DE19642729C2 - Polynukleotide und die durch diese kodierten Proteine, geeignet zur Bekämpfung von Blatthornkäfern - Google Patents

Polynukleotide und die durch diese kodierten Proteine, geeignet zur Bekämpfung von Blatthornkäfern

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Description

Die Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide und die durch diese kodierten Proteine, sowie deren Verwendung zur Bekämpfung von Blatthornkäfern (Scarabaeidae). Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Proteine.
Blatthornkäfer wie der Feldmaikäfer (Melolontha melolontha) oder der Waldmaikäfer (Melolontha hippocastani) und insbesondere deren Larven (Engerlinge) können große Schäden in land- und forstwirtschaftlichen Kulturen anrichten. Da ihre Bekämpfung mittels chemischer Insektizide schwierig und für die Umwelt bedenklich ist, werden verstärkt Bemühungen unternommen, die Vermehrung und Ausbreitung dieser Insekten mit biologischen Mitteln zu kontrollieren. So ist beispielsweise in der WO 93115206 ein Verfahren beschrieben, bei dem vegetative Zellen, Sporen oder Proteinkristalle bestimmter Stämme von Bacillus thuringiensis zur Bekämpfung von Blatthornkäfern eingesetzt werden. Die Wirksamkeit dieses Verfahrens ist allerdings nicht befriedigend.
Aus der WO 8705928 ist der Vorschlag bekannt, Sporen von Bacillus popilliae (B. popilliae) zur biologischen Bekämpfung von Scarabaeidenlarven einzusetzen.
B. popilliae ist der Erreger der sogenannten Milky Disease bei Larven von Maikäfern und anderer Blatthornkäfer. Die mit dem Bacillus infizierten Larven weisen in ihrer Hämolymphe hohe Konzentrationen an vegetativen Zellen und Sporangien von B. popilliae auf, die eine milchig weiße Verfärbung des Engerlings bewirken.
B. popilliae als Verursacher der Milky Disease wurde erstmals von Dutky beim Japankäfer (Popillia japonica) in den USA beschrieben (in: Journal of Agricultural Research 61 (1940) S. 57-68, "Two new sporeforming bacteria causing milky disease of the Japanese beetle") und später von Hurpin und Vago sowie von Wille auch in Engerlingen des Feldmaikäfers (Melolontha melolontha) nachgewiesen (B. Hurpin und C. Vago in: Entomophaga 3 (1958) S. 285-330, "Les maladies du hanneton commun (Melolontha melolontha L. (Col., Scarabaeidae)"; H. Wille in: Mitteilungen. Schweizerische Entomologische Gesellschaft 29 (1956) S. 271-282: "Bacillus fribourgensis n. sp., Erreger einer "milky disease" im Engerling von Melolontha melolontha L.").
Das Bakterium B. popilliae ist u. a. dadurch charakterisiert, daß es keine Katalase bildet, die meisten Isolate gegen das Antibiotikum Vancomycin resistent sind und während der Sporulation einen auffälligen Proteinkristall bilden, der innerhalb des spindelförmigen Sporangiums neben der eigentlichen Spore angeordnet ist.
In seiner Eigenschaft als Pathogen für Scarabaeiden weist B. popilliae eine hohe Spezifität auf. Die aus verschiedenen Scarabaeidenarten isolierten B. popilliae Subspecies unterscheiden sich zum Teil erheblich in ihren Wachstumseigenschaften, der Zusammensetzung des Proteinkristalls sowie ihren Plasmiden.
Die Infizierung der Käferlarven mit B. popilliae erfolgt durch perorale Aufnahme der Sporangien. Im Darm der Larven keimen die Sporen aus, und die vegetativen Bakterienzellen dringen durch das Darmepithel und die Basalmembran in die Hämolymphe ein und vermehren sich dort während der folgenden drei bis vier Wochen. Dann sporulieren die B. popilliae -Zellen, was letztendlich zum Tod der Käferlarve führt.
Im Gegensatz zu anderen Bacillus-Arten bildet B. popilliae jedoch unter in vitro Bedingungen überwiegend vegetativen Zellen und nur ausnahmsweise Sporen. Die WO 87 05 928 beschreibt zwar ein Verfahren zur Gewinnung der Sporen in vitro, bei dem die vegetativen Zellen von B. popilliae in einem definierten Medium kultiviert werden und schließlich durch Zugabe eines bestimmten Adjuvans zur Sporulation angeregt werden, aber auch mit dieser Methode wird nur eine Sporulationsrate von etwa 80% erreicht. Um ausreichende Mengen an infektiösem Sporenmaterial für eine biologische Bekämpfung zu gewinnen, ist infolgedessen ein beträchtlicher apparativer, personeller und finanzieller Aufwand erforderlich, der diese Methode wirtschaftlich unrentabel und damit für die Praxis ungeeignet macht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, biologische Mittel zur Bekämpfung von Scara­ baeiden bereitzustellen, die eine befriedigende Kontrolle dieser Schädlinge zulassen, und die technisch einfach und kostengünstig auch in großtechnischen Mengen herstellbar sind.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Polynukleotiden gelöst, die ein Protein codieren, das einem innerhalb des spindelförmigen Sporangiums von Bacillus popilliae natürlicherweise und charakteristischerweise vorkommenden, während der Sporulation gebildeten und neben der Spo­ re angeordneten Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist und zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden, insbesondere Melolontha-Arten und mit diesen nah verwandte Arten, und/oder zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen geeig­ net ist. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide weisen entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz auf, oder eine Teilsequenz hiervon, oder eine durch Substi­ tution, Deletion, Insertion und/oder Inversion hiervon abgeleitete Nukleotidsequenz oder eine ganz oder teilweise hiermit hybridisierende Nukleotidsequenz.
Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß der Proteinkristall aus B. popilliae maß­ geblich für eine Fraßhemmung bei Scarabaeidenlarven verantwortlich ist, und daß dieser Protein­ kristall bei adulten Tieren nach oraler Verabreichung zu deren Tod führt. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Polynukleotide ist es erstmals möglich, diese B. popilliae - Proteinkristal­ le in praktisch unbegrenzten Mengen, d. h. insbesondere auch im großbiotechnischen Umfang zu gewinnen bzw. herzustellen.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide selbst können entweder aus einer natürlichen Quelle gewonnen oder auch synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden.
Sie liegen vorzugsweise als Bestandteil eines rekombinanten DNS-Vektormolekül vor, das die Fähigkeit zur Expression des bzw. eines für Bacillus popilliae charakteristischen Kristallproteins bzw. Proteinkristalls oder eines damit verwandten Proteins in einer prokaryontischen oder eukary­ ontischen Zelle aufweist. Dieses Vektormolekül hat u. a. den Vorteil, daß es in eine beliebige Zelle, beispielsweise einer handelsüblichen, leicht zu kultivierenden Bakterienkultur von E. coli oder Bacillus thuringiensis, eingeschleust, einem in der Zelle bereits vorhandenen oder mit einge­ schleusten Promotor unterworfen und sowohl repliziert als auch zur Expression gebracht werden kann. Als Vektormoleküle sind besonders aus gram-positiven Bakterien stammende Plasmide geeignet.
Zur biotechnologischen Gewinnung der von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden kodierten Kristallproteinen wird der Einsatz von transformierten Wirtszellen vorgeschlagen, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten, das mit einem Promotor gekoppelt ist, der in der Wirtszelle natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthalten ist. Das bzw. die erfindungsgemäße(n) Polynukleotid(e) werden in den Wirtsorganismus, d. h. in einen Mikroorganismus, einen Virus, ein Protozoon, eine Pflanzenzelle o. ä. eingeschleust, z. B. durch Transformation, Transduktion oder Konjugation, in das genetische Material dieser Zellen bzw. Viren integriert und zur Expression gebracht.
Als besonders geeignete Wirtszellen haben sich die vegetativen Zellen von Bacillus thuringiensis, z. B. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki erwiesen. Bacillus thuringiensis ist sehr gut untersucht und es ist in diesem System vergleichsweise einfach, das Kristallprotein von B. popilliae auch in großen Mengen herzustellen.
Das bzw. die erfindungsgemäße(n) Protein(e) kann/können allein oder in Kombination mit wenigstens einer anderen Substanzen als biologisches Insektizid zur Bekämpfung von Scarabaeiden, d. h. zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von adulten und/oder larvalen Scarabaeiden, insbesondere Melolontha-Arten und mit diesen nah verwandte Arten eingesetzt werden. Der Begriff "Substanz" umfaßt hier chemische und biologische Materialien einschließlich Mikroorganismen. Durch die Kombination mit anderen Pathogenen wie Viren, Rickettsien, Bakterien, Pilzen, Microsporidien u. a. kann eine vorteilhafte Steigerung der Kristalltoxin-Wirkung herbeigeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Proteine zusammen mit Sporen von Bacillus popilliae und/oder Bacillus thuringiensis, eingesetzt. Die Sporen von Bacillus sphaericus sind ebenfalls gut geeignet.
Eine andere, ebenfalls sehr vorteilhafte Variante sieht vor, daß die erfindungsgemäßen Proteine in Kombination mit cytolysierenden Proteinen und/oder Rezeptorproteinen für das Darmepithel von Scarabaeiden, vorzugsweise in Form von Fusionsproteinen, eingesetzt werden.
Noch eine andere Variante sieht vor, daß die erfindungsgemäßen Proteine in Kombination mit Pilzsporen eingesetzt werden.
Es besteht auch die Möglichkeit, das bzw. die erfindungsgemäße(n) Protein(e), allein oder in Kombination mit wenigstens einer anderen Substanz, zur Bekämpfung von solchen Bodenorganismen einzusetzen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen. Die Bekämpfung umfaßt die Inaktivierung, insbesondere die Hemmung der Fraßtätigkeit, und/oder die Abtötung der betreffenden Bodenorganismen.
Zur Gewinnung bzw. Erzeugung der erfindungsgemäßen Proteine ist ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide in einen Mikroorganismus (z. B. ein Bakterium, Virus, Pilz oder Protozoon), oder eine Zelle einer tierischen oder pflanzlichen Zellkultur einschleust (transformiert), der Kontrolle und Steuerung eines in diesem Mikroorganismus bzw. dieser Zelle natürlicherweise oder als Folge einer/der Rekombination enthaltenen, vorzugsweise regulierbaren Promotors unterwirft und zur Expression bringt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante dieses Verfahrens wird das (die) Polynukleotid(e) in ein Bakterium der Art Bacillus thuringiensis eingeschleust.
Die Erfindung umfaßt auch die Möglichkeit, erfindungsgemäße Polynukleotide in Pflanzen bzw. Pflanzenteile zu übertragen, um diese gegen Scarabaeidenfraß zu schützen. Das heißt mit anderen Worten: sie umfaßt auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Polynukleotiden zur Erzeugung transgener Pflanzen mit der Eigenschaft, in allen oder einigen Pflanzengeweben ein Kristallprotein zu synthetisieren, das dem für Bacillus popilliae charakteristischen Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, und das zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden, insbesondere Melolontha-Arten und mit diesen nah verwandte Arten, geeignet ist und/oder auch zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen.
Zu diesem Zweck ist ein Verfahren vorgeschlagen zur Erzeugung von Pflanzen oder Pflanzengeweben oder Pflanzenvermehrungsmaterial mit rekombiniertem genetischem Material, das ein erfindungsgemäßes heterologes Polynukleotid umfaßt, dessen Exprimierung zu einem Protein führt, das dem in Bacillus popilliae natürlicher- und charakteristischerweise vorkommenden Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist. Dieses erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß man Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe mit einer rekombinanten DNA transformiert, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthält und zusätzlich regulatorische Nukleotidsequenzen, welche die stabile Integration und die Exprimierung des Polynukleotids in den Pflanzenzellen bewirken können, daß man die Pflanze oder deren Vermehrungsmaterial oder beides dann aus den mit der heterologen DNA transformierten Pflanzenzellen oder dem entsprechenden Gewebe regeneriert, und daß man gegebenenfalls diese regenerierte Pflanze oder ihr Vermehrungsmaterial oder beides biologisch vervielfältigt.
Die mit diesem Verfahren oder auf andere Weise erzeugten, gentechnisch transformierten Zellen mit einer stabil in ihr Genom integrierten (rekombinierten) heterologen DNA, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthält, welches ein Protein kodiert, das dem in Bacillus popilliae natürlicher- und charakteristischerweise vorkommenden Kristallprotein gleich oder ähnlich ist, und wobei dieses Protein unter der Steuerung eines von den Polymerasen der Zellen erkannten, in den Zellen natürlicherweise oder als Folge einer/der Rekombination enthaltenen Promotors exprimiert wird, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
Aus Engerlingen von Melolontha melolontha wird ein Stamm von Bacillus popilliae subsp. melolonthae isoliert. Aus den Bakterienzellen dieses Stammes wird mit den gängigen Verfahren zum einen das Gesamt-DNA-Material präpariert, zum anderen wird das Kristallprotein isoliert, aufgereinigt und seine Aminosäuresequenz (in einem handelsüblichen Protein-Sequenator) bestimmt. Zu Teilsequenzen aus den beiden Endbereichen des Proteins werden korrespondierende Oligonukleotide synthetisiert um in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Primer zur Synthese einer DNA-Sonde für das Kristallprotein-Gen zu dienen. Die PCR wird unter Einsatz der Gesamt-DNA aus Bacillus popilliae subsp. melolonthae durchgeführt.
Alternativ kann man das isolierte Kristallprotein auch zunächst in kurze Fragmente spalten, dann die Aminosäuresequenz einiger dieser Fragmente bestimmen und durch Vergleich mit der im Stand der Technik bekannten Aminosäuresequenz des Cry II A- Proteins aus Bacillus thuringiensis zwei Fragmente auswählen, die mutmaßlich aus den beiden Endbereichen des Proteins stammen. Die zu diesen Fragmenten korrespondierenden DNA-Sequenzen werden dann als Oligonukleotide bereitgestellt und als Primer für die PCR-Synthese eingesetzt.
Das Produkt der PCR wird als Sonde für eine Hybridisierung im Southern Blot eingesetzt. Dabei wird ein 5,3 kB Eco RI Fragment des Bacillus popillae-Genoms identifiziert. Das 5,3 kB Eco RI Fragment wird z. B. in das Plasmid pBCSK+ eingebaut und in dem E. coli Stamm XL 1 Blue MRF' cloniert.
Die Sequenzierung dieses 5,3 kB Eco RI Fragment, z. B. mittels der Kettenabbruch- Methode nach Sanger, unter Verwendung handelsüblicher Sequenasetestsysteme, z. B. eines T7 Sequencing Kits, führt zu dem im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 1 dargestellten Ergebnis.
Beispiel 2: Gentechnologische Herstellung eines erfindungsgemäßen Kristallproteins
Das gemäß Beispiel 1 gewonnene 5,3 kB Eco RI Fragment des Bacillus popilliae- Genoms wird in ein Plasmid für gram-positive Bakterien eingebaut und in Bakterienzellen eines kristallfreien Stammes von Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki eingeschleust. Als Plasmid eignet sich besonders ein als Klonierungsvektor für Bacillus thuringiensis bekanntes Plasmid wie pHT304, pHT315 oder pHT370, deren Herstellung in der Publikation von O. Arantes und D. Lerecius in Gene, 148 (1991), S. 115-119, beschrieben ist. Es wird insoweit Bezug auf diese Publikation genommen und ihr Inhalt hiermit in die vorliegende Beschreibung mit aufgenommen.
Rekombinierte Bakterien werden vermehrt bzw. kloniert und bei Bedarf zur Synthese des Kristallproteins angeregt. Die geschieht durch Induzierung der Sporenbildung, vorzugsweise einfach dadurch, daß die Kulturbedingungen gezielt verändert werden. Dann wird die Proteinfreisetzung induziert, indem beispielsweise durch erneute Veränderung der Kulturbedingungen die Sporenkeimung bzw. Autolyse der Sporangien ausgelöst wird. Das freigesetzte Protein wird aus dem Kulturmedium abgetrennt, gereinigt und gegebenenfalls bis zur Verwendung kühl, trocken und dunkel gelagert.
Beispiel 3: Verwendung des erfindungsgemäßen Kristallproteins zur Bekämpfung von adulten Scarabaeiden der Art Melolontha melolontha.
Adulte Maikäfer (Melolontha melolontha) wurden 10 Tage unter naturgetreuen Bedingungen in Käfigen gehalten. Nach 2 Tagen wurde 20 Tieren eine wäßrigen Suspension des erfindungsgemäßen Proteins verabreicht. Die Futteraufnahme war sofort gehemmt. Bereits nach 4 Tagen waren 12 Tiere (= 60%) tot.
In der Praxis wird das Präparat auf die Nahrungspflanzen der Käfer aufgesprüht.
Beispiel 4: Verwendung des erfindungsgemäßen Kristallproteins zur Bekämpfung von Scarabaeiden-Larven (Engerlingen) der Art Melolontha melolontha.
Engerlinge der Maikäfer (Melolontha melolontha) wurden im Freiland ausgegraben, im Labor einzeln in Zuchtgefäßen gehalten und mit Karottenscheiben gefüttert. Nach 3 Wochen wurde 10 Tieren das erfindungsgemäße Protein in einer wäßrigen Suspension mit oder ohne Sporen verfüttert. Schon ein Tag später war die Futteraufnahme stark vermindert, gehemmt.
In der Praxis wird das Präparat, eventuell in Kombination mit anderen Pathogenen und vorzugsweise zusammen mit Ködern in den Boden eingebracht.

Claims (19)

1. Isoliertes Polynukleotid, das ein Protein codiert, welches einem innerhalb des spindelförmigen Sporangiums von Bacillus popilliae natürlicherweise und charakteristischerweise vorkommenden, während der Sporulation gebildeten und neben der Spore angeordneten Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, und das
  • 1. entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz, wobei SEQ ID NO: 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
  • 2. oder eine Teilsequenz hiervon
  • 3. oder eine durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Inversion hiervon abgeleitete Nukleotidsequenz
  • 4. oder eine ganz oder teilweise hiermit hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist,
  • 5. wobei das von diesen Teilsequenzen, abgeleiteten Nukleotidsequenzen und/oder teilweise hybridisierenden Nukleotidsequenzen codierte Protein zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden, und/oder zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen geeignet ist.
2. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus einer natürlichen Quelle gewonnen oder synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt ist.
3. Rekombinantes DNS-Vektormolekül, das ein Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt, und das die Fähigkeit zur Expression des/eines für Bacillus popilliae charakteristischen Kristallproteins bzw. Proteinkristalls oder eines damit verwandten Proteins bzw. Proteinkristalls in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle aufweist.
4. Rekombinantes DNS-Vektormolekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektormolekül ein in gram-positiven Bakterien vorkommendes Plasmid ist.
5. Transformierte Wirtszelle, die ein Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 enthält, das mit einem in der Wirtszelle natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthaltenen Promotor gekoppelt ist, und die die Fähigkeit zur Expression dieses Polynukleotids und Synthetisierung eines Kristallproteins, das dem in Bacillus popilliae charakteristischerweise vorhandenen Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist.
6. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle Bacillus thuringiensis, vorzugsweise Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ist.
7. Isoliertes Protein, das einem innerhalb des spindelförmigen Sporangiums von Bacillus popilliae natürlicherweise und charakteristischerweise vorkommenden, während der Sporulation gebildeten und neben der Spore angeordneten Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist und zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden, und/oder zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen geeignet ist, und das von einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 kodiert ist, und/oder Teile eines solchen Proteins.
8. Isoliertes Protein, das einem innerhalb des spindelförmigen Sporangiums von Bacillus popilliae natürlicherweise und charakteristrischerweise vorkommenden, während der Sporulation gebildeten und neben der Spore angeordneten Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist und zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden und/oder zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen geeignet ist, und das die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine damit verwandte, durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Inversion davon ableitbare Aminosäuresequenz ganz oder teilweise umfaßt, wobei SEQ ID NO: 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
9. Verwendung von Proteinen nach Anspruch 7 oder 8, allein oder in Kombination mit wenigstens einer anderen Substanz einschließlich Mikroorganismen, zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von adulten und/oder larvalen Scarabaeiden, insbesondere Melolontha-Arten und mit diesen nah verwandte Arten.
10. Verwendung von Proteinen nach Anspruch 7 oder 8, allein oder in Kombination mit wenigstens einer anderen Substanz einschließlich Mikroorganismen, zur Inaktivierung, insbesondere Hemmung der Fraßtätigkeit, und/oder zur Abtötung von Pflanzen und/oder Pilze schädigende und/oder Krankheiten übertragenden Bodenorganismen.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als (eine der) andere(n) Substanz(en) Bakteriensporen, vorzugsweise Sporen von Bacillus popilliae und/oder Bacillus thuringiensis eingesetzt werden.
12. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als (eine der) andere(n) Substanz(en) Pilzsporen eingesetzt werden.
13. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als eine (der) andere Substanz(en) cytolysierende Proteine und/oder Rezeptorproteine für das Darmepithel von Scarabaeiden eingesetzt werden, vorzugsweise in Form von Fusionsproteinen mit Proteinen nach Anspruch 7 oder 8.
14. Verfahren zur Herstellung von Proteinen nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Polynukleotide nach Anspruch 1 in einen Mikroorganismus insbesondere ein Bakterium, Virus, Pilz oder Protozoon, oder eine Zelle einer tierischen oder pflanzlichen Zellkultur einschleust, der Kontrolle und Steuerung eines in dem Mikroorganismus bzw. der Zelle natürlicherweise oder als Folge einer/der Rekombination enthaltenen, vorzugsweise regulierbaren Promotors unterwirft und zur Expression bringt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das (die) Polynukleotid(e) in ein Bakterium der Art Bacillus thuringiensis eingeschleust wird.
16. Verwendung von Polynukleotiden nach Anspruch 1 zur Erzeugung transgener Pflanzen mit der Eigenschaft, in allen oder einigen Pflanzengeweben einen Kristallprotein zu synthetisieren, das dem für Bacillus popilliae charakteristischen Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, und das zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von adulten und/oder larvalen Scarabaeiden, insbesondere Melolontha-Arten und mit diesen nah verwandte Arten geeignet ist.
17. Gentechnisch transformierte Zelle mit einer stabil in ihr Genom integrierten heterologen DNA, die ein Polynukleotid nach Anspruch 1 umfaßt, welches ein Kristallprotein kodiert, das dem in Bacillus popilliae natürlicher- und charakteristischerweise vorkommenden Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, wobei die Exprimierung dieses Proteins unter der Steuerung eines von den Polymerasen der Zelle erkannten, in der Zelle natürlicherweise oder als Folge einer/der Rekombination enthaltenen Promotors erfolgt.
18. Verwendung eines heterologen Polynukleotids nach Anspruch 1 zur Erzeugung von Pflanzen oder Pflanzengeweben oder Pflanzenvermehrungsmaterial mit rekombiniertem, das betreffende Polynukleotid umfassendem genetischem Material,, dessen Exprimierung zu einem Protein führt, das dem in Bacillus popilliae natürlicher- und charakteristischerweise vorkommenden Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen oder Gewebe dieser Pflanzen mit einer rekombinanten DNA transformiert, die ein Polynukleotid nach Anspruch 1 und regulatorische Nukleotidsequenzen enthält, welche die stabile Integration und die Exprimierung des Polynukleotids in der(den) Pflanzenzellen bewirken können, die Pflanze oder deren Vermehrungsmaterial oder beides dann aus der(den) mit der heterologen DNA transformierten Pflanzenzelle(n) oder dem entsprechenden Gewebe regeneriert, und gegebenenfalls diese regenerierte Pflanze oder ihr Vermehrungsmaterial oder beides biologisch vervielfältigt.
19. Transgene Pflanze, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 oder ein rekombinantes DNS-Vektormolekül gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, welches in allen oder einigen Pflanzenzellen ein Kristallprotein zu synthetisieren in der Lage ist, das dem für Bacillus popilliae während der Sporulation gebildeten und neben der Spore angeordneten Kristallprotein gleicht oder ähnlich ist, und das zur Hemmung der Fraßtätigkeit und/oder Abtötung von larvalen und/oder adulten Scarabaeiden geeignet ist und/oder auch zur Inaktivierung und/oder Abtötung von solchen Bodenorganismen, die Pflanzen und/oder Pilze schädigen und/oder Krankheiten übertragen.
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