CN111629587A

CN111629587A - 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽的组合及其用途

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Publication number: CN111629587A
Application number: CN201880079727.XA
Authority: CN
Inventors: A.L.卢; K.迈尔; G.劳谢尔; G.吴
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-09-04
Also published as: WO2019125717A1; RU2020123976A; EP3726964A4; US20230227843A1; EP3726964A1; ZA202003373B; AR113431A1; BR112020012658A2; CA3083276A1; US20200332314A1; MX2020006448A

Abstract

本发明提供了用于防治有害生物的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列来转化生物体。特别地，所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是细菌物种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建随后转化到包括植物在内的目的生物体中的表达载体，作为用于分离其他同源(或部分同源的)基因的探针。所述杀有害生物蛋白可用于防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体，抑制其生长或将其杀灭，并且可用于生产具有杀昆虫活性的组合物。

Description

具有改善的活性谱的杀昆虫多肽的组合及其用途

交叉引用

本申请要求2017年12月22日提交的美国临时申请号62/609879的权益，所述临时申请通过引用以其全文并入本文。

以电子方式提交的序列表的引用

该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“7497WOPCT_SequenceListing”，创建于2018年11月05日，且具有1130千字节大小，并且与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开涉及分子生物学领域。提供了包含编码杀有害生物蛋白的基因的分子堆叠物或育种堆叠物的转基因植物。这些编码杀有害生物蛋白的核酸序列的堆叠物可用于产生抗有害生物转基因植物。

背景技术

使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物防治，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强的靶特异性。另外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，所述昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今为止发现的最成功的生物防治剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，作为有害生物化学防治的替代品在农业上起着重要作用。

通过将作物植物进行遗传工程改造以从芽孢杆菌属产生杀有害生物蛋白，已经开发出抗昆虫增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从苏云金芽孢杆菌菌株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些经遗传工程改造的作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些经遗传工程改造的昆虫抗性作物植物仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在一些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴定用于有害生物防治的替代性生物防治剂。

因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新杀有害生物蛋白和杀有害生物蛋白的组合，例如针对鳞翅目和鞘翅目中的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述昆虫包括但不限于已对现存杀昆虫剂产生抗性的昆虫有害生物。

发明内容

在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的转基因堆叠物和方法。转基因堆叠物包括杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体、以及包含所述载体的宿主细胞。还提供了包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的组合物。还提供了防治昆虫有害生物群体的方法。

在一个方面，涵盖了包含IPD103多肽的转基因堆叠物。提供了包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、和SEQ IDNO：38以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合的IPD103多肽的转基因堆叠物。还提供了包含IPD103多肽和至少一种编码另一种杀昆虫多肽的其他基因的转基因堆叠物。提供了包含IPD103多肽和至少一种选自以下的杀有害生物多肽的转基因堆叠物：Cry1B多肽、变体Cry1B多肽、Cry1C多肽、Cry1D多肽、和Cry1J多肽。

在另一方面，提供了用于产生转基因堆叠物和使用那些多肽来防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达本文公开的杀有害生物序列中的一种或多种。在不同实施例中，所述转基因植物进一步包含一种或多种另外的抗昆虫基因，例如，用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。所述转基因植物可以包含赋予目的农艺性状的任何基因。

在另一方面，还包括用于在样品中检测实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测转基因堆叠物的存在的试剂盒。所述试剂盒可以与实施预期试剂检测的方法所需的所有试剂和对照样品，以及使用说明书一起提供。

在另一方面，实施例的组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含所述生物体的组合物对于农业目的是所希望的。

附图说明

图1A-1B显示了使用Vector

套件的

模块，IPD1 03Aa多肽(SEQID NO：2)、IPD103Ab多肽(SEQ ID NO：4)、IPD103Ac多肽(SEQ ID NO：6)、IPD103Ad多肽(SEQID NO：8)、IPD103Ae多肽(SEQ ID NO：10)、IPD103Ba多肽(SEQ ID NO：12)、IPD103Bb多肽(SEQ ID NO：14)、IPD103Bc多肽(SEQ ID NO：16)、IPD103Bd多肽(SEQ ID NO：18)、IPD103Be多肽(SEQ ID NO：20)、IPD103Bf多肽(SEQ ID NO：22)、IPD103Bg多肽(SEQ ID NO：24)、IPD103Bh多肽(SEQ ID NO：26)、IPD103Ca多肽(SEQ ID NO：34)、以及IPD103Da多肽(SEQ IDNO：38)的氨基酸序列比对。突出显示了氨基酸序列之间的氨基酸序列多样性。保守氨基酸差异是由(A)阴影表示，而非保守氨基酸差异由(A)阴影表示。

图2显示了来自表达IPD103Aa多肽(SEQ ID NO：2)的构建体PHP79658、PHP79559和PHP79660的、单个转基因T0玉米事件的CEW、ECB和FAW的％叶损害。

图3显示了来自表达IPD103Aa多肽(SEQ ID NO：2)的构建体PHP79658、PHP79559和PHP79660的、单个转基因T0玉米事件的CEW的总玉米穗取食(cm²)。

图4显示了反映来自实例16的SDS-PAGE凝胶的凝胶内荧光的密度测定值的曲线，针对25nM IPD103Aa^Alexa与谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(玉米穗蛾(Corn Earworm))BBMV的结合的同源竞争，其量被标准化为在不存在未标记的IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的情况下结合的量。实线反映了数据的平方逻辑斯蒂方程的最佳拟合。

图5显示了反映来自实例16的SDS-PAGE凝胶的凝胶内荧光的密度测定值的曲线，针对25nM IPD103Aa^Alexa与玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲玉米螟(European CornBorer))BBMV的结合的同源竞争，其量被标准化为在不存在未标记的IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的情况下结合的量。实线反映了数据的平方逻辑斯蒂方程的最佳拟合。

具体实施方式

应理解，本公开不局限于所描述的特定方法、方案、细胞系、属、以及试剂，因此可以变化。还应当理解的是本文所使用的术语是仅为了描述具体实施例的目的，并且不旨在限制本公开的范围。

如本文所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括多个此类细胞，并且提及“所述蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质及等同物。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。

本公开涉及用于防治有害生物的分子堆叠物和育种堆叠物以及方法。如本文所使用的，“分子堆叠物”被定义为在一个或多个重组DNA中被同时或连续地递送到单个转基因基因座中的多个性状基因。如本文所使用的，“育种堆叠物”被定义为通过常规育种，通过使在第一转基因基因座中含有一个或多个单个转基因的转基因植物与在第二转基因基因座中含有其他单个或多个转基因的另一转基因植物杂交，而进行递送的多个性状基因。所述方法涉及用编码IPD103多肽和至少一种其他杀有害生物多肽的分子核酸序列转化生物体。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。所述组合物包括细菌物种的杀有害生物核酸和蛋白。转基因堆叠物可用于防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和/或线虫有害生物群体并且可用于产生具有杀有害生物活性的转基因植物。目的昆虫有害生物包括但不限于：鳞翅目物种，所述鳞翅目物种包括但不限于：玉米穗蛾(CEW)(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(European Corn Borer)(ECB)(玉米螟(Ostrinia nubialis))，小菜蛾(diamond-back moth)，例如玉米穗虫(Helicoverpa zea Boddie)；大豆夜蛾(soybeanlooper)，例如大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)；以及黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)，例如梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)；以及鞘翅目物种，所述鞘翅目物种包括但不限于：西方玉米根虫(Western corn rootworm)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera))-WCRW、南方玉米根虫(Southern corn rootworm)(斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi))-SCRW、和北方玉米根虫(Northern cornrootworm)(北方玉米根虫(Diabrotica barberi))-NCRW。

在本文中使用“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”来指毒素或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，该毒素具有针对以下一种或多种有害生物的毒性活性，这些有害生物包括但不局限于：鳞翅目、双翅目、半翅目以及鞘翅目或线虫门的成员。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，所述生物体包括例如，芽孢杆菌属物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、发光杆菌属(Photorhabdus)物种、致病杆菌属(Xenorhabdus)物种、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、和鲍比氏类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀有害生物蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，例如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-13)，来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：基因库登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas Taiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]，58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学杂志]59：45-50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞、组织和器官培养杂志]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxicology Journal[开放毒理学杂志]，3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)的杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；美国专利公开US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US 20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO2015/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；美国公开号2017-0233440的PtIP-96多肽；美国公开号2018-0222947的IPD079多肽；PCT WO 2017/105987的IPD082多肽，和δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞性cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员(参见Crickmore等人，“Bacillusthuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

δ-内毒素的实例还包括但不限于美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604、8.304,605和8,476,226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端缺失)；PCT WO 2004/020636的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白，如Cry2Ab蛋白)；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人，(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]，74：7145-7151；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry 46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公开号2004/0250311的AXMI-008；美国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的AXMI-014；美国专利申请公开号2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-205；美国专利申请公开号2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利申请公开号2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利申请公开号2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，具有美国专利号8,319,019的修饰的蛋白水解位点的cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员已知的(综述参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途和Cry转基因植物(包括但不限于表达Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的植物)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)PlantBiotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment，CERA)，ILSI研究基金会(ILSI Research Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。一种以上的杀有害生物蛋白也可以在植物中表达，例如Vip3Ab&Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE&Cry1F(US 2012/0311746)；Cry1CA&Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F&CryCa(US2012/0317681)；Cry1Da&Cry1Be(US 2012/0331590)；Cry1Da&Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB&Cry1BE(US 2012/0324606)；Cry1Fa&Cry2Aa和Cry1I&Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab和Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US 20130167268)；以及Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US 20130116170)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Streptomyces)(Purcell等人，(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686、和8,237,020等的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

在一些实施例中，“IPD103多肽”或“IPD103蛋白”被定义为具有杀昆虫活性的多肽，如在PCT WO 2018/005411中所公开的，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38相比，IPD103多肽具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指+/-0.5％。

在一些实施例中，IPD103多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少95％同一性。

在一些实施例中，IPD103多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列。

在一些实施例中，IPD103多肽与SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ IDNO：260或SEQ ID NO：261的氨基酸序列具有至少95％同一性。

在一些实施例中，IPD103多肽包含SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQID NO：260或SEQ ID NO：261的氨基酸序列。

在一些实施例中，“PtIP-83多肽”或“PtIP-83蛋白”被定义为具有杀昆虫活性的多肽，如在美国公开US 21060347799中所公开的，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、和SEQ ID NO：61相比，PtIP-83多肽具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

在一些实施例中，PtIP-83多肽包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、和SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，PtIP-83多肽包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、和SEQ ID NO：61的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1B多肽选自Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、和Cry1Bi1(登录号KC156700)。

在一些实施例中，Cry1B多肽选自US 8,772,577、US 9,404,121、美国公开US20160194364、和美国序列号62/607372的Cry1B，将所述文献并入本文。

在一些实施例中，Cry1B多肽选自SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ IDNO：227、SEQ ID NO：228、和SEQ ID NO：229的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1B多肽是美国公开US 20170226164和WO公开WO 2017/180715的变体Cry1B多肽，将所述文献并入本文。

在一些实施例中，所述变体Cry1B多肽包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210或SEQ ID NO：211的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述变体Cry1B多肽选自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211。

在一些实施例中，Cry1C多肽选自Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6(登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、和Cry1Da3(登录号HQ43978)。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含与SEQ ID NO：230的Cry1Ca多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1D多肽选自Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、Cry1Dc1(登录号ABK35074)、和US 20170233759的Cry1D多肽，将所述文献通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含与US 2017 0233759的Cry1Da多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含与SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的Cry1Da多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1J多肽选自Cry1Ja1(登录号AAA22341)、Cry1Ja2(登录号HM070030)、Cry1Ja3(登录号JQ228425)、Cry1Jb1(登录号AAA98959)、Cry1Jc1(登录号AAC31092)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、Cry1Jd1(登录号CAC50779)。

在一些实施例中，Cry1J多肽选自美国公开号US 20170240603的变体Cry1J。

在一些实施例中，Cry1J变体多肽包含与SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：217或SEQ ID NO：219具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1J变体多肽包含SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：217或SEQ ID NO：219的氨基酸序列。

在一些实施例中，变体Cry1J多肽选自SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：217或SEQ ID NO：219。

核酸分子及其变体和片段

分离的或重组的核酸分子，其包含编码IPD103多肽、PtIP-83多肽、Cry1B多肽、变体Cry1B多肽、Cry1C多肽、Cry1D多肽、和Cry1J多肽的核酸序列。如本文所使用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。

在本文中使用“分离的”核酸分子(或DNA)来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的核酸序列(或DNA)。在本文中使用“重组”核酸分子(或DNA)来指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸是不含在衍生出该核酸的生物体的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸的5′和3′末端的序列)(优选编码蛋白质的序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时排除分离的染色体。

在一些实施例中，编码本公开的多肽的分离核酸分子与天然或基因组核酸序列相比具有核酸序列的一个或多个变化。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；与天然或基因组序列相比，由于氨基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的改变；一个或多个内含子的去除；一个或多个上游或下游调节区的缺失；和与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区域的缺失。在一些实施例中，编码IPD103多肽的核酸分子是非基因组序列。

考虑了编码本公开的多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。当可操作地连接到合适的启动子、转录终止和/或聚腺苷酸化序列上时，这类多核苷酸可用于在宿主细胞中生产本公开的多肽。这类多核苷酸可用于本公开的DNA构建体、分子堆叠物、和育种堆叠物中。

编码多肽的多核苷酸

编码IPD103多肽或相关蛋白的多核苷酸的一个来源是蕨类或其他原始植物物种，所述物种选自但不限于蹄盖蕨属(Athyrium)物种、鹿角蕨属(Platycerium)物种、凤尾蕨属(Pteris)物种、线蕨属(Colysis)物种、肾蕨属(Nephrolepis)物种、耳蕨属(Polystichium)物种、金星蕨属(Thelypteris)物种、三叉蕨属(Tectaria)物种、和骨碎补属(Davallia)物种，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：37的IPD103多核苷酸，所述多核苷酸分别编码SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、和SEQ ID NO：38的IPD103多肽。可以使用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的多核苷酸以在重组细菌宿主(包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、埃希氏杆菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonas)和根瘤菌(Rhizobium)细菌宿主细胞)中表达IPD103多肽。

编码本公开的多肽的多核苷酸也可以由本公开的多肽序列重新合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从本公开的多肽序列推导出来。计算机程序如“BackTranslate”(GCG^TM包，阿克莱瑞公司(Acclerys，Inc.)，San Diego[圣迭戈市]，Calif.[加利福尼亚州])可用于将肽序列转换成编码该肽的相应核苷酸序列。此外，本公开的合成的多核苷酸序列可以被设计成使得它们在植物中表达。

在一些实施例中，“IPD103多核苷酸”被定义为编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的、PCT WO 2018/005411中公开的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，IPD103多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的IPD103多肽。

在一些实施例中，IPD103多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少95％同一性的IPD103多肽。

在一些实施例中，IPD103多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列的IPD103多肽。

在一些实施例中，编码IPD103多肽的多核苷酸是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37中所示序列。

在一些实施例中，IPD103多核苷酸编码包含SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：261的氨基酸序列的IPD103多肽。

在一些实施例中，编码IPD103多肽的多核苷酸是SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ IDNO：249、SEQ ID NO：250或SEQ ID NO：251中所示序列。

在一些实施例中，“PtIP-83多核苷酸”被定义为编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的、美国公开US 21060347799(通过引用并入本文)中公开的多核苷酸。

在一些实施例中，PtIP-83多核苷酸编码与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的PtIP-83多肽。

在一些实施例中，PtIP-83多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的PtIP-83多肽。

在一些实施例中，PtIP-83多核苷酸编码包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、或SEQ ID NO：61的氨基酸序列的PtIP-83多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1B多肽：Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、和Cry1Bi1(登录号KC156700)。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1B多肽：US 8,772,577、US9,404,121、美国公开US 2016 0194364、和美国序列号62/607372的Cry1B，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1B多肽：SEQ ID NO：63、SEQID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、和SEQ ID NO：229的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码美国公开US 20170226164和WO公开WO2017/180715的变体Cry1B多肽，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210或SEQ ID NO：211的氨基酸序列的变体Cry1B多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的变体Cry1B多肽：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ IDNO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ IDNO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ IDNO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ IDNO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ IDNO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ IDNO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1C多肽：Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886)、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6(登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(登录号AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、和Cry1Da3(登录号HQ43978)。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：230的Cry1Ca多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的Cry1C多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列的Cry1C多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1D多肽：Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、和Cry1De1(登录号ABK35074)。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的Cry1Da多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的Cry1D多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的Cry1Da多肽的氨基酸序列的Cry1D多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的Cry1J多肽：Cry1Ja1(登录号AAA22341)、Cry1Ja2(登录号HM070030)、Cry1Ja3(登录号JQ228425)、Cry1Jb1(登录号AAA98959)、Cry1Jc1(登录号AAC31092)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、和Cry1Jd1(登录号CAC50779)。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码美国公开号US20170240603的变体Cry1J多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219具有至少95％同一性的氨基酸序列的Cry1J变体多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQID NO：217或SEQ ID NO：219的氨基酸序列的Cry1J变体多肽。

在一些实施例中，提供的多核苷酸编码选自以下的变体Cry1J多肽：SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219。

在一些实施例中，编码本公开的多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所使用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与该基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区；插入异源5’和/或3’非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

在一些实施例中，编码IPD103多肽的核酸分子是非基因组多核苷酸，所述非基因组多核苷酸具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列，其中所述IPD103多肽具有杀昆虫活性。

在一些实施例中，IPD103多核苷酸编码包含与贯穿SEQ ID NO：2的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的氨基酸序列的IPD103多肽。

组合物

也涵盖组合物，所述组合物包含含有IPD103多肽和至少一种其他杀有害生物蛋白的分子堆叠物或育种堆叠物。

核苷酸构建体、表达盒和载体

如本文所使用的术语“核苷酸构建体”或“DNA构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸构成的多核苷酸和寡核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合也可用于本文公开的方法中。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，所述形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

另外的实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。经转化的生物体包含：实施例的DNA分子、含有DNA分子的表达盒或含有表达盒的载体，它可以稳定地并入经转化的生物体的基因组。

在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。所述构建体将包括可操作地连接到实施例的序列的5′和3′的调节序列。如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。所述构建体可以另外含有待共转化进生物体的至少一个另外的基因。可替代地，可以在多个DNA构建体上提供一个或多个另外的基因。

提供的这种DNA构建体具有用于插入本公开的IPD103多肽基因序列的多个限制性位点，该多肽基因序列将位于调节性区域的转录调节之下。DNA构建体可以另外包含选择性标记基因。

按5′到3′的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始区域(即，启动子)、实施例的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区域(即，终止区)。针对实施例的宿主生物体和/或序列，转录起始区(即，启动子)可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。如本文所使用的，术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”情况下，它是指所述启动子对于实施例的可操作地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如本文所使用的，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列是异源的。当所述启动子是天然(native或natural)序列时，可操作地连接的序列的表达从野生型表达变化，这导致表型的改变。

在一些实施例中，提供了DNA构建体，所述DNA构建体包含：编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；和选自以下的一个或多个多核苷酸：编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1C多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1D多肽的多核苷酸；以及编码具有杀昆虫活性的Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，提供了DNA构建体，其中编码所述多肽的多核苷酸各自可操作地连接到异源调节元件。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的、PCT WO2018/005411中公开的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38具有至少95％同一性的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，DNA包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的、美国公开US 21060347799中公开的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59、或SEQ ID NO：61的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、和Cry1Bi1(登录号KC156700)。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：US 8,772,577、US 9,404,121、美国公US 20160194364、和美国序列号62/607372的Cry1B，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、和SEQ ID NO：229的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码美国公开US 20170226164和WO公开WO2017/180715的变体Cry1B多肽的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码变体Cry1B多肽的多核苷酸，所述变体Cry1B多肽包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210或SEQ ID NO：211的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的变体Cry1B多肽的多核苷酸：SEQID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、和SEQ IDNO：211。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1C多肽的多核苷酸：Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886)、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6(登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(登录号AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、和Cry1Da3(登录号HQ43978)。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含与Cry1Ca多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含Cry1Ca多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1D多肽的多核苷酸：Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、和Cry1De1(登录号ABK35074)。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含与Cry1Da多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含Cry1Da多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的Cry1J多肽的多核苷酸：Cry1Ja1(登录号AAA22341)、Cry1Ja2(登录号HM070030)、Cry1Ja3(登录号JQ228425)、Cry1Jb1(登录号AAA98959)、Cry1Jc1(登录号AAC31092)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、和Cry1Jd1(登录号CAC50779)。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码美国公开号US20170240603的变体Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含与SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219的氨基酸序列。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码选自以下的变体Cry1J多肽的多核苷酸：SEQID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219。

在一些实施例中，DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如本文所使用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。也可以使用各种增强子，其例如包括在植物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子(即，玉米泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464))、ω增强子或ω主要增强子(Gallie等人，(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，编辑：Ceeh(Liss公司，纽约)237-256和Gallie等人，(1987)Gene[基因]60：217-25)、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：1685-96)和美国专利号7,803,992的增强子，其中每一个通过引用并入。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当转录增强子都可用于实施例中。

终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于启动子、目的序列、植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。

方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人，(1991)GenesDev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：7891-7903以及Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-9639。

适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物偏好性密码子来合成以改善表达。有关宿主偏好性使用的讨论，参见，例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：1-11。例如，虽然实施例的核酸序列在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达，但是可以修饰序列，以考虑单子叶或双子叶植物的特定偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已经表现出了差异(Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好性可以源自玉米的已知基因序列。来自玉米植物的28种基因的玉米使用在Murray等人(同上)的表4中列出。可使用合成植物偏好性基因的方法，例如Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，和Liu H等人Mol Bio Rep[分子生物学报告]37：677-684，2010，其通过引用并入本文。玉米(Zea maize)使用表也可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝4577上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

大豆(Glycine max)使用表可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

在一些实施例中，编码本公开的多肽的重组核酸分子具有玉米优化的密码子。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号的序列、编码外显子-内含子剪接位点信号的序列、编码转座子样重复序列的序列和得到充分表征的、可能不利于基因表达的其他序列。可以将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉米宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列包括；小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人，(1995)Gene[基因]165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature[自然]353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)Nature[自然]325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，Cech编著(利斯公司，纽约)，第237-256页)和玉米褪绿斑驳病毒(maize chloroticmottle)前导序列(MCMV)(Lommel，等人，(1991)Virology[病毒学]81：382-385)。还参见，Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84：965-968。此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进该肽的共翻译或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。

如本文所使用的，“信号序列”是指导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，伴随某些产生的糖基化。通常将细菌的杀昆虫毒素合成为原毒素，所述原毒素在所述靶标有害生物的肠中被蛋白水解激活(Chang，(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]153：507-516)。在一些实施例中，所述信号序列位于所述天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如本文所使用的，术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶向信号肽和腔靶向信号肽组成的特征二分型转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基-近端部分。腔靶向信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。高等植物叶绿体蛋白质组学的最新研究已在鉴定许多核编码的腔蛋白质中取得了进展(Kieselbach等人FEBSLETT[欧洲生化学会联盟通讯]480：271-276，2000；Peltier等人.Plant Cell[植物细胞]12：319-341，2000；Bricker等人.Biochim.Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1503：350-356，2001)，根据本公开可能使用所述核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。Kieselbach等人，Photosynthesis Research[光合作用研究]78：249-264，2003报道了来自拟南芥属(Arabidopsis)约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白。特别地，此公开物的表2(其通过引用并入本说明书中)公开了通过其登录号鉴定的来自叶绿体腔的85种蛋白质(还参见美国专利申请公开2009/09044298)。另外，最近公开的水稻基因组草拟版本(Goff等人，Science[科学]296：92-100，2002)是可以根据本公开使用的用于腔靶向信号肽的合适来源。

合适的叶绿体转运肽(CTP)包含嵌合CT，这些嵌合CT包括但不限于：来自以下的CTP的N-末端结构域、中心结构域或C-末端结构域：水稻(Oryza sativa)1-脱氧-D木糖-5-磷酸合酶、水稻-超氧化物歧化酶、水稻-可溶性淀粉合酶、水稻-NADP-依赖性苹果酸酶、水稻-磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶2、水稻-L-抗坏血酸过氧化物酶5、水稻-磷酸葡聚糖水二激酶、玉米ssRUBISCO、玉米-β-葡糖苷酶、玉米-苹果酸脱氢酶、玉米硫氧还蛋白M-型(美国专利申请公开2012/0304336)。

可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向叶绿体的编码本公开的多肽的基因，以解决植物核与所述细胞器之间的使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好性序列合成目的核酸。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

许多启动子可用于实施所述实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成型、组织偏好性、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 1999/43838和美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature[自然]313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如以下美国专利号中所讨论的那些：5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。

根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节实施例的核苷酸序列在植物中表达的特别引人关注的是伤口诱导型启动子。这种伤口诱导型启动子可以对由昆虫取食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28：425-449；Duan等人，(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]215：200-208)；系统素(McGurl等人，(1992)Science[科学]225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters[欧洲生化学会联盟通讯]323：73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6(2)：141-150)等，以上文献通过引用并入本文。

此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这种病原体诱导型启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人，(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；Uknes等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656；以及Van Loon，(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见，WO 1999/43819，其通过引用并入本文。

引人关注的是在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9：335-342；Matton等人，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2：325-331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：2427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]2：93-98以及Yang，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93：14972-14977。还参见Chen等人，(1996)Plant J.[植物杂志]10：955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3：191-201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)及其中引用的参考文献。特别引人关注的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见，例如Cordero等人，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。

可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，所述启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学诱导型启动子包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉米GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他目的化学调节型启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如，Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：10421-10425和McNellis等人，(1998)Plant J.[植物杂志]14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见，例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]227：229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，其通过引用并入本文。

组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的多肽表达。组织偏好性启动子包括描述于以下文献中的那些：Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.[分子遗传学和普通遗传学]254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol[植物生理学]112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Lam，(1994)Results Probl.Call Differ.[细胞分化的结果和问题]20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4(3)：495-505。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。

叶偏好性启动子包括，例如，Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)PlantJ.[植物杂志]3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20)：9586-9590。

根偏好性或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的启动子来选择，或者从不同相容物种重新分离。参见例如，Hire，等人，(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10)：1051-1061(法国菜豆GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3)：433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露聚糖合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)以及Miao等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见，Bogusz等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科作物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi，(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见，Plant Science[植物科学](Limerick[利默里克])79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在所述启动子中是解离的。Teeri等人，(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的尤其希望的特征组合(参见，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示相似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等人，(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691)。还参见，美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。在US20130117883中公开了拟南芥(Arabidopsis thaliana)根偏好性调节序列。

“种子偏好性”启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及种子发芽性启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见，Thompson等人，(1989)BioEssays[生物测定]10：108，其通过引用并入本文。此类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信号)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)(参见美国专利号6,225,529，通过引用结合在此)。γ-玉米醇溶蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku和Goldberg，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：1079-1093)、豆-β菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO 2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子；通过引用并入本文。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“优选”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织偏好性启动子几乎专门在特定组织中表达。

当需要低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文所使用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物之间的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达，以给出低水平总表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。

此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如以下专利文献中所公开的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611，通过引用并入本文。

以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于实施例中。

通常，表达盒将包含选择性标记基因，用于选择经转化的细胞。利用选择性标记基因来选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物(如草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))抗性的基因。合适的选择性标记基因的其他实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等人，(1983)Nature[自然]303：209-213和Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；链霉素(Jones，等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博来霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-136)；溴草腈(Stalker等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)。一般参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.[生物技术当代观点]3：506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell[细胞]71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人，(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人，(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人，(1987)Cell[细胞]49：603-612；Figge等人，(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：2549-2553；Deuschle等人，(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]，University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：5072-5076；Wyborski等人，(1991)NucleicAcids Res.[核酸研究]19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35：1591-1595；Kleinschnidt，等人，(1988)Biochemistry[生物化学]27：1094-1104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36：913-919；Hlavka等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，78卷(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])和Gill等人，(1988)Nature[自然]334：721-724。此类公开内容通过引用并入本文。

以上可选择标记基因的列表并不意在是限制性的。任何选择性标记基因都可用于实施例中。

植物转化

所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文所使用的，“引入”意指将所述多核苷酸或多肽呈送给所述植物，以此类方式使得所述序列进入所述植物细胞的内部。所述实施例的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸或多肽进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

如本文所使用的，“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所使用的，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所使用的“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见，例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等人，(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips 编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林施普林格出版公司])；和McCabe等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；以及Lecl转化法(WO 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见Tu等人，(1998)Plant MolecularBiology[植物分子生物学]37：829-838和Chong等人，(2000)Transgenic Research[转基因研究]9：71-78。可以在以下文献中找到另外的转化方法：Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Scienceand Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh，等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]，12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany[植物学年报]75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌的玉米)；将其全部通过引用并入本文。

在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提供给植物。此类瞬时转化法包括但不限于将多核苷酸或其变体和片段直接引入植物中或将多肽转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人，(1986)MolGen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.[植物科学]44：53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]91：2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784，将其全部通过引用并入本文。可替代地，可以使用以下将多核苷酸瞬时转化到植物中：包括病毒载体系统的技术并以阻止随后释放DNA的方式沉淀多核苷酸。因此，可以从粒子结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)的粒子。

用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。简而言之，实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，所述植物已经稳定地将靶位点并入其基因组中，所述靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。

植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体组成，所述DNA载体由多于一种连续DNA区段组成。这些载体通常被称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常含有包含T-DNA转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、被设计成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和“目的基因”(经工程改造成能够在植物细胞(理想的是转基因植物代的细胞)中表达的基因)。此质粒载体上也存在细菌复制所需的序列。将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，所述反式作用因子介导从农杆菌属到植物细胞的T-DNA转化。所述质粒通常含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行DNA的转移和vir介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux，(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5：446-451)。若干种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。通过其他方法如显微投影、显微镜注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二质粒载体。

通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)以从一组未转化的细胞群中回收经转化的植物细胞。在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中施加最大阈值水平的适当选择以杀死未转化的细胞，并通过定期转移到新鲜培养基中来分离并增殖从所述选择处理中存活的推定经转化的细胞。通过连续传代和使用适当的选择进行挑战，可以鉴定并增殖这些用所述质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到所述转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。

典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，所述经转化的细胞分化成芽。然后将所述芽转移到用于回收已生根的芽或小植物的选择性生根培养基上。然后转基因的小植株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如Hiei等人，(1994)The Plant Journal[植物杂志]6：271-282；Ishida等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750)。典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于生产转基因植物的技术和方法的一般描述发现于以下文献中：Ayres和Park，(1994)Critical Reviews in PlantScience[植物科学评论]13：219-239以及Bommineni和Jauhar，(1997)Maydica[美迪卡杂志]42：107-120。由于经转化的材料含有许多细胞；所以在受试的靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中同时存在经转化的细胞和未经转化的细胞。杀死未经转化的细胞并允许经转化细胞增殖的能力产生经转化的植物培养物。通常，去除未经转化的细胞的能力限制经转化的植物细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。

可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，此类方法涉及将目的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。应当认识到，可以最初将所述实施例的重组蛋白合成为病毒多蛋白的一部分，然后可以在体内或在体外通过蛋白水解加工以产生所需的多肽。还认识到，包含实施例的多肽的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有所需的杀有害生物活性。此类病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列涵盖在所述实施例中。为植物提供核苷酸构建体并在植物中产生编码的蛋白的方法，其涉及病毒DNA或RNA分子，例如在美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931中；通过引用并入本文。

转化叶绿体的方法包括例如：Svab，等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12：601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，通过利用核编码的和质体导向的RNA合酶的组织偏好性表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。这种系统已被报道于以下文献中：McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：7301-7305。

所述实施例进一步涉及实施例的经转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和芽的插条。

所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(corn，Zea mays)，芸苔属(Brassica)物种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，水稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(sorghum，Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(pearl millet，Pennisetum glaucum)、黍(proso millet，Panicum miliaceum)、谷子(foxtail millet，Setaria italica)、龙爪稷(finger millet，Eleusine coracana))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea)物种)，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus)物种)，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa)物种)，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig，Ficus casica)，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum)物种)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属的成员例如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。可以用于实践实施例的针叶树包括(例如)松树如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsugacanadensis)；北美云杉(Sitka spruce，Picea glauca)；红杉(redwood，Sequoiasempervirens)；枞树(true firs)，如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，如玉米和大豆植物。

草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa annua)；一年生黑麦草(黑麦草(Lolium multiflorum))；加拿大早熟禾(Canada bluegrass，Poacompressa)；紫羊茅(Chewing’s fescue，Festuca rubra)；细弱翦股颖(colonialbentgrass，Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(creeping bentgrass，Agrostis palustris)；沙生冰草(crested wheatgrass，Agropyron desertorum)；扁穗冰草(fairwaywheatgrass，Agropyron cristatum)；硬羊茅(长叶羊茅(Festuca longifolia))；草地早熟禾(Kentucky bluegrass，Poa pratensis)；鸭茅(orchardgrass，Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(perennial ryegrass，Lolium perenne)；红狐茅(紫羊茅(Festuca rubra))；小糠草(redtop，Agrostis alba)；粗茎早熟禾(rough bluegrass，Poa trivialis)；羊茅(sheep fescue，Festuca ovina)；无芒雀麦(smooth bromegrass，Bromus inermis)；高羊茅(tall fescue，Festuca arundinacea)；梯牧草(timothy，Phleum pratense)；绒毛剪股颖(velvet bentgrass，Agrostis canina)；碱茅(weeping alkaligrass，Puccinelliadistans)；蓝茎冰草(western wheatgrass，Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属(Cynodon)物种)；圣奥古斯丁草(St.Augustine grass，Stenotaphrum secundatum)；结缕草(结缕属(Zoysia)物种)；百喜草(Bahia grass，Paspalum notatum)；地毯草(carpetgrass，Axonopus affinis)；假俭草(centipede grass，Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(kikuyu grass，Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(seashore paspalum，Paspalumvaginatum)；格兰马草(blue gramma，Bouteloua gracilis)；野牛草(buffalo grass，Buchloe dactyloids)；垂穗草(sideoats gramma，Bouteloua curtipendula)。

目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

植物转化评估

在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(如分析与已整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物)证实异源基因在所述植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是移植到土壤中之前在早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中存在并入的基因的快速方法(Sambrook和Russell，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual.[分子克隆：实验手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，NY[纽约州])。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

植物转化可以通过基因DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂凝胶中进行分级并转移到硝化纤维或尼龙膜上。然后用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测该膜或“印迹”，以证实根据标准技术将引入的基因整合到该植物基因组中(Sambrook 和Russell，(2001)，同上)。

在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并且印迹到尼龙过滤器上(Sambrook和Russell，(2001)同上)。然后通过将所述过滤器与来自杀有害生物基因的放射性探针杂交来测试由所述杀有害生物基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，(2001)同上)。

可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)使用与多肽上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由杀有害生物基因所编码的蛋白质的存在。

将基因组编辑技术引入植物的方法

在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将所公开的多核苷酸组合物引入植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术编辑植物基因组中先前引入的多核苷酸。例如，可以通过使用双链断裂技术(如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等)将所公开的多核苷酸引入植物基因组中需要的位置上。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用CRISPR-Cas系统将所公开的多核苷酸引入基因组中需要的位置上。植物基因组中需要的位置可以是任何对于插入来说需要的靶位点，如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶位点。现有的目的性状可能是内源性状或先前引入的性状。

在一些实施例中，在将所公开的多核苷酸先前已经引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列。可以将位点特异性修饰引入所公开的多核苷酸组合物中，所述位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，可以使用基因组编辑技术在植物基因组内定位紧邻本文公开的多核苷酸组合物的另外的杀昆虫活性蛋白，以产生杀昆虫活性蛋白的分子堆叠物或育种堆叠物。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

转基因植物中性状的堆叠

转基因植物可以包含本文公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠，导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所使用的，术语“堆叠”包括使多个性状存在于相同植物中(即，两个性状都并入核基因组中、一个性状并入核基因组中并且另一个性状并入质体的基因组中、或者两种性状都并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠的性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠物或育种堆叠物。如本文所使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则目的多核苷酸序列可以在任意时间并以任意顺序组合。可以用共转化方案将所述性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。所述序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要引入将抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在所述植物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。

在一些实施例中，提供了包含分子堆叠物的转基因植物，所述分子堆叠物包含：编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；和选自以下的一个或多个多核苷酸：编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1C多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1D多肽的多核苷酸和编码具有杀昆虫活性的Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物提供了针对实夜蛾亚科(Heliothine)和/或灰翅夜蛾属(Spodoptera)有害生物物种的杀昆虫活性。在一些实施例中，实夜蛾亚科和/或灰翅夜蛾属有害生物选自黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(VBC)黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、大豆夜蛾(soybean looper)(SBL)大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米穗蛾(corn earworm)(CEW)玉米穗蛾(Heliothis zea)、烟芽夜蛾(tobacco budworm)(TBW)烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(cotton bollworm)(CBW)谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、秋夜蛾(fall armyworm)(FAW)草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、和南部粘虫(southern armyworm)(SAW)南方灰翅夜蛾(Spodopteraeridania)。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的、PCT WO2018/005411中公开的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEO ID NO：38具有至少95％同一性的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的、美国公开US 21060347799中公开的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59、或SEQ ID NO：61的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、和Cry1Bi1(登录号KC156700)。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：US 8,772,577、US 9,404,121、美国公US 20160194364、和美国序列号62/607372的Cry1B，将这些文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、和SEQ ID NO：229的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码美国公开US 20170226164和WO公开WO2017/180715的变体Cry1B多肽的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码变体Cry1B多肽的多核苷酸，所述变体Cry1B多肽包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQID NO：210或SEQ ID NO：211的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的变体Cry1B多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ IDNO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ IDNO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ IDNO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ IDNO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ IDNO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ IDNO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、和SEQ ID NO：211。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1C多肽的多核苷酸：Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886)、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6(登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(登录号AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、和Cry1Da3(登录号HQ43978)。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含Cry1Ca多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1D多肽的多核苷酸：Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号176415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、和Cry1Dc1(登录号ABK35074)。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含Cry1Da多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的Cry1J多肽的多核苷酸：Cry1Ja1(登录号AAA22341)、Cry1Ja2(登录号HM070030)、Cry1Ja3(登录号JQ228425)、Cry1Jb1(登录号AAA98959)、Cry1Jc1(登录号AAC31092)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、和Cry1Jd1(登录号CAC50779)。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码美国公开号US20170240603的变体Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含与SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219的氨基酸序列。

在一些实施例中，分子堆叠物包含编码选自以下的变体Cry1J多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219。

在一些实施例中，提供了包含育种堆叠物的转基因植物，所述育种堆叠物包含：编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；和选自以下的一个或多个多核苷酸：编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1C多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1D多肽的多核苷酸和编码具有杀昆虫活性的Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物提供了针对实夜蛾亚科和/或灰翅夜蛾属有害生物物种的杀昆虫活性。在一些实施例中，实夜蛾亚科和/或灰翅夜蛾属有害生物选自黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(VBC)黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(soybeanlooper)(SBL)大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米穗蛾(corn earworm)(CEW)玉米穗蛾(Heliothis zea)、烟芽夜蛾(tobacco budworm)(TBW)烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、棉铃虫(cotton bollworm)(CBW)谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、秋夜蛾(fallarmyworm)(FAW)草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、和南部粘虫(southern armyworm)(SAW)南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的、PCT WO2018/005411中公开的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38具有至少95％同一性的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的IPD103多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的、美国公开US 21060347799中公开的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码PtIP-83多肽的PtIP-83多核苷酸，所述PtIP-83多肽包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59、或SEQ ID NO：61的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、和Cry1Bi1(登录号KC156700)。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：US 8,772,577、US 9,404,121、美国公US 20160194364、和美国序列号62/607372的Cry1B，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1B多肽的多核苷酸：SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO；224、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、和SEQ ID NO：229的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码美国公开US 20170226164和WO公开WO2017/180715的变体Cry1B多肽的多核苷酸，将所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码变体Cry1B多肽的多核苷酸，所述变体Cry1B多肽包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQID NO：210或SEQ ID NO：211的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的变体Cry1B多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：13l、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ IDNO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ IDNO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ IDNO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ IDNO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ IDNO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ IDNO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、和SEQ ID NO：211。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1C多肽的多核苷酸：Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886)、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6(登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(登录号AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、和Cry1Da3(登录号HQ43978)。

在一些实施例中，Cry1C多肽包含Cry1Ca多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1D多肽的多核苷酸：Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、和Cry1Dc1(登录号ABK35074)。

在一些实施例中，Cry1D多肽包含Cry1Da多肽的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的Cry1J多肽的多核苷酸：Cry1Ja1(登录号AAA22341)、Cry1Ja2(登录号HM070030)、Cry1Ja3(登录号JQ228425)、Cry1Jb1(登录号AAA98959)、Cry1Jc1(登录号AAC31092)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、和Cry1Jd1(登录号CAC50779)。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码美国公开号US 20170240603的变体Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含与SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码Cry1J变体多肽的多核苷酸，所述Cry1J变体多肽包含SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219的氨基酸序列。

在一些实施例中，育种堆叠物包含编码选自以下的变体Cry1J多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：219。

在一些实施例中，与一种或多种另外的抗昆虫性状堆叠的、编码本文公开的IPD103多肽的多核苷酸可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、经修饰的淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整农艺学方案。

可用于堆叠的转基因包括但不限于：

1.转基因，其赋予昆虫抗性或抗病性并编码：

(A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程改造对具体病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如Jones等人，(1994)Science[科学]266：789(cloning of the tomato Cf-9gene for resistance toCladosporium fulvum[克隆番茄Cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；Martin等人，(1993)Science[科学]262：1432(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringaepv.tomato encodes a protein kinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变体的番茄Pto基因编码蛋白激酶])；Mindrinos等人，(1994)Cell[细胞]78：1089(Arabidopsis RSP2genefor resistance to Pseudomonas syringae[拟南芥RSP2基因用于对抗丁香假单胞菌])，McDowell和Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.[生物科技趋势]21(4)：178-83以及Toyoda等人，(2002)Transgenic Res.[转基因研究]11(6)：567-82。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。

(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或其上建模的合成多肽的基因。参见，例如，Geiser等人，(1986)Gene[基因]48：109，其公开了Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(美国马里兰州罗克韦尔市(Rockville，Md.))，例如

登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出，并为此目的通过引用并入本文：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。

编码杀有害生物蛋白的基因也可以堆叠，包括但不限于：来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)的杀昆虫蛋白，例如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-13)，来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：基因库登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业食品化学杂志]58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年报]59：45-50和Li等人，(2007)Plant CellTiss.Organ Cult.[植物细胞组织和器官培养]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open ToxinologyJournal[开放的毒理学杂志]3：101-118和Morgan，等人，(2001)Applied andEnvir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；美国专利公开US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 2015/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；美国公开号2017-0233440的PtIP-96多肽；美国公开号2018-0222947的IPD079多肽；PCT WO 2017/105987的IPD082多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类别以及苏云金茅孢杆菌溶细胞性Cyt1和Cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员可在以下中找到：Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesei.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

δ-内毒素的实例还包括但不限于美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白，如Cry2Ab蛋白)；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于Naimov等人，(2008)Applied andEnvironmental Microbiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151中；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCTUS 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；US 7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US 2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；US 20110023184的AXMI-205；US 2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063、和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230、和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184：US 2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、和AXMI-045；US 2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US 2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；和美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；以及美国专利申请公开号201I/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白可在以下中找到：Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员已知的(综述参见vanFrannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途和Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(GM Crop Database Center for Environmental RiskAssessment，CERA)，ILSI研究基金会(ILSI Research Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。多于一种杀有害生物蛋白还可以在植物中表达多于一种杀有害生物蛋白，这些杀有害生物蛋白如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)、Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)、Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)、以及Cry1Fa和Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Streptomyces)(Purcell等人，(1993)Biochem Biophys ResCommun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质可在lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html上找到，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alonetoxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素(lycotoxin)-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

(C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)、其变体、基于其的模拟物、或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见，例如Hammock等人，(1990)Nature[自然]344：458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)的杆状病毒表达。

(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见以下公开内容：Regan，(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269：9(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt等人，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]163：1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定咽侧体抑制素(allostatin))；Chattopadhyay等人，(2004)Critical Reviews in Microbiology[微生物学评论]30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2)：300-310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；Ussuf等人，(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7)：847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)Toxicon[毒素]44(4)：385-403。还参见，Tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因。

(E)编码如下酶的多核苷酸，所述酶负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。

(F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，PCT申请WO1993/02197，所属人为Scott等人，该文献公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从登录号39637和67152下的

获得。还参见，Kramer等人，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.[昆虫生物化学与分子生物学]23：691，他们教导编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列；和Kawalleck等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：673，他们提供欧芹ubi4-2多泛素基因的核苷酸序列；以及美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。

(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella等人，(1994)PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。

(H)编码疏水力矩肽(hydrophobic moment peptide)的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852，其公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物，以及PCT申请WO 1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。

(I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes等人，(1993)Plant Sci.[植物科学]89：43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)具有抗性的转基因烟草植物。

(J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy等人，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.[植物病理学年鉴]28：451。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。

(K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。Cf.Taylor等人，摘要#497，SEVENTHINT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS[关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会](爱丁堡，苏格兰，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中酶促失活)。

(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人，(1993)Nature[自然]366：469，他们提出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。

(M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见Lamb等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：1436。Toubart等人，(1992)Plant J.[植物杂志]2：367描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。

(N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，Logemann等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：305表明，表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性。

(O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。Briggs，(1995)Current Biology[当代生物学]5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.[植物生物学当代观点]7(4)：456-64，以及Somssich，(2003)Cell[细胞]113(7)：815-6。

(P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)Pl.Physiol.[植物生理学]101：709-712，和Parijs等人，(1991)Planta[植物]183：258-264，以及Bushnell等人，(1998)Can.J.of Plant Path.[加拿大植物病理学杂志]20(2)：137-149)。还参见，美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利号6,891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防御应答中的第一步(US2012/0110696)。

(Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。

(R)编码胱抑素(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。

(S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865：6,777,592和7,238,781。

(T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 1996/30517；PCT申请WO 1993/19181、WO 2003/033651，以及Urwin等人，(1998)Planta[植物]204：472-479，和Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.[植物生物学当代观点]2(4)：327-31；美国专利号6,284,948和7,301,069以及miR164基因(WO 2012/058266)。

(U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如Shoemaker等人，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mappingin Soybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱]，Plant Genome IV Conference[植物基因组第四次会议]，圣迭戈市，加利福尼亚州(1995)。

(V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此目的通过引入并入本文。

(W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并为此目的通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。

2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：

(A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，所述除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。此类别的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，分别如以下文献中所述：Lee等人，(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和Miki等人，(1990)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序列号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。

(B)编码对草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)有抗性的蛋白质的多核苷酸。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945；4,940,835；5,866,775；6,225,114；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE 37,287E和5,491,288以及国际公开EP 1173580；WO 2001/66704；EP1173581和EP 1173582，为此目的将以上专利通过引用并入本文。还给予植物草甘磷抗性，使所述植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中进行了更全面地描述，为此目的将这两份专利通过引用并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利号7,462,481；7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变aroA基因的DNA分子可以在

登录号39256下获得，并且所述突变基因的核苷酸序列公开于Comai的美国专利号4,769,061中。Kumada等人的欧洲申请号0 333 033和Goodman等人的美国专利号4,975,374公开了赋予除草剂(如L-草铵膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等人的EP申请号0 242 246和0 242 236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；DeGreef等人，(1989)Bio/Technology[生物技术]，7：61描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616和5,879,903，为此目的将以上专利通过引用并入本文。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83：435。

(C)编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲氰(腈水解酶基因))具有抗性的蛋白质的多核苷酸。Przibilla等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3：169描述了用编码突变体psbA基因的质粒对衣藻进行转化。Stalker的美国专利号4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的DNA分子可在

登录号53435、67441和67442下获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于以下文献中：Hayes等人，(1992)Biochem.J.[生物化学杂志]285：173。

(D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸，已经发现其使表达此酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性(参见，例如，Hattori等人，(1995)Mol Gen Genet.[分子遗传学和普通遗传学]246：419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota等人，(1994)Plant Physiol[植物生理学]106：17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等人，(1995)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]36：1687)和各种磷酸转移酶的基因(Datta等人，(1992)Plant Mol Biol[植物分子生理学]20：619)。

(E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，所述原卟啉原氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。对这些除草剂具有抗性的、含有经改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的开发描述于以下文献中：美国专利号6,288,306；6,282,83和5,767,373，以及国际公开WO 2001/12825。

(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，例如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的aad-1基因本身首先在WO 2005/107437中公开(还参见US 2009/0093366)。来自食酸丛毛单胞菌(Delftia acidovorans)的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，所述蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2，4-D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使若干种除草剂失活来赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。

(G)编码美国专利申请公开2003/0135879中公开的、用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；

(H)编码美国专利号4,810,648中所公开的、用于赋予溴苯腈耐受性的溴草腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；

(I)编码以下文献中描述的、用于达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子：Misawa等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4：833-840和Misawa等人，(1994)PlantJ.[植物杂志]6：481-489。

3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因

如：

(A)改变的脂肪酸，例如，通过以下各项：

(1)下调硬脂酰-ACP以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：2624和WO 1999/64579(Genes to AlterLipid Profiles in Corn[改变玉米脂质谱的基因])。

(2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245)。

(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，如在WO 2001/12800中。

(4)改变LEC1，AGP，Dek1，Superal1，mi1 ps和各种Ipa基因如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如，参见WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO2003/011015、美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397、和美国专利申请公开号US2003/0079247、US 2003/0204870以及Rivera-Madrid等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]92：5620-5624。

(5)基因编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美国专利号8,058,571和8,338,152)、用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)、用于改善ω-3脂肪酸谱的报春花属(Primula)Δ6-去饱和酶。

(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)。

(7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达，以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)。

(8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达，以调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平，并改善ω-6与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/0191904)。

(9)核酸分子编码wrinkled1样多肽，用于调节糖代谢(美国专利号8,217,223)。

(B)改变的磷含量，例如，通过

(1)引入植酸酶编码基因将增强植酸的分解，向经转化的植物添加更多的游离磷酸。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)Gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列。

(2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，这可以在玉米中通过以下方法来完成：克隆然后重新引入与一个或多个等位基因相关联的DNA，如在以低水平的植酸为特征的玉米突变体中经鉴定的LPA等位基因，例如WO 2005/113778中所述；和/或改变肌醇激酶活性，如WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1998/45448、WO1999/55882、WO 2001/04147中所述。

(C)改变的碳水化合物(例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因而影响其)，或改变硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见，美国专利号6,531,648，为此目的将其通过引用结合)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体如cs27或TUSC27或en27的基因(参见，美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/0204418，为此目的将其通过引用并入)。参见，Shiroza等人，(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：810(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：292(表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，

等人，(1993)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)以及Fisher等人，(1993)Plant Physiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、Fragile 1和2、Refl、HCHL、C4H改进消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平生产高油种子的方法(AGP))。本文提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。

(D)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见，涉及操作抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和WO 2000/68393，和通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。

(E)改变的种子必需氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1999/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1998/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、WO 1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程改造的种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的必需氨基酸的明确结构的合成储存蛋白，用于改善植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨酸增加)、WO 1995/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、WO2001/79516。

4.控制雄性不育的基因：

有若干种赋予遗传性雄性不育的方法，如在基因组内单独位置处赋予雄性不育的多个突变基因，如Brar等人在美国专利号4,654,465和4,727,219中所公开的，以及染色体易位，如Patterson在美国专利号3,861,709和3,710,511中所述。除这些方法之外，Albertsen等人的美国专利号5,432,068描述了核雄性不育的系统，其包括：鉴定对雄性能育性至关重要的基因；沉默这种对雄性能育性至关重要的天然基因；从基本的雄性能育性基因中除去天然启动子并用诱导型启动子替换；将此经遗传工程改造的基因插回入植物；并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子未打“开”，导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或将启动子打“开”来恢复能育性，该启动子反过来又允许赋予雄性能育性的基因被转录。

(A)在绒毡层特异性启动子的控制下以及应用化学品N-Ac-PPT引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)。

(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 1992/13957)。

(C)引入barnase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19：611-622)。

关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和6,265,640，所有这些专利都通过引用并入本文。

5.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因。

这包括引入可以在FLP/FRT系统中使用的FRT位点和/或可以在Cre/Loxp系统中使用的Lox位点。例如，参见Lyznik等人，(2003)Plant Cell Rep[植物细胞报告]21：925-932和WO 1999/25821，以上文献通过引用并入本文。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser等人，(1991)Vicki Chandler，The Maize Handbook[玉米手册]，第118章(Springer-Verlag[施普林格出版社]，1994))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。

6.影响非生物胁迫抗性的基因

包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮反应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量的增加。

(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分利用效率；美国专利号5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521。

(B)WO 199938977描述了基因，所述基因包括有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的CBF基因和转录因子。

(C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改善的植物表型，如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性。

(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素表达被修饰，导致具有增加的胁迫耐受性的植物，如耐旱性和/或增加的产量。还可参见：WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)。

(E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和WO 2000/32761。

(F)对于植物转录因子或非生物胁迫的转录调节子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852。

(G)增加液泡焦磷酸酶如AVP1表达以提高产量的基因(美国专利号8,058,515)；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类热休克因子)多肽(寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽)的核酸；间隔期2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源框1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开号US 201I/0283420)。

(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸以调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)以增加活力。

(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)。

(J)编码用于调节发育、调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的ACC合酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公开号US 2010/0287669)。

(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白质的多核苷酸(WO 2012/058528)。

(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)。

(M)针对胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白质(美国专利号8,338,661)。

(N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增加(美国专利申请公开号2010/0257633)。

(O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下组成：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽、和YTP多肽，这些多肽增加产量相关性状(美国专利申请公开号2011/0061133)。

(P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中的产量相关性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。

影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或渐渗到植物中，参见例如WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利号6,573,430(TFL)、美国专利号6,713,663(FT)、WO1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。

7.赋予增加的产量的基因

(A)由编码核酸的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽(ACCDP)转化的转基因作物植物，其中，与所述植物的野生型品种相比，在所述作物植物中的核酸序列的表达使所述植物具有增加的根生长、和/或增加的产量、和/或增加的对环境胁迫的耐受性(美国专利号8,097,769)。

(B)已显示，使用种子偏好性启动子的玉米锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/0079623)。

(C)已显示，玉米侧生器官界限(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成型过表达能增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/0079622)。

(D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽(WO 2012/038893)的核酸的表达来增强植物中产量相关的性状。

(E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。

(F)编码用于修饰植物根系结构的核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公开号2009/0064373)。

8.赋予植物可消化性的基因。

(A)通过调节木聚糖合成酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖水平(美国专利号8,173,866)。

在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得监管批准的性状或事件，包括但不限于如下具有监管许可的事件，这些事件可以在环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，其可以使用www前缀进行访问)和在国际农业生物技术应用服务部门(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，其可以使用www前缀进行访问)找到。

基因沉默

在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种目的多核苷酸沉默的形式，导致对一种或多种靶有害生物多肽的抑制。在一些实施例中，使用抑制DNA构建体来实现该沉默。

在一些实施例中，编码IPD103多肽的多肽或其片段或变体的一种或多种多核苷酸可以与编码具有如上所述的杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地可以进一步包括提供如下文所述一种或多种靶多核苷酸的基因沉默的一种或多种多核苷酸。

“抑制DNA构建体”是重组DNA构建体，当被转化或稳定整合到植物的基因组中时，导致该植物中靶基因的“沉默”。所述靶基因对于所述植物可以是内源的或转基因的。本文中关于靶基因使用的“沉默”通常是指抑制由该靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平，和/或酶活性或蛋白质功能性的水平。术语“抑制”包括调低、降低、下调、减少、抑制、消除和预防。“沉默”或“基因沉默”并没有指定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。

抑制DNA构建体可以包含源自目的靶基因的区域，并且可以包含目的靶基因的正义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。取决于待使用的方法，所述区域可以与目的基因的全部或部分正义链(或反义链)具有100％同一性或小于100％同一性(例如，至少50％或者51％和100％之间任何整数的同一性)。

抑制DNA构建体，一旦选择了目的靶基因就可以构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、以及(更普遍地)RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体(如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微小RNA)构建体)。

“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的生产。

“反义RNA”是指与靶标初级转录物或mRNA的全部或部分互补、并且阻断靶标分离的核酸片段表达的RNA转录物。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的正义RNA转录物的产生。“正义”RNA是指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以正义方向过表达与天然mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见，Vaucheret等人，(1998)Plant J.[植物杂志]，16：651-659和Gura，(2000)Nature[自然]404：804-808)。

另一个变化描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列的抑制的用途(PCT公开号WO 1998/36083)。

最近的工作已经描述了并入互补方向上的全部或部分mRNA编码序列的“发夹”结构的用途，该“发夹”结构产生了已表达的RNA的潜在“茎-环”结构(PCT公开WO 1999/53050)。在这种情况下，所述茎由对应于相对于启动子在正义或反义方向上插入的目的基因的多核苷酸形成，并且所述环由目的基因的一些多核苷酸形成，这些多核苷酸在所述构建体中不具有互补序列。这增加了已回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。对于发夹抑制的综述，参见Wesley等人，(2003)Methods in Molecular Biology，Plant FunctionalGenomics：Methods and Protocols[分子生物学中的方法，植物功能基因组：方法和方案]236：273-286。

具有由来自待抑制的基因的至少30个核苷酸形成的茎和由随机核苷酸序列形成环的构建体也已被有效地用于抑制(PCT公开WO 1999/61632)。

也已经描述了使用多聚-T和多聚-A序列来产生茎-环结构中的茎(PCT公开WO2002/00894)。

另一个变化包括使用合成重复序列促进茎-环结构中的茎的形成。已经显示用这种重组DNA片段制备的转基因生物体中由PCT公开WO 2002/00904中所述的形成环的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低。

RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature[自然]391：806)。植物中相应的过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为压抑(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，用于预防外源基因的表达，并且通常为不同的区系(flora)和门(phyla)所共享(Fire等人，(1999)Trends Genet.[遗传学趋势]15：358)。这种来自外源基因表达的保护可以应答于源自病毒感染的双链RNA(dsRNA)的产生或者从通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应将转座子元件随机整合到宿主基因组中而逐步形成。dsRNA在细胞中的存在通过尚未完全表征的机制来触发RNAi应答。

细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与将dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片(Berstein等人，(2001)Nature[自然]409：363)。源自切丁酶活性的短干扰RNA的长度典型地为约21至约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发育]15：188)。切丁酶也已经涉及从涉及翻译控制的保守结构的前体RNA中切除21-和22-核苷酸时序小RNA(stRNA)(Hutvagner等人，(2001)Science[科学]293：834)。RNAi应答也是内切核酸酶复合物的特点，所述内切核酸酶复合物通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导与siRNA双链体的反义链具有序列互补性的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发育]15：188)。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA(例如miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节染色质结构的细胞机制，并且从而防止靶基因序列的转录(参见例如，Allshire，(2002)Science[科学]297：1818-1819；Volpe等人，(2002)Science[科学]297：1833-1837；Jenuwein，(2002)Science[科学]297：2215-2218以及Hall等人，(2002)Science[科学]297：2232-2237)。因此，本公开的miRNA分子可用于经由与RNA转录物的相互作用或者通过与特定基因序列的相互作用来介导基因沉默，其中这种相互作用导致转录或转录后水平的基因沉默。

进一步提供了允许产生自沉默元件的RNAi增加的方法和组合物。在这类实施例中，所述方法和组合物采用第一多核苷酸，其包含可操作地连接到植物细胞中有活性的启动子的靶标有害生物序列的沉默元件；以及第二多核苷酸，其包含抑制增强子元件，所述抑制增强子元件包含靶标有害生物序列或者与在植物细胞中有活性的启动子可操作地连接的活性变体或其片段。具有抑制增强子元件的沉默元件的组合表达导致从所述沉默元件产生的抑制性RNA的扩增增加超过了仅单独通过所述沉默元件的表达可实现的增加程度。除了特异性RNAi物种本身的扩增增加之外，所述方法和组合物进一步允许产生可以增强破坏靶基因表达的有效性的多种RNAi物种群体。正如，当抑制增强子元件在植物细胞中与沉默元件组合表达时，所述方法和组合物可以允许在整个植物内系统地产生RNAi；生产比仅单独用沉默元件构建体所能观察到的更大量的RNAi；以及更多的RNAi加载入植物韧皮部中，从而通过RNAi方法更好地防治取食韧皮部的昆虫。因此，各种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改善方法。参见，例如美国专利申请公开2009/0188008。

如本文所使用的，“抑制增强子元件”包含如下多核苷酸，该多核苷酸包含待抑制的靶序列或者其活性片段或变体。应当认识到，抑制增强子元件不需要与靶序列相同，但是所述抑制增强子元件可以包含所述靶序列的变体，只要所述抑制增强子元件与靶序列具有足够的序列同一性，以允许由所述沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过所述沉默元件的表达可达到的增加程度。相似地，所述抑制增强子元件可以包含所述靶序列的片段，其中所述片段具有足够的长度以允许由所述沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过所述沉默元件表达可实现的增加程度。

应当认识到，可以使用来自相同靶序列或来自不同靶序列或者来自相同靶序列的不同区域的多种抑制增强子元件。例如，所使用的抑制增强子元件可以包含源自靶序列的不同区域(即来自3′UTR、编码序列、内含子和/或5′UTR)的靶序列片段。此外，如本文别处所述，所述抑制增强子元件可以包含在表达盒中，并且在具体实施例中，所述抑制增强子元件在与所述沉默元件相同或不同的DNA载体或构建体上。所述抑制增强子元件可以可操作地连接到如本文公开的启动子上。应当意识到，可以组成型或替代地表达抑制增强子元件，或可替代地，所述元件能以阶段特异性方式使用本文别处讨论的各种可诱导或组织偏好性或发育调节的启动子产生。

在具体实施例中，使用沉默元件和抑制增强子元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在另外的实施例中，本公开的植物或植物部分具有比用单独的沉默元件构建体的表达所能观察到的更多的RNAi加载入植物韧皮部中，并且从而通过RNAi方法更好地防治取食韧皮部的昆虫。在具体实施例中，本公开的植物、植物部分和植物细胞可以进一步被表征为允许产生多种RNAi种类，这些RNAi种类可以增强破坏靶基因表达的有效性。

在具体实施例中，沉默元件和抑制增强子元件的组合表达使植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中抑制性RNA的浓度增加超过单独表达所述沉默元件时所能达到的增加水平。

如本文所使用的，当与适当的对照植物相比时，“抑制性RNA的水平增加”包括在具有该组合表达的植物中产生的RNAi水平的任何统计学上显著的增加。例如，当与适当的对照相比时，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1％、约1％-5％、约5％-10％、约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约40％-50％、约50％-60％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-100％或更高的增加。在其他实施例中，当与适当的对照相比时，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100倍或更多倍的增加。美国专利申请公开2011/0301223和美国专利申请公开2009/0192117中可以找到用于防治蝽象和草盲蝽属(Lygus)的沉默元件和抑制增强子元件组合表达的实例。

一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))中靶基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶基因表达的方法，所述方法作为控制昆虫侵袭的手段。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶H亚基的RNAi，可用于防治如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵染。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调如下靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述靶基因编码：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、Pros 25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Pros β2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫跨膜四蛋白(Tetraspanine)2A蛋白(推定的跨膜结构域蛋白)；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶激活剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫囊泡H+ -ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。PCT公开WO 2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和US 2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了干扰双链核糖核酸以抑制无脊椎动物有害生物的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

在有害生物防治方面的用途

可以使用在有害生物防治或使其他生物体工程化中用于使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法。

可以选择占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在具体环境中成功地与野生型微生物竞争，为表达IPD103多肽的基因供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对该杀有害生物剂的保护使其不受环境降解和失活的影响。

杀有害生物组合物

在一些实施例中，活性成分能以组合物的形式施用并且可以与其他化合物同时或相继施用于需要处理的作物区域或植物。这些化合物可以是在单次施用所述制剂后允许长期对靶区域进行给予的肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放的或可生物降解的运载体制剂。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的若干种的混合物，如果需要，与另外的农业上可接受的运载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起。合适的运载体和助剂可以是固体或液体，并且对应于在制剂技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。类似地，制剂可以制备成可食用的“诱饵”或者塑成有害生物“陷阱”以允许靶标有害生物取食或摄取所述有害生物制剂。

施用含有由细菌菌株产生的IPD103多肽中的至少一种的活性成分或农用化学组合物的方法包括叶子施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵染的强度。

可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含所述多肽的细胞培养物等常规方法进行制备。在所有这类含有至少一种这样的杀有害生物多肽的组合物中，所述多肽能以按重量计从约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本公开的方法在给定区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或减少其数量，或者可以预防性地将其施用于环境区域以防止易感有害生物的侵袭。优选地，所述有害生物摄入杀有害生物有效量的多肽或与其接触。如本文所使用的“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或显著减少有害生物生长、取食或正常生理发育的有害生物的量。所述量将根据例如待控制的具体靶有害生物，待处理的特定环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物施用的方法、速率、浓度、稳定性和数量等因素而变化。制剂也可以根据气候条件、环境因素和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重程度而变化。

可以通过用所需的农业上可接受的运载体配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液或分离的蛋白组分来制备所需的杀有害生物剂组合物。可以在施用之前以适当方式(如冻干、冷冻干燥、干燥)或者在水性运载体、培养基或合适的稀释剂(如盐水或其他缓冲液)中配制所述组合物。配制的组合物可以是尘剂或颗粒状物质的形式或者在油(植物或矿物)或水或油/水乳液中的悬浮液或者作为可湿性粉剂或者与适用于农业应用的任何其他运载体材料组合的形式。可以使用合适的农业运载体可以是固体或液体。术语“农业上可接受的运载体”涵盖在杀有害生物剂制剂中，用于杀有害生物剂制剂技术的所有助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等。制剂可以与一种或多种固体或液体助利混合，并通过各种方法(例如通过使用常规配制技术将杀有害生物组合物与合适的助剂均匀混合、共混和/或研磨)制备。美国专利号6,468,523中描述了合适的制剂和施用方法，其通过引用并入本文。还可以用一种或多种化学组合物处理植物，所述化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：果实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉米除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉米杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉米杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆-乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；卡诺拉油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；卡诺拉油菜杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；卡诺拉油菜杀昆虫剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氟虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆-乙基、嗪草酮、喹禾灵、精异丙甲草胺(S-metolachlor)、环己通(Hexazinne)或其组合。

在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。

杀有害生物和杀昆虫活性

“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目和鞘翅目。

实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。

鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)(甜菜粘虫(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(斜纹夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑切根虫(blackcutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(western cutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübher)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusiani Hübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includensWalker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾((Anticarsia gemmatalis Hübner)，绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar))；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟青虫(tobacco budworm))；一星黏虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittellaFabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉铃虫(cottonbollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyeloistransitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniellaZeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautellaWalker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(ricestem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyracephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellusClemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grape leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melonworm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraeagrandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreumaloftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflowermoth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(1essercornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser waxmoth))；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆英野螟(Marucatestulalis Geyer)(豆英蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷螟(Indian meal moth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celeryleaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheadedbudworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Easternblackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruittree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leafroller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von

)(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylishospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydialatiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopizaviteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoeciliaambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricolaMeyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholitamolesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleimahelianthaha Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属物种(Argyrotaeniaspp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。

鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖指明亚种(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlocklooper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Westernhemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manducaquinquemaculata Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomatohornworm))；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)、烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(wintermoth))；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orangedog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(Californiaoakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrusleafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small whitebutterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined whitebutterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichokeplume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia protodice)(Boisduval和Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionarycaterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbingclothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomatoleafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。

引人关注的是鳞翅目、夜蛾科、实夜蛾亚科的幼虫和成虫。实夜蛾亚科包括以下属：曙夜蛾属(Adisura)、Aedophron、Australothis、Baptarma、Chazaria、Derrima、Eutricopis、Hebdomochondra、铃夜蛾属(Helicoverpa)、Heliocheilus、Heliolonche、实夜蛾属(Heliothis)、Heliothodes、Melaporphyria、Micriantha、Microhelia、Periphanes、Protadisura、Psectrotarsia、Pyrocleptria、焰夜蛾属(Pyrrhia)、Rhodoecia、Schinia、和Stenoecia。

引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granariusLinnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hyperapunctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stemweevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maizebillbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲指明亚种(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi(Smith和Lawrence))(北方玉米根虫(northern cornrootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲(Crueifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(stripped flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflowerbeetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northernmasked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogusmajalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophagacrinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpetbeetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limoniusspp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属物种(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

引人关注的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Muscadomestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitransLinnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属物种(Chrysomyaspp.)；蝇属物种(Phormia spp.)；和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属物种(horse flies Tabanus spp.)；肤蝇胃蝇属物种(bot flies Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇皮蝇属物种(cattle grubs Hypoderma spp.)；鹿蝇斑虻属物种(deer flies Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(mosquitoes Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anophcles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇原蚋属物种(black fliesProsimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科(Cicadellidae)的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种(Blissus spp.)；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

来自半翅目的农业上的重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphonpisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpea aphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii Glover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(appleaphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄粗额蚜(Aulacorthum solaniKaltenbach)(指顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphonfragaefolii Cockerell)(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphisplantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosomalanigerum Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealyplum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodum Walker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicaeSulzer，peach-potato aphid，green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonoviaribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce aphid))；瘿绵对属物种(Graptostethus spp.)(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，cornleaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grainaphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属物种(Adelgesspp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobaccowhitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen，smaller brownplanthopper)；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(asterleafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus

)(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvatalugens

brown planthopper)；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(corn planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backedplanthopper)；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Iceryapurchasi Maskell，cottony cushion scale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosusComstock，San Jose scale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrusmealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsyllapyricola Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmonpsylla)。

来自半翅目的农业上重要的目的物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternumhilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲谷长蝽指明亚种(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lacebug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercussuturellus Herrich-

)(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servusSay，brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one-spottedstink bug)；长蝽属物种(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius，European tarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(southerngreen stink bug))；美洲稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。

此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltismodestus Distant，tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarkedfleahopper)；皂英蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plantbug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocorisrapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(falsechinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezaraviridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科物种(Coreidae spp.)；红蝽科物种(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾科物种(Tinidae spp.)；负予蝽科物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽科(Reduviidae)物种和臭虫科(Cimicidae)物种。

另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceriatosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski，strawberry spider mite)；细须螨科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisiMcGregor，citrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他叶取食螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚致瘫痪埤(Australian paralysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilisSay)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))以及在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。

引人关注的是缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物，如衣鱼(Lepisma saccharinaLinnaeus)(蠹虫(silverfish))；斑衣鱼(Thermobia domestica Packard)(小灶衣鱼(firebrat))。

所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蜘蛛目中的蜘蛛如褐隐毒蛛(Loxoscelesreclusa Gertsch and Mulaik)(褐皮花蛛(brown recluse spider))和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇毒蛛(black widow spider))，以及蚰蜒目(Scutigeromorpha)中的蜈蚣如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(蚰蜒(housecentipede))。

引人关注的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，谷实夜蛾；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾，以及黎豆夜蛾(例如梨豆夜蛾)。

用于测量杀有害生物活性的方法是已知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252：199-206；Marrone等人，(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78：290-293以及美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其整体并入本文。通常，在取食测定中混合并使用了所述蛋白质。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78：290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成所述有害生物死亡的能力。

线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heteroderaglycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heteroderaschachtii)(甜菜胞囊线虫(beet cyst nematode))；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(谷物胞囊线虫(cereal cyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp)。

种子处理

为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和激活剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀乌剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，典型地进行表面处理。这些化合物典型地与用于配制的其他运载体、表面活性剂或促进施加的助剂一起配制。所述涂层可通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干制剂进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：The Pesticide Manual：A World Compendium[农药手册：世界纲要]，C.D.S.Tomlin编辑，由the British CropProduction Council[英国作物生产委员会]出版，其通过引用并入本文。

可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸，阿拉酸式苯-S-甲基，阿维菌素，杀草强，阿扎康唑，固氮螺菌属(azospirillum)，印楝素，嘧菌酯，芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种(bradyrhizobium spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌(bradyrhizobium betae)、香炉盘慢生根瘤菌(bradyrhizobium canariense)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobium elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(bradyrhizobium iriomotense)、慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(bradyrhizobium yuanmingense))，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫酰胺，精-异丙甲草胺，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻虫嗪，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充这些品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖赋予抗昆虫的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植物对所述除草剂的抗性等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或多种品种的产量潜力的总体增加。

用于杀灭昆虫有害生物和防治昆虫群体的方法

在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中表达编码IPD103多肽的多核苷酸和选自以下的一个或多个多核苷酸：编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1C多肽的多核苷酸；编码具有杀昆虫活性的Cry1D多肽的多核苷酸；以及编码具有杀昆虫活性的Cry1J多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，提供了用于保护植物免受实夜蛾亚科有害生物物种侵害的方法。在一些实施例中，实夜蛾亚科有害生物物种选自黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(VBC)黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(soybean looper)(SBL)大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米穗蛾(corn earworm)(CEW)玉米穗蛾(Heliothis zea)、烟芽夜蛾(tobacco budworm)(TBW)烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(cottonbollworm)(CBW)谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、秋夜蛾(fall armyworm)(FAW)草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、和南部粘虫(southern armyworm)(SAW)南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)。

抗昆虫管理(IRM)策略

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是防治农业上重要的昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人，1990；1993)。然而，昆虫已经进化，这些昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。

增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉米)，用于与生产对靶标有害生物具有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使用www前缀进行访问)发布了与生产一种对靶有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，所述网址可使用www前缀访问)也提供了有关庇护所要求的类似指导。由于庇护区内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。

增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，所述储存库可以有效地对抗昆虫有害生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同作用模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，Rouss概述了用于管理杀昆虫转基因作物的双毒素策略，也称为“金字塔结构”或“堆叠”。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.[皇家学会伦敦皇家学会哲学会刊B系列]，(1998)353：1777-1786)。每种都能有效抵抗靶有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆叠或金字塔结构可以允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的IRM效应的各种方法，包括在田地中的各种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

在一些实施例中，本公开的转基因堆叠物可用作与其他杀有害生物蛋白(包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属或发光杆菌属杀昆虫蛋白、其他杀昆虫活性蛋白等)组合(即，金字塔化)的抗昆虫管理策略。

提供了在促进抗昆虫管理的转基因植物中防治一种或多种鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，防治转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进抗昆虫管理的方法包括呈现IPD103多肽杀昆虫蛋白和选自以下的一种或多种多肽中的至少一种：具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽；具有杀昆虫活性的Cry1B多肽；具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽；具有杀昆虫活性的Cry1C多肽；具有杀昆虫活性的Cry1D多肽；和具有杀昆虫活性的Cry1J多肽。

还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对在所述植物中表达杀昆虫蛋白以控制所述昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，所述方法包括表达与具有不同作用方式的第二种杀昆虫蛋白组合的、对这些昆虫物种具有杀昆虫作用的IPD103多肽。

还提供了用于转基因植物的有效抗鳞翅目和/或鞘翅目昆虫管理的手段，所述手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白包含IPD103多肽和Cry蛋白。还提供了转基因植物的有效抗鳞翅目和/或鞘翅目昆虫管理的手段，所述手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式。此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示IPD103多肽不与此类昆虫中的Cry蛋白竞争结合位点。

在一些实施例中，本公开的分子堆叠物、育种堆叠物和方法可用于杀灭实夜蛾亚科有害生物或防治实夜蛾亚科有害生物群体。在一些实施例中，实夜蛾亚科有害生物选自黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(VBC)黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(soybean looper)(SBL)大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米穗蛾(cornearworm)(CEW)玉米穗蛾(Heliothis zea)、烟芽夜蛾(tobacco budworm)(TBW)烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(cotton bollworm)(CBW)谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、秋夜蛾(fall armyworm)(FAW)草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、和南部粘虫(southern armyworm)(SAW)南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)。

提高植物产量的方法

提供了用于提高植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并在有害生物(所述多肽对其具有杀有害生物活性)侵袭的田地中种植所述植物或其种子。在一些实施例中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物具有杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染。

如本文所定义的，植物的“产量”是指该植物生产的生物质的质量和/或数量。如本文所使用的“生物质”是指任何经测量的植物产物。生物质产量的增加是所测量的植物产物的产量上的任何改善。增加植物产量具有若干个商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消耗的叶菜类的产量。此外，增加叶生物质可用于增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量上的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，与不表达杀有害生物序列的植物相比，产量上至少增加1％、至少增加3％、至少增加5％、至少增加10％、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，表达IPD103多肽和选自以下的一种或多种杀有害生物多肽的植物的经改善的有害生物抗性使得植物产量得到增加：具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽；具有杀昆虫活性的Cry1B多肽；具有杀昆虫活性的变体Cry1B多肽；具有杀昆虫活性的Cry1C多肽；具有杀昆虫活性的Cry1D多肽；和具有杀昆虫活性的Cry1J多肽。杀有害生物多肽的表达导致有害生物侵染植物或在所述植物上取食的能力下降，从而提高植物产量。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

实验

实例1-来自蕨类日本蹄盖蕨(Athyrium niponicum)“红颜(Red Beauty)”的针对玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、和黎豆夜蛾具有活性的杀昆虫蛋白的鉴定

通过蛋白质纯化、质谱法(MS)和PCR克隆从商业栽培品种日本蹄盖蕨“红颜”(本文指定为NY15)鉴定杀昆虫蛋白IPD103Aa(SEQ ID NO：2)。用基于人工饮食的测定，从来自日本蹄盖蕨“红颜”的蛋白提取物观察针对鳞翅目有害生物的杀昆虫活性。

NY15植物材料是在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃。从储存中取出冷冻样品并且在液氮温度下，用

2010(SPEX

麦塔成(Metuchen)，新泽西州(NJ))将其研磨成细粉。为了提取蛋白，按5mL/克NY15鲜重，添加提取缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM氯化钾，2.5mM EDTA，1.5％聚乙烯吡咯烷酮和“完全，无EDTA”蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche)，印第安纳波利斯(Indianapolis)，印第安纳州(Indiana)))。通过在20,000g下离心10min，使提取材料澄清。用1/2体积的提取缓冲液重新提取剩余细胞沉淀，离心并且合并上清液，过滤并且使用Sephadex^TM G25(GE医疗集团(GE Healthcare)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(NJ))柱脱盐到20mM Tris，pH 8中，并且在10kDa分子量筛截离心浓缩器(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(Sartorius Stedim)，哥廷根(Goettingen)，德国)上浓缩。

以96孔形式，使用覆盖在基于琼脂的鳞翅目饮食(南国产品公司(SouthlandProducts Inc.)，湖村(Lake Village)，阿肯色州(AR))上的脱盐蛋白提取物，进行针对大豆夜蛾(SBL)(大豆尺夜蛾)、玉米穗蛾(CEW)(谷实夜蛾)和欧洲玉米螟(ECB)玉米螟)的生物测定。允许样品在饮食的顶部上干燥。将可变数量的新生昆虫(2-5只)单独置于处理过的板的每个孔中。测定在27℃运行四天，并且然后对昆虫死亡率和不同阶段的昆虫生长发育迟缓进行评分。评分以数值记录为死亡(3)、严重地发育迟缓(2)(很少生长或根本没有生长但活着，并且相当于一龄幼虫)、发育迟缓(1)(生长到二龄，但不等同于对照)、或者标准(0)。在基于饮食的测定的4个重复的每一个中，针对CEW将粗NY15提取物评分为1。

对于蛋白质纯化，如上所述产生NY15的提取物，并且将上清液脱盐到20mM Tris，pH 8中，然后加载到在相同缓冲液中平衡的15mL Capto^TM Q柱(GE医疗集团(GEHealthcare))上。施加50mM Tris，pH 8.0中的从0M至0.3M NaCl的10个柱体积的线性梯度。在上述生物测定中，针对CEW测定洗脱的1mL级分。在约7至11mS/cm电导率下洗脱的级分中检测针对CEW的活性。合并这些级分，并且脱盐到20mM Tris，pH 8.7中，并且加载到在相同缓冲液中平衡的1ml Mono Q^TM柱(GE医疗集团(GE Healthcare))上。施加至40％洗脱缓冲液(20mM Tris+0.35M NaCl，pH8.7)的20CV线性梯度，并且收集1mL级分。在约8.5-13.3mS/cm²电导率下洗脱的级分中检测针对CEW的活性。合并活性级分，并且脱盐到25mM BisTris，pH7.2中，并且加载到4mL Mono P^TM柱(GE医疗集团(GE Healthcare))上。施加100％Polybuffer 74的等度梯度，并且针对CEW测定1mL洗脱级分。直接地、连同在用10kDa MWCO单位浓缩后，提交级分。存在与Mono P^TM运行相关联的三个活性区域，其中Mono P^TM级分C2-3、C7-8和D12都显示了针对CEW的活性。在1x和4x浓度下，前两个区域具有活性，而级分D12仅在4x浓缩后显示活性。在LDS聚丙烯酰胺凝胶上的Mono P^TM级分的变性电泳表明，在大约20kDa处的蛋白条带的丰度与洗脱的CEW活性的三个区域直接关联。

在蛋白质消化后，通过MS分析进行蛋白质测序和鉴定。从用Coomassie^TM亮蓝G-250染料染色的LDS-PAGE凝胶上跑样获得用于MS鉴定的蛋白质。将这些目的条带从凝胶上切下，脱色，用二硫苏糖醇还原，然后用碘乙酰胺烷基化。用胰蛋白酶消化过夜后、样品经受与Eksigent^TM NanoLC^TM Ultra 1-D Plus nano-lc系统(AB Sciex^TM，马萨诸塞州(MA)01701，弗雷明汉，老康涅狄格路500号)接口的Thermo Q Exactive^TM Orbitrap^TM质谱仪(

马萨诸塞州(MA)02454，沃尔瑟姆，怀曼街81号)上的纳米液相色谱/电喷雾串联质谱法(nano-LC/ESI-MS/MS)。通过使用

(矩阵科学公司(Matrix Science)，英国伦敦NW3 1QY，铂金斯巷10号)的数据库搜索进行蛋白质鉴定。针对包含来自日本蹄盖蕨“红颜”NY15源植物的转录物的内部转录组数据库和公众蛋白数据库Swiss-Prot(使用Mascot搜索引擎(矩阵科学公司(Matrix Science)))，进行搜索。将所有三个凝胶条带的氨基酸序列与来自NY15的预测蛋白进行比对。

实例2-日本蹄盖蕨“红颜”的转录组测序和IPD103Aa的克隆

如下制备日本蹄盖蕨“红颜”(NY15)的转录组。用

试剂盒

从冷冻组织中分离总RNA。使用来自

公司(加利福尼亚州圣迭戈市(San Diego，CA))的TruSeq^TM mRNA-Seq试剂盒和方案制备来自所得总RNA的测序文库。简而言之，将mRNA经由附接至寡(dT)珠分离，片段化至180nt的平均大小，通过随机六聚体初始反转录为cDNA，末端修复，3’A-尾，并与

索引的TruSeq^TM衔接子连接。使用

TruSeq^TM引物PCR扩增所连接的cDNA片段，并在Agilent

DNA7500芯片上检查纯化的PCR产物的质量和数量。在质量和数量评估之后，通过用双特异性核酸酶(DSN)(

莫斯科，俄罗斯)处理将100ng转录物文库标准化。通过添加200mM Hepes缓冲液完成标准化，随后进行热变性，并在68℃退火五个小时。将退火的文库用2μl DSN酶处理25分钟，根据制造商方案通过

柱进行纯化，并使用

适配子特异性引物扩增12个循环。用

XP珠(贝克曼基因组学公司(BeckmanGenomics)，丹佛市(Danvers)，马萨诸塞州)纯化最终产物，并在Agilent

DNA7500芯片上检查质量和数量。

根据

2500的制造商方案对标准化的转录物文库进行测序。对文库进行合并、杂交、并且使用机上聚类方法(onboard clustering method)、随后是每个标准化文库六千万个75bp配对末端读数的靶深度的测序，进行三次测序/流动槽泳道。

针对从NY15的转录组装配体通过可读框(ORF)预测的蛋白质序列，搜索通过LCMS测序鉴定的IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的肽序列。这些肽给出了与对应于IPD103Aa(SEQ IDNO：2)的转录物的完全匹配。使用编码序列来设计引物以克隆IPD103Aa多核苷酸序列(SEQID NO：1)。使用κ HiFi^TM聚合酶(卡帕生物科学公司(Kapa Bioscience)，威明顿市，马萨诸塞州(MA))，以及使用

II试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo FischerScientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州(MA))从来自日本蹄盖蕨“红颜”的总RNA制备的cDNA作为模板，用聚合酶链式反应产生此克隆。凝胶纯化PCR产物，用NdeI和XhoI限制性酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))进行消化，并且连接到也用相同酶消化的pE T14b

中。对克隆进行测序从而验证克隆。

实例3-在大肠杆菌中表达的IPD103Aa的纯化

使用框内NdeI/XhoI限制性位点(具有针对N-末端6x His标签，接着是凝血酶切割位点的编码序列)将编码IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的SEQ ID NO：1的多核苷酸亚克隆到pET14b载体

中。用包含IPD103Aa基因的pET质粒DNA转化化学感受态

C41(DE3)SOLOs细胞

用于重组蛋白表达。经转化的大肠杆菌细胞在37℃用氨苄青霉素选择生长过夜，然后接种到新鲜的2xYT培养基(1∶25)中，并进一步生长至约0.8的光密度。通过添加0.3mM IPTG诱导蛋白质表达，并使这些细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，通过使用HisPur^TM钴树脂(克隆技术公司(Clonetech)，山景城，加利福尼亚州)的固定化金属离子色谱纯化大肠杆菌表达的蛋白质。使用PBS缓冲液预平衡的PD-10柱(GE生命科学公司(GE Life Sciences)，匹兹堡，美国)将纯化的级分脱盐。将洗脱的蛋白质用于饮食生物测定，从而评估针对多种鳞翅目幼虫的蛋白质活性。

实例4-在大肠杆菌中表达后，IPD103Aa同源物的鉴定及其纯化

可以通过在针对序列相似性的默认参数下进行BLAST^TM(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，可以使用www前缀登录该网址)搜索来确定基因同一性。分析IPD103Aa(SEQ ID NO：1)的多核苷酸序列。在杜邦先锋公司(DUPONT PIONEER)内部植物转录组数据库中，用BLAST^TM，针对IPD103Aa蛋白(SEQ ID NO：2)的多个同源物进行基因鉴定。IPD103Aa同源物和从中鉴定它们的生物体显示在表1中。

表1

通过从总RNA的逆转录，从具有自内部数据库鉴定的同源物的来源生物体产生cDNA。使用为每个同源物的编码序列设计的引物，从其各自cDNA，PCR扩增同源物。用NdeI/XhoI限制性酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，伊普斯威奇(Ipswich)，马萨诸塞州(MA))消化PCR产物，并且连接到用相同酶消化的pET14b(Novagen)质粒中。通过测序确认克隆的PCR产物。如在Needle程序(EMBOSS工具套件)中执行的，如使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法计算的IPD103Aa同源物的氨基酸序列同一性显示在表2中。

表2

实例5-在大肠杆菌中表达的纯化标记蛋白的鳞翅目测定

使用并入基于琼脂的鳞翅目饮食(南国产品公司(Southland Products Inc.)，湖村(Lake Village)，阿肯色州(AR))的纯化的N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)或N-6xHisIPD103Ab(SEQ ID NO：4)多肽的稀释系列，以96孔板形式进行针对五种有害生物物种玉米穗蛾(CEW)(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟)、秋夜蛾(FAW)(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda JE Smith))、大豆夜蛾(SBL)(大豆尺夜蛾)、以及黎豆夜蛾(VBC)(梨豆夜蛾)的生物测定。每个样品使用四个重复。将二至五只新生昆虫放置到处理过的板的每个孔中。在27℃孵育四天之后，对幼虫死亡率或发育迟缓的严重程度进行评分。评分以数值记录为死亡(3)、严重地发育迟缓(2)(很少生长或根本没有生长但活着，并且相当于一龄幼虫)、发育迟缓(1)(生长到二龄，但不等同于对照)、或者标准(0)。N-6xHis-标记的IPD103Aa(SEQ IDNO：2)和N-6xHis IPD103Ab(SEQ ID NO：4)的稀释系列针对鳞翅目有害生物的生物测定的结果显示在表3中。值表示4个重复测定的平均幼虫抑制评分。

表3

实例6-在大肠杆菌中表达的IPD103同源物的纯化和生物测定

使用框内NdeI/XhoI限制性位点(具有N-末端6x His标签，接着是凝血酶切割位点以及IPD103同源物天然终止密码子)，将编码IPD103同源物的基因亚克隆到pET14b载体(Novagen公司)中。用包含IPD103Aa同源物基因的pET14b质粒DNA转化化学感受态

C41(DE3)SOLOs细胞(Lucigen)，用于重组蛋白表达。经转化的大肠杆菌细胞在37℃用氨苄青霉素选择生长过夜，然后接种到新鲜的2xYT培养基(1∶100)中，并进一步生长至约0.8-1.2的光密度。通过添加1.0mM IPTG诱导蛋白质表达，并使这些细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，通过使用

钴树脂(克隆技术公司(Clonetech)，山景城，加利福尼亚州)的固定化金属离子色谱(IMAC)纯化经大肠杆菌表达的蛋白质。使用6K MWCO Flextubes(IBI公司，皮斯塔，爱荷华州)，将在250mM咪唑中洗脱的纯化的1.5mL级分透析到PBS缓冲液中，在搅拌板上在4℃下过夜。在饮食测定中运行透析蛋白，从而评估杀昆虫蛋白针对鳞翅目的所选择的幼虫的作用。IPD103Aa的一系列同源物的活性总结在表4中。

表4

同源物ID

AA序列

CEW

ECB

FAW

SBL

VBC

IPD103Ab

SEQ ID NO：4

+

IPD103Ac

SEQ ID NO：6

+

IPD103Ad

SEQ ID NO：8

+

IPD103Ae

SEQ ID NO：10

+

IPD103Ba

SEQ ID NO：12

+

IPD103Bb

SEQ ID NO：14

+

-

+

IPD103Bc

SEQ ID NO：16

+

-

+

IPD103Bd

SEQ ID NO：18

+

IPD103Be

SEQ ID NO：20

+

IPD103Bf

SEQ ID NO：22

+

IPD103Bg

SEQ ID NO：24

+

IPD103Bh

SEQ ID NO：26

+

-

+

-

+

IPD103Bi

SEQ ID NO：28

+

IPD103Ca

SEQ ID NO：34

+

IPD103Da

SEQ ID NO：36

+

实例7-具有多个氨基酸取代的IPD103Aa变体

为了产生具有多个氨基酸改变的IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的变体，通过编码IPD103Aa(SEQ ID NO：12)、IPD103Be(SEQ ID NO：20)、和IPD103Da(SEQ ID NO：38)的SEQID NO：1、SEQ ID NO：19、和SEQ ID NO：37的多核苷酸序列的家族改组(Chia-Chun J.Chang等人，1999，Nature Biotechnology[自然生技术]17，793-797)产生变体文库。构建了用于产生IPD103变体的三个文库。在第一个文库(文库11)中，IPD103Aa(SEQ ID NO：1)的天然多核苷酸序列和IPD103Be(SEQ ID NO：19)的天然多核苷酸序列用作文库亲本。在第二个文库中，IPD103Be(SEQ ID NO：19)的天然多核苷酸序列和编码IPD103Da多肽的SEQ ID NO：35的多核苷酸序列(具有密码子优化从而增加与SEQ ID NO：1的相似性)被用作文库亲本。在第三个文库中，IPD103Aa(SEQ ID NO：1)和IPD103Be(SEQ ID NO：19)的天然多核苷酸序列以及IPD103Da(SEQ ID NO：35)的密码子优化的多核苷酸序列用作文库亲本。挑选第二和第三文库，并且一起进行筛选(文库123)。

将文库变体转化为大肠杆菌细胞后，挑取集落并在24孔板中培养以进行蛋白质表达。通过

蛋白提取试剂(赛默科技公司(Thermo Scientific)，罗克福德，伊利诺伊州)产生细胞裂解物，并且筛选CEW和/或FAW杀昆虫活性。对活性变体进行测序并鉴定氨基酸取代。从文库11筛选了460种变体，并鉴定了110种独特活性变体的序列。从文库123筛选了552种变体，并鉴定了78种独特活性变体的序列。

表5总结了活性变体与IPD103Aa(SEQ ID NO：2)相比的％同一性，具有各自％同一性的变体数量和变体鉴定。

表5

实例8-用于在植物中表达IPD103多肽的载体构建体

对于在玉米中测试，构建表达载体PHP79658、PHP70659、和PHP7600，从而包括转基因盒，该转基因盒含有编码IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的三种不同基因设计中的一种、连接到PINII终止子(US-2014-0130205)的MMV ENH：MMV ENH：BYDV启动子(WO 2017/095698)。

实例9-在瞬时叶组织上的表达和昆虫生物测定

为了确认IPD103Aa(SEQ ID NO：2)和IPD103Ab(SEQ ID NO：4)的活性，将相应基因在病毒启动子dMMV或AtUBQ10启动子的控制下克隆到瞬时表达系统中(Dav等人，(1999)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]40：771-782；PCT专利公开WO 2011133387；Norris SR等人(1993)Plant Mol Biol[植物分子生物学]21(5)：895-906)。将构建体渗透到叶中。将农杆菌属细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞以使得可重复感染和随后的植物来源的转基因表达可被测量或研究的农杆菌浸润法(Kapila等人，(1997)Plant Science[植物科学]122：101-108)。简而言之，用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物对矮菜豆(bushbean)(菜豆(common bean、Phaseolus vulgaris))或大豆(soybean、Glycine mdx)的单叶阶段进行农杆菌浸润。从每种小植株切除叶盘，并且用大豆夜蛾(SBL)(大豆尺夜蛾)、玉米穗蛾(CEW)(谷实夜蛾)、[FAW]、黎豆夜蛾(VBC)(梨豆夜蛾)或欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟)的新生昆虫侵染。用仅含有空表达载体的农杆菌产生来自对照的叶圆盘。将来自非浸润植物的叶圆盘用作第二对照。在侵染两天后(CEW、VBC)、三天后(SBL)或四天后(ECB)，对绿叶组织的消耗评分，并且如表6所示给出0至9的评分。瞬时表达的IPD103Aa(SEO ID NO：2)和同源物保护矮菜豆叶盘免受侵染昆虫的消耗，而观察到阴性对照和未处理组织的总绿色组织消耗。通过基于质谱法的蛋白鉴定方法，使用来自浸润叶组织的提取的蛋白质裂解物确认IPD103Aa(SEQ ID NO：2)和IPD103Ab(SEQ ID NO：4)的瞬时蛋白质表达(Patterson，(1998)10(22)：1-24，Current Protocol in Molecular Biology[当前分子生物学方案]，由约翰威利父子公司(John Wiley&Son Inc)出版)。如表10中所示，IPD103Aa(SEQ ID NO：2)和所有测试的同源物导致矮菜豆得到针对多种鳞翅目叶的取食损害的保护。使用表6中描述的量表，评估在病毒启动子dMMV(Dey等人，(1999)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]40：771-782)的控制下，瞬时表达杀昆虫基因的大豆叶的幼虫取食损害。将IPD103蛋白的表达的作用与非农杆菌浸润的对照和表达DsRed2荧光标记的对照(克隆技术实验室公司(Clontech)；山景城，加利福尼亚州)进行比较。针对来自所选择的鳞翅目的叶取食损害，在矮菜豆中瞬时表达的选择的IPD103多肽的活性显示在表7中。显示了6次重复测量的平均评分和标准误差(SE)。

针对来自所选择的鳞翅目的叶取食损害，在大豆中瞬时表达的选择的IPD103Aa多肽的活性显示在表8中。显示了12次重复/处理的平均叶取食评分和标准偏差(StdDev)。

表6

叶取食评分	％消耗
		1	86-100
2	71-85
		3	61-70
4	51-60
		5	36-50
6	11-35
		7	11-36
8	1-3
		9	0

表7

表8

实例10-玉米的农杆菌介导的转化和转基因植物的再生

对于用实施例的核苷酸序列对玉米进行的农杆菌介导的转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840和PCT专利公开号WO 1998/32326，其内容通过引用并入本文)。简而言之，从玉米中分离未成熟的胚，并且在特定条件下将胚与农杆菌悬浮液接触，借此该细菌能够将PHP79658、PHP70659和PHP7600载体转移到至少一个未成熟的胚的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟的胚浸泡在农杆菌悬浮液中，引发接种。使这些胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在侵染步骤后，可以在固体培养基上培养未成熟的胚。在此共培养期之后，设想任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，将这些胚在抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下孵育，而不添加植物转化的选择剂(步骤3：静息步骤)。将这些未成熟的胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并用于经感染的细胞的静息期。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，并且回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养这些未成熟胚，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，并使在选择培养基上生长的或在固体培养基上培养的愈伤组织再生植物。

为了检测叶组织中的IPD103蛋白，将4个冻干叶穿孔/样品粉碎并重新悬浮于含有0.1％Tween 20的100μL PBS(PBST)、含有1片/7mL迷你完全蛋白酶抑制剂(罗氏公司1183615301)的1％β-巯基乙醇中。将悬浮液超声处理2分钟，并且然后在4℃、20,000g进行离心持续15分钟。向上清液等份1/3体积的3X

LDS样品缓冲液(Invitrogen^TM，加利福尼亚州，美国)中，添加含有1片/7mL迷你完全蛋白酶抑制剂的1％B-ME。将反应物在80℃加热10分钟，并且然后离心。将上清液样品按照制造商(Invitrogen^TM)说明书装载在具有MES运行缓冲液的4％-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用

装置(Invitrogen^TM)转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST中亲和纯化的兔抗IPD103Aa多克隆抗体中孵育过夜。将膜用PBST冲洗三次，并且然后在PBST中孵育15分钟，并且然后孵育两次5分钟，然后孵育2小时，在具有山羊抗兔HRP的PBST中持续3小时。使用ECL蛋白质印迹试剂(GE医疗集团(GE Healthcare)，目录号RPN2106)可以观察到所检测的蛋白质，并使用发光图像分析仪(ImageQuant LAS 4000，GE医疗集团(GEHealthcare))显现。使用标准生物测定法测试杀昆虫蛋白表达阳性的转基因玉米植物的杀有害生物活性。这些方法包括例如全植物生物测定。

实例11-转基因玉米植物的粒子轰击转化和再生

用含有编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚。将穗剥皮并在30％

漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并用无菌水冲洗两次。将未成熟胚切除，并以每个平板25个胚将胚轴侧向下(盾片侧向上)放置于560Y培养基上持续4小时，并且然后排列在2.5cm靶区内准备进行轰击。使用如下的CaCI₂沉淀程序，将包含可操作地连接到启动子的编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒载体DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨球粒上：在水中100μI制备的钨粒子；在Tris EDTA缓冲液中10μI(1pg)DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCI₂和10μI 0.1M亚精胺。

将每种试剂顺序添加至钨粒子悬浮液中，同时维持在多管涡旋混合器上。将最终混合物短暂超声处理，并且允许在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀期后，将管短暂离心，去除液体，并且用500ml 100％乙醇洗涤，并且离心30秒。再次去除液体，并且添加105μI的100％乙醇到最终钨粒子球粒中。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子短暂超声处理，并且将10μI点在每个巨载体的中心，并且允许在轰击之前干燥约2分钟。在粒子枪中，以水平#4轰击样品板。所有样品接受在650PSI的单次射击，其中从每个制备的粒子/DNA的管中取总共十个等分试样。

在轰击后，将胚在560Y培养基上保持2天，然后转移到含有3mg/升双丙氨膦的560R选择培养基上，并且每2周进行一次传代。在约10周的选择之后，将选择抗性愈伤组织克隆转移到288J培养基中以开始植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将发育良好的体细胞胚转移到培养基上进行萌芽，并且转移到有光照的培养室中。在约7-10天后，将发育的小植物转移到试管中的272V不含激素的培养基中7-10天，直到小植物良好地生长。然后将植物转移到含有盆栽土壤的平托花盆(inserts in flats)(相当于2.5″盆)中，并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后转移到经典的600盆(1.6加仑)中并生长至成熟。通过测定，例如免疫测定和蛋白质印迹法，针对IPD103多肽的表达，对植物进行监测和评分。

使用标准生物测定法测试杀昆虫蛋白表达阳性的转基因玉米植物的杀有害生物活性。这些方法包括例如根切除生物测定和全植物生物测定。参见，例如，美国专利申请公开号US 2003/0120054和国际公开号WO 2003/018810。

轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(西格玛公司(SIGMA)C-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合液(1000倍西格玛公司(SIGMA)-151 1)、0.5mg/l硫胺素HCI、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D、以及2.88g/l L-脯氨酸(用D-1 H₂O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；2.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite，在用D-1 H₂O定容之后添加)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并且冷却至室温后添加)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(西格玛公司(SIGMA)C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s维生素混合液(1000倍西格玛公司(SIGMA)-151 1)、0.5mg/l硫胺素HCI、30.0g/l蔗糖、以及2.0mg/l 2，4-D(用D-1 H₂O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-l H₂O定容之后添加)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(在对培养基进行灭菌并冷却至室温之后添加这两者)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 1 1 1 17-074)、5.0ml/l MS维生素储液(0.100g烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-1 H₂O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.[植物生理学]15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、以及1.0ml/l的0.1mM脱落酸(用精制的D-1 H₂O定容，之后调节至pH 5.6)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-l H₂O定容之后添加)和1.0mg/1吲哚乙酸以及3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并且冷却至60℃后添加)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 1 1 1 17-074)、5.0ml/l MS维生素储液(0.100g/l烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-1 H₂O定容)、0.1g/l肌醇、以及40.0g/l蔗糖(用精制的D-l H₂O定容，之后调节pH至5.6)；以及6g/l细菌用琼脂(在用精制的D-1 H₂O定容之后添加)，灭菌并冷却至60℃。

实例12-稳定转化的玉米植物针对一系列鳞翅目昆虫的昆虫控制效力

从经转化的玉米植物切除叶盘，并且测试IPD103Aa多肽针对欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟)、玉米穗蛾(CEW)(谷实夜蛾)、和秋夜蛾(草地贪夜蛾)的杀昆虫活性。将用于三种IPD103Aa基因设计的表达的构建体PHP79658、PHP79559和PHP79660用于产生转基因玉米事件，从而测试由这些多肽的表达提供的针对由鳞翅目有害生物引起的叶取食损害的效力。图2表明，通过IPD103Aa基因的表达，赋予了对广谱鳞翅目有害生物的叶取食的强保护。

实例13-IPD103多肽事件的温室效力

图4显示了从PHP79658、PHP79659和PHP79660构建体产生的事件的T0温室效力结果。相对于如通过保护玉米穗免受玉米穗蛾(CEW)影响所测量的阴性对照事件(空)，观察到源自所有3个构建体的事件的效力。使用网格测量穗保护，为穗取食损害的平方厘米数(CEWSCM)。图4显示了来自PHP79658、PHP79659和PHP79660的大部分事件比具有2cm²或更小的穗虫损伤评分的阴性对照表现更好。

实例14-大豆(Glycine max)的转化和再生

通过粒子枪轰击法(Klein等人，Nature[自然](伦敦)327：70-73(1987)；美国专利号4,945,050)，使用BIORAD Biolistic PDS1000/He仪以及质粒或片段DNA之一来产生转基因大豆系。以下储备溶液和培养基用于大豆植物的转化和再生：

储备溶液：

硫酸盐100X储备：

37.0g MgSO₄·7H₂O、1.69g MnSO₄·H₂O、0.86g ZnSO₄·7H₂O、0.0025g CuSO₄·5H₂O

卤化物100X储备：

30.0g CaCl₂·2H₂O、0.083g KI、0.0025g CoCl₂·6H₂O

P，B，Mo 100X储备：

18.5g KH₂PO₄、0.62g H₃BO₃、0.025g Na₂MoO₄·2H₂O

Fe EDTA 100X储备：

3.724g Na₂EDTA、2.784g FeSO₄.7H₂O

2，4-D储备：

10mg/mL维生素

维生素B5、1000X储备：

100.0g肌醇、1.0g烟酸、1.0g吡哆醇HCl、10g硫铵HCL。

培养基(每升)：

SB199固体培养基：

1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)、1mL维生素B5 1000X储备、30g蔗糖、4ml2，4-D(40mg/L最终浓度)，pH 7.0，2g脱乙酰吉兰糖胶

SB1固体培养基：

1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066)、1mL维生素B5 1000X储备、31.5g葡萄糖、2mL 2，4-D(20mg/L最终浓度)，pH 5.7，8g TC琼脂

SB196：

10mL的以上储备液1-4的每种、1mL维生素B5储备液、0.463g(NH4)2 SO4、2.83gKNO3、1mL 2，4D储备液、1g天冬氨酸、10g蔗糖，pH 5.7

SB71-4：

Gamborg’s B5盐、20g蔗糖、5g TC琼脂，pH 5.7。

SB103：

1pk.Murashige和Skoog盐混合物、1mL维生素B5储备液、750mg MgCl2六水合物、60g麦芽糖、2g脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.7。

SB166：

补充有5g每升活性炭的SB103。

大豆胚悬浮培养起始：

种植后45-55天从可利用的大豆植物中挑出未成熟种子的豆英，从其壳中取出并放入灭菌的品红盒中。将大豆种子通过在具有1滴ivory皂(即95mL高压蒸汽处理的蒸馏水加5mL Clorox和1滴皂，充分混合)的5％Clorox溶液中振荡15分钟进行灭菌。使用2个1L瓶子的无菌蒸馏水冲洗种子，将少于3mm的那些放置在各个显微镜载玻片上。将种子的小端切割，并将子叶从种皮中压出。将子叶转移到含有SB199培养基的板上(每板25个至30个子叶)持续2周，然后转移至SB1持续2周至4周。将板用纤维带包裹。在这个时间之后，将次级胚切割并置于SB196液体培养基中持续7天。

培养条件：

将大豆胚悬浮培养液(cv.93Y21)维持在50mL液体培养基SB196中(在旋转式摇床中，100-150rpm，26℃，在80-100μE/m2/s的光强度下，以16：8h白天/夜晚光周期)。通过将多达1/2硬币尺寸量的组织(团块一起堆积)接种至50mL新鲜液体SB196中，每7天至14天传代培养培养物。

制备用于轰击的DNA：

在粒子枪轰击程序中，可以使用纯化的1)整个质粒DNA；或2)仅含有一个或多个目的重组DNA表达盒的DNA片段。对于每十七次轰击转化，制备每个DNA质粒的每对碱基对含有1皮克至90皮克(pg)的质粒DNA的85μL悬浮液。如以下，将DNA质粒或片段共沉淀在金颗粒上。将悬浮中的DNA添加至50μL的10-60mg/mL 0.6μm金颗粒悬浮液中，并然后与50μL CaCl₂(2.5M)和20μL亚精胺(0.1M)合并。将混合物涡旋5秒，在微量离心机中旋转5秒并除去上清液。然后将DNA涂覆的颗粒用150μL的100％乙醇洗涤一次，再次在微量离心机中涡旋并旋转，然后在85μL的无水乙醇中重悬浮。然后将5μL的经DNA包被的金颗粒加到每个巨载体盘上。

组织制备和DNA轰击：

将大约100mg的两周龄的悬浮培养物置于一个空的60mm X 15mm培养皿中，并且用移液管从组织中除去残余的液体。将组织放置在距离挡板大约3.5英寸处，并将组织的每个板轰击一次。膜破裂压力设定在650psi，并将箱抽至-28英寸Hg。轰击后，将来自每个板的组织分开在两个烧瓶之间，放回液体培养基中，并如上所述进行培养。

经转化的胚的选择和植物再生：

轰击后，将来自每个轰击板的组织分开，并放置在每板轰击的组织的SB196液体培养维持培养基的两个烧瓶中。轰击后七天，每个烧瓶中的液体培养基被补充有100ng/mL选择剂(选择培养基)的新鲜SB196培养维持培养基替代。为了选择经转化的大豆细胞，所用的选择剂可以是具有化学名称2-氯-N-((4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨甲酰基)苯磺酰胺(常用名：DPX-W4189和氯磺隆)的磺酰脲类(SU)化合物。氯磺隆是杜邦公司磺酰脲除草剂

中的活性成分。每两周更换含有SU的选择培养基，持续8周。在8周选择期后，观察到从未转化的坏死胚发生簇中生长的绿色转化组织岛。将这些推定的转基因事件分离并保存在具有100ng/mL的SU的SB196液体培养基中另外5周，每1-2周更换培养基以产生新的、克隆繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。胚与SU接触总共约13周的时间。将悬浮培养物传代培养，并保持为未成熟胚芽簇，并还通过各个体细胞胚的成熟和萌芽再生为整个植物。

在成熟培养基上四周(在SB166上1周，随后在SB103上3周)后，体细胞胚适应于发芽。然后将它们从成熟培养基中取出并在空的培养皿中干燥长达七天。然后将干燥的胚种植在SB71-4培养基中，在与上述相同的光和温度条件下，使其在这些培养基中发芽。将发芽的胚转移到灌封培养基中并生长至成熟以用于种子生产。

实例15-测试Cry1Ab和Cry1F选择的欧洲玉米螟的交叉抗性

为了确定Cry1Ab或Cry1F抗性昆虫是否对N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)具有交叉抗性，用N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)处理对Cry1Ab(Crespo A.等人，Pest ManagSci[有害生物管理科学]65：1071-1081，2009)或Cry1F(Siegfried B.等人，Pest ManagSci[有害生物管理科学]70：725-733,2014)易感或具有抗性的欧洲玉米螟(ECB，玉米螟)幼虫。实验室Cry1F选择的品系(Cry1F-R)源自2007年收集的五个田间群体的组合，并且使用增加量的表达Cry1F玉米的冻干叶组织，针对抗性进行选择(Alves，A，US 2012/0148497A1，2012)。

使用饮食并入的生物测定方法，确定对Cry1Ab(Cry1Ab-res)或Cry1F(Cry1F-res)具有抗性的ECB品系，以及对杀昆虫蛋白易感的品系(SS)的幼虫易感性。简而言之，在每个96孔板的孔中，将25μL的样品与75μL的人工饮食混合。每个生物测定包括八个浓度的样品连同阴性缓冲液对照，每个浓度四个重复，并且每个重复八个个体。每个测定孔中放置一个ECB新生幼虫(孵化后＜24h)。一旦侵染，用聚酯薄膜密封板，并且使用#1或#2昆虫针为每个孔添加通气孔。在27℃，50％RH，以及16：8小时(L：D)的光周期下，对板进行孵育。在6天暴露后，对每个样品的死亡率和幼虫生长抑制(如果在6天内，幼虫并不进入第二龄，定义为抑制)进行评分。基于概率单位分析计算导致个体的50％死亡率(LC50)或50％的抑制(IC50)的浓度。抗性比率(RR)＝(抗性ECB的LC50)/(易感性ECB的LC50)，对于Cry1A-res集落的Cry1Ab，抗性比率＞300倍，并且对于Cry1F-res集落的Cry1F，抗性比率＞1000。表9显示了Cry1A抗性或Cry1F抗性ECB对N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)没有交叉抗性。

表9

实例16-测试Cry1A选择的小菜蛾的交叉抗性

将与由Kain等人(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]97：2073-2078,2004)描述的方法类似的饮食覆盖测定用于确定小菜蛾(DBM，Plutella xylostella)对N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的易感性。八个浓度的N-6xHis-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)加上对照以及每个浓度的三个杯(重复)包括在具有抗性(Cry1A-res)或易感DBM集落的每个生物测定中。将0.2mL的IPD103Aa溶液的等分部分施加至并且均匀分布在具有5ml的人工饮食的30-mL塑料杯的饮食表面(表面积7cm²)上。将DBM新生幼虫转移到每个杯中。杯覆盖有盖子，并且保持在27℃，50％RH和16：8(L：D)h光周期下，在5天后，评估死亡率或生长抑制。基于概率单位分析计算个体的50％死亡率(LC50)或50％的抑制(IC50)的浓度。采用Cry1A，RR为约100倍。对于Cry1A-res集落，为88。表10显示了Cry1A抗性DBM对N-6xHis-IPD103Aa(SEQ IDNO：2)没有交叉抗性。

表10

实例17-IPD103Aa的作用位点

在来自谷实夜蛾(玉米穗蛾)和玉米螟(欧洲玉米螟)的中肠液提取物的存在下，评估IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的稳定性，从而确定全长状态是否表示预成型的蛋白，并且是否需要中肠蛋白水解以便在体内激活至毒性状态。

针对靶位点鉴定，测试IPD103Aa(SEQ ID NO：2)与谷实夜蛾(玉米穗蛾)刷状缘膜囊泡的直接结合。图4显示了标准化至不存在未标记IPD103Aa(SEQ ID NO：2)时结合的量，在不同浓度的未标记IPD103Aa(SEQ ID NO：2)存在下，结合的Alexa-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的平均密度测定值。实线反映了数据的平方逻辑斯蒂方程的最佳拟合。数据通过具有38nM的EC50值的S曲线剂量响应方程进行最佳拟合。

针对靶位点鉴定，测试IPD103Aa(SEQ ID NO：2)与玉米螟(欧洲玉米螟)刷状缘膜囊泡的直接结合。图5显示了标准化至不存在未标记IPD103Aa(SEQ ID NO：2)时结合的量，在不同浓度的未标记IPD103Aa(SEQ ID NO：2)存在下，结合的Alexa-IPD103Aa(SEQ ID NO：2)的平均密度测定值。实线反映了数据的平方逻辑斯蒂方程的最佳拟合。数据通过具有83nM的EC50值的S曲线剂量响应方程进行最佳拟合。

实例18-IPD103Aa变体的饱和诱变

在编码IPD103变体IPD103lib11reary-54的多核苷酸的所选密码子处进行饱和诱变(实例7-表5)。通过定点诱变产生突变体(

发光多位点定点诱变试剂盒，安捷伦科技公司(Agilent Technologies))。将所得文库变体转化到大肠杆菌细胞后，对集落进行序列鉴定。挑取独特的克隆并在96孔板中培养以用于蛋白质表达。通过来自赛默科技公司(Thermo Scientific)(3747N Meridian Rd，罗克福德(Rockford)，IL USA 61101)的

蛋白质提取试剂产生细胞裂解物，并筛选CEW杀昆虫活性。表11总结了在IPD103libllreary-54的每个诱变位置处鉴定的氨基酸取代和保留杀昆虫活性的氨基酸取代。

表11

实例19影响蛋白质稳定性和IPD103功能的氨基酸位置的鉴定

在IPD103lib11reary-54内的所选位置上进行另外的诱变。从单个突变体纯化蛋白并且针对对CEW的活性进行筛选。表12总结了鉴定的另外的氨基酸取代、允许保留杀昆虫活性的氨基酸取代、以及导致大肠杆菌减少蛋白产量的氨基酸取代。

表12

实例20转基因杀昆虫堆叠物

可以利用编码本公开的杀有害生物蛋白(包括IPD103(SEQ ID NO：2)、PtIP-83Cb(SEQ ID NO：45)、Cry1B变体IP1B-34(SEQ ID NO：91)、Cry1Ca多肽、和Cry1D多肽)的多核苷酸序列，构建分子堆叠物和育种堆叠物。针对以下所选昆虫物种的示例性堆叠物和所选堆叠物组分的活性谱：大豆夜蛾(SBL)；黎豆夜蛾(VBC)；棉铃虫(CBW)；南部粘虫(SAW)；玉米穗蛾(CEW)；秋夜蛾(FAW)；蝗虫粘虫(grasshopper armyworm，GAW)；以及烟芽夜蛾(TBM)。

表13

实例21-IPD103Aa同源物的鉴定

如实例4中所述鉴定另外的IPD103Aa同源物。IPD103Aa同源物、从中鉴定它们的生物体、DNA序列标识符、蛋白质序列识别、和CEW活性显示在表14中。

表14

对本公开的各种所说明的实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所公开的精确形式。虽然为了说明目的而在本文描述了具体实施例和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开范围内的各种等效修饰是可能的。本文提供的教导可以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，并且因此在所附权利要求书的范围内。

可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施例。

背景技术、具体实施方式和实例中引用的每个文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容通过引用以其整体并入本文。

就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，分子量为平均分子量；温度为摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。

Claims

1.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含：

a)编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；以及

b)一个或多个选自以下的多核苷酸：

i)编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii)编码具有杀昆虫活性的CrylB多肽的多核苷酸；

iii)编码具有杀昆虫活性的变体CrylB多肽的多核苷酸；

iv)编码具有杀昆虫活性的Crv1C多肽的多核苷酸；

v)编码具有杀昆虫活性的CrylD多肽的多核苷酸；和

vi)编码具有杀昆虫活性的CrylJ多肽的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的DNA构建体，其中编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接到异源调节元件。

3.如权利要求1所述的DNA构建体，其中：

a)所述IPD103多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

b)所述PtIP-83多肽包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

c)所述CrylB多肽包含与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

d)所述变体CrylB多肽包含与SEQ ID NO：91的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

e)所述CrylC多肽包含与SEQ ID NO：230的CrylCa多肽的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

f)所述CrylD多肽包含与SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的CrylD多肽的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及

g)所述CrylJ多肽包含与SEQ ID NO：213的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体包含选自以下的分子堆叠物：

i)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD1 03多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylCa多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iv)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylCa多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

v)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

vi)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；以及

vii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；和

b)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸。

5.一种包含分子堆叠物的转基因植物，所述分子堆叠物包含：

a)编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；以及

b)一个或多个选自以下的多核苷酸：

i)编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii)编码具有杀昆虫活性的CrylB多肽的多核苷酸；

iii)编码具有杀昆虫活性的变体CrylB多肽的多核苷酸；

iv)编码具有杀昆虫活性的CrylC多肽的多核苷酸；

v)编码具有杀昆虫活性的CrylD多肽的多核苷酸；以及

vi)编码具有杀昆虫活性的CrylJ多肽的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的转基因植物，其中编码所述多肽的多核苷酸各自可操作地连接到异源调节元件。

7.如权利要求5所述的转基因植物，其中：

e)所述CrylC多肽包含与SEQ ID NO：230的CrylCa多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列；

f)所述CrylD多肽包含与SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：241的CrylD多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及

8.如权利要求5所述的转基因植物，其中所述分子堆叠物选自：

i)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylCa多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iv)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述Crv1Ca多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

v)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

vi)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；以及

vii)包含以下的分子堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；和

b)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸。

9.一种包含育种堆叠物的转基因植物，所述育种堆叠物包含：

a)编码具有杀昆虫活性的IPD103多肽的多核苷酸；以及

b)选自以下的多核苷酸中的一个或多个：

i.编码具有杀昆虫活性的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii编码具有杀昆虫活性的CrylB多肽的多核苷酸；

iii.编码具有杀昆虫活性的变体CrvlB多肽的多核苷酸；

iv.编码具有杀昆虫活性的CrylC多肽的多核苷酸；

v.编码具有杀昆虫活性的CrylD多肽的多核苷酸；以及

vi.编码具有杀昆虫活性的CrylJ多肽的多核苷酸。

10.如权利要求9所述的转基因植物，其中编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接到异源调节元件。

11.如权利要求9所述的转基因植物，其中：

e)所述CrylC多肽包含与CrylCa多肽的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

f)所述CrylD多肽包含与CrylCa多肽的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及

12.如权利要求11所述的转基因植物，其中所述育种堆叠物包含：

i)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

ii)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylCa多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iii)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；

iv)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylCa多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

v)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码SEQ ID NO：91的变体CrylB多肽的多核苷酸；以及

c)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；

vi)包含以下的育种堆叠物：

a)编码SEQ ID NO：2的IPD103多肽的多核苷酸；

b)编码所述CrylD多肽的多核苷酸；以及

c)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸；以及

vii)包含以下的育种堆叠物：以及

a)编码SEQ ID NO：2的IPD1 03多肽的多核苷酸；和

b)编码SEQ ID NO：45的PtIP-83多肽的多核苷酸。

13.一种转基因植物或其子代，所述转基因植物或其子代包含如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述转基因植物是玉米或大豆。

14.一种转基因植物或其子代，所述转基因植物或其子代包含如权利要求5所述的分子堆叠物，其中所述转基因植物是玉米或大豆。

15.一种转基因植物或其子代，所述转基因植物或其子代包含如权利要求9所述的育种堆叠物，其中所述转基因植物是玉米或大豆。

16.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物群体与如权利要求5所述的转基因植物接触。

17.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括在如权利要求5所述的转基因植物中表达所述多核苷酸。

18.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物群体与如权利要求9所述的转基因植物接触。

19.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括在如权利要求9所述的转基因植物中表达所述多核苷酸。

20.一种杀昆虫多肽，所述杀昆虫多肽与SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQID NO：260或SEQ ID NO：261的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

21.如权利要求20所述的杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫多肽选自SEQ ID NO：252、SEQID NO：253、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：256、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：261的氨基酸序列。

22.如权利要求20所述的杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫多肽可操作地连接到异源信号肽或转运肽。

23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求20所述的多肽。

24.如权利要求23所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调节元件。

25.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含如权利要求24所述的多核苷酸。

26.一种转基因植物，所述转基因植物包含如权利要求25所述的DNA构建体。

27.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物群体与如权利要求26所述的转基因植物接触。

28.一种用于防治昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括在如权利要求26所述的转基因植物中表达所述多肽。

29.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述IPD103多肽是如权利要求20所述的杀昆虫多肽。