CN112020302B9 - 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于防治有害生物的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列来转化生物体。特别地，所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是细菌物种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建随后转化到包括植物在内的目的生物体中的表达载体，作为用于分离其他同源(或部分同源的)基因的探针。所述杀有害生物蛋白可用于防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体，抑制其生长或将其杀灭，并且可用于生产具有杀昆虫活性的组合物。

Description

来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
交叉引用
本申请要求2018年3月14日提交的美国临时申请号62/642642
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以
技术领域
本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖
背景技术
使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义
已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对一系列昆虫有害
通过将作物植物进行遗传工程改造以从芽孢杆菌属产生杀有害
因此，仍然需要对昆虫有害生物具有增加的杀昆虫活性、不同的
发明内容
在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种
在另一方面，提供了编码IPD113多肽的分离的或重组的核酸分
在另一方面，涵盖IPD113多肽。还提供了分离的或重组的IPD113
在另一方面，提供了用于生产多肽和使用那些多肽用来防治或杀
在另一方面，还包括用于在样品中检测实施例的核酸和多肽的方
在另一方面，实施例的组合物和方法可用于产生用于生产IPD113
附图说明
图1A-1C显示使用Vector
图2A-2D显示使用Vector
图3A-3C显示使用Vector
图4A-4L显示使用Vector
图5显示与含有缺乏IPD113Dh多核苷酸的构建体(空)的阴性
具体实施方式
应理解，本公开不局限于所描述的特定方法、方案、细胞系、属、
如本文使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”
本公开涉及用于防治有害生物的组合物和方法。这些方法涉及用
本文所使用的“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”是指
δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275、
在一些实施例中，IPD113多肽包含从本文公开的全长核酸序列
因此，本文提供了赋予杀有害生物活性的新颖的分离或重组的核
IPD113蛋白及其变体和片段
本公开涵盖了IPD113多肽。如本文中可互换地使用的“IPD113
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于凤尾蕨属中的物种。
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、水龙骨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目肾蕨科
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、肾蕨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、水龙骨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目叉蕨科
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、叉蕨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目骨碎补科
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、骨碎补科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目鳞毛蕨科
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、鳞毛蕨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、凤尾蕨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、铁角蕨科、
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于水龙骨目、乌毛蕨科、
在一些实施例中，编码IPD113多肽的核酸来源于沙草蕨目
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于瓶尔小草属
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于石韦属中的蕨类物种，
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于黑心蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于鳞毛蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于旱蕨属中的蕨类物种，
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于羽节蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于碎米蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于蕨属中的蕨类物种，
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于小毛蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于节毛蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于弯脉蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于泽泻蕨属中的蕨类物
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于修蕨属中的蕨类物种，
在一些实施例中，所述IPD113多肽来源于复叶耳蕨属中的蕨类
本文所使用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述
在一些实施例中，所述IPD113多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：
在一些实施例中，所述IPD113多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：
在另一方面，涵盖了IPD113多肽。还提供了具有以下的分离的
在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector
如本文使用的，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括包
本文所用的“重组蛋白”是指不再处于其天然环境中(例如处于
“片段”或“生物活性部分”包括包含与IPD113多肽具有充分
在一些实施例中，所述IPD113多肽片段是来自以下IPD113多肽
在一些实施例中，所述IPD113多肽片段是相对于以下IPD113
如本文使用的“变体”是指具有与亲本氨基酸序列具有至少约
在一些实施例中，IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序
在一些实施例中，IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序
在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含氨基酸序列，所述氨基
在一些实施例中，IPD113多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：
用于IPD113多肽的此类操作的方法可以通过DNA中的突变来进
在一些方面，在所述氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响
例如，可以在一个或多个、预测的、非必需氨基酸残基处做出保
氨基酸取代可以在保留功能的非保守区域中进行。通常，此类取
在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数
某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，
也可以理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。美
如美国专利号4,554,101中所详述的，已为氨基酸残基分配以下
可替代地，可以对氨基或羧基末端处的多种蛋白质的蛋白序列进
本公开的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了源自诱变和引起重
结构域交换或改组是用于产生改变的IPD113多肽的另一种机
杀昆虫蛋白家族的系统发育、序列基序、和结构分析。可以使用
1)系统发育树构建
可以使用软件MEGA5进行系统发育分析。可以对蛋白序列进行
2)蛋白序列基序发现
根据先前构建的系统发育树对蛋白序列进行重新排序，并输入基
3)二级结构预测
PSIPRED，排名最高的二级结构预测方法(Jones DT.(1999)J.Mol.
4)蛋白序列与二级结构的比对
可以开发脚本，以对所有蛋白质根据来自步骤1的多重蛋白序列
在一些实施例中，IPD113多肽具有经修饰的物理特性。如本文
在一些实施例中，变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的
细菌基因通常在可读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码
本领域技术人员理解，可以修饰多核苷酸编码序列以在甲硫氨酸
在一些实施例中，IPD113多肽的翻译起始因子甲硫氨酸在翻译
在一些实施例中，所述IPD113多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID 
在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的至少两种不
在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含选自以下的至少两种
在一些实施例中，所述嵌合杀昆虫蛋白包含a)实施例的第一重
在一些实施例中，提供嵌合IPD113多肽，其包含与本公开的第
在其他实施例中，IPD113多肽可以表达为具有催化多步翻译后
在另一实施例中，IPD113多肽可以由两个单独的基因编码，其
通常，可以使用任何断裂内含肽来设计反式剪接配偶体，包括任
天然存在的非断裂内含肽可能具有内切核酸酶活性或其他酶活
在一些实施例中，IPD113多肽是环形排列的变体。在某些实施
在另一实施例中，提供了在其氨基酸序列中包含如下氨基酸序列
在一些实施例中，提供了包含本公开的IPD113多肽或嵌合
R1L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1
其中R1是本公开的IPD113多肽或嵌合IPD113多肽，并且R2是
在一些实施例中，所述接头包含选自以下式的组的序列：
核酸分子及其变体和片段
提供了包含编码IPD113多肽或其生物活性部分的核酸序列的分
本文所用的“分离的”核酸分子(或DNA)是指不再处于其天
在一些实施例中，与天然或基因组核酸序列相比，编码IPD113
考虑了编码IPD113多肽或相关蛋白质的多种多核苷酸。当可操
用于工程化IPD113多肽的方法
用于工程化IPD113多肽的方法也涵盖在本公开中。在一些实施
在一些实施例中，通过本公开的方法将IPD113多肽进行工程化
使用本公开的方法，可以识别蛋白水解敏感性位点，并且可以改
使用本公开的方法，可以识别参与受体结合和/或孔形成的位点并
使用本公开的方法，可以识别水分子对位点的占据并可以修饰该
使用本公开的方法，可以识别区域中的氢键结合，并且可以取代
使用本公开的方法，可以识别环区，并且可以改性该环区以产生
使用本公开的方法，可以识别和改性复合物静电表面以及疏水或
使用本公开的方法，可以识别和改性金属结合位点以产生具有经
使用本公开的方法，可以识别和改性可以被掩埋或以其他方式从
使用本公开的方法，可以识别和修饰其他生物分子的非特异性结
应用各种计算工具，加上对饱和诱变的理解以及本文公开的
编码IPD113多肽的多核苷酸
编码IPD113多肽或相关蛋白的多核苷酸的一个来源是蕨类或其
以下多核苷酸：SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：
编码IPD113多肽的多核苷酸也可以从IPD113多肽序列从头合
在一些实施例中，编码IPD113多肽的核酸分子是具有以下中列
本文所用的“互补序列”是指与给定核酸序列充分互补的核酸
在一些实施例中，编码IPD113多肽的核酸分子是非基因组核酸
在一些实施例中，编码IPD113多肽的核酸分子是具有核苷酸序
在一些实施例中，所述IPD113多核苷酸编码IPD113多肽，所述
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码包含氨基酸序列的IPD113
在一些实施例中，所述核酸分子编码IPD113多肽，所述IPD113
还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻
作为编码IPD113多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖
在一些实施例中，所述IPD113多肽是由核酸序列编码的，所述
在一些实施例中，所述核酸编码IPD113多肽，所述IPD113多肽
为了确定两种或更多种氨基酸序列或者两种或更多种核酸序列
用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中
在一些实施例中，所述IPD113多核苷酸编码包含氨基酸序列的
在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多
在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多
在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多
在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多
在一些实施例中，IPD113多核苷酸编码IPD113多肽，所述
实施例还涵盖编码IPD113多肽变体的核酸分子。编码IPD113
本公开提供编码本文公开的IPD113多肽中的任何一个的经分离
技术人员将进一步了解，可以通过核酸序列的突变引入变化，从
可替代地，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(如
本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归(recursive)
多种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)可以单独和/或组
虽然在随后的讨论过程中作出明确的区分和分类，但是应当理
本文所述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸
用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀有害生物活性的多
产生多样性的突变方法包括例如定向诱变(Ling等人，(1997)Anal 
其他合适的方法包括点错配修复(Kramer等人，(1984)Cell[细胞]
关于各种多样性产生方法的另外的细节可以在以下美国专利、
实施例的核苷酸序列还可以用于从蕨类植物(包括但不限于石松
在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由
为了从蕨类或其他原始植物中鉴定潜在的IPD113多肽，可以使
可替代地，使用多种方案，例如使用基于LC-MS/MS的蛋白质鉴
在杂交方法中，全部或部分杀有害生物核酸序列可用于筛选
例如，编码本文公开的IPD113多肽的完整核酸序列或者其一个
此类序列的杂交可以在严格条件下进行。本文所用的“严格条
组合物
还包括包含至少一种本公开的IPD113多肽或IPD113嵌合多肽的
抗体
还涵盖了针对实施例的IPD113多肽或其变体或片段的抗体。本
提供了用于检测样品中IPD113多肽的存在或检测编码IPD113
受体鉴定和分离
还涵盖了针对实施例的IPD113多肽或针对其变体或片段的受
核苷酸构建体、表达盒和载体
本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含
另外的实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物
在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。
提供的这种DNA构建体具有用于插入本公开的IPD113多肽基因
按5′到3′的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始
在一些实施例中，所述DNA构建体包含编码实施例的IPD113
在一些实施例中，所述DNA构建体包含编码实施例的嵌合
在一些实施例中，所述DNA构建体包含多核苷酸，所述多核苷
在一些实施例中，所述DNA构建体包含多核苷酸，所述多核苷
在一些实施例中，DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如
终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的
方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如
适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿
大豆使用表可以在
在一些实施例中，编码IPD113多肽的重组核酸分子具有玉米优
额外的序列修饰可以增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除
表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻
如本文使用的，“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共
合适的叶绿体转运肽(CTP)包含嵌合CT，这些嵌合CT包括但
可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向叶绿体的IPD113多肽
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当取
若干启动子可用于实施这些实施例。可基于所需结果，选择启动
根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调
此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型
引人关注的是在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参
可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节
组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的
叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等人，
根偏好性或根特异性的启动子可以从来自文献中的许多可获得
“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育
当需要低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文使用的术
此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 
以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可
通常，表达盒将包含选择性标记基因，用于选择经转化的细胞。
以上可选择标记基因的列表并不意在是限制性的。任何选择性标
植物转化
所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文使用
如本文使用的，“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要靶向
在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提
可以通过使用位点特异性重组系统实现将多核苷酸插入所需基
植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体
通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例
典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，
可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例
转化叶绿体的方法包括例如：Svab，等人，(1990)Proc.Natl.Acad.
所述实施例进一步涉及实施例的经转化植物的植物繁殖材料，包
所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物
蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例
草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa 
目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科
植物转化评估
在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(如分析与
PCR分析是移植到土壤中之前在早期阶段筛选转化的细胞、组织
植物转化可以通过基因DNA印迹分析来证实(Sambrook和
在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛
可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标
将基因组编辑技术引入植物的方法
在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将所公开的IPD113
在一些实施例中，在所公开的IPD113多核苷酸先前已经被引入
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和
转基因植物中性状的堆叠
转基因植物可以包含本文公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与
在一些实施例中，单独的或与一种或多种另外的抗昆虫性状堆叠
可用于堆叠的转基因包括但不限于：
1.转基因，其赋予对昆虫或疾病的抗性并编码：
(A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物
(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或其上建模的合成多
也可以堆叠编码杀有害生物蛋白的基因，所述杀有害生物蛋白包
δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275、
(C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)、
(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害
(E)编码如下酶的多核苷酸，所述酶负责单萜、倍半萜烯、类固
(F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多
(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella
(H)编码疏水力矩肽(hydrophobic moment peptide)的多核苷酸。
(I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂
(J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，
(K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，
(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人，
(M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多
(N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例
(O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。
(P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)Pl.Physiol.[植物
(Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯
(R)编码胱抑素(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。
(S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；
(T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 
(U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、
(V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，
(W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 
2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：
(A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，所述除草剂抑制生长
(B)编码对草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合酶
(C)编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪(psbA和gs+基因)
(D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的
(E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多
(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium 
(G)编码美国专利申请公开2003/0135879中公开的、用于赋予麦
(H)编码美国专利号4,810,648中所公开的、用于赋予溴苯腈耐
(I)编码以下文献中描述的、用于达草灭耐受性的八氢番茄红素
3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因
如：
(A)改变的脂肪酸，例如，通过以下各项：
(1)下调硬脂酰-ACP以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon
(2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降
(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，如在WO 2001/12800中。
(4)改变LEC1，AGP，Dek1，Superal1，mi1 ps和各种Ipa基因
(5)基因编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美
(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用
(7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达，以增加
(8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达，以调节植物
(9)核酸分子编码wrinkled1样多肽，用于调节糖代谢(美国专利
(B)改变的磷含量，例如，通过
(1)引入植酸酶编码基因将增强植酸的分解，向经转化的植物添
(2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，这可以在玉蜀黍中通过
(C)改变的碳水化合物(例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶
(D)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。
(E)改变的种子必需氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增
4.控制雄性不育的基因：
有若干种赋予遗传性雄性不育的方法，如在基因组内单独位置处
(A)在绒毡层特异性启动子的控制下以及应用化学品N-Ac-PPT
(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 
(C)引入barnase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant Mol.Biol.
关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见
5.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
这包括引入可以在FLP/FRT系统中使用的FRT位点和/或可以在
6.影响非生物胁迫抗性的基因
包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮反
(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变
(B)WO 199938977描述了基因，所述基因包括有效减轻冷冻、高
(C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中
(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723
(E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美
(F)对于植物转录因子或非生物胁迫的转录调节子，参见，例如，
(G)增加液泡焦磷酸酶如AVP1表达以提高产量的基因(美国专
(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸
(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申
(J)编码用于调节发育、调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的
(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白质的多核
(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国
(M)针对胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白质(美国专利
(N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增
(O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下组成：
(P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸
影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结
7.赋予增加的产量的基因
(A)由编码核酸的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽
(B)已显示，使用种子偏好性启动子的玉米锌指蛋白基因
(C)已显示，玉米侧生器官界限(LOB)结构域蛋白
(D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或
(E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，得
(F)编码用于修饰植物根系结构的核苷二磷酸酶激酶(NDK)多
8.赋予植物可消化性的基因。
(A)通过调节木聚糖合成酶的表达来改变存在于植物细胞壁中
在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得监管批准的性状或
基因沉默
在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种目的多核苷酸
在一些实施例中，编码IPD113多肽的多肽或其片段或变体的一
“抑制DNA构建体”是重组DNA构建体，当被转化或稳定整
抑制DNA构建体可以包含源自目的靶基因的区域，并且可以包
抑制DNA构建体，一旦选择了目的靶基因就容易地构建，并且
“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产
“反义RNA”是指与靶标初级转录物或mRNA的全部或部分互
“共抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的正义RNA转录物的产
另一个变化描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列
最近的工作已经描述了并入互补方向上的全部或部分mRNA编
具有由来自待抑制的基因的至少30个核苷酸形成的茎和由随机
也已经描述了使用多聚-T和多聚-A序列来产生茎-环结构中的茎
另一个变化包括使用合成重复序列促进茎-环结构中的茎的形
RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异
细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切丁酶(dicer)的核糖核酸
进一步提供了允许产生自沉默元件的RNAi增加的方法和组合
如本文使用的，“抑制增强子元件”包含如下多核苷酸，所述多
应当认识到，可以使用来自相同靶序列或来自不同靶序列或者来
在具体实施例中，使用沉默元件和抑制增强子元件两者时，RNAi
在具体实施例中，沉默元件和抑制增强子元件的组合表达使植物
如本文使用的，当与适当的对照植物相比时，“抑制性RNA的
一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生
在有害生物防治方面的用途
在有害生物防治或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核
可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶
可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生IPD113多肽。
杀有害生物组合物
在一些实施例中，活性成分能以组合物的形式施用并且可以与其
施用含有由细菌菌株产生的IPD113多肽中的至少一种的活性成
可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶
可以通过本公开的方法在每个区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅
可以通过用所需的农业上可接受的运载体配制细菌细胞、晶体和
在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、
在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多
杀有害生物和杀昆虫活性
“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱
本领域的技术人员会知道，不是所有的化合物均对所有有害生物
鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老
鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖
引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科
引人关注的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜
作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限
来自同翅目的农业上的重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜
来自半翅目的农业上重要的目的物种包括但不限于：拟绿蝽
此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus 
另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿
引人关注的是缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物，如衣鱼
所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蜘蛛目中的蜘蛛如褐隐毒
引人关注的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包
用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例
线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮
种子处理
为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆
可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：
可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种
用于杀灭昆虫有害生物和防治昆虫群体的方法
在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方
在一些实施例中，提供了用于防治昆虫有害生物群体的方法，所
在一些实施例中，提供了用于防治对杀有害生物蛋白具有抗性的
在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的
抗昆虫管理(IRM)策略
苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明
增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀
增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀
在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合
在一些实施例中，本公开的IPD113多肽可用作与其他杀有害生
提供了在促进抗昆虫管理的转基因植物中防治一种或多种鳞翅
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染
还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对转基因植物产生抗性的
还提供了用于转基因植物的有效抗鳞翅目和/或鞘翅目昆虫管理
此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅
提高植物产量的方法
提供了用于提高植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本
如本文所定义的，植物的“产量”是指植物生产的生物质的质量
在具体方法中，由于表达本文公开的IPD113多肽的植物的经改
加工方法
进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含IPD1l3多核
“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实例
实例1-从蕨类植物欧洲凤尾蕨分离并鉴定对鳞翅目物种具有活性的
从来自银心凤尾蕨(Pteris cretica cv albolineata)(PS930)和阴
银心凤尾蕨(PS930)和阴地凤尾蕨(PS995)与粗样品具有类似
从-80℃的储存中取出的PS930和PS995的合并的植物材料并且
在用CoomassieTM亮蓝G-250染料染色的LDS-PAGE凝胶上跑样
通过使用
实例2-银心凤尾蕨的转录组测序和IPD113Aa的克隆
如下制备白斑凤尾蕨(Pteris albolineata)的异名，银心凤尾蕨(ID
根据
针对通过来自PS930的转录组装配体的可读框(ORF)预测的蛋
实例3-IPD113Aa在瞬时叶组织上的表达和昆虫生物测定
为了证实IPD113Aa多肽(SEQ ID NO：1)的活性，将相应的基
表1
表2
实例4-IPD113Aa同源物的鉴定
可以通过在针对序列相似性的默认参数下进行BLASTTM(基本
表3
通过从总RNA逆转录，从具有由内部数据库鉴定的同源物的来
如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，使用尼德曼-
表4
表5
实例5-农杆菌介导的IPD113同源物在豆中的瞬时表达
使用如实例3中所述的矮菜豆瞬时表达系统测量IPD113同源物
表6
实例6-用在大肠杆菌中表达的纯化的IPD113蛋白进行的鳞翅目测定
将选择的IPD113同源物从它们各自的瞬时表达载体亚克隆到含
表7
实例7-构建IPD113嵌合体和具有多个氨基酸取代的变体
为了产生具有多样化序列的活性变体，通过多重PCR片段重叠
如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，使用尼德曼-
表8
测试的IPD113Aa变体的活性谱总结在表9中，其中“++++”表
表9
实例8-IPD113同源物之间的嵌合体
为了产生具有多样化序列的活性变体，通过多重PCR片段重叠
如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，使用尼德曼-
表10
测试的IPD113嵌合体的活性谱总结在表11中，其中“++++”
表11
  SBL FAW CEW ECB VBC
pAL-1942 + + ++ + +++
pAL-1943 + + + + +
pAL-1944 +++ ++++ +++ +++ ++++
pAL-1945 +++ +++ ++++ +++ ++++
pAL-1946 + +++ + + ++
pAL-1998 + +++ + ++ +++
pAL-1999 + + + + +
pAL-2000 +++ +++ ++++ +++ ++++
pAL-2001 + + + + +++
pAL-2002 + + + + +
实例9-用于在植物中表达IPD113多肽的载体构建体
为了在玉米中进行测试，构建表达载体即载体1，以包括转基因
实例10-农杆菌介导的玉米的稳定转化
对于杀昆虫多肽的农杆菌介导的玉米转化，使用在甘露糖选择下
实例11-稳定转化的玉米植物针对一系列鳞翅目昆虫的昆虫防治效力
从经转化的玉米植物切除叶圆盘，并且测试IPD113Dh多肽(SEQ 
实例12-大豆(Soybean，Glycine max)的转化和再生
通过粒子枪轰击法(Klein等人，Nature[自然](伦敦)327：70-73
储备溶液：
硫酸盐100X储备液：
37.0g MgSO4.7H2O、1.69g MnSO4.H2O、0.86g ZnSO4.7H2O、
卤化物100X储备液：
30.0g CaCl2.2H2O、0.083g KI，0.0025g CoCl2.6H2O
P，B，Mo 100X储备液：
18.5g KH2PO4、0.62g H3BO3、0.025g Na2MoO4.2H2O
Fe EDTA 100X储备液：
3.724g Na2EDTA、2.784g FeSO4.7H2O
2，4-D储备液：
10mg/mL维生素
B5维生素，1000X储备液：
100.0g肌醇、1.0g烟酸、1.0g吡哆醇HCl、10g硫铵HCL。
培养基(每升)：
SB199固体培养基：
1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)、1mL维生素B5 1000X
SB1固体培养基：
1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)、1mL维生素B5 1000X
SB196：
10mL的以上储备溶液1-4中的每种、1mL维生素B5储备液、
SB71-4：
Gamborg’s B5盐、20g蔗糖、5g TC琼脂(pH 5.7)。
SB103：
1pk.Murashige和Skoog盐混合物、1mL维生素B5储备液、750
SB166：
补充有5g每升活性炭的SB103。
大豆胚悬浮培养起始：
种植后45-55天从可利用的大豆植物中挑出未成熟种子的豆荚，
培养条件：
将大豆胚悬浮培养液(cv.93Y21)维持在50mL液体培养基
制备用于轰击的DNA：
在粒子枪轰击程序中，可以使用纯化的1)整个质粒DNA；或2)
组织制备和DNA轰击：
将大约100mg的两周龄的悬浮培养物置于一个空的60mm X15
经转化的胚的选择和植物再生：
轰击后，将来自每个轰击板的组织分开，并放置在每板轰击的组
在成熟培养基上四周(在SB166上1周，随后在SB103上3周)
实例13-影响蛋白质稳定性和IPD113功能的氨基酸位置的鉴定
为鉴定影响IPD113的蛋白结构稳定性和杀昆虫功能的氨基酸位
表12总结了在IPD113Dap(SEQ ID：113)的每个诱变位置处鉴
表12
对本公开的各种所说明的实施例的上述描述并不旨在是详尽的
可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下
背景技术、具体实施方式和实例中引用的每个文献(包括专利、
就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准

Claims (19)

1.一种重组杀昆虫多肽，所述重组杀昆虫多肽如SEQ ID NO: 100、102、113或114的氨基酸序列所示。
2.如权利要求1所述的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫多肽与异源信号序列或转运序列连接。
3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1所述的重组杀昆虫多肽。
4.一种农业组合物，所述农业组合物包含至少一种权利要求1所述的重组杀昆虫多肽。
5.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码权利要求1所述的杀昆虫多肽。
6.如权利要求5所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调节元件。
7.如权利要求5所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸具有经优化用于在农业上重要的作物中表达的密码子。
8.如权利要求5所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸是cDNA。
9.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码权利要求3所述的融合蛋白。
10.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含权利要求5所述的重组多核苷酸。
11.一种生产转基因植物的方法，其包括将权利要求5所述的多核苷酸引入植物或植物部分。
12.一种生产转基因植物的方法，其包括将权利要求10所述的DNA构建体引入植物或植物部分。
13.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体生长或将其杀灭的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物与权利要求1所述的杀昆虫多肽接触，其中所述昆虫有害生物或昆虫有害生物群体是玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾。
14.一种控制昆虫有害生物对植物的损害的方法，所述方法包括向所述昆虫有害生物或有害生物群体提供权利要求1所述的杀昆虫多肽以供摄取，其中所述杀昆虫多肽由转基因植物产生，并存在于至少一株所述植物中，并且其中所述昆虫有害生物或昆虫有害生物群体是玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾。
15.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体生长或将其杀灭的方法，所述方法包括在转基因植物中表达权利要求5所述的多核苷酸，其中所述昆虫有害生物或昆虫有害生物群体是玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾。
16.一种用于控制昆虫有害生物侵染的方法，所述方法包括在所述有害生物的饮食中提供根据权利要求12所述的方法生产的转基因植物或其一部分，其中所述昆虫有害生物或有害生物群体是玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾。
17.一种用于提高作物产量的方法，所述方法包括使根据权利要求12所述的方法生产的转基因植物生长，其中相对于不包含所述转基因植物的作物，在昆虫有害生物存在下所述作物的产量增加，其中所述昆虫有害生物或有害生物群体是玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾。
18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述转基因植物选自玉米、大豆、小麦、水稻、高粱、向日葵、大麦、甘蔗、马铃薯、番茄、棉花、油菜籽植物、花生和苜蓿。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述转基因植物是卡诺拉油菜。
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Correct: Nucleotide and amino acid sequence table of the instruction manual submitted on March 29, 2023

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