ES2327948T3 - Polinucleotido optimizado para plantas que codifica una proteina pesticida de aproximadamente 45 kda. - Google Patents

Polinucleotido optimizado para plantas que codifica una proteina pesticida de aproximadamente 45 kda. Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 6.

Description

Polinucleótido optimizado para plantas que codifica una proteína pesticida de aproximadamente 45 kDa.
Antecedentes de la invención
Los insectos y otras plagas cuestan a los agricultores miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cultivos y en los gastos de mantener estas plagas bajo control. Las pérdidas causadas por plagas de insectos en entornos de producción agrícola incluyen disminución del rendimiento del cultivo, calidad de cultivo reducida y costes de cosechado aumentados.
Los pesticidas químicos han proporcionado un procedimiento eficaz de control de plagas; sin embargo, el público ha comenzado preocuparse acerca de la cantidad de residuos químicos que podrían encontrarse en el alimento, el agua del suelo y el entorno. Por lo tanto, los pesticidas químicos sintéticos se están escrutando cada vez más y, como debe ser, para determinar sus consecuencias ambientales tóxicas potenciales. Los pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y los acuíferos subyacentes, contaminar las aguas superficiales como resultado de la escorrentía y destruir formas de vida no diana. Los agentes de control químicos sintéticos tienen la desventaja adicional de presentar riesgos para la seguridad pública cuando se aplican en áreas en las que mascotas, animales de granja o niños pueden entrar en contacto con ellos. También pueden proporcionar riesgos para la salud a las personas que los apliquen, especialmente si no se siguen las técnicas de aplicación apropiadas. Las agencias reguladoras alrededor del mundo están restringiendo y/o prohibiendo los usos de muchos pesticidas y, particularmente, los pesticidas químicos sintéticos que son persistentes en el entorno y entran en la cadena alimenticia. Los ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente usados incluyen los organocloros, por ejemplo, DDT, mirex, kepona, lindano, aldrina, clordano, aldicarb y dieldrina; los organofosfatos, por ejemplo, clorpirifós, paratión, malatión y diazinón; y carbamatos. Nuevas restricciones rigurosas sobre el uso de pesticidas y la eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado podría limitar opciones económicas y eficaces para controlar pestes costosas.
Debido a los problemas asociados con el uso de pesticidas químicos sintéticos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La sustitución de pesticidas químicos sintéticos o la combinación de estos agentes con pesticidas biológicos podría reducir los niveles de químicos tóxicos en el entorno.
Un agente pesticida biológico que se está usando con una popularidad creciente es el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria Gram positiva formadora de esporas. La mayoría de cepas de B.t. no presentan actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen, y pueden caracterizarse por, inclusiones proteicas cristalinas paraesporales. Estas "\delta-endotoxinas", que tienen típicamente una actividad pesticida específica, son diferentes de las exotoxinas, que tienen un intervalo de huéspedes inespecífico. Estas inclusiones aparecen con frecuencia microscópicamente como cristales de una forma muy particular. Las proteínas pueden ser altamente tóxicas para plagas y son específicas en su actividad tóxica.
Se han usado preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis subsp. kurstaki durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, el B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produce una \delta-endotoxina cristalina que es tóxica para las larvas de varios insectos lepidópteros.
La clonación y expresión de un gen de proteína cristalina de B. t. en Escherichia coli se describió en la bibliografía publicada hace más de 15 años (Schnepf, H. E., H. R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2893-2897). Tanto la Patente de Estados Unidos Nº 4.448.885 como la Patente de Estados Unidos Nº 4.467.036 describen la expresión de proteína cristalina de B.t. en E. coli. Se han producido productos de B.t. basados en ADN recombinante y se autorizado su uso.
El uso comercial de pesticidas de B.t. se limitaba originariamente a un intervalo estrecho de plagas de lepidópteros (orugas). Más recientemente, sin embargo, los investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades por un intervalo mucho más amplio de plagas. Por ejemplo, otras especies de B.t., en concreto israelensis y morrisoni (también conocido como tenebrionis, también conocido como B.t. M-7) se han usado comercialmente para controlar insectos de los órdenes Diptera y Coleoptera, respectivamente (Gaertner, F. H. [1989] "Celullar Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms," en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R. M. Wilkins, ed., Taylor y Francis, Nueva York y Londres, 1990, págs. 245-255).
Ahora se han identificado nuevas subespecies de B.t. y se han aislado y secuenciado genes responsables de proteínas \delta-endotoxinas activas (Höfte, H., H. R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52 (2): 242-255). Höfte y Whiteley clasificaron los genes de proteínas cristalinas de B.t. en cuatro clases principales. Las clases eran cryI (específica de Lepidópteros), cryII (específica de Lepidópteros y Dípteros), cryIII (específica de Coleópteros) y cryIV (específica de Dípteros). Se ha descrito el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J. S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10: 271-275). Por ejemplo, las denominaciones CryV y CryVI se han propuesto para dos nuevos grupos de toxinas activas en nematodos.
El esquema de nomenclatura y clasificación de 1989 de Höfte y Whiteley se basaba tanto en la secuencia de aminoácidos deducida como en el intervalo de huésped de la toxina. Ese sistema se adaptó para abarcar 14 tipos diferentes de genes de toxinas que se dividieron en cinco clases principales. El número de genes de proteínas cristalinas de Bacillus thuringiensis secuenciados está actualmente en más de 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado que se basa solamente en la identidad de aminoácidos (Crickmore y col [1996] Society of Invertebrate Pathology, 29^{th} Annual Meeting, IIIrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, 1-6 de septiembre, 1996, resumen). El término nemotécnico "cry" se ha conservado para todos los genes de toxinas excepto cytA y cytB, que continúan siendo una clase separada. Los números romanos se han cambiado por números arábigos en la categoría primaria y se han eliminado los paréntesis de la categoría terciaria. Se han conservado muchos de los nombres originales aunque varios se han vuelto a clasificar.
Con el uso de técnicas de ingeniería genética, están en desarrollo nuevas estrategias para suministro de toxinas de B.t. a entornos agrícolas, incluyendo el uso de plantas modificadas genéticamente con genes de toxinas de B.t. para resistencia a insectos y el uso de células microbianas estabilizadas como vehículos de suministro de toxinas de B.t. (Gaertner, F. H., L. Kim [1988] TIBTECH 6: S4-S7). Por lo tanto, están volviéndose comercialmente valiosos genes de endotoxinas de B.t. aislados.
Se han conseguido diversas mejoras por modificación de toxinas de B.t. y/o sus genes. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.380.831 y 5.567.862 se refieren a la producción de genes de proteínas cristalinas insecticidas sintéticos que tienen una expresión mejorada en plantas.
Los obstáculos al uso agrícola con éxito de toxinas de B.t. incluyen el desarrollo de resistencia a toxinas de B.t. por insectos. Además, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos de B.t. Los últimos incluyen insectos tales como picudo del algodón y oruga cortadora negra, así como insectos adultos de la mayoría de especies que hasta ahora no han demostrado una sensibilidad significativa aparente a \delta-endotoxinas de B.t.
Por lo tanto, las estrategias de manejo de resistencias en tecnología vegetal con B.t. se han vuelto de gran interés y continúa existiendo una gran necesidad de nuevos genes de toxinas. Por ejemplo, el documento WO97/40162 describe proteínas activas en coleópteros de 15 kDa y 45 kDa que pueden obtenerse de los aislados de B.t. PS80JJ1 y PS149B1.
Como resultado de una investigación exhaustiva y de la inversión en recursos, continúan expidiéndose patentes para nuevos aislados, toxinas y genes de B.t. y para nuevos usos de aislados de B.t. Véase, Feitelson y col., anteriormente, para una revisión. El documento US5589382 describe el aislado de B.t. PS80JJ1 como que tiene actividad frente a nematodos. El documento US5632987 describe que el aislado de B.t. PS80JJ1 tiene actividad contra gusano de la raíz del maíz. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de B.t. y nuevos usos de aislados de B.t. conocidos continúa siendo una técnica empírica impredecible.
Sumario de la invención
Un nuevo polinucleótido de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 6. Esta secuencia polinucleotídica es para un gen denominado 149B1-45-PO, que está optimizado para la expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 45 kDa que puede obtenerse de PS149B1 que se describe en el documento WO97/40162.
La nueva secuencia polinucleotídica tiene ciertas modificaciones en comparación con secuencias de tipo silvestre, que la hacen particularmente adecuada para una expresión optimizada en plantas. Usando esta secuencia polinucleotídica, puede conseguirse la transformación de plantas usando técnicas conocidas por los especialistas en la técnica para conferir resistencia a plagas en las plantas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, un huésped no humano recombinante expresa un polinucleótido de la invención. Dicho huésped puede usarse en un procedimiento de acuerdo con la invención para entrar en contacto con una plaga vegetal y de este modo controlar la plaga.
Descripción de la invención
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la plaga se pone en contacto además con una segunda proteína codifica por la SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 5.
La SEC ID Nº: 4 es una secuencia polinucleotídica para un gen denominado 80JJ1-45-PO, que está optimizado para la expresión en maíz. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 45 kDa. Este gen se describe en el documento WO97/40162.
La SEC ID Nº: 5 es una secuencia polinucleotídica para un gen denominado 149B1-15-PO, que está optimizado para la expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 15 kDa que puede obtenerse de PS149B1 que también se describe en el documento WO97/40162.
Debería ser evidente para un especialista en esta técnica que, dadas las secuencias expuestas en este documento, el gen de la presente invención puede obtenerse por diversos medios. En realizaciones preferidas, el presente gen puede obtenerse sintéticamente usando un sintetizador de genes, por ejemplo. Los genes específicos ejemplificados en este documento también pueden obtenerse por modificación, de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, de ciertos genes de tipo silvestre (por ejemplo, mediante técnicas de mutación puntual) a partir de ciertos aislados depositados en un depósito de cultivos, como se analiza a continuación.
Ciertos cultivos analizados en esta solicitud se han depositado en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos. Las cepas depositadas enumeradas a continuación se describen en las referencias de patentes que se han analizado anteriormente en la sección titulada "Antecedentes de la invención".
1
Debería entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una autorización para realizar la presente invención en menoscabo de los derechos de patente concedidos por acción gubernamental.
Genes y toxinas. La presente invención incluye, en realizaciones preferidas, secuencias polinucleotídicas optimizadas para la expresión en plantas.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para formar "genes" completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como reconocerá fácilmente el especialista, la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 6 se muestran sin codones de terminación. La SEC ID Nº: 5 y/o la SEC ID Nº: 6 pueden colocarse apropiadamente bajo el control de un promotor en un huésped de interés, como se conoce fácilmente en la técnica.
Como reconocerá el especialista, el ADN puede existir en forma bicatenaria. En esta disposición, una cadena es complementaria a la otra cadena y viceversa. La "cadena codificante" se usa con frecuencia en la técnica para referirse a la cadena que tiene una serie de codones (un codón son tres nucleótidos que pueden leerse de tres en tres para dar un aminoácido particular) que puede leerse con una fase de lectura abierta (ORF) para formar una proteína o péptido de interés. Para expresar una proteína in vivo, una cadena de ADN se traduce típicamente en una cadena de ARN complementaria que se usa como molde para la proteína. A medida que el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen cadenas complementarias adicionales de ADN. Por lo tanto, la presente invención incluye el uso de cualquiera de los polinucleótidos ejemplificados que se muestran en la lista de secuencias adjunta o las cadenas complementarias. Se incluyen en la presente invención ARN y PNA (ácidos peptidonucleicos) que son funcionalmente equivalentes a las nuevas moléculas de ADN específicamente ejemplificadas.
Ciertas secuencias de ADN de la presente invención se han ejemplificado específicamente en este documento. Estas secuencias son ejemplares de la presente invención. Debería ser fácilmente evidente que la presente invención incluye no sólo los genes y secuencias específicamente ejemplificados en este documento, sino también equivalentes y variantes de los mismos (tales como genes mutantes, fusiones, quiméricos, truncamientos, fragmentos y de menor tamaño) que presenten las mismas o características similares respecto a la expresión de toxinas en plantas, en comparación con los descritos específicamente en este documento. Como se usan en este documento, los términos "variantes" y "equivalentes" se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones (internas y/o terminales), adiciones o inserciones de nucleótidos (o aminoácidos) que no afectan materialmente a la expresión de los presentes genes y la actividad pesticida resultante en plantas. También se incluyen en esta definición fragmentos de proteínas polinucleotídicas que conserven la actividad pesticida y "porciones pesticidas" de proteínas de longitud completa.
Los genes pueden modificarse y pueden construirse fácilmente variaciones de genes usando técnicas convencionales. Por ejemplo, son bien conocidas en la técnica procedimientos para generar mutaciones puntuales. Además, pueden usarse exonucleasas o endonucleasas disponibles en el mercado de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. También pueden obtenerse genes útiles usando una diversidad de enzimas de restricción.
Debería observarse que genes equivalentes codificarán toxinas que tengan una identidad u homología de aminoácidos elevada con las toxinas codificadas por los presentes genes. La homología de aminoácidos será mayor en regiones críticas de la toxina que sean responsables de la actividad biológica o que estén implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia es responsable de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden situarse en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Se incluyen en el alcance de la presente invención sustituciones conservativas por las que un aminoácido de una clase se sustituye con otro aminoácido del mismo tipo siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. La Tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase
3
En algunos casos, también se pueden realizar sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no tienen que desmerecer significativamente la capacidad de las plantas de expresar las secuencias de ADN sujeto o la actividad biológica de la toxina.
Como se usa en este documento, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas" se refiere a estas moléculas cuando las mismas no están asociadas con las demás moléculas con las que se encontrarían en la naturaleza e incluirían su uso en plantas. Por tanto, la referencia a "aislados" y/o "purificadas" significa la implicación de la "mano del hombre" como se describe en este documento.
Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican toxina de la invención sujeto se pueden introducir en una amplia diversidad de huéspedes microbianos o vegetales. En algunas realizaciones de la invención sujeto, los huéspedes microbianos transformados se pueden usar en etapas preliminares para preparar precursores, por ejemplo, que se usarán finalmente para transformar, en realizaciones preferidas, células vegetales y plantas de tal forma que expresen las toxinas codificadas por los genes de la invención sujeto. Los microbios transformados y usados de este modo pertenecen al alcance de la invención sujeto. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, un B.t., E. coli o Pseudomonas. Las transformaciones se pueden realizar por los especialistas en la técnica usando técnicas convencionales. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen en este documento o están disponibles de otro modo de manera sencilla para el especialista.
Por tanto, en realizaciones preferidas, la expresión de un gen de esta invención da como resultado, directamente o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento de la proteína de interés. Cuando las plantas transformadas se ingieren por la plaga, las plagas ingerirán la toxina. El resultado es un control de la plaga.
El gen de la toxina de B.t. se puede introducir mediante un vector adecuado en un huésped, preferiblemente un huésped vegetal. Existen muchos cultivos de interés, tales como maíz, trigo, arroz, algodón, soja y girasol. Los genes de la invención sujeto son particularmente bien adecuados para proporcionar mantenimiento y expresión estables, en la planta transformada, del gen que expresa el pesticida polipeptídico y, de forma deseable, proporcionan protección mejorada del pesticida contra degradación e inactivación ambiental.
Por tanto, la invención sujeto incluye huéspedes recombinantes que comprenden la SEC ID Nº 6. El huésped recombinante puede ser, por ejemplo, una célula vegetal. Las plantas enteras que comprenden los polinucleótidos sujeto también pertenecen al alcance de la invención sujeto. En realizaciones particularmente preferidas, una planta se puede hacer resistente al daño por el gusano de la raíz del maíz transformándose para expresar un segundo polinucleótido, tal como la SEC ID Nº 4, que codifica una proteína de 45 kDa. Así mismo, la SEC ID Nº 5 y la SEC ID Nº 6 se pueden usar de manera conjunta, bajo un promotor o promotores separados, tales como el promotor de ubiquitina. Para este aspecto, los polinucleótidos de la SEC ID Nº 2 y la SEC ID Nº 6 se pueden usar, por ejemplo, de manera conjunta.
Aunque la invención sujeto proporciona realizaciones específicas de genes sintéticos, también se pueden usar otros genes que son equivalentes funcionalmente a los genes ilustrados en este documento para transformar huéspedes, preferiblemente huéspedes vegetales. Se puede encontrar una guía adicional para la producción de genes sintéticos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831.
Todas las publicaciones y referencias de patente a las que se hace referencia o citadas en este documento, se incorporan de este modo por referencia en su totalidad en este documento hasta el punto que no sean incongruentes con las enseñanzas explícitas de esta memoria descriptiva.
A continuación se da un ejemplo que ilustra procedimientos para practicar la invención. Este ejemplo no se debe considerar como limitante.
Ejemplo 1 Inserción de Genes de Toxina en Plantas
Un aspecto de la invención sujeto es la transformación de plantas con las secuencias polinucleotídicas sujeto que codifican toxinas insecticidas. Las plantas transformadas son resistentes a ataque por la plaga diana. Los genes de la invención sujeto se optimizan para el uso en plantas.
Obviamente, se necesita una región promotora capaz de expresar el gen en una planta. Por tanto, para expresión in planta, el ADN de la invención sujeto está bajo el control de una región promotora apropiada. Las técnicas para obtener una expresión in planta mediante el uso de tales construcciones se conocen en la técnica. Una región promotora preferida usada para la expresión de los transgenes tanto de 15 kDa como de 45 kDa es el promotor de ubiquitina de Zea mays más el exón 1 de Z. mays y el intrón 1 de Z. mays (Christensen, A. H., y col. 1992 Plant Mol. Biol. 18: 675-689). Un terminador de la transcripción preferido para ambos trasgenes es el terminador de inhibidor II de la proteinosa de patata (PinII) (An, G. y col. 1989 Plant Cell 1: 115-22).
Los genes que codifican toxinas pesticidas, como se describe en este documento, se pueden insertar en células vegetales mediante el uso de una diversidad de técnicas que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, las plantas de maíz que contienen trasngenes de 14 kDa y 44 kDa se obtuvieron por bombardeo con microproyectiles usando la pistola de partículas Biolistics® PDS-100He fabricada por Bio-Rad, esencialmente como se describe por Klein y col. (1987).
Un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas está disponible para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, serie pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la toxina de B.t. se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, después se recogen y lisan. El plásmido se recupera. El análisis de secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y otros procedimientos bioquímicos-de biología molecular también se llevan a cabo generalmente como procedimientos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada se puede escindir y unir a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia plasmídica se puede clonar en el mismo o en otro plásmido.
Dependiendo del procedimiento de insertar genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces al menos el borde derecho, pero frecuentemente el borde derecho y el izquierdo del ADN-T de plásmido Ti o Ri, se tiene que unir como la región flanqueante de los genes a insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha investigado detenidamente y se ha descrito suficientemente en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capitulo 5; Fraley y col., Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; y An y col. (1985) EMBO J. 4: 277-287.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable en ese lugar y, como norma, no vuelve a salir. Normalmente contiene un marcador de selección que otorga a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o a un antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, ente otros. El marcador empleado individualmente debe permitir por consiguiente la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado.
Un gran número de técnicas está disponible para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo con micropartículas) o electroporación así como otros procedimientos posibles. Si se usan Agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar se tiene que clonar en plásmidos especiales, concretamente, en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a secuencias que son homólogas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no se pueden replicar por sí mismos en Agrobacterias. El vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de selección y un engarce o poliengarce que están enmarcados por las regiones de borde de ADN-T derecho e izquierdo. Se pueden introducir por transformación directamente en Agrobacterias (Holsters y col. Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). El Agrobacterium usado como célula huésped es para comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede estar contenido ADN-T adicional. La bacteria transformada de este modo se usa para la transformación de células vegetales. Los explantes vegetales se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Después se pueden regenerar plantas completas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas obtenidas de este modo se pueden ensayar para la presencia del ADN insertado. No se realizan demandas especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos normales, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas crecen dentro de las plantas del modo habitual. Pueden formar células germinales y transmitir el rasgo o los rasgos transformados a las plantas de la progenie. Tales plantas se pueden cultivar del modo normal y cruzar con plantas que tengan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
<110> Mycogen Corporation
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<120> Polinucleótidos Optimizados para Plantas que Codifican Proteínas Pesticidas de Aproximadamente 15 kDa y Aproximadamente 45 kDa
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<130> MA723/4X
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<140>
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<141>
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<150> 60/105.408
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<151> 23-10-1998
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<150> 60/105.359
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<151> 23-10-1998
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 357
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<212> ADN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: gen sintético de toxina de Bacillus thuringiensis 
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4 
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<210> 2
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<211> 357
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: gen sintético de toxina de Bacillus thuringiensis 
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5 
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Toxina codificada por gen sintético de Bacillus thuringiensis 
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<212> ADN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: gen sintético de toxina de Bacillus thuringiensis 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: gen sintético de toxina de Bacillus thuringiensis 
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9

Claims (9)

1. Un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 6.
2. Un huésped no humano recombinante que expresa un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un huésped de acuerdo con la reivindicación 2, que es una célula vegetal.
4. Un huésped de acuerdo con la reivindicación 2, que es una planta.
5. Un huésped de acuerdo con la reivindicación 2, que es maíz.
6. Un procedimiento para controlar una plaga en una planta, que comprende poner en contacto la plaga con un huésped de acuerdo con la reivindicación 2.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el huésped es una planta.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el huésped es una planta de Zea mays.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende adicionalmente poner en contacto la plaga con una segunda proteína, codificada por la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 5.
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