DE69931511T2

DE69931511T2 - Für 15kda und 45kda pestizid-proteine kodierende pflanzen-optimierte polynukleotide

Info

Publication number: DE69931511T2
Application number: DE69931511T
Authority: DE
Inventors: A. Guy Poway CARDINEAU; J. Steven San Diego STELMAN; E. Kenneth Cardsbad NARVA
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: WO2000024904A1; AR066201A2; US6340593B1; JP4912473B2; DE69931511D1; AU768246B2; CA2703161A1; ATE327333T1; CN1324407A; JP2002528083A; ES2327948T3; JP4647099B2; EP1124967B1; BR9914746A; ES2264283T3; CA2345905A1; KR20010073216A; AR020944A1; CA2703161C; AU1218100A

Description

Hintergrund der Erfindung
Insekten und andere Schädlinge verursachen in der Landwirtschaft jährlich Kosten in Milliardenhöhe durch Ernteverluste und Ausgaben für die Bekämpfung dieser Schädlinge. Die durch Insektenschädlinge verursachten Verluste im Bereich der landwirtschaftlichen Produktion umfassen eine verringerte Ernteausbeute, eine verminderte Erntequalität und erhöhte Erntekosten.
Als wirksames Verfahren zur Schädlingsbekämpfung stehen chemische Pestizide zur Verfügung. Jedoch sind in der Öffentlichkeit Bedenken wegen der Menge an chemischen Rückständen, die möglicherweise in Nahrungsmitteln, im Grundwasser und in der Umwelt festgestellt werden, aufgetreten. Daher werden synthetische chemische Pestizide zunehmend (richtigerweise) auf ihre möglichen toxischen Folgen für die Umwelt hinterfragt. Synthetische chemische Pestizide können den Boden und die darunter liegenden wasserführenden Schichten vergiften, können weggespült werden und somit Oberflächengewässer verschmutzen und können Organismen, auf die sie nicht abzielen, zerstören. Synthetische chemische Bekämpfungsmittel sind ferner mit dem Nachteil behaftet, dass sie ein Sicherheitsrisiko für die Öffentlichkeit darstellen, wenn sie in Bereichen eingesetzt werden, wo Haustiere, landwirtschaftlich genutzte Tiere oder Kinder in Kontakt mit ihnen kommen können. Sie können auch für die Anwender Gesundheitsrisiken darstellen, insbesondere wenn die richtigen Anwendungstechniken nicht eingehalten werden. Weltweit sind Behörden im Begriff, die Anwendung zahlreicher Pestizide und insbesondere von synthetischen chemischen Pestiziden, die in der Umgebung beständig sind und in die Nahrungskette gelangen, einzuschränken und/oder zu verbieten. Zu Beispielen für in breitem Umfang genutzten synthetischen chemischen Pestiziden gehören die Organochlorverbindungen, wie DDT, Mirex, Kepon, Lindan, Aldrin, Chlordan, Aldicarb und Dieldrin; die Organophosphate, z.B. Chlorpyrifos, Parathion, Malathion und Diazinon; und Carbamate. Die Möglichkeit, dass strenge neue Einschränkungen bezüglich der Verwendung von Pestiziden eingeführt und einige wirksame Pestizide vom Markt genommen werden, könnte die wirtschaftlichen und wirkungsvollen Optionen zur Bekämpfung von kostenintensiven Schädlingen einschränken.
Aufgrund der Schwierigkeiten, die mit der Verwendung von synthetischen chemischen Pestiziden verbunden sind, besteht ein klares Bedürfnis zur Einschränkung der Verwendung dieser Mittel sowie die Notwendigkeit, alternative Bekämpfungsmittel aufzufinden. Der Ersatz von synthetischen chemischen Pestiziden oder eine Kombination dieser Mittel mit biologischen Pestiziden könnte die Anteile von toxischen Chemikalien in der Umwelt vermindern.
Ein biologisches pestizides Mittel, das zunehmend an Popularität gewinnt, ist der Bodenmirkoorganismus Bacillus thuringiensis (B.t.). Der Bodenmikroorganismus Bacillus thuringiensis (B.t.) ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium. Die meisten Stämme von B.t. besitzen keine pestizide Aktivität. Einige B.t.-Stämme erzeugen parasporale, kristalline Proteineinschlüsse und können aufgrund dieser Einschlüsse charakterisiert werden. Diese "δ-Endotoxine", die typischerweise eine spezifische pestizide Aktivität aufweisen, unterscheiden sich von Exotoxinen, die einen nichtspezifischen Wirtsbereich besitzen. Diese Einschlüsse treten im Mikroskop häufig als unterscheidungskräftig geformte Kristalle auf. Die Proteine können gegenüber Schädlingen hochgradig toxisch sein und sind in Bezug auf ihre toxische Aktivität spezifisch.
Präparate der Sporen und Kristalle von B. thuringiensis subsp. kurstaki werden seit vielen Jahren als gewerbliche Insektizide für Lepidoptera-Schädlinge verwendet. Beispielsweise erzeugt B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 ein kristallines δ-Endotoxin, das für die Larven einer Anzahl von Lepidoptera-Insekten toxisch ist.
Die Klonierung und Expression eines B.t.-Kristallprotein-Gens in Escherichia coli wurde in der Literatur vor mehr als 15 Jahren beschrieben (H. E. Schnepf, H. R. Whiteley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 2893–2897). Das US-Patent 4 448 885 und das US-Patent 4 467 036 beschreiben beide die Expression von B.t.-Kristallprotein in E. coli. B.t.-Produkte auf der Basis von rekombinanter DNA wurden erzeugt und zur Anwendung zugelassen.
Die gewerbliche Anwendung von B.t.-Pestiziden war ursprünglich auf einen engen Bereich von Lepidoptera-(Raupen)-Schädlingen beschränkt. Neuerdings haben jedoch Forscher B.t.-Pestizide mit spezifischen Wirkungen für einen breiteren Bereich von Schädlingen aufgefunden. Beispielsweise werden weitere Spezies von B.t., nämlich israelensis und morrisoni (a. k. a. tenebrionis, a. k. a. B.t. M-7), gewerblich zur Bekämpfung von Insekten der Ordnungen Diptera bzw. Coleoptera, verwendet (F. H. Gaertner, (1989), "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms" in Controlled Delivery of Crop Protection Agents, Hrsg. R. M. Wilkins, Taylor und Francis, New York und London (1990), S. 245–255).
Nunmehr wurden neue Unterspezies von B.t. identifiziert und es wurden Gene, die für aktive δ-Endotoxin-Proteine verantwortlich sind, isoliert und sequenziert (H. Höfte, H. R. Whiteley, Microbiological Reviews, Bd. 52(2) (1989), S. 242–255). Höfte und Whiteley teilten B.t.-Kristallprotein-Gene in vier Hauptklassen ein. Bei diesen Klassen handelte es sich um cryI (Lepidopteraspezifisch), cryII (Lepidoptera- und Diptera-spezifisch), cryIII (Coleopteraspezifisch) und cryIV (Diptera-spezifisch). Es wurde auch über die Entdeckung von Stämmen, die spezifisch gegenüber anderen Schädlingen sind, berichtet (J. S. Feitelson, J. Payne, L. Kim, Bio/Technology, Bd. 10 (1992), S. 271–275). Beispielsweise wurden die Bezeichnungen CryV und CryVI für neue Gruppen von gegenüber Nematoden aktiven Toxinen vorgeschlagen.
Das aus dem Jahr 1989 stammende Nomenklatur- und Klassifikationsschema von Höfte und Whiteley beruhten sowohl auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz als auch auf dem Wirtsbereich des Toxins. Dieses System wurde so angepasst, dass es 14 verschiedene Typen von Toxin-Genen abdeckte, die in fünf Hauptklassen eingeteilt wurden. Die Anzahl an sequenzierten Bacillus thuringiensis-Kristallprotein-Genen beträgt derzeit mehr als 50. Ein revidiertes Nomenklaturschema wurde vorgeschlagen, das nur auf der Aminosäure-Identität beruht (Crickmore et al., Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, IIIrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universität Cordoba, Cordoba, Spanien (1996), 1.–6. September 1996, Abstract). Die mnemonische Bezeichnung "cry" wurde für alle Toxin-Gene, ausgenommen cytA und cytB, die als getrennte Klasse verbleiben, beibehalten. Römische Ziffern wurden in der primären Beurteilung gegen arabische Ziffern ausgetauscht und die Klammern in der dritten Beurteilungsgruppe wurden entfernt. Viele der ursprünglichen Namen wurden beibehalten, obgleich eine Anzahl davon neu klassifiziert wurde.
Mit dem Einsatz der Gentechnik werden derzeit neue Wege zur Abgabe von B.t.-Toxinen auf landwirtschaftliche Bereiche entwickelt, einschließlich der Verwendung von Pflanzen, die gentechnisch mit B.t.-Toxin-Genen auf Insektenresistenz behandelt worden sind, und der Verwendung von stabilisierten mikrobiellen Zellen als Abgabeträger für B.t.-Toxine (F. H. Gaertner, L. Kim, TIBTECH, Bd. 6 (1988), S4–S7). Somit werden isolierte B.t.-Endotoxin-Gene in zunehmendem Maße gewerblich wertvoll.
Es wurden verschiedene Verbesserungen durch Modifikation von B.t.-Toxinen und/oder ihrer Gene erreicht. Beispielsweise betreffen die US-Patente 5 380 831 und 5 567 862 die Herstellung von synthetischen, insektiziden Kristallprotein-Genen mit verbesserter Expression in Pflanzen.
Zu Hindernissen für eine erfolgreiche Anwendung von B.t.-Toxinen in der Landwirtschaft gehören die Entwicklung einer Resistenz gegenüber B.t.-Toxinen durch Insekten. Ferner können bestimmte Insekten unempfindlich gegenüber den Einflüssen von B.t. werden. Zu den letztgenannten Insekten gehören der Baumwollkapselkäfer ("boll weevil") und und die Ypsiloneule ("black cutworm") sowie ausgewachsene Insekten der meisten Spezies, bei denen bisher keine offensichtliche signifikante Empfindlichkeit gegenüber B.t-δ-Endotoxinen gezeigt wurde.
Somit haben Strategien zur Handhabung der Resistenz in der B.t.-Pflanzentechnik großes Interesse gefunden und es bleibt ein starkes Bedürfnis nach neuen Toxin-Genen bestehen. Beispielsweise beschreiben WO-97/40162 15 kDa- und 45 kDa-Coleopteran-aktive Proteine, die aus den B.t.-Isolaten PS80JJ1 und PS149B1 erhältlich sind.
Aufgrund umfangreicher Forschungen und Investitionen erscheinen ständig Patente auf neue B.t.-Isolate, -Toxine und -Gene sowie auf neue Anwendungen von B.t.-Isolaten; vergl. bezüglich einer Übersicht den vorstehend zitierten Artikel von Feitelson et al. US-5 589 382 beschreibt das B.t.-Isolat PS80JJ1 mit Aktivität gegen Nematoden. US-5 632 987 beschreibt das B.t.-Isolat PS80JJ1 mit Aktivität gegen den Maiswurzelbohrer ("corn rootworm"). Jedoch bleibt das Auffinden neuer B.t.-Isolate und neuer Anwendungen von bekannten B.t.-Isolaten eine empirische Tätigkeit, deren Erfolg nicht vorhersagbar ist.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßes neuartiges Polynucleotid weist die Sequenz von SEQ ID NO: 5 auf. Diese Polynucleotidsequenz gilt für ein Gen mit der Bezeichnung 149B1-15-PO, das für die Expression in Zea mays optimiert ist. Dieses Gen kodiert für ein Protein mit etwa 15 kDa, das aus dem in WO-97/40162 beschriebenen PS149B1 erhältlich ist.
Die neue Polynucleotidsequenz weist im Vergleich zu Wildtypsequenzen bestimmte Modifikationen auf, aufgrund derer sie besonders gut für eine optimierte Expression in Pflanzen geeignet ist. Unter Verwendung dieser Polynucleotidsequenz lässt sich die Transformation von Pflanzen unter Einsatz von dem Fachmann geläufigen Techniken erreichen, um den Pflanzen Resistenz gegenüber Schädlingen zu verleihen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung exprimiert ein rekombinanter, nicht-humaner Wirt ein erfindungsgemäßes Polynucleotid. Ein derartiger Wirt kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um einen Pflanzenschädling zu kontaktieren und dadurch den Schädling zu bekämpfen.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Schädling zusätzlich mit einem zweiten Protein in Kontakt gebracht, das durch SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 kodiert wird.
SEQ ID NO: 4 ist eine Polynucleotidsequenz für ein Gen mit der Bezeichnung 80JJ1-45-PO, das für die Expression in Mais optimiert ist. Dieses Gen kodiert für ein Protein von etwa 45 kDa. Dieses Gen ist in WO-97/40162 beschrieben.
SEQ ID NO: 6 ist eine Polynucleotidsequenz für ein Gen mit der Bezeichnung 149B1-45-PO, das für die Expression in Zea mays optimiert ist. Dieses Gen kodiert für ein Protein von etwa 45 kDa, das aus PS149B1, das ebenfalls in WO-97/40162 beschrieben ist, erhältlich ist.
Für den Fachmann ist es aufgrund der hier dargestellten Sequenzen ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Gen durch verschiedene Mittel erhalten werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen kann das vorliegende Gen beispielsweise synthetisch unter Verwendung eines Gen-Synthesegeräts hergestellt werden. Die hier beispielhaft vorgestellten speziellen Gene lassen sich auch erhalten, indem man entsprechend der Lehre der vorliegenden Erfindung bestimmte Wildtypgene (beispielsweise durch Punktmutationstechniken) aus bestimmten Isolaten, die gemäß den nachstehenden Ausführungen bei einer Hinterlegungsstelle hinterlegt worden sind, modifiziert.
Bestimmte Kulturen, die in der vorliegenden Anmeldung erörtert werden, wurden bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt. Die nachstehend aufgeführten hinterlegten Stämme sind in den Patentveröffentlichungen, die vorstehend im Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" erörtert wurden, beschrieben.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Verfügbarkeit bei einer Hinterlegungsstelle keine Erlaubnis zur Ausführung der vorliegenden Erfindung unter Eingriff in von Regierungsbehörden gewährte Rechte darstellt.
Gene und Toxine. Die vorliegende Erfindung umfasst in bevorzugten Ausführungsformen Polynucleotidsequenzen, die für die Expression in Pflanzen optimiert sind, wobei die Sequenzen aus SEQ ID NO: 5 und gegebenenfalls SEQ ID NO: 6 ausgewählt sind.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können zur Bildung von vollständigen "Genen" verwendet werden, um für Proteine oder Peptide in einer erwünschten Wirtszelle zu kodieren. Beispielsweise sind, wie es für den Fachmann leicht ersichtlich ist, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 ohne Stoppcodons dargestellt. SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 6 können in geeigneter Weise in einem Wirt von Interesse unter die Kontrolle eines Promotors gestellt werden, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Wie es für den Fachmann leicht ersichtlich ist, kann DNA in einer doppelsträngigen Form vorliegen. Bei dieser Anordnung ist ein Strang komplementär zum anderen Strang und umgekehrt. Der "kodierende Strang" wird auf dem einschlägigen Gebiet häufig zur Bezeichnung des Strangs mit einer Reihe von Codons (bei einem Codon handelt es sich um drei Nucleotide, die als Dreiergruppe zur Bildung einer speziellen Aminosäure gelesen werden können) verwendet, der als ein offener Leseraster (ORF) zur Bildung eines Proteins oder Peptids von Interesse gelesen werden kann. Um in vivo ein Protein zu exprimieren, wird typischerweise ein DNA-Strang in einen komplementären RNA-Strang, der als Matrize für das Protein verwendet wird, translatiert. Bei Replikation von DNA (beispielsweise) in einer Pflanze werden zusätzliche, komplementäre DNA-Stränge erzeugt. Somit umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung entweder der beispielhaft aufgeführten Polynucleotide, die in der beigefügten Sequenzliste dargestellt sind, oder von komplementären Strängen. RNA und PNA (Peptid-Nucleinsäuren), die funktionell zu den speziell als Beispiele aufgeführten neuen DNA-Molekülen äquivalent sind, fallen unter die vorliegende Erfindung.
Bestimmte DNA-Sequenzen der Erfindung werden hier in spezifischer Weise beispielhaft dargelegt. Diese Sequenzen stellen Beispiele der vorliegenden Erfindung dar. Es ist leicht ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung nicht nur die Gene und Sequenzen umfasst, die hier speziell als Beispiele aufgeführt werden, sondern auch Äquivalente und Varianten davon (z.B. Mutanten, Fusionsprodukte, chimäre Produkte, geschnittene Produkte, Fragmente und kleinere Gene), die die gleichen oder ähnliche Eigenschaften in Bezug auf eine Expression von Toxinen in Pflanzen aufweisen, und zwar im Vergleich mit den hier speziell beschriebenen Produkten. Die hier verwendeten Ausdrücke "Varianten" und "Äquivalente" beziehen sich auf Sequenzen, die Nucleotid- (oder Aminosäure)-Substitutionen, -Deletionen (intern und/oder terminal), -Additionen oder -Insertionen aufweisen, die die Expression der vorliegenden Gene und die sich daraus ergebende pestizide Aktivität in Pflanzen nicht wesentlich beeinflussen. Fragmente von Polynucleotid-Proteinen, bei denen eine pestizide Aktivität erhalten bleibt, und "pestizide Teile" von Proteinen von voller Länge fallen ebenfalls unter diese Definition.
Gene können modifiziert werden und Variationen von Genen lassen sich leicht konstruieren, wobei man sich üblicher Techniken bedient. Beispielsweise sind Techniken zur Herstellung von Punktmutationen aus dem Stand der Technik bekannt. Ferner können handelsübliche Exonucleasen oder Endonucleasen gemäß üblichen Verfahren verwendet werden und Enzyme, wie Bal31, oder eine positionsgerichtete Mutagenese können dazu herangezogen werden, systematisch Nucleotide von den Enden dieser Gene abzuschneiden. Geeignete Gene lassen sich auch unter Anwendung einer Vielzahl von Restriktionsenzymen erhalten.
Es ist darauf hinzuweisen, dass äquivalente Gene für Toxine kodieren, die eine hochgradige Aminosäure-Identität oder -Homologie mit Toxinen, die durch die vorliegenden Gene kodiert werden, aufweisen. Die Aminosäure-Homologie ist am höchsten in den kritischen Regionen des Toxins, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind oder die an der Festlegung der dreidimensionalen Konfiguration, die letztlich für die biologische Aktivität verantwortlich ist, beteiligt sind. Diesbezüglich sind bestimmte Substitutionen akzeptabel und lassen sich erwarten, wenn diese Substitutionen in Regionen, die für die Aktivität nicht kritisch sind, vorliegen oder bei denen es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen handelt, die die dreidimensionale Konfiguration des Moleküls nicht beeinträchtigen. Beispielsweise lassen sich Aminosäuren in die folgenden Klassen einteilen: nicht-polar, ungeladen polar, basisch und sauer. Konservative Substitutionen, bei denen eine Aminosäure einer Klasse durch eine andere Aminosäure des gleichen Typs ersetzt wird, fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, so lang die Substitution wesentlich die biologische Aktivität der Verbindung nicht verändert. In Tabelle 1 sind Beispiele für Aminosäuren, die zu den einzelnen Klassen gehören, aufgeführt. Tabelle 1
In einigen Fällen lassen sich auch nicht-konservative Substitutionen vornehmen. Der kritische Faktor besteht darin, dass diese Substitutionen nicht in erheblichem Maße von der Fähigkeit von Pflanzen zur Expression der vorliegenden DNA-Sequenzen oder von der biologischen Aktivität des Toxins wegführen.
Die hier verwendeten Ausdrücke "isolierte" Polynucleotide und/oder "gereinigte" Toxine beziehen sich auf diese Moleküle, wenn sie nicht mit den anderen Molekülen, mit denen sie in der Natur auftreten und die bei ihrer Anwendung in Pflanzen enthalten sind, assoziiert sind. Somit bedeutet eine Bezugnahme auf "isoliert" und/oder "gereinigt" die Beteiligung des "Menschen" gemäß den hier gemachten Angaben.
Rekombinante Wirte. Die für ein Toxin kodierenden Gene der vorliegenden Erfindung lassen sich in eine Vielzahl von Mikroorganismen- oder Pflanzenwirte einführen. Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können transformierte mikrobielle Wirte beispielsweise in vorgeschalteten Stufen zur Herstellung von Vorläufern verwendet werden, die letztlich in bevorzugten Ausführungsformen zur Transformation von Pflanzenzellen und Pflanzen verwendet werden, so dass sie die durch die erfindungsgemäßen Gene kodierten Toxine exprimieren. Mikroorganismen, die auf diese Weise transformiert sind und verwendet werden, fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Bei rekombinanten Mikroorganismen kann es sich beispielsweise um B.t., E. coli oder Pseudomonas handeln. Transformationen lassen sich vom Fachmann unter Anwendung üblicher Techniken vornehmen. Materialien, die für diese Transformationen erforderlich sind, werden hier beschrieben oder stehen dem Fachmann anderweitig leicht zur Verfügung.
Somit führt bei bevorzugten Ausführungsformen die Expression eines erfindungsgemäßen Gens direkt oder indirekt zur intrazellulären Erzeugung und Aufrechterhaltung des Proteins von Interesse. Wenn transformierte Pflanzen durch den Schädling aufgenommen werden, nehmen die Schädlinge das Toxin auf. Das Ergebnis besteht in einer Bekämpfung des Schädlings.
Das B.t.-Toxin-Gen kann über einen geeigneten Vektor in einen Wirt, vorzugsweise einen Pflanzenwirt, eingeführt werden. Es gibt zahlreiche Nutzpflanzen von Interesse, wie Mais, Weizen, Reis, Baumwolle, Sojabohnen und Sonnenblumen. Die erfindungsgemäßen Gene eignen sich insbesondere zur Bereitstellung einer stabilen Aufrechterhaltung und Expression des das Polypeptid-Pestizid exprimierenden Gens in der transformierten Pflanze und führen in wünschenswerter Weise zu einem verbesserten Schutz des Pestizids vor einem Abbau und einer Inaktivierung in der Umwelt.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung rekombinante Wirte, die SEQ ID NO: 5 umfassen. Beim rekombinanten Wirt kann es sich beispielsweise um eine Pflanzenzelle handeln. Vollständige Pflanzen, die die vorliegenden Polynucleotide umfassen, fallen ebenfalls unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen kann eine Pflanze gegenüber einer Schädigung durch den Maiswurzelbohrer resistent gemacht werden, indem sie so transformiert wird, dass sie ein zweites Polynucleotid, wie SEQ ID NO: 4, das für ein 45 kDa-Protein kodiert, exprimiert. Gleichermaßen können SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 zusammen unter der Wirkung eines Promotors oder von getrennten Promotoren, z.B. dem Ubiquitin-Promotor, verwendet werden. Diesbezüglich können beispielsweise die Polynucleotide SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 verwendet werden.
Obgleich die vorliegende Erfindung spezielle Ausführungsformen von synthetischen Genen bereitstellt, können auch andere Gene, die funktionell äquivalent mit den hier beispielhaft aufgeführten Genen sind, zur Transformation von Wirten, insbesondere von Pflanzenwirten, herangezogen werden. Eine zusätzliche Anleitung zur Erzeugung von synthetischen Genen findet sich beispielsweise im US-Patent 5 380 831.
Nachstehend findet sich ein Beispiel, das Verfahren zur Durchführung der Erfindung erläutert. Dieses Beispiel ist nicht als Beschränkung anzusehen.
Beispiel 1 – Insertion von Toxin-Genen in Pflanzen
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Transformation von Pflanzen mit den vorliegenden Polynucleotidsequenzen, die für insektizide Toxine kodieren. Die transformierten Pflanzen sind gegenüber einem Angriff durch den Zielschädling resistent. Die erfindungsgemäßen Gene sind zur Verwendung in Pflanzen optimiert.
Offensichtlich ist eine Promotorregion, die zur Expression des Gens in einer Pflanze befähigt ist, erforderlich. So steht zur in planta-Expression die erfindungsgemäße DNA unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorregion. Techniken zur Erzielung einer in planta-Expression unter Verwendung von derartigen Konstrukten sind aus dem Stand der Technik bekannt. Eine bevorzugte Promotorregion, die zur Expression sowohl von 15 kDa- als auch von 45 kDa- Transgenen verwendet wird, ist der Zea mays-Ubiquitinpromotor plus Z. mays Exon I und Z. mays Intron I (A. H. Christensen et al., Plant Mol. Biol., Bd. 18 (1992), S. 675–689). Ein bevorzugter transkriptionaler Terminator für beide Transgene ist der Kartoffel-Proteinase-Inhibitor II (PinII)-Terminator (G. An et al., Plant Cell, Bd. 1 (1989), S. 115–122).
Gene, die für pestizide Toxine gemäß den hier gemachten Angaben kodieren, können in Pflanzenzellen unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, eingeführt werden. Beispielsweise wurden in bevorzugten Ausführungsformen Maispflanzen mit einem Gehalt an 14 kDa- und 44 kDa-Transgenen durch Mikroprojektil-Bombardierung im wesentlichen gemäß den Angaben von Klein et al. (1987) unter Verwendung der Biolistics^RO PDS-100He-Teilchenpistole der Fa. Bio-Rad erhalten.
Eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der die Selektion der transformierten Zellen gestattet, umfassen, stehen für die Durchführung der Insertion von fremden Genen in höhere Pflanzen zur Verfügung. Die Vektoren umfassen beispielsweise pBR322, die pUC-Reihe, die M13mp-Reihe, pACYC184 und dergl. Demgemäß kann die für das B.t.-Toxin kodierende Sequenz in den Vektor an einer geeigneten Restriktionsstelle eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, sodann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Als Analyseverfahren werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, eine Elektrophorese und andere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verknüpft werden. Die einzelnen Plasmidsequenzen können in gleiche oder andere Plasmide kloniert werden.
Je nach dem Verfahren zum Einführen der erwünschten Gene in die Pflanze können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid für die Transformation der Pflanzenzelle verwendet wird, müssen zumindest der rechte Rand, häufig aber der rechte und der linke Rand der Ti- oder Ri-Plasmid T-DNA als die flankierende Region der einzuführenden Gene verbunden werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde eingehend untersucht und ist in folgenden Literaturstellen gründlich beschrieben: EP-120 516; Hoekema (1985), in: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Kapitel 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., Bd. 4, S. 1–46; und An et al EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 277–287.
Nachdem die inserierte DNA in das Genom integriert worden ist, ist sie dort relativ stabil und tritt in der Regel nicht mehr aus. Normalerweise enthält sie einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie unter anderem Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol, verleiht. Der individuell verwendete Marker soll demgemäß die Selektion von transformierten Zellen unter Zellen, die die inserierte DNA nicht enthalten, ermöglichen.
Eine Vielzahl von Techniken steht für die Insertion von DNA in eine Pflanzenwirtszelle zur Verfügung. Derartige Techniken umfassen eine Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, eine Fusion, eine Injektion, eine biolistische Technik (Mikropartikel-Bombardierung) oder eine Elektroporation sowie weitere mögliche Verfahren. Wenn Agrobacteria für die Transformation verwendet werden, muss die zu inserierende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, nämlich entweder in einen Zwischenvektor oder in einen binären Vektor. Die Zwischenvektoren können in das Ti- oder Ri-Plasmid durch homologe Rekombination integriert werden, und zwar aufgrund von Sequenzen, die homolog mit Sequenzen in der T-DNA sind. Das Ti- oder Ri-Plasmid umfasst auch die vir-Region, die für die Übertragung der T-DNA erforderlich ist. Zwischenvektoren können in Agrobacteria nicht selbst replizieren. Der Zwischenvektor kann in Agrobacterium tumefaciens mittels eines Helferplasmids (Konjugation) übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacteria selbst replizieren. Sie umfassen ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, die von rechten und linken T-DNA-Randbereichen eingerahmt werden. Sie können direkt in Agrobacteria transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 163 (1978), S. 181–187). Das als Wirtszelle verwendete Agrobacterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, umfassen. Die vir-Region ist für die Übertragung der T-DNA in die Pflanzenzelle erforderlich. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das auf diese Weise transformierte Bakterium wird für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Pflanzenexplantate können in vorteilhafter Weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes für die Übertragung der DNA in die Pflanzenzelle gezüchtet werden. Vollständige Pflanzen können sodann aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stängelabschnitte, Wurzeln, jedoch auch Protoplasten oder in Suspension gezüchtete Zellen) in einem geeigneten Medium, das Antibiotika oder Biozide für die Selektion enthalten kann, regeneriert werden. Die auf diese Weise erhaltenen Pflanzen können sodann auf die Anwesenheit der inserierten DNA getestet werden. Im Fall einer Injektion oder Elektroporation werden keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es ist möglich, übliche Plasmide zu verwenden, z.B. pUC-Derivate.
Die transformierten Zellen wachsen in üblicher Weise innerhalb der Pflanzen. Sie können Keimzellen bilden und das oder die transformierten Merkmale auf Tochterpflanzen übertragen. Derartige Pflanzen können in normaler Weise gezüchtet und mit Pflanzen gekreuzt werden, die die gleichen transformierten Erbfaktoren oder andere Erbfaktoren aufweisen. Die erhaltenen Hybride weisen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften auf. Sequenzliste

Claims

Polynucleotid mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 5.
Rekombinanter, nicht-humaner Wirt, der ein Polynucleotid nach Anspruch 1 exprimiert.
Wirt nach Anspruch 2, bei dem es sich um eine Pflanzenzelle handelt.
Wirt nach Anspruch 2, bei dem es sich um eine Pflanze handelt.
Wirt nach Anspruch 2, bei dem es sich um Mais handelt.
Verfahren zur Bekämpfung eines Schädlings in einer Pflanze, umfassend das Kontaktieren des Schädlings mit einem Wirt nach Anspruch 2.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Wirt um eine Pflanze handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Wirt um eine Zea mays-Pflanze handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, zusätzlich umfassend das Kontaktieren des Schädlings mit einem zweiten Protein, das durch SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 kodiert wird.