6 mM - derjenigen, die mit optimaler Stickstoffdüngung assoziiert ist - erhielten. Kein signifikanter Ausbeutegewinn über dem, der mit nicht-inokuliertem Vergleichsbeispiel A erzielt wurde, wurde in den inokulierten Zuckerrüben beobachtet. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die mit den Fusionsprodukten in Beispiel 2 assoziierten Ausbeutegewinne auf einer endosymbiotischen Beziehung zwischen dem Fusionsprodukt und der Pflanze beruhten, wodurch fixierter Stickstoff durch das Fusionsprodukt bereitgestellt und von der Wirtspflanze verwendet wurde. Wären die in Beispiel 2 berichteten Ausbeutegewinne das Ergebnis von durch die Fusionsprodukte bereitgestellten Wachstumsregulatoren oder Hormonen gewesen, hätten ähnliche Gewinne in Beispiel 3 beobachtet werden müssen. Ein weiterer Beleg für eine endosymbiotische Assoziation mit dem Wirt wird durch Lichtmikroskopie unter Verwendung von Gramfärbung und durch erneute Isolierung der Bakterien (mit der Expression des beibehaltenen Antibiotika-Resistenzmarkers) aus infizierten Pflanzen bereitgestellt. Weiterhin können die hybriden Bakterien über die ganze Pflanze verteilt aufgefunden werden. Ihre Lokalisierung ist nicht auf die Stelle der Infektion beschränkt. Die Anzahl von hybriden Bakterien in Pflanzengewebe betrug ungefähr 10&sup5; pro Gramm (Trockengewicht) in einer Maispflanze, die unter niedrig-Nitratbedingungen wuchs.
Es ist selbstverständlich, daß mit geeigneten Änderungen in dem Absuchverfahren Hybride erfindungsgemäß hergestellt werden können, die Stickstoff anaerob fixieren können, wie dies von Rhizobium durchgeführt wird, oder in der Anwesenheit von sehr geringen Mengen an Sauerstoff, wie dies von mikroaerophilen Bakterien durchgeführt wird. Insbesondere muß Sauerstoff in dem stickstofffreien Kulturmedium während des Absuchens nach stickstoffixierender Fähigkeit minimiert oder entfernt sein.
Wenn solche anaeroben, stickstoffixierende Hybride in endosymbiotische Beziehungen mit Wirtspflanzen treten sollen, muß das Hybrid auch genetisches Material, wie solches, das in Arten von Rhizobium enthalten ist, enthalten, das die Wirtspflanze veranlaßt, eine sauerstofffreie oder niedrig-Sauerstoffumgebung zu erzeugen, die normalerweise nicht in Feldfruchtpflanzen aufgefunden wird. Aus diesem Grund ist die Verwendung von aeroben, stickstoffixierenden Bakterien bevorzugt.
Bei einigen der erfindungsgemäßen Fusionsprodukte ist auch beobachtet worden, daß sie Sporen bilden. Selektion von gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten endosymbiotischen Bakterien, die Sporen bilden, erleichtert Anwendung und Überleben der Bakterien, wenn sie an Wirtspflanzen verabreicht werden, da die Sporen im allgemeinen resistenter gegen Streß sind als wachsende Bakterienzellen.
Während die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte primär durch Bezugnahme auf Fusionsprodukte aus Bakterien, die Stickstoff fixieren können, beschrieben worden sind, ist es selbstverständlich, daß mit geeigneten Änderungen in dem Absuchverfahren Hybride erfindungsgemäß hergestellt werden können, die andere Landwirtschaftschemikalien, wie Insektizide, Herbizide, Antipilzmittel, antibakterielle Mittel, antivirale Mittel, Pflanzenwachstumsregulatoren und gelöste Phosphate herstellen können. Weiterhin, während die vorgenannten Beispiele den Einschluß von Genen zum Erzeugen von einer Landwirtschaftschemikalie in dem Hybrid erläutern, wird es als möglich angesehen, daß Gene zur Herstellung von zwei oder mehr verträglichen Produkten in gemäß der vorliegenden Erfindung aufgefundene Hybride eingebracht werden können. Somit würden Fusionen aus gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Hybriden mit anderen Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien, anfängliche Fusion mit Organismen, von denen bekannt ist, daß sie mehr als eine Landwirtschaftschemikalie herstellen, oder anfängliche Fusion, die mit mehr als einem Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterium durchgeführt wird, solche mehrfach produzierenden Organismen erzeugen. Ähnlich kann der Umfang an verwendbaren Wirtspflanzen ausgewählt werden durch Fusionen mit zwei oder mehreren infizierenden Bakterien.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung hybrider Landwirtschaftschemikalien produzierender Bakterien, die in nichtpathogene, endosymbiotische Beziehungen mit einer Wirtspflanze treten können, umfassend:

(A) in beliebiger Reihenfolge:

(1) Identifizieren der Wirtspflanze;

(2) Identifizieren eines infizierenden Bakteriums, das die Wirtspflanze infiziert;

(3) Selektieren von Mutanten des infizierenden Bakteriums mit einer oder mehrerer selektierbaren Eigenschaften zusätzlich zu der Fähigkeit, die Wirtspflanze zu infizieren; und

(4) Selektieren eines Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums mit einer oder mehreren selektierbaren Eigenschaften;

(B) Erzeugen von Fusionshybriden des infizierenden Bakteriums und des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums;

(C) nacheinander Selektieren aus den Produkten des vorher durchgeführten Schritts oder Teilschritts in beliebiger Reihenfolge:

(1) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die mindestens eine der selektierbaren Eigenschaften des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums und mindestens eine der selektierbaren Eigenschaften des infizierenden Bakteriums besitzen;

(2) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die die Fähigkeit manifestieren, mit Pflanzengewebe auf die gleiche Weise wechselzuwirken, wie das infizierende Bakterium mit Pflanzengewebe während der Anfangsphase der Infektion in der Wirtspflanze wechselwirkt;

(3) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die bei der Anwendung auf den Wirt nicht Manifestationen einer Krankheit erzeugen; und

(4) einer bakteriellen Untergruppe, die solche Hybride umfaßt, die die Fähigkeit zum Herstellen der Landwirtschaftschemikalie besitzen, falls nicht zuvor darauf selektiert wurde; und

(D) Selektieren aus den Produkten des zuletzt durchgeführten Schritts der Schritte (C) (1) bis (C) (4) solcher Hybride, die die Leistung der Wirtspflanze verbessern können im Vergleich zu entweder direkter Anwendung der Landwirtschaftschemikalie oder Anwendung des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakteriums auf die Pflanze.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die im Schritt (C) (1) selektierte selektierbare Eigenschaft der Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien die Fähigkeit zum Herstellen der Landwirtschaftschemikalie ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die im Schritt (C) (1) selektierte selektierbare Eigenschaft des Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien eine oder mehrere selektierbare Eigenschaften zusätzlich zu der Fähigkeit, die Landwirtschaftschemikalie herzustellen, sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der weitere Schritt des Modifizierens der endosymbiotischen Landwirtschaftschemikalien produzierenden Bakterien durch natürliche oder künstliche genetische Techniken enthalten ist, um deren Leistungsfähigkeit als Quellen der Landwirtschaftschemikalie für die Wirtspflanze zu erhöhen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Schritte (C) (1) und/oder (C) (2) zwei oder mehrmals ausgeführt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fähigkeit von Schritt (C) (2) die Fähigkeit ist, an Pflanzenzellen zu binden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fähigkeit von Schritt (C) (2) die Fähigkeit ist, sich über das Gefäßsystem der Wirtspflanze auszubreiten.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fähigkeit von Schritt (C) (2) die Fähigkeit ist, in den Wurzeln der Wirtspflanze ohne Erzeugung von Krankheitssymptomen zu leben.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, worin die Produkte von Schritt (C) weiterhin beschränkt werden vor Schritt (D) durch Selektion durch weiteres Absuchen gemäß diesem Verfahren auf solche Hybride, die sich am leichtestens über die Wirtspflanze ausbreiten.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Stickstoff bindendes Bakterium ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Landwirtschaftscheinikalien produzierende Bakterium und das infizierende Bakterium beide gram-negative Bakterien sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritte (C) (1) bis (C) (4) in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritte (C) (1) bis (C) (3) in der aufgeführten Reihenfolge durchgeführt werden und Schritt (C) (4) weggelassen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fusionshybride in Schritt (B) durch Protoplastenfusion erzeugt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fusionshybride in Schritt (B) durch Spheroplastenfusion erzeugt werden.

16. Stabiles Fusionshybridbakterium mit einer Landwirtschaftschemikalien produzierenden Fähigkeit und das ein nicht-pathogener Endosymbiont einer Wirtspflanze ist, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

17. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das infizierende Bakterium einer Gattung angehört, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Agrobakterium Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas oder Azospirillum.

18. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Stickstoff bindendes Bakterium ist.

19. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 18, worin das Stickstoff bindende Bakterium zu der Gattung Azotobacter gehört.

20. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein antibakterielles Agenz zu bilden.

21. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein antivirales Agens zu bilden.

22. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein Insektizid zu bilden.

23. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein Nematozid zu bilden.

24. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein Mitizid zu bilden.

25. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein Herbizid zu bilden.

26. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, ein Fungizid zu bilden.

27. Stabiles Fusionshybridbakterium nach einem der Ansprüche 20, 21, 23, 24, 25 und 26, worin das Bakterium zu der Gattung Streptomyces gehört.

28. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, gebundene Phosphate löslich zu machen.

29. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 22 oder 28, worin das Bakterium zu der Gattung Bacillus gehört.

30. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, einen Pflanzenwachstumsregulator zu bilden.

31. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 30, worin das Bakterium mit der Fähigkeit, einen Pflanzenwachstumsregulator zu bilden, zu der Gattung Pseudomonas gehört.

32. Stabiles Fusionshybridbakterium nach Anspruch 16, worin das Landwirtschaftschemikalien produzierende Bakterium ein Bakterium ist mit der Fähigkeit, Chemikalien zu produzieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aromastoffen und fraßverhindernden Agenzien.

33. Landwirtschaftliches Samenprodukt umfassend Pflanzensamen von Feldfrüchten, ein biologisch abbaubares Nährstoffträgermaterial, beschichtet auf den Samen, und ein stabiles Fusionshybridbakterium wie in Anspruch 16 beansprucht, assoziiert mit dem Trägermaterial.

34. Landwirtschaftliches Produkt umfassend Pflanzensamen von Feldfrüchten, infiziert mit einem stabilen Fusionshybridbakterium wie in Anspruch 16 beansprucht.

35. Landwirtschaftliche Bodenbeizflüssigkeit umfassend eine Mischung aus Wasser und ein stabiles Fusionshybridbakterium wie in Anspruch 16 beansprucht.

36. Landwirtschaftliches Produkt umfassend ein stabiles Hybridbakterium wie in Anspruch 16 beansprucht in einem gartenbauverträglichen Träger, geeignet zur Injektion in die Wirtspflanze.