CN113092649B - 利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，包括(1)初步确定目标蛋白，(2)全蛋白提取，(3)蛋白的还原烷基化，(4)蛋白的酶解、除盐，(5)建库：采用液质联用，将所有样品混合进样跑质谱，建立样品中所有蛋白的数据库，(6)目标蛋白的最终建立，(7)样品目标蛋白峰面积的测定，获得每个链终止子的相对含量。本发明利用靶向蛋白组学技术代替回收胶点进行质谱鉴定的方法，在节约成本的同时，缩减了测定的时间和提高了结果的准确性。

Description

利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法。
背景技术
优质强筋小麦是加工面包、方便面等面食的主要原料。近年来国家食品消费结构升级，对优质强筋小麦需求快速增加。但是，我国的强筋小麦品种与美国硬红春品种相比，品质指标偏低、稳定性较差。因此，加强小麦品质形成机理及调控途径的研究，对于推动我国优质专用小麦高产优质高效发展至关重要。
小麦的品质不仅受基因型的影响，而且与生态环境条件和农艺栽培措施密切相关。遗传改良和栽培措施对小麦品质的调控主要是通过改变籽粒面粉中面筋的含量和质量来实现的。小麦籽粒蛋白质中影响品质的蛋白为醇溶蛋白和谷蛋白，两者相互结合形成高度聚合的网状结构即面筋，且分别决定面团的延展性和弹性。其中，醇溶蛋白可以进一步划分为ω-，α-和γ-醇溶蛋白，分别含有0，6，8个半胱氨酸残基，其偶数个半胱氨酸残基的含量可以保证醇溶蛋白形成分子内二硫键，并使醇溶蛋白以蛋白单体形式存在于面粉中。谷蛋白则在籽粒灌浆过程中伴随着籽粒脱水，既可以形成分子内二硫键，也可以形成分子间二硫键，并通过二硫键的作用逐渐聚合，以聚合物的形式存在于面粉，谷蛋白聚合程度越高，其品质越好。
然而，小麦籽粒中也存在一些与面筋聚合物相关的蛋白质，其序列与麦醇溶蛋白非常相似。含有7个和9个半胱氨酸残基的α-和γ-麦醇溶蛋白被称为α-和γ-链终止子或C型LMW-GS，含有1个半胱氨酸残基的ω-麦醇溶蛋白被称为ω-链终止子或D型LMW-GS。这些含有奇数个半胱氨酸残基的醇溶蛋白可以与面筋聚合蛋白反应形成链间二硫键，作为链终止子，终止面筋聚合物的形成并限制其大小，影响其聚合程度进而影响小麦品质。
由此可见，链终止子含量的高低对于小麦品质的形成至关重要，研究不同品种的链终止子含量差异或者不同栽培措施下链终止子含量与强筋小麦品质的关系有利于制定因地适宜的栽培模式，推动区域强筋小麦产业发展。
但是目前测定链终止子含量的方法较为复杂且耗时较长。首先用0.5％SDS缓冲液提取SDS-可溶性和SDS-不可溶性谷蛋白，制备色谱分别收集SDS-可溶性谷蛋白和SDS-不可溶性谷蛋白，然后将收集的组分跑双向凝胶电泳，然后切割各蛋白质斑点进行还原和消化，最后将切割的单一斑点的肽段通过质谱仪进行测定分析。此方法需经过提取、收集、跑胶、还原消化、质谱分析等步骤完成鉴定，程序繁琐复杂，且每次只能鉴定单一胶点成分，对电泳分离的成百上千个胶点的鉴定需耗费大量时间，鉴定效率极低，同时还存在试剂、分析等成本高昂、准确率低等问题。
因此，能够准确、快速、程序简化、低成本测定小麦籽粒链终止子的试验方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，解决现有的方法耗时耗力，成本高、准确性和效率低的问题。
本发明的技术方案为：
一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，步骤如下：
(1)初步确定目标蛋白：根据链终止子的定义查找数据库初步确定目标蛋白；
(2)小麦籽粒全蛋白的提取：将保存在-80℃冰箱里的小麦籽粒用液氮充分研磨后，称取200mg粉末，加入0.8ml裂解液a后超声，然后加入0.8ml三羟甲基氨基甲烷饱和酚混匀后于冰上静置10min；16000×g 4℃离心10min，转移上层酚相至新离心管，加入四倍以上体积-20℃预冷浓度0.1mol/L乙酸铵/甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜；20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷甲醇漂洗，-20℃静置60min；加入-20℃预冷甲醇漂洗两次，离心去上清；适当风干后加入0.8ml裂解液b后超声，20000×g 4℃离心10min，上清转管，用2D Quant试剂盒，按照试剂盒操作步骤测定蛋白浓度；
(3)蛋白的还原烷基化：将每个样品中500μg的蛋白质转移到新试管中，并用裂解缓冲液调节至等体积，然后加入终浓度5mmol/L二硫苏糖醇还原二硫键，37℃反应60min，冷却至室温后加入30mmol/L碘乙酰胺，封闭游离巯基，室温避光反应45min；加入5倍体积-20℃预冷甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜，20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷80％甲醇漂洗3次；
(4)蛋白的酶解、除盐：适当风干后向蛋白质中添加300μL浓度0.1mol/L四乙基溴化铵，并在冰上以200W的频率超声处理5分钟；加入20μg胰蛋白酶，37℃酶解过夜后加入终浓度1％三氟乙酸终止反应；用C18 SPE小柱除盐，洗脱肽段用真空浓缩仪抽干；
(5)建库：采用液质联用，将所有样品混合进样跑质谱，建立样品中所有蛋白的数据库；
(6)目标蛋白的最终建立：搜索筛选步骤(5)中的蛋白，结合链终止子的定义获得最终的15-20个目标蛋白，获得目标蛋白的肽段序列和保留时间等参数；
(7)样品目标蛋白峰面积的测定：根据数据库的保留时间等参数，对质谱进行参数设定，可同时监测15-20个目标蛋白，然后逐个进样，获得样品的目标蛋白的肽段峰面积，然后进行处理间的比较，获得每个链终止子的相对含量。
进一步地，步骤(1)的具体方法为：根据链终止子的定义，即包含额外的半胱氨酸残基的醇溶蛋白，可以与面筋聚合蛋白反应形成链间二硫键作为链终止子终止面筋聚合物的形成并限制其大小，链终止子可以分为ω-、α-、和γ-链终止子，根据定义查找数据库https://www.uniprot.org/peptidesearch/，初步确定目标蛋白。
进一步地，步骤(2)中，裂解液a的组成为：1mol/L蔗糖、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、0.1mol/L氯化钾、50mmol/L抗坏血酸、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液；裂解液b的组成为：8mol/L尿素、50mmo/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、5mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液。
进一步地，步骤(5)中建库和步骤(7)中样品目标蛋白峰面积的测定的具体方法为：在步骤(5)将合并的待测样品或步骤(7)单一的待测样品注入反相C18色谱柱，流动相由溶液A和溶液B组成，首先用溶液A清洗肽段，然后使用以下线性梯度以250nL/min的流速分离：0-1min，6％溶液B；1-76min，6-28％溶液B；76-79min，28-60％溶液B；79-81min，60-90％溶液B；81-90min，90％溶液B。此后，使用Q-Exactive HF-X质谱仪分析每个样品；质谱仪以正离子模式执行，并具有以下参数：以60000的分辨率获得350至1800m/z的全MS扫描，AGC目标值设置为3e6，最大离子注入时间为20ms，进行完整的MS扫描，然后进行30000分辨率的15次PRM MS2扫描，包含列表为15个条目，隔离窗口为1.4m/z，前驱物离子通过HCD进行了碎片化，归一化碰撞能量为28eV，AGC目标值设置为5e5，最大离子注入时间为50ms；
然后使用Proteome DiscovererTM软件2.2分析获得的原始数据，将FDR设置为0.01，采用Skyline对PRM原始数据进行峰提取，选择子离子中Y3到Yn-1中丰度较高的离子进行定量分析，并进行人工检查和纠正，将Skyline分析后的每段目标肽段的峰面积结果进行导出，其中包括了目标肽段序列，目标蛋白名称，样本名称，保留时间和用于定量的每条肽段峰面积，获得样品中所有蛋白的数据库。
进一步地，溶液A组成为：以体积计，0.1％甲酸+99.9％水；缓冲液B组成为：以体积计，80％乙腈+0.1％甲酸+19.9％水。
进一步地，所述反向色谱中：捕集柱Thermo Acclaim PepMap 100C18 column,2μm,75μm×20mm；分析柱Thermo Acclaim PepMap RSLC C18 column,2μm,75μm×500mm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明利用靶向定量蛋白组学方法代替定量二维凝胶电泳结合串联质谱技术，靶向定量蛋白组学选择性更高，灵敏度更高，直观性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。
2.在实际操作中，靶向定量蛋白组学方法测定多个目标蛋白比定量二维凝胶电泳结合串联质谱方法成本更低、效率更高，主要表现在靶向定量蛋白组学可以同时监测15-20个目标蛋白，而定量二维凝胶电泳结合串联质谱每次只能回收鉴定一个蛋白胶点，而一块完整的小麦籽粒双向凝胶电泳胶含有成百甚至上千的胶点。
附图说明
图1不同施氮处理对强筋小麦籽粒链终止子相对含量的影响。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
一种利用靶向定量蛋白组学方法代替定量二维凝胶电泳结合串联质谱技术测定小麦籽粒链终止子的试验方法，具体步骤如下：
(1)初步确定目标蛋白：根据链终止子的定义，即包含额外的半胱氨酸残基的醇溶蛋白，可以与面筋聚合蛋白反应形成链间二硫键作为链终止子终止面筋聚合物的形成并限制其大小，链终止子可以分为ω-，α-，和γ-链终止子。根据定义查找数据库https://www.uniprot.org/peptidesearch/，初步确定目标蛋白。
(2)小麦籽粒全蛋白的提取：将保存在-80℃冰箱里的小麦籽粒用液氮充分研磨后，称取200mg粉末。加入0.8ml裂解液a(1mol/L蔗糖、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、0.1mol/L氯化钾、50mmol/L抗坏血酸、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液)后超声，然后加入0.8ml三羟甲基氨基甲烷饱和酚混匀后于冰上静置10min。16000×g 4℃离心10min，转移上层酚相至新离心管，加入四倍以上体积-20℃预冷0.1mol/L乙酸铵/甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜。20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷甲醇漂洗，-20℃静置60min。加入-20℃预冷甲醇漂洗两次，离心去上清。适当风干后加入0.8ml裂解液b(8mol/L尿素、50mmo/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、5mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液)后超声，20000×g 4℃离心10min，上清转管，用2D Quant试剂盒，按照试剂盒操作步骤测定蛋白浓度。
(3)蛋白的还原烷基化：将每个样品中500μg的蛋白质转移到新试管中，并用裂解缓冲液调节至等体积，然后加入终浓度5mmol/L二硫苏糖醇还原二硫键，37℃反应60min，冷却至室温后加入30mmol/L碘乙酰胺，封闭游离巯基，室温避光反应45min。加入5倍体积-20℃预冷甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜，20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷80％甲醇漂洗3次。
(4)蛋白的酶解、除盐：适当风干后向蛋白质中添加300μL浓度0.1mol/L四乙基溴化铵，并在冰上以200W的频率超声处理5分钟；加入20μg胰蛋白酶，37℃酶解过夜后加入终浓度1％三氟乙酸终止反应；用C18 SPE小柱除盐，洗脱肽段用真空浓缩仪抽干。
(5)建库：采用液质联用，将所有样品混合进样跑质谱，建立一个数据库。具体操作如下，将合并的标记样品置于连接到高效液相色谱(HPLC)系统的SCX分馏柱上。将肽混合物重新溶解在溶液A中[甲酸+水(0.1/99.9，V/V)]，然后使用连接至反相色谱柱(捕集柱Thermo Acclaim PepMap 100C18 column,2μm,75μm×20mm；分析柱Thermo AcclaimPepMap RSLC C18 column,2μm,75μm×500mm)的Thermo EASY-nLC 1200。使用以下梯度：0-1min，6％溶液B[乙腈+甲酸+水(80:0.1:19.9，V:V:V)]；1-76min，6-28％溶液B；76-79min，28-60％溶液B；79-81min，60-90％溶液B；81-90min，90％溶液B。以250nL/min的流速进行分离。
此后，使用Q-Exactive HF-X质谱仪分析每个样品；质谱仪以正离子模式执行，并具有以下参数：以60000的分辨率获得350至1800m/z的全MS扫描，AGC目标值设置为3e6，最大离子注入时间为20ms，进行完整的MS扫描，然后进行30000分辨率的15次PRM MS2扫描，包含列表为15个条目，隔离窗口为1.4m/z，前驱物离子通过HCD进行了碎片化，归一化碰撞能量为28eV，AGC目标值设置为5e5，最大离子注入时间为50ms。
然后使用Proteome DiscovererTM软件2.2(Thermo Fisher Scientific)分析获得的原始数据。将FDR设置为0.01。采用Skyline对PRM原始数据进行峰提取，选择子离子中Y3到Yn-1中丰度较高的离子进行定量分析，并进行人工检查和纠正，将Skyline分析后的每段目标肽段的峰面积结果进行导出，其中包括了目标肽段序列，目标蛋白名称，样本名称，保留时间和用于定量的每条肽段峰面积，获得样品中所有蛋白的数据库。
(6)目标蛋白的最终建立：搜索筛选(5)中的蛋白，结合链终止子的定义获得最终的15-20个目标蛋白。(5)的建库可以获得目标蛋白的肽段序列和保留时间等参数。
(7)样品目标蛋白峰面积的测定：根据数据库的保留时间等参数，对质谱进行参数设定，可同时监测15-20个目标蛋白，然后逐个进样，获得样品的目标蛋白的肽段峰面积，然后进行处理间的比较，获得每个链终止子的相对含量。
获得样品的目标蛋白的肽段峰面积详细步骤同步骤(5)。
试验例
1材料与方法
1.1试验设计
试验于2019年10月-2020年6月在山东省泰安市岱岳区大汶口镇东武村进行。试验地前茬作物为玉米，一年两熟种植，多年秸秆还田，试验地土壤类型为壤土。播前试验地0-20cm土壤有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为12.07g·kg-1、1.37g·kg-1、124.52g·kg-1、27.77mg·kg-1、86.42mg·kg-1。播前土壤0-1.00m无机态氮(硝态氮和铵态氮)积累量为228.57kg·hm-2。本试验以强筋小麦品种藁城8901为试验材料，设置两个氮肥处理，分别为150(对照组)、300(处理组)N kg·hm-2(分别用N150、N300表示)。
1.2测定项目与方法
1.2.1小麦品质的测定
面粉湿面筋含量用瑞典Perten公司产2200型面筋洗涤仪，按国标GB/T14608-93测定；面团稳定时间用德国公司Brabender产810106002型粉质仪按照GB/T14614-2006测定；面包烘烤试验按AACC10-01方法进行，应用菜籽置换法(NationalG公司生产面包体积测定仪)测定面包体积。
1.2.2小麦面粉蛋白质含量的测定
按GB2905-1982“谷类、豆类作物种子粗蛋白质测定法(半微量凯氏法)”对小麦籽粒氮素含量进行测定，氮素含量乘以指数5.7即为小麦籽粒中蛋白质含量。
1.2.3链终止子的测定
1.2.3.1初步确定目标蛋白
根据链终止子的定义，即包含额外的半胱氨酸残基的醇溶蛋白，可以与面筋聚合蛋白反应形成链间二硫键作为链终止子终止面筋聚合物的形成并限制其大小，链终止子可以分为ω-，α-，和γ-链终止子。根据定义查找数据库https://www.uniprot.org/peptidesearch/，初步确定目标蛋白。
1.2.3.2小麦籽粒全蛋白的提取
将保存在-80℃冰箱里的小麦籽粒用液氮充分研磨后，称取200mg粉末。加入0.8ml裂解液a(1mol/L蔗糖、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、0.1mol/L氯化钾、50mmol/L抗坏血酸、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液)后超声，然后加入0.8ml三羟甲基氨基甲烷饱和酚混匀后于冰上静置10min。16000×g 4℃离心10min，转移上层酚相至新离心管，加入四倍以上体积-20℃预冷0.1mol/L乙酸铵/甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜。20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷甲醇漂洗，-20℃静置60min。加入-20℃预冷甲醇漂洗两次，离心去上清。适当风干后加入0.8ml裂解液b(8mol/L尿素、50mmo/L三羟甲基氨基甲烷pH8.0、1g/L乙基苯基聚乙二醇、1g/L脱氧胆酸钠、10mmol/L乙二胺四乙酸、5mmol/L二硫苏糖醇、1g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液)后超声，20000×g 4℃离心10min，上清转管，用2DQuant试剂盒，按照试剂盒操作步骤测定蛋白浓度。
1.2.3.3蛋白的还原烷基化
将每个样品中500μg的蛋白质转移到新试管中，并用裂解缓冲液调节至等体积，然后加入终浓度5mmol/L二硫苏糖醇还原二硫键，37℃反应60min，冷却至室温后加入30mmol/L碘乙酰胺，封闭游离巯基，室温避光反应45min。加入5倍体积-20℃预冷甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜，20000×g 4℃离心10min，弃去上清，加入-20℃预冷80％甲醇漂洗3次。
1.2.3.4蛋白的酶解、除盐
适当风干后向蛋白质中添加300μL浓度0.1mol/L四乙基溴化铵，并在冰上以200W的频率超声处理5分钟；加入20μg胰蛋白酶，37℃酶解过夜后加入终浓度1％三氟乙酸终止反应；用C18 SPE小柱除盐，洗脱肽段用真空浓缩仪抽干。
1.2.3.5液质联用分析
采用液质联用，将所有样品混合进样跑质谱，建立一个数据库。具体操作如下，将合并的标记样品置于连接到高效液相色谱(HPLC)系统的SCX分馏柱上。将肽混合物重新溶解在溶液A中[甲酸+水(0.1/99.9，V/V)]，然后使用连接至反相色谱柱(捕集柱ThermoAcclaim PepMap 100C18 column,2μm,75μm×20mm；分析柱Thermo Acclaim PepMap RSLCC18 column,2μm,75μm×500mm)的Thermo EASY-nLC 1200。使用以下梯度：0-1min，6％溶液B[乙腈+甲酸+水(80:0.1:19.9，V:V:V)]；1-76min，6-28％溶液B；76-79min，28-60％溶液B；79-81min，60-90％溶液B；81-90min，90％溶液B。以250nL/min的流速进行分离。
此后，使用Q-Exactive HF-X质谱仪分析每个样品；质谱仪以正离子模式执行，并具有以下参数：以60000的分辨率获得350至1800m/z的全MS扫描，AGC目标值设置为3e6，最大离子注入时间为20ms，进行完整的MS扫描，然后进行30000分辨率的15次PRM MS2扫描，包含列表为15个条目，隔离窗口为1.4m/z，前驱物离子通过HCD进行了碎片化，归一化碰撞能量为28eV，AGC目标值设置为5e5，最大离子注入时间为50ms。
然后使用Proteome DiscovererTM软件2.2(Thermo Fisher Scientific)分析获得的原始数据。将FDR设置为0.01。采用Skyline对PRM原始数据进行峰提取，选择子离子中Y3到Yn-1中丰度较高的离子进行定量分析，并进行人工检查和纠正，将Skyline分析后的每段目标肽段的峰面积结果进行导出，其中包括了目标肽段序列，目标蛋白名称，样本名称，保留时间和用于定量的每条肽段峰面积，获得样品中所有蛋白的数据库。
1.2.3.6目标蛋白的最终建立
搜索筛选1.2.3.5中的蛋白，结合链终止子的定义获得最终的15-20个目标蛋白。1.2.3.5的建库可以获得目标蛋白的肽段序列和保留时间等参数。
1.2.3.7样品目标蛋白峰面积的测定
根据数据库的保留时间等参数，对质谱进行参数设定，可同时监测15-20个目标蛋白，然后逐个进样，获得样品的目标蛋白的肽段峰面积(方法同1.2.3.5)，然后进行处理间的比较，获得每个链终止子的相对含量。
1.3数据处理
采用EXCEL 2007进行数据处理；数据统计分析软件为DPS 7.05，采用Sigma plot12.5作图。
2结果与分析
2.1不同施氮处理对强筋小麦品质的影响
表1不同施氮处理对强筋小麦藁城8901品质的影响
Figure BDA0003017335220000081
注：同列不同字母表示达5％差异显著性水平
从表1可以看出，当施氮量由N150增加至N300时，湿面筋含量增加，面团稳定时间降低，面包体积减小，且差异显著。由此可见，过量施氮会使强筋小麦品质变差。
2.2不同施氮处理对强筋小麦蛋白质含量的影响
表2不同施氮处理对强筋小麦藁城8901蛋白质含量的影响
Figure BDA0003017335220000091
从表2可以看出，当施氮量由N150增至N300时，蛋白质含量增加。由此可以看出，蛋白质含量不是品质变差的原因。所以需要进一步测定其他因素对品质的影响，如链终止子含量。
2.3不同施氮处理对强筋小麦籽粒链终止子含量的影响
2.3.1目标蛋白名称
表3目标蛋白基本信息
Figure BDA0003017335220000092
由表3可知，共有12个目标蛋白。其中，α-链终止子有4个，γ-链终止子8个，未发现ω-链终止子。
2.3.2目标蛋白肽峰面积
不同施氮处理对强筋小麦籽粒链终止子相对含量的影响见图1，由图1中A可以看出，不同链终止子特异肽段的碎片离子峰面积。图1中B表示同一目标蛋白N300/N150相对含量。根据倍数变化>1.3或<0.77确定处理组和对照组存在差异的蛋白。由此可以看出，A0A0E3Z581、A5JSB7、D0ES81、A0A4D6Q708和A0A4D6Q9J3在处理组N300和对照组N150间差异显著，且N300高于N150，以上5个链终止子是处理组和对照组最终小麦籽粒品质的形成产生差异的影响因子。

Claims (5)

1.一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）初步确定目标蛋白：根据链终止子的定义，即包含额外的半胱氨酸残基的醇溶蛋白，可以与面筋聚合蛋白反应形成链间二硫键作为链终止子终止面筋聚合物的形成并限制其大小，链终止子可以分为ω-，α-，和γ-链终止子，根据定义查找数据库https://www.uniprot.org/peptidesearch/，初步确定目标蛋白；
（2）小麦籽粒全蛋白的提取：将保存在-80℃冰箱里的小麦籽粒用液氮充分研磨后，称取200 mg粉末，加入0.8 ml裂解液a后超声，然后加入0.8 ml三羟甲基氨基甲烷饱和酚混匀后于冰上静置10 min；16000×g 4℃离心10 min，转移上层酚相至新离心管，加入四倍以上体积-20℃预冷浓度0.1 mol/L 乙酸铵/甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜；20000×g 4℃离心10 min，弃去上清，加入-20℃预冷甲醇漂洗，-20℃静置60 min；加入-20℃预冷甲醇漂洗两次，离心去上清；适当风干后加入0.8 ml裂解液b后超声，20000×g 4℃离心10 min，上清转管，用2D Quant试剂盒，按照试剂盒操作步骤测定蛋白浓度；
（3）蛋白的还原烷基化：将每个样品中500 μg的蛋白质转移到新试管中，并用裂解缓冲液调节至等体积，然后加入终浓度5 mmol/L 二硫苏糖醇还原二硫键，37℃反应60 min，冷却至室温后加入30 mmol/L碘乙酰胺，封闭游离巯基，室温避光反应45 min；加入5倍体积-20℃预冷甲醇沉淀蛋白，-20℃静置过夜，20000×g 4℃离心10 min，弃去上清，加入-20℃预冷80%甲醇漂洗 3次；
（4）蛋白的酶解、除盐：适当风干后向蛋白质中添加300 μL 浓度0.1 mol/L 四乙基溴化铵，并在冰上以200 W的频率超声处理5分钟；加入20 µg胰蛋白酶，37℃酶解过夜后加入终浓度1% 三氟乙酸终止反应；用C18 SPE小柱除盐，洗脱肽段用真空浓缩仪抽干；
（5）建库：采用液质联用，将所有样品混合进样跑质谱，建立样品中所有蛋白的数据库；
（6）目标蛋白的最终建立：搜索筛选步骤（5）中的蛋白，结合链终止子的定义获得最终的15-20个目标蛋白；获得目标蛋白的肽段序列和保留时间等参数；
（7）样品目标蛋白峰面积的测定：根据数据库的保留时间等参数，对质谱进行参数设定，可同时监测15-20个目标蛋白，然后逐个进样，获得样品的目标蛋白的肽段峰面积，然后进行处理间的比较，获得每个链终止子的相对含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，其特征在于，步骤（2）中，裂解液a的组成为：1 mol/L蔗糖、0.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、0.1 mol/L氯化钾、50 mmol/L抗坏血酸、1 g/L乙基苯基聚乙二醇、1 g/L脱氧胆酸钠、10 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L二硫苏糖醇、1 g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液；裂解液b的组成为：8 mol/L 尿素、50 mmo/L三羟甲基氨基甲烷pH 8.0、1 g/L 乙基苯基聚乙二醇、1 g/L脱氧胆酸钠、10 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/L 二硫苏糖醇、1 g/L磷酸酶抑制剂混合物水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，其特征在于，步骤（5）中建库和步骤（7）中样品目标蛋白峰面积的测定的具体方法为：在步骤（5）将合并的待测样品或步骤（7）单一待测样品注入反相C18色谱柱，流动相由溶液A和溶液B组成，首先用溶液A清洗肽段，然后使用以下线性梯度以250 nL/min的流速分离：0-1min，6%溶液B；1-76 min，6-28%溶液B；76-79 min，28-60%溶液B；79-81 min，60-90%溶液B；81-90 min，90%溶液B；此后，使用Q-Exactive HF-X质谱仪分析每个样品；质谱仪以正离子模式执行，并具有以下参数：以60000的分辨率获得350至1800 m/z的全MS扫描，AGC目标值设置为3e6，最大离子注入时间为20 ms，进行完整的MS扫描，然后进行30000分辨率的15次PRM MS2扫描，包含列表为15个条目，隔离窗口为1.4 m/z，前驱物离子通过HCD进行了碎片化，归一化碰撞能量为28 eV， AGC目标值设置为5e5，最大离子注入时间为50 ms；
然后使用Proteome Discoverer™软件2.2分析获得的原始数据，将FDR设置为0.01，采用 Skyline对 PRM 原始数据进行峰提取，选择子离子中Y3 到 Yn-1 中丰度较高的离子进行定量分析，并进行人工检查和纠正，将 Skyline 分析后的每段目标肽段的峰面积结果进行导出，其中包括了目标肽段序列，目标蛋白名称，样本名称，保留时间和用于定量的每条肽段峰面积，获得样品中所有蛋白的数据库。
4.根据权利要求3所述的一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，其特征在于，溶液A组成为：以体积计，0.1%甲酸+99.9%水；缓冲液B组成为：以体积计，80%乙腈+0.1%甲酸+19.9%水。
5.根据权利要求3所述的一种利用靶向定量蛋白组学方法测定小麦籽粒链终止子的方法，其特征在于，所述反相C18色谱柱为：捕集柱Thermo Acclaim PepMap 100 C18 column,2 μm, 75 μm×20 mm；分析柱Thermo Acclaim PepMap RSLC C18 column, 2 μm, 75 μm×500 mm。
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