ES2264283T3 - Polinucleotidos optimizados de plantas que codifican proteinas pesticidas de aproximadamente 15kda y aproximadamente 45kda. - Google Patents
Polinucleotidos optimizados de plantas que codifican proteinas pesticidas de aproximadamente 15kda y aproximadamente 45kda.Info
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Abstract
Un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:5.
Description
Polinucleótidos optimizados de plantas que
codifican proteínas pesticidas de aproximadamente 15 kDa y
aproximadamente 45 kDa.
Los insectos y otras plagas cuestan a los
agricultores miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de
cultivos y en el gasto de mantenimiento de estas plagas bajo
control. Las pérdidas causadas por las plagas de insectos en el
medio ambiente de la producción agrícola incluyen la disminución del
rendimiento de los cultivos, reducción de calidad de los cultivos, e
incremento de los costes de recolección.
Los pesticidas químicos han proporcionado un
procedimiento eficaz para el control de plagas; sin embargo, el
público ha llegado a preocuparse sobre la cantidad de productos
químicos residuales que podrían encontrarse en los alimentos, el
agua subterránea, y el medio ambiente. Por ello, los pesticidas
químicos sintéticos están siendo de manera creciente examinados, y
por tanto corregidos, con respecto a sus consecuencias tóxicas
potenciales para el medio ambiente. Los pesticidas químicos
sintéticos pueden envenenar el suelo y los acuíferos subyacentes,
polucionar las aguas superficiales como un resultado de la
escorrentía, y destruir formas de vida no previstas. Los agentes de
control químicos sintéticos tienen además el inconveniente de
presentar riesgos de seguridad pública cuando se aplican en áreas
en las que los animales domésticos, animales de granja, o niños
pueden entrar en contacto con ellos. Igualmente, pueden
proporcionar riesgos para la salud a los aplicadores, especialmente
si no se siguen las técnicas de aplicación apropiadas. Los
organismos reguladores alrededor del mundo están restringiendo y/o
desterrando los usos de muchos pesticidas y, en particular, los
pesticidas químicos sintéticos que son persistentes en el medio
ambiente y entran en la cadena alimentaria. Los ejemplos de
pesticidas químicos sintéticos ampliamente usados, incluyen los
organoclorados, p. ej., DDT, mirex, kepona, lindano, aldrin,
clordano, aldicarb, y dieldrin; los organofosfatos, p. ej.,
clorpirifos, paration, malation, y diazinon; y carbamatos. Las
nuevas restricciones rigurosas sobre el uso de pesticidas y la
eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado, podrían
limitar opciones económicas y eficaces para el control de plagas
costosas.
Dado los problemas asociados con el uso de
pesticidas químicos sintéticos, existe una clara necesidad de
limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar
agentes de control alternativos. La substitución de pesticidas
químicos sintéticos, o la combinación de estos agentes con
pesticidas biológicos, podría reducir los niveles de productos
químicos tóxicos en el medio ambiente.
Un agente pesticida biológico que ha sido usado
con creciente popularidad, el microbio del suelo Bacillus
thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus
thuringiensis (B.t.), es una bacteria formadora de esporas,
gram-positiva. La mayoría de las cepas de B.t. no
muestran actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen, y
pueden ser caracterizadas por, inclusiones de proteína cristalina
paraesporal. Estas "\delta-endotoxinas",
las cuales típicamente tienen actividad pesticida específica, son
diferentes de las exotoxinas, las cuales tienen una gama de
huéspedes no específica. Frecuentemente, estas inclusiones aparecen
microscópicamente como cristales claramente formados. Las proteínas
pueden ser altamente tóxicas para las plagas y son específicas en su
actividad tóxica.
Las preparaciones de las esporas y cristales de
B. thuringiensis subespecie kusrtaki, han sido usadas durante
muchos años como insecticidas comerciales para plagas de
lepidópteros. Por ejemplo, el B. thuringiensis var.
kusrtaki HD-1, produce una
\delta-endotoxina que es tóxica para las larvas de
un cierto número de insectos lepidópteros.
La clonación y expresión de un gen de proteína
cristal de B.t. en Escherichia coli ha sido descrita en la
literatura publicada hace más de 15 años (Schnepf, H.E., H.R.
Whitely, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, págs.
2893-2897, (1981)). La Patente de EE.UU. No.
4.448.885 y la Patente de EE.UU. No. 4.467.036, describen ambas la
expresión de proteína cristal de B.t. en E. coli. Los
productos de B.t. basados en DNA recombinante han sido producidos y
aprobados para su uso.
El uso comercial de pesticidas de B.t. estuvo
originalmente restringido a una gama estrecha de plagas de
lepidópteros (orugas). Sin embargo, más recientemente, los
investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con
especificidades para una gama mucho más amplia de plagas. Por
ejemplo, otras especies de B.t., fundamentalmente israelensis
y morrisoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t.
M-7), han sido usadas comercialmente para controlar
insectos de los órdenes Dípteros y Coleópteros, respectivamente
(Gaertner, F.H., "Sistemas de suministro celular para proteínas
insecticidas: Microorganismos vivientes y no vivientes", en
Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins,
ed. Taylor y Francis, New York and London, págs.
245-255, (1990)).
Actualmente, se han identificado nuevas
subespecies de B.t., y los genes responsables de las proteínas de
\delta-endotoxina activa han sido aislados y
secuenciados (Höfte, H., H.R. Whiteley, Microbiological
Reviews, vol. 52, (no. 2), págs. 242-245,
(1989)). Höfte y Whitley clasificaron genes de proteína cristal de
B.t. en cuatro clases principales. Las clases fueron cryI
(específica de Lepidópteros), cryII (específica de
Lepidópteros y Dípteros), cryIII (específica de Coleópteros)
y cryIV (específica de Dípteros). Se ha informado del
descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas
(Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim, Bio/Technology, vol. 10,
págs. 271-275, (1992)). Por ejemplo, han sido
propuestas las designaciones CryV y CryVI para dos nuevos grupos de
toxinas nematodo-activas.
La nomenclatura y esquema de clasificación de
1989 de Höfte y Whitley se basó en la secuencia de aminoácidos
deducida y la gama del huésped de la toxina. Dicho sistema se adaptó
para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxinas, los cuales
fueron divididos en cinco clases principales. El número de genes de
proteínas cristal de Bacillus thuringiensis secuenciados
usualmente se mantiene en más de 50. Ha sido propuesto un esquema de
nomenclatura revisado, el cual está basado únicamente en la
identidad del aminoácido (Crickmore, y otros, Society for
Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, IIIrd Internacional
Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba,
Córdoba, España, 1-6 de Septiembre, (1996),
resumen). El "cry" nemónico se ha mantenido para todos los
genes de toxinas, excepto el cytA y cytB, los cuales permanecen como
una clase separada. Los numerales romanos han sido cambiados por
numerales árabes en la primera fila, y se han eliminado los
paréntesis en la tercera fila. Se han mantenido muchos de los
nombres originales, aunque un cierto número han sido
reclasificados.
Con el uso de técnicas de ingeniería genética,
se encuentran en desarrollo nuevas vías para el suministro de
toxinas de B.t. a ambientes agrícolas, incluyendo el uso de plantas
genéticamente manipuladas con genes de toxinas de B.t. para
resistencia a insectos y el uso de células microbianas,
estabilizadas, como vehículos de suministro de toxinas de B.t.
(Gaertner, F.H., L. Kim, TIBTECH, vol. 6, págs.
S4-S7, (1988)). De acuerdo con ello, los genes de
endotoxinas de B.t. aislados han comenzado a ser comercialmente
valiosos.
Se han logrado varias mejoras mediante la
modificación de toxinas de B.t. y/o sus genes. Por ejemplo, las
Patentes de EE.UU. Nos. 5.380.831 y 5.567.862, se refieren a la
producción de genes de proteínas cristal insecticidas sintéticos que
tienen expresión mejorada en plantas.
Los obstáculos para el uso agrícola con éxito de
toxinas de B.t. incluyen el desarrollo de resistencia a toxinas de
B.t. por los insectos. Además, ciertos insectos pueden ser
refractarios a los efectos del B.t. Estos últimos incluyen insectos
tales como el gorgojo de la cápsula del algodón y la agrótida negra,
así como insectos adultos de la mayoría de las especies, las
cuales, hasta ahora, han no demostrado una sensibilidad
significativamente aparente a las
\delta-endotoxinas de B.t.
De acuerdo con ello, las estrategias de control
de la resistencia en la tecnología de plantas al B.t. han llegado a
ser de gran interés, y existe aún una gran necesidad de nuevos genes
de toxinas. Por ejemplo, la Patente WO 97/40162, describe proteínas
activas frente a los coleópteros de 15kDa y 45 kDa, obtenibles a
partir de aislados de B.t. PS80JJ1 y PS149B1.
Como un resultado de las extensas inversiones en
recursos e investigaciones, continúan concediéndose patentes para
nuevos aislados, toxinas y genes de B.t., y para nuevos usos de
aislados de B.t. Para un a revisión, véase Feitelson, y otros, más
arriba. La Patente de EE.UU. 5.589.382 describe el aislado de B.t.
PS80JJ1 como poseedor de actividad contra nematodos. La Patente de
EE.UU. 5.632.987 describe el aislado de B.t. PS80JJ1 como poseedor
de actividad contra el gusano de la raíz del maíz. Sin embargo, el
descubrimiento de nuevos aislados de B.t. y de nuevos usos de
aislados de B.t. conocidos, continúa siendo una técnica
impredecible, empírica.
Un nuevo polinucleótido de acuerdo con la
presente invención tiene la secuencia de SEC ID NO:5. Esta secuencia
de polinucleótido es para un gen designado como
149B1-15-PO, la cual está optimizada
para expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de
aproximadamente 15 kDa obtenible a partir PS149B1 que está descrita
en la Patente WO 97/40162.
La nueva secuencia de polinucleótido tiene
ciertas modificaciones, comparada con las secuencias tipo salvaje,
que la hace particularmente adecuada para la expresión optimizada
en plantas. Usando esta secuencia de polinucleótido, puede llevarse
a cabo la transformación de plantas, usando técnicas conocidas por
los expertos en la técnica, con el fin de conferir resistencia a las
plagas sobre las plantas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, un huésped no humano recombinante expresa un
polinucleótido de la invención. Puede usarse un huésped de este
tipo, en un procedimiento de acuerdo con la invención, para poner en
contacto una plaga de plantas y, de esta forma, controlar la
plaga.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención, la plaga se pone adicionalmente en contacto con una
segunda proteína, codificada por la SEC ID NO:4 o la SEC ID
NO:6.
La SEC ID NO:4 es una secuencia de
polinucleótido para un gen designado como
80JJ1-45-PO, el cual está optimizado
para expresión en maíz. Este gen codifica una proteína de
aproximadamente 45 kDa. Este gen está descrito en la Patente WO
97/40162.
La SEC ID NO:6 es una secuencia de
polinucleótido para un gen designado como
149B1-45-PO, el cual está optimizado
para expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de
aproximadamente 45 kDa obtenible a partir del PS149B1, el cual está
descrito igualmente en la Patente WO 97/40162.
Debería resultar obvio para una persona experta
en esta técnica que, dadas las secuencias aquí establecidas, el gen
de la invención sujeto puede obtenerse por varios medios. En
realizaciones preferidas, el gen sujeto puede producirse
sintéticamente mediante el uso, por ejemplo, de un sintetizador de
gen. Los genes específicos aquí ejemplificados pueden igualmente
obtenerse mediante modificación, de acuerdo con las directrices de
la invención sujeto, de ciertos genes de tipo salvaje (por ejemplo,
mediante técnicas de mutación puntual) a partir de ciertos aislados
depositados en un depósito de cultivos tal como se expone más
adelante.
Ciertos cultivos expuestos en esta solicitud han
sido depositados en la Agricultural Research Service Patent
Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815
North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Las cepas
depositadas enumeradas a continuación están descritas en las
referencias de patentes tal como se ha expuesto anteriormente en la
sección titulada "Fundamentos de la invención".
| Subcultivo | Número de registro | Fecha de depósito |
| B.t. PS80JJ1 | NRRL B-18679 | 17 de Julio de 1990 |
| E. coli (NM522) (pMYC2421) | NRRL B-21555 | 28 de Marzo de 1996 |
| (PS80JJ1 14kDa y 45 kDa) | ||
| E. coli (NM522) (pMYC2426) | NRRL B-21671 | 26 de Marzo de 1997 |
| (PS80JJ1 14kDa y 45 kDa) | ||
| B.t. PS149B1 | NRRL B-21553 | 28 de Marzo de 1996 |
| E. coli (NM522) (pMYC2429) | NRRL B-21673 | 26 de Marzo de 1997 |
| (PS149B1 15kDa y 45 kDa) |
Debería darse por entendido que la
disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para llevar
a la práctica la invención sujeto, en derogación de los derechos de
patente garantizados por la acción gubernamental.
Genes y toxinas. La invención sujeto
incluye, en realizaciones preferidas, secuencias de polinucleótidos
optimizadas para expresión en plantas, en las que dichas secuencias
están seleccionadas entre la SEC ID NO:5 y opcionalmente también
la SEC ID NO:6.
Los polinucleótidos de la invención sujeto
pueden usarse para formar "genes" completos para codificar
proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo,
tal como un técnico experto fácilmente reconocería, la SEC ID
NO:5 y SEC ID NO:6 se muestran sin codones de parada. La SEC ID NO:5
y/o SEC ID NO:6 pueden colocarse de manera apropiada bajo el
control de un promotor en un huésped de interés, tal como es
fácilmente conocido en la técnica.
Tal como el técnico experto fácilmente
reconocerá, el DNA puede existir en una forma de hebra doble. En
esta disposición, una hebra es complementaria de la otra hebra y
vive versa. La "hebra de codificación" se usa frecuentemente
en la técnica para referirse a la hebra que tiene una serie de
codones (un codón son los tres nucleótidos que pueden leerse los
tres al mismo tiempo para proporcionar un aminoácido particular) que
pueden leerse como un marco de lectura abierto (OPR) para formar
una proteína o péptido de interés. Con el fin de expresar una
proteína in vivo, una hebra de DNA se traduce típicamente
dentro de una hebra complementaria de RNA, el cual se usa como el
molde para la proteína. Puesto que el DNA está replicado en una
planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias,
adicionales, de DNA. De acuerdo con ello, la invención sujeto
incluye el uso o de los polinucleótidos ejemplificados mostrados en
el listado de secuencias adjunto, o de las hebras complementarias.
El RNA y PNA (ácidos nucléicos de péptidos) que son funcionalmente
equivalentes a las moléculas de DNA nuevas, específicamente
ejemplificadas, se encuentran incluidos en la invención sujeto.
Ciertas secuencias de DNA de la invención sujeto
han sido específicamente ejemplificadas aquí. Estas secuencias son
ejemplos de la invención sujeto. Debería ser fácilmente obvio que la
invención sujeto incluye no solamente los genes y secuencias
específicamente ejemplificados aquí, sino, además, los equivalentes
y variantes de las mismos (tales como mutantes, fusiones,
quiméricos, truncaciones, fragmentos, y genes más pequeños) que
muestran la misma o similares características relativas a la
expresión de toxinas en las plantas, comparadas con las
específicamente descritas aquí. Tal como se usa aquí,
"variantes" y "equivalentes" se refiere a secuencias que
tienen substituciones de nucleótidos (o aminoácidos), deleciones
(internas y/o terminales), adiciones, o inserciones que no afectan
materialmente la expresión de los genes sujeto, y la actividad
pesticida resultante, en plantas. Los fragmentos de proteínas de
polinucleótidos que retienen la actividad pesticida, y las
"porciones pesticidas" de proteínas de longitud completa, se
encuentran igualmente incluidas en esta definición.
Usando técnicas estándar, pueden modificarse
genes, y pueden construirse fácilmente variaciones de genes. Por
ejemplo, las técnicas para la realización de mutaciones puntuales
son bien conocidas en la técnica. Además, pueden usarse
exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo
con procedimientos estándar, y enzimas tal como Bal31 o
puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para cortar
sistemáticamente nucleótidos procedentes de los extremos de estos
genes. Igualmente, pueden obtenerse genes útiles usando una
diversidad de enzimas de restricción.
Debería indicarse que genes equivalentes
codificarán toxinas que tienen alta identidad u homología de
aminoácidos con las toxinas codificadas por los genes sujeto. La
homología de aminoácidos será la más alta en regiones críticas de la
toxina que responden a la actividad biológica o que están implicadas
en la determinación de la configuración tridimensional que
finalmente es la responsable de la actividad biológica. A este
respecto, son aceptables y pueden ser esperadas ciertas
substituciones, si estas substituciones son en regiones que no son
críticas para la actividad o son substituciones conservadoras de
aminoácidos que no afectan a la configuración tridimensional de la
molécula. Por ejemplo, pueden introducirse aminoácidos de las
siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y
ácidos. Las substituciones conservadoras, mediante las cuales un
aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo
tipo, entran dentro del alcance de la invención sujeto, siempre y
cuando que la substitución no altere materialmente la actividad
biológica del compuesto. La Tabla 1 proporciona un listado de
ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.
| Clase de aminoácido | Ejemplos de aminoácidos |
| No polar | Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp |
| Polar no cargado | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
| Ácido | Asp, Glu |
| Básico | Lys, Arg, His |
En algunos casos, pueden igualmente hacerse
substituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas
substituciones no deben disminuir de manera significativa la
capacidad de las plantas para expresar las secuencias del DNA sujeto
o la actividad biológica de la toxina.
Tal como se usa aquí, la referencia a
polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas", se
refiere a esas moléculas cuando no están asociadas con las otras
moléculas con las cuales se encontrarían en la naturaleza e
incluiría su uso en plantas. De acuerdo con ello, la referencia a
"aislado" y/o "purificada" significa la implicación de la
"mano del hombre" tal como se describe aquí.
Huéspedes recombinantes. Los genes que
codifican la toxina de la invención sujeto, pueden introducirse
dentro de una amplia variedad de huéspedes microbianos o plantas.
En algunas realizaciones de la invención sujeto, los huéspedes
microbianos transformados pueden usarse en etapas preliminares para
la preparación de precursores, por ejemplo, los cuales
eventualmente se usarán para transformar, en realizaciones
preferidas, células de plantas y plantas de manera tal que expresen
las toxinas codificadas por los genes de la invención sujeto. Los
microbios transformados y usados de esta manera, están dentro del
alcance de la invención sujeto. Los microbios recombinantes pueden
ser, por ejemplo, un B.t., E. coli, o Pseudomonas. Las
transformaciones pueden realizarse por los expertos en la técnica
usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas
transformaciones se describen aquí o bien se encuentran fácilmente
disponibles para el técnico experto.
De acuerdo con ello, en realizaciones
preferidas, la expresión de un gen de esta invención da como
resultado, directamente o indirectamente, la producción intracelular
y el mantenimiento de la proteína de interés. Cuando las plantas
transformadas son ingeridas por la plaga, las plagas ingerirán la
toxina. El resultado es un control de la plaga.
El gen de la toxina de B.t. puede introducirse
mediante un vector adecuado dentro de un huésped, preferiblemente un
huésped de planta. Existen muchos cultivos de interés, tales como
maíz, trigo, arroz, algodón, sojas y girasoles. Los genes de la
invención sujeto son particularmente adecuados para proporcionar
mantenimiento y expresión estable, en la planta transformada, del
gen que expresa el pesticida polipéptido, y, de manera deseable,
proporciona protección mejorada del pesticida de la degradación e
inactivación del medio ambiente.
De acuerdo con ello, la invención sujeto incluye
huéspedes recombinantes que comprenden la SEC ID NO:5. El huésped
recombinante puede ser, por ejemplo, una célula de planta. Las
plantas completas que comprenden los polinucleótidos sujeto entran
igualmente dentro del alcance de la invención sujeto. En
realizaciones particularmente preferidas, una planta puede hacerse
resistente al daño por el gusano de la raíz del maíz mediante
transformación para expresar un segundo polinucleótido, tal la SEC
ID NO:4, que codifica una proteína de 45 kDa. Igualmente, las SEC
ID NO:5 y SEC ID NO:6 pueden usarse conjuntamente, bajo un promotor
o promotores separados, tal como el promotor ubiquitina. Para tal
fin, pueden usarse, por ejemplo, los polinucleótidos de la SEC ID
NO:4 y la SEC ID NO:5.
Aunque la invención sujeto proporciona
realizaciones específicas de genes sintéticos, pueden usarse
igualmente otros genes que sean funcionalmente equivalentes a los
genes ejemplificados aquí para transformar huéspedes,
preferiblemente huéspedes de plantas. Las directrices adicionales
para la producción de genes sintéticos pueden encontrarse, por
ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5.380.831.
Lo que sigue a continuación, es un ejemplo que
ilustra los procedimientos para la puesta en práctica de la
invención. Este ejemplo no debería considerarse como limitativo.
Un aspecto de la invención sujeto es la
transformación de plantas con las secuencias de polinucleótidos
sujeto que codifican toxinas insecticidas. Las plantas
transformadas son resistentes al ataque por la plaga prevista. Los
genes de la invención sujeto están optimizados para uso en
plantas.
Obviamente, es necesaria una región promotora
capaz de expresar el gen en una planta. De acuerdo con ello, para la
expresión in planta, el DNA de la invención sujeto está bajo
el control de una región promotora apropiada. Las técnicas para la
obtención de la expresión in planta mediante el uso de dichos
constructos son conocidas en la técnica. Una región promotora
preferida usada para la expresión de transgenes de 15 kDa y 45 kDa
es el promotor ubiquitina de Zea mays más el exón 1 de Z.
mays y el intrón 1 de Z. mays (Christensen, A.H., y
otros, Plant Mol. Biol., vol. 18, págs.
675-689, (1992)). Un terminador de transcripción
preferido para ambos transgenes es el terminador inhibidor II de
proteínasa de patata (PinII) (An, G., y otros, Plant Cell,
vol. 1, págs. 115-22, (1989)).
Los genes que codifican toxinas pesticidas, tal
como se describen aquí, pueden insertarse dentro de células de
plantas usando una diversidad de técnicas que son bien conocidas en
la técnica. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, se obtuvieron
plantas de maíz que contenían transgenes de 14 kDa y 44 kDa mediante
bombardeo con microproyectiles usando la pistola de partículas
Biolistics® Ò PDS-100He fabricada por
Bio-Rad, esencialmente tal como ha sido descrito por
Klein, y otros, (1987).
Para la preparación para la inserción de genes
extraños dentro de plantas superiores, existen disponibles un gran
número de vectores de clonación que comprenden un sistema de
replicación en E. coli y un marcador que permite la
selección de las células transformadas. Los vectores comprenden, por
ejemplo, pBR322, las series pUC, las series M13mp, pACYC184, etc.
De acuerdo con ello, la secuencia que codifica la toxina de B.t.
puede insertarse dentro del vector en un sitio de restricción
adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación dentro
de E. coli. Las células de E. coli son cultivadas en
un medio nutriente adecuado y, a continuación, recolectadas y
lisadas. El plásmido se recupera. Como procedimientos de análisis,
generalmente se llevan a cabo análisis de secuencias, análisis de
restricción, electroforesis, y otros procedimientos
bioquímicos-biológicos moleculares. Después de cada
manipulación, la secuencia de DNA usada puede escindirse y unirse a
la secuencia de DNA siguiente. Cada secuencia de plásmido puede
clonarse en el mismo o en otros plásmidos.
Dependiendo del procedimiento de inserción de
los genes deseados dentro de la planta, pueden ser necesarias otras
secuencias de DNA. Por ejemplo, si se usa el plásmido Ti o Ri para
la transformación de la célula de la planta, en ese caso, ha de
unirse a la región flanqueante de los genes a insertar al menos el
límite izquierdo, aunque frecuentemente el borde derecho y el
izquierdo del T-DNA del plásmido Ti o Ri. El uso de
T-DNA para la transformación de células de plantas
ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en la
Patente EP 120.516; por Hoekema, en The Binary Plant Vector
System, Offset-durkkerij Kanters B.V.,
Alblassardam, (1985), Capítulo 5; por Fraley, y otros, en Crit.
Rev. Plant Sci., vol. 4, págs. 1-46; y por An, y
otros, en EMBO J., vol. 4, págs. 277-287,
(1985).
Una vez que el DNA insertado ha sido integrado
en el genoma, es relativamente estable en él, y, como norma, no
sale nuevamente. Normalmente, contiene un marcador de selección que
confiere a las células de plantas transformadas resistencia a un
biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina,
higromicina, o cloranfenicol, entre otros. Los marcadores usados
individualmente deberían de acuerdo con ello permitir la selección
de células transformadas en vez de células que no contienen el DNA
insertado.
Para la inserción de DNA dentro de una célula
huésped de una planta existen disponibles un gran número de
técnicas. Dichas técnicas incluyen transformación con
T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación,
fusión, inyección, biolísticos (bombardeo de micropartículas), o
electroporación, así como otros procedimientos posibles. Si se usan
Agrobacterias para la transformación, el DNA a insertar ha de ser
clonado dentro de plásmidos especiales, fundamentalmente o bien
dentro de un vector intermedio, o bien dentro de vector binario.
Los vectores intermedios pueden integrarse dentro del plásmido Ti o
Ri mediante recombinación de homólogos debido a secuencias que son
homólogas a las secuencias en el T-DNA. Igualmente,
el plásmido Ti o Ri comprende la región vir necesaria para la
transferencia del T-DNA. Los vectores intermedios
no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacterias. El vector
intermedio puede ser transferido dentro de Agrobacterium
tumefaciens mediante un plásmido ayudante (conjugación). Los
vectores binarios pueden replicarse por sí mismos en E. coli
y en Agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de selección y
un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones
límites derecha e izquierda de T-DNA. Pueden
transformarse directamente dentro de Agrobacterias (Holsters, y
otros, Mol. Gen. Genet., vol. 163, págs.
181-187, (1978)). El Agrobacterium usado
como célula huésped es para comprender un plásmido que porta una
región vir. La región vir es necesaria para la
transferencia del T-DNA dentro de la célula de la
planta. Pueden estar contenidos T-DNA adicionales.
El bacterio así transformado se usa para la transformación de
células de plantas. Los explantes de plantas pueden cultivarse de
manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del DNA
dentro de la célula de la planta. A continuación, pueden regenerarse
plantas completas a partir del material de planta infectado (por
ejemplo, piezas de hojas, segmentos de tallos, raíces, e igualmente
protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio
adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para
selección. A continuación, las plantas así obtenidas pueden
ensayarse para determinar la presencia del DNA insertado. No se
producen especiales demandas de los plásmidos en el caso de
inyección o electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios,
tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas se desarrollan dentro
de las plantas de la manera usual. Pueden formar células gérmenes y
transmitir el rasgo(s) transformado a las plantas progenie.
Dichas plantas pueden desarrollarse de la manera normal y cruzarse
con plantas que tienen los mismos factores hereditarios u otros
factores hereditarios transformados. Los individuos híbridos
resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
<110> Mycogen Corporation
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polinucleótidos optimizados de
plantas que codifican proteínas pesticidas de aproximadamente 15 kDa
y aproximadamente 45 kDa
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> MA723/4X
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<140>
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<141>
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<150> 60/105,408
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<151>
1998-10-23
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<150> 60/105,359
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<151>
1998-10-23
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis
sintético
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 357
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis
sintético
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 119
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Toxina codificada por el gen de Bacillus
thuringiensis sintético
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<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis
sintético
\newpage
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<400> 4
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis
sintético
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<400> 5
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<212> DNA
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis
sintético
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<400> 6
Claims (9)
1. Un polinucleótido que tiene la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID NO:5.
2. Un huésped no humano recombinante que expresa
un polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 1.
3. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación
2, que es una célula de planta.
4. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación
2, que es una planta.
5. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación
2, que es maíz.
6. Un procedimiento para el control de una plaga
en una planta, que comprende el contacto de la plaga con un huésped
de acuerdo con la Reivindicación 2.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 6, en el que el huésped es una planta.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 6, en el que el huésped es una planta de Zea
mays.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 6 a 8, el cual comprende adicionalmente el
contacto de la plaga con una segunda proteína, codificada por la SEC
ID NO:4 o la SEC ID NO:6.
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