CN101124335B - 高通量蛋白组学 - Google Patents

Abstract

以高通量方案获得表达系统和蛋白的方法，所述方法利用从用需要的核苷酸序列转化的细胞培养的细胞的混合物，该方法使得能够快速生产用于阵列中以评估活性的蛋白。在一种实施方案中，评估阵列中的蛋白(或肽)对感染剂的免疫活性。

Description

高通量蛋白组学

相关申请的相互参考

本申请要求2004年7月1日提交的美国临时申请60/585,351和2004年12月23日提交的美国临时申请60/638,624的权益。在此引入这些申请的内容作为参考。

对联邦资助的研究下进行的发明的权利声明

本工作部分得到了国家卫生部/国家变态反应和感染病学会的支持。美国政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明涉及从编码性可读框(ORF)制备蛋白或肽的方法，以及鉴定免疫活性蛋白的方法。本发明也涉及从多个编码性ORF制备蛋白/肽阵列的方法，以及这些阵列在测定免疫活性蛋白中的用途。本发明也涉及这些免疫活性肽和使用它们的方法。

背景技术

长期以来已知诸如大肠杆菌和酵母的微生物含有重组酶系统，其在不需要提供外源酶如连接酶的条件下实现同源重组。例如，Oliner，J.D.，et al，Nucleic Acids Res.(1993)21：5192-5197描述了克隆PCR产物的方法，该方法是通过给它们提供与线性化的载体两端的序列相同的末端序列。将产物和载体DNA共转染到大肠杆菌菌株JC8679中，对载体和PCR产物进行体内重组。通过与诊断性DNA的杂交鉴定含有重组质粒的菌落。作者提出了用该方法在大肠杆菌中克隆基因组PCR产物的优化方案。

最近，Zhang，Y.，et al，Nature Genetics(1998)20：123-128描述了相似的方法，认为该方法增加了可以通过该方法克隆的DNA的大小。

美国公开申请2003/0044820描述了用PCR将核酸片段克隆到载体中的方法，该方法采用了衔接序列，所述序列可以含有功能元件，如启动子、终止子、选择标记等。通过PCR扩增线性化的载体，而不是通过常规克隆和随后的消化制备线性化的载体。这增加了给线性化的载体提供额外序列的优点，所述序列可以匹配PCR扩增的核酸的连接部分。也描述了用于选择具有重组质粒的菌落的独特系统。

最近，Parrish，J.，et at，J.Proteome Res.(2004)3：582-586描述了影响采用在大肠杆菌中进行重组的常规技术的克隆效率的参数。在该工作中，扩增了在空肠弯曲杆菌中鉴定的读框，并且插入大肠杆菌中的线性化载体。分离各个菌落，对克隆进行测序。采用了扩增对基因组序列预测的1,685种基因的全长ORF的引物对，其中已经确定了该生物的所述基因组序列。1,346种PCR产物在凝胶上是可见的，并且这些基因中的75％提供了具有含有插入片段的载体的菌落。

也已知除大肠杆菌外的具有重组酶功能的细胞。例如，Ma，H.，Kunes，S.，Schatz，PJ.and Botstein，D.，Gene(1987)58：201-216显示了啤酒糖酵母能够进行该重组。

前述每种方法都需要分离用于产生每种靶蛋白的单克隆，这是难以适于高通量加工的步骤，并且可能导致突变体而不是完整蛋白的分离。因此，前述方法都不能容易地提供例如大量代表感染剂(infectious agent)的大多数或所有完整基因组的大量蛋白，即生物的完整蛋白组。因此，仍然需要使得能够制备所述蛋白组阵列的高通量方案，可以分析该阵列，得到各种相互作用和特性。

所述阵列的用途之一是鉴定通过由感染性生物产生的免疫活性蛋白，作为开发抗该生物的疫苗的一个步骤。鉴定感染剂中的所述抗原性蛋白的努力采用了很多形式。在亲水性图中分析了蛋白，例如，确定将要暴露，因此可以接触免疫系统的区域。或者，(如美国专利6,620,412和6,451,309中的描述)检测了400种单克隆抗体中和病毒的能力，然后检测了它们保护小鼠免受侵袭的能力。由此鉴定的抗体缔合于与它们免疫反应的蛋白。鉴定了许多这样的蛋白。

美国申请2003/0082579描述了通过用免疫血清中存在的至少一种抗体筛选来源于感染性生物的蛋白阵列而鉴定抗原的方法，所述免疫血清用该生物或生物的部分进行过刺激。通过PCR扩增编码性DNA，然后进行第二轮PCR扩增以导入转录控制序列；然后将第二轮产物体外翻译为蛋白，获得了阵列中的蛋白。但是，很明显，如果在高通量方式中尝试，描述的获得蛋白阵列的方法产生了不足量的蛋白。

因此，这些方法证明了通过筛选感染剂的蛋白以鉴定诱导免疫应答的蛋白或蛋白的部分，可以发现在疫苗和诊断开发中有用的抗原性蛋白。但是，由于它们需要针对每种蛋白分离单克隆，它们不能提供用于鉴定感染剂的特征性抗原的高通量方法，所述特征性抗原代表了可能的抗原性蛋白或肽部分的全部范围。需要所述快速方法来迅速应答，以开发针对新感染剂例如生物武器的疫苗或诊断测试。通过允许合成基本代表完整蛋白组的蛋白/肽阵列，并且通过以可以自动化的实际方式提供实现其的手段，本发明提供了迅速鉴定用于诊断测试、疫苗和T细胞免疫的刺激剂的最有可能的候选物的机会。

发明内容

一方面，本发明涉及基于对来源于诸如病毒、原生动物、寄生虫或细菌的感染剂的基因组的蛋白或肽的主要部分或基本完整的表达的所有组成成分的调查，鉴定具有免疫原活性的蛋白或肽的方法。该方法允许展示代表所述感染剂的基因组中48个-基本所有可读框的蛋白和/或肽，并且允许用来自暴露于所述感染剂的个体的免疫血清或血浆测试阵列中的每种蛋白和/或肽。因此，该方法最终使得能够鉴定由感染剂的基因组编码的基本所有的免疫活性肽。

概言之，本发明具有许多方面，涉及制备用于鉴定来自感染剂的免疫活性肽或蛋白的肽/蛋白阵列，也总体涉及制备蛋白/肽阵列。这些方法允许制备含有代表感染剂的基因组的显著部分的肽或蛋白的阵列。这些阵列可以用于鉴定可以诱导细胞和/或体液免疫应答的免疫活性剂。本发明也涉及如此鉴定的特异性抗原和与它们具有免疫反应性的单克隆抗体。这些抗原、它们的核酸和抗体都可以用于制备用于针对感染剂的诊断、预防和治疗性处理的免疫原性组合物。因此，一方面，本发明涉及获得需要的核苷酸序列的表达系统的方法，所述方法不采用各个集落的选择，而是使得用户从细胞的收获、培养的混合物获得这些表达系统。要提取的核酸和用于获得转化细胞的比例也是本发明的一方面。

本发明的另一方面涉及通过本发明的方法制备，或代表感染性生物的基因组的显著部分的肽/蛋白阵列。本发明也涉及如上文所述鉴定的抗原和使用这些抗原的方法，它们的相应的单克隆抗体，和编码它们的核酸分子。与受感染者血清中的抗体反应的抗原可以直接用于血清学测试中，以诊断感染患者。

一方面，本发明涉及获得需要的核苷酸序列的表达系统的方法。该方法可以使用用需要的核苷酸序列的表达系统转化的宿主细胞，或用可以由所述细胞组装成表达系统的成分转化的重组酶-感受态宿主细胞。所述表达系统典型地是质粒；宿主细胞可以是化学感受态细菌、酵母或电穿孔感受态细菌；在某些实施方案中，宿主细胞是酵母，如啤酒糖酵母或细菌，如大肠杆菌，并且可以包括选自JC8679、TBI、DH5α、DH5、HB101、JM101、JM109和LE392的至少一种大肠杆菌菌株。

表达系统的成分可以包括线性化的质粒、来自感兴趣生物的至少一个可读框，或所述ORF的一部分，和设计用于确保ORF可以剪接成线性化的质粒以生成新质粒的一个或多个衔接子。因此，每个所述的衔接子含有与线性化的质粒的一端互补的第一核苷酸序列和与基因组ORF的一端互补的第二核苷酸序列。合适设计的两个这样的衔接子可以用于将ORF插入线性化的质粒，产生新质粒，其具有合适符合质粒的可读框而插入的ORF的核苷酸序列。

衔接子可以任选进一步包括符合ORF的编码一个或多个添加的特征如表位标记的核苷酸序列，使得表达的蛋白将是包含与表位标记连接的ORF编码的肽的融合蛋白。所述表位标记可以用于被表达的肽或蛋白的检测、纯化或定位。用于该目的的表位标记可以包括，但不限于一种或多种以下标记：编码3-12个连续的组氨酸残基，通常6-10个所述残基的聚组氨酸标记；血凝素(HA)标记；c-Myc标记；生物素-连接酶识别位点；谷胱甘肽-S-腺苷酰转移酶(GST)标记；荧光蛋白，如GFP；FLAG-标记；和接头。由于通常使用两个这样的衔接子，这些元件可以包括在一个或两个所述衔接子上；例如，在一个衔接子上包括聚组氨酸标记，在另一个衔接子上包括HA标记，使得对于单一的表达蛋白利用两种不同的检测或定位方法。在本发明的一些实施方案中，在任一衔接子或线性化的质粒上包括一个或多个其它功能元件；所述元件的放置和选择是本领域公知的。所述元件可以包括启动子、终止子序列、操纵子、融合标记、信号肽或其它功能肽、反义序列和核酶。

要表达的核苷酸序列可以包括来自生物基因组的序列，在一些实施方案中，对其进行选择，以包含来自感兴趣的生物的基因的一个可读框(ORF)。在一些实施方案中，所述生物是微生物，在一些实施方案中，其是感染剂。在核苷酸序列包含生物如感染剂的一部分基因组的实施方案中，本发明的方法采用的衔接子包括一个或多个表位标记；所述标记的代表性实例包括HA、c-Myc和具有至少6个连续组氨酸残基的聚组氨酸。

在本发明的一方面，在使用前通过PCR扩增感兴趣的靶定的基因组核苷酸序列和线性化的质粒，每一百万个细胞采用1-10ng靶定的核苷酸序列和线性化的质粒；在其它方面，靶定的核苷酸序列和线性化的质粒的量可以更大。在一些实施方案中，核苷酸序列与质粒的摩尔比可以是约1:1；在其它实施方案中，其是1:10-10:1；在其它实施方案中，其是100:1-1:100。

然后在这些成分的存在下培养细胞，并且收获，从转化细胞的混合物提取表达系统。在本发明的另一方面，不需要在分离表达系统前分离单克隆。相反，培养的细胞是以“混合物”收获的，并且直接从收获的细胞分离表达系统，典型是质粒。因此，该方法对于高通量和自动化的制备所述表达系统的方式是有利的，并且在回收编码需要的蛋白或肽的质粒中更成功。后一优点反映了本发明的方法防止不合宜地选择了突变或含有不需要的质粒(而不是寻求的质粒)的集落而导致的需要地表达系统的损失。

如此产生的表达系统可以用于在来源于细胞的系统中制备一种或多种肽或蛋白，所述系统可以翻译表达系统，以制备编码的肽。来源于细胞的系统可以在完整细胞内，或其可以是必要的酶和成分的无细胞混合物。在一些实施方案中，来源于细胞的系统是细菌，如大肠杆菌(E.coli)；或酵母；或原核细胞。在其它实施方案中，其是诸如哺乳动物细胞的真核细胞，如网织红细胞，或者可以是昆虫细胞。在某些实施方案中，将表达系统导入抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞、B细胞或巨噬细胞。在其它实施方案中，采用的翻译/转录细胞是无细胞系统，其可以来源于诸如大肠杆菌的微生物，或来源于诸如网织红细胞的真核细胞，或来源于诸如麦胚的植物细胞。

在一种实施方案中，蛋白或肽代表宿主基因组的一种或多种基因。因此，本发明的方法可以用于制备编码所述基因组的任何亚组的基因，并且可以用于制备编码所述基因组的大多数或基本所有基因的一组质粒或质粒的阵列。在某些实施方案中，基因组是感染剂的基因组。

通过本发明的方法获得和表达的表达系统可以用于制备所述代表感染剂或其它生物的基因组的蛋白或肽的阵列。这些阵列可以用于本发明的其它方面，其涉及鉴定将诱导体液和/或细胞免疫应答的抗原。该方法包括将此处的方法制备的至少一种蛋白或肽或代表感染剂的基因组中的可读框编码的基本所有蛋白/肽的蛋白和/或肽的阵列暴露于已经暴露于感染剂的受试者的免疫血清或血浆，该受试者可以称作“免疫的受试者”。暴露可以是例如通过用感染剂的减毒形式或感染剂的一部分接种，或被所述感染剂感染。阵列中包含的显示出与所述血清、血浆或成分免疫反应的蛋白/肽被鉴定为疫苗生产的可能候选物。如果阵列包括全长蛋白，该方法可进一步包括提供来源于由前述方法鉴定的抗原的肽的额外阵列的步骤，其中所述肽代表抗原性肽的片段，并且使得能够将抗原性表位更精确定位在肽上。或者，可以用本领域公知的方法如亲水性图来分析全长蛋白或更长的肽，以鉴定可能展示最大免疫活性的区域。鉴定为免疫反应性并且可能用于疫苗制剂中的相同蛋白或肽也可以直接用于血清学诊断测试，以鉴定负责受感染的患者的疾病的感染剂。不具有抗给定感染剂编码的蛋白的血清抗体的患者不受该感染剂的感染。具有抗来自感染剂的蛋白的抗体的患者是最近受到过感染，或过去某个时间受到过感染。

用于鉴定免疫活性肽或蛋白的肽/蛋白阵列可以代表感染剂基因组的显著部分，如50％，或它们可以代表大多数(>50％)或基本所有(至少98％)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过本发明的方法制备蛋白的阵列。在一些实施方案中，将本发明的方法制备的蛋白或肽或阵列暴露于来自多个免疫的受试者的免疫成分，从至少大多数免疫的受试者诱导免疫应答的蛋白或肽被鉴定为免疫优势抗原，并且是包含在疫苗中的合适候选物。在一些实施方案中，也将阵列或蛋白本领域来自未免疫的受试者的血清，将在免疫的受试者中诱导免疫应答，但在未免疫的受试者中不诱导免疫应答的蛋白被选为适用于疫苗。

在本发明的一些实施方案中，通过检测来自免疫的受试者的至少一种抗体与蛋白或肽的结合而检测体液免疫应答。可以通过本领域公知的方法观察蛋白与抗体的结合，包括需要采用第二抗体的方法，所述第二抗体用例如荧光标记物、放射性标记物或酶进行标记。

在本发明的一些实施方案中，可以检测细胞免疫应答。相关免疫成分是来自免疫的受试者的T细胞。在所述实施方案中，观察当所述T细胞接触一种或多种肽或蛋白时由T细胞形成至少一种细胞因子，从而检测免疫应答。对于所述实施方案，可以由抗原呈递细胞(APC)呈递肽或蛋白，在一些实施方案中，将APC用于从本发明的方法获得的质粒表达肽或蛋白。在其它实施方案中，蛋白或肽是作为含有至少一种表位标记的融合蛋白而表达的，所述表位标记用于将蛋白或肽固定于表面。在一些实施方案中，表面是小于APC的颗粒或珠子，因此可以被诸如巨噬细胞的APC摄取；在一种所述实施方案中，颗粒是镍珠或包被了镍或镍盐或络合物的珠子，并且肽或蛋白包括具有至少6个连续组氨酸残基的聚组氨酸表位标记。然后可以通过聚组氨酸标记对镍的亲和力，将肽固定在含镍的珠子上。

另一方面，本发明提供了检测获自受试者的免疫成分对测试物质的免疫应答的方法，所述测试物质包含在含有其它抗原性物质的样品中，受试者可能对所述其它抗原性物质表现出免疫应答。这些情况可能来自于，例如，当要测试的蛋白受试者在来源于细胞的系统中表达时，并且受试者可能曾经暴露于所述系统，因此受试者对其表现出免疫应答。在该方法中，首先用额外的、不相关的抗原性物质处理获自受试者的免疫成分，从而在用所述测试物质处理免疫成分前阻断对不相关抗原性物质的任何免疫反应。例如，如果在来源于大肠杆菌的系统中产生要测试的蛋白或肽，可以用大肠杆菌提取物处理来源于人类受试者的免疫成分样品，以阻断人类可能对多种大肠杆菌抗原表现出的背景免疫应答。然后，可以预先用大肠杆菌的裂解物或提取物处理来自受试者的样品。

概言之，本发明涉及提供由可读框(ORF)或其一部分编码的各个蛋白或肽的方法，该方法包括在提取自重组酶感受态细胞的混合物(不是克隆)的表达系统(如质粒)中表达编码所述蛋白或肽的插入片段，所述细胞进行了修饰，以包含所述插入片段和线性化的质粒；其中所述线性化的质粒和插入片段通过所述细胞中的体内同源重组而连接，并且其中从所述ORF或其部分扩增了所述插入片段。在一种特定实施方案中，线性化质粒自身得到了扩增。可以通过PCR进行扩增。例如，可以在无细胞系统或提供需要的翻译后修饰的细胞中进行表达，以产生蛋白。该方法可以允许同时产生多种蛋白或肽。在一些实施方案中，可以同时产生10、50、100、200、400、600、800、1000、1500、2000或2000种以上不同的蛋白或肽。

本发明提供了生产由感染剂或生物的基因组编码的大多数或基本所有蛋白或肽的方法。由此获得的蛋白或肽可能分别包含在或可以点样在基质，如硝酸纤维素或板或芯片上，以便在测试表面上产生蛋白或肽的阵列。在一些实施方案中，每一种所述蛋白或肽都可以与一种或多种表位标记融合，这使得能够对翻译后的蛋白进行检测、定位或纯化。表位标记可以用于将蛋白或肽固定在携带互补结合物质或由所述物质组成的表面上，所述物质例如是能够与表达的蛋白的聚组氨酸标记紧密结合的镍表面。因此，在一些实施方案中，表达的感兴趣的肽与表位标记融合，所述表位标记用于将肽固定在诸如珠子或测定板孔的表面上。在一种实施方案中，表位标记是含有至少6个连续组氨酸残基的聚组氨酸序列，固定了一种或多种所述蛋白的表面包括镍。

在另一种实施方案中，本发明涉及获得包含插入片段的质粒的方法，所述插入片段包含作为ORF或其部分的核苷酸序列，该方法包括从重组酶感受态微生物的混合物(不是克隆)提取所述质粒，所述微生物进行了修饰，以含有线性化的载体和包含所述ORF或其部分的扩增的核酸，并且通过同源重组实现所述插入片段和所述线性化的质粒的重组。

另一方面，本发明涉及鉴定将对感染剂产生体液免疫应答的抗原的方法，该方法包括使通过本发明的方法获得的蛋白和/或肽与免疫血清或血浆或其中包含的免疫球蛋白接触，所述免疫血清、血浆和免疫球蛋白中的每一种物质都获自暴露于任选处于减毒形式的感染剂或其一些部分的受试者，接触的方式预计将诱导免疫应答，并且将与血浆、血清或分离的免疫球蛋白免疫反应的那些蛋白或肽鉴定为合适的抗原。在一些实施方案中，所述肽/蛋白代表了所述感染剂的大部分或基本全部基因组，并且，免疫反应性包括了与受试者反应于感染剂而产生的至少一种抗体的结合。可以根据上文描述的方法采用体内重组获得质粒，然后在来源于细胞的系统中表达，以获得蛋白或肽，所述系统可以在完整细胞内，或者可以是无细胞系统。在某些情况下，可能需要用携带了用于表达蛋白的来源于细胞的系统的生物的裂解物处理血清或血浆，以使背景免疫反应最小。在一些实施方案中，从大肠杆菌获得来源于细胞的系统，用大肠杆菌的提取物或裂解物阻断对来源于细胞的系统的成分的背景免疫应答。在一些实施方案中，可以用第二抗体检测蛋白或肽与抗体的结合，为了便于检测，用荧光、放射性或酶标记基团对第二抗体进行了标记。

在其它方面，本发明涉及鉴定对感染剂产生细胞免疫应答的抗原的方法。该方法可以与上文所述的方法相似，但可以使用受试者的树突细胞或免疫系统的其它细胞成分作为免疫活性的诊断剂。在某些实施方案中，通过例如在表达的蛋白上掺入使得蛋白能够固定在镍包被的珠子上的聚组氨酸表位标记，将上文所述的方法提供的蛋白或肽固定在诸如珠子的基质上，然后将固定的蛋白或肽暴露于APC。有利地，基质是诸如珠子的结构，其小于APC，因此由所述APC内化。然后将所述APC暴露于至少一种类型的应答细胞，如通过上文所述的方法进行了抗感染剂免疫的受试者的T细胞，所述应答细胞或T细胞产生一种或多种细胞因子，证明了存在对该蛋白的免疫应答。因此，在该实施方案中，通过检测当T细胞暴露于APC时一种或多种细胞因子的形成，可以检测免疫应答，所述APC已经暴露于过肽或蛋白。或者，可以通过观察所述应答细胞或T细胞的细胞毒性活性的增殖，可以检测免疫应答。

一旦鉴定了抗原性蛋白，就可以用本发明的方法筛选蛋白，以更精确地鉴定蛋白上的免疫原性区域。这是通过提供设计用于表达蛋白的片段而完成的，所述区域的长度可以是例如10-20或20-30或20-50或20-100个氨基酸，但合适的时候也可以采用更短或更长的片段。然后通过本发明的方法表达和分析这些更短的片段，由此鉴定产生抗原性效果的肽。任选地，这些片段可以设计为重叠的，使错过抗原的机会最小，因为它跨两个片段。

在其它方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的蛋白/肽的阵列，涉及从所述阵列鉴定的抗原，涉及通过本发明的方法鉴定的免疫优势抗原，涉及包含至少一种所述抗原的疫苗组合物，以及包含编码至少一种所述抗原的核苷酸序列的DNA疫苗组合物，并且涉及含有至少一种由上述方法鉴定的抗原的血清血诊断测试。在其它方面，它涉及至少一种所述抗原的特异性抗体，特别是单克隆抗体，并且涉及包含所述抗体的组合物。另一方面涉及用本发明的组合物，包括抗原、抗原、疫苗和DNA疫苗免疫受试者的方法，和例如利用治疗上或诊断上用这些方法鉴定的核酸和/或抗原明确确定个体是否感染或以前感染过特定生物。

在本发明的某些实施方案中，用此处描述的生产表达系统的方法将选自生物基因组的一组基因中的每一种基因掺入生物自身的质粒，所述质粒任选包含表位标记；并且生产所述蛋白的阵列，其代表所述生物的大多数或基本所有的蛋白(完整蛋白组)。该生物可以是感染剂，如炭疽芽孢杆菌(炭疽病)、肉毒梭菌、鼠疫耶尔森氏菌、天花和其它痘病毒、土拉热弗朗西丝氏菌(野兔热)或病毒性出血热病毒，包括沙粒病毒(如LCM、Junin病毒、Machupo病毒、Guanarito病毒、拉沙热病毒)、布尼病毒(如汉坦病毒、山谷热病毒)、黄病毒(如登革热病毒)或线状病毒(如埃博拉病毒、马尔堡病毒)。生物也可以是感染剂，如类鼻疽伯克霍尔德氏菌、伯氏考克斯氏体(Q热)、布鲁氏菌种(布鲁氏菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽病)、蓖麻毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒(普氏立克次氏体)或食物和水传播的病原体，包括细菌(如致腹泻大肠杆菌、致病弧菌、志贺氏菌种、沙门氏菌属、单核细胞增生利斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎病毒)或原生动物(如Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayatanensis、表吮贾第虫、弓形虫属、微孢子属)。所述生物也可以是诸如病毒性脑炎病毒，包括西尼罗河病毒、LaCrosse病毒、加利福尼亚脑炎病毒、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒或柯萨努尔森林病毒的感染剂。所述生物也可以是诸如Nipah病毒、汉坦病毒、蜱传播的出血热病毒(如克里米亚-刚果出血热病毒)、蜱传播的脑炎病毒、黄热病毒、多药物抗性TB病毒、流感病毒、立克次氏体、狂犬病或严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)的感染剂。在一些实施方案中，它是土拉热弗朗西丝氏菌、人乳头瘤病毒、西尼罗河病毒、类鼻疽伯克霍尔德氏菌或恶性疟原虫、结核分枝杆菌或痘苗病毒。可以将如此产生的蛋白排列成阵列，如通过将产生的每种蛋白或肽点样在诸如芯片的测试表面上。可以通过蛋白与测试表面，如与硝酸纤维素的非特异性结合，或通过表位标记(如果存在于蛋白或肽上)与结合表位标记的表面的一部分之间的缔合，将蛋白定位在所述阵列上；例如，如果蛋白或肽包含聚组氨酸标记，可以使用含镍的表面。

阵列可以包括所述生物的选定的一组蛋白，或它可以包括代表感染剂的至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％或更多，即基本全部基因组的蛋白和/或肽。所述蛋白和/或肽的数目将是至少100、200、300、400、500、1000、1500、2000或超过2000种不同的序列。在这样的实施方案中，可以通过制备集合起来代表所述比例的生物蛋白组的一些独立的阵列，从而获得所述阵列。因此，在一些实施方案中，本发明提供了在测试表面生产蛋白阵列的方法，其中该阵列代表感染剂的蛋白组的选定部分，最多并且包括基本整个蛋白组。所述蛋白组阵列可以用于确定感染受试者的致病生物的株，以及用于鉴定免疫优势抗原性蛋白，或用于确定蛋白可能具有的任何其它活性或特性。在其它方面，本发明涉及与鉴定的抗原具有免疫反应性的单克隆抗体，和用所述抗体赋予被动免疫的方法。

附图简述

图1显示了宿主载体的简图和BamH1位点周围的核苷酸序列。如图所示，来自于从基因组PCR扩增的片段的框内插入发生在206号碱基的谷氨酸密码子GAG。5’同源克隆区开始于206号碱基，并且向上游延伸33个碱基，并且导致与10×组氨酸标记的框内融合。3’同源克隆区开始于212号碱基，向下游延伸33个碱基，导致HA标记，并且以TAA终止密码子终止。

图2显示的凝胶展示了清洁过的来自痘苗病毒和土拉热弗朗西丝氏菌的PCR产物。

图3显示了苯酚-氯仿裂解的细胞的凝胶，所述裂解的细胞产生来自实现重组的大肠杆菌的过夜培养物的总核酸。

图4显示了来自从图3中采用的过夜培养物选定的集落的微量制备物的质粒。

图5显示了对图4的质粒微量制备物的翻译产物进行电泳的SDS PAGE凝胶，用抗聚组氨酸抗体探测所述凝胶。

图6显示用抗组氨酸抗体或抗HA抗体探测的图4的质粒的翻译产物的斑点印迹。

图7显示用抗组氨酸标记(图7)、抗HA标记(图7B)、用不含大肠杆菌裂解物的VIG(图7C)和裂解物存在下用痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)(图7D)探测的斑点印迹上鉴定的免疫反应性蛋白的SDS PAGE的示范结果。

图8显示用和不用大肠杆菌裂解物处理VIG时各个痘苗病毒蛋白的斑点印迹的定量结果。

图9显示鉴定与VIG具有免疫反应性的D8L、F13L、H3L、H5R、A56R和644的痘苗病毒蛋白的微阵列。

图10显示了获自转化混合物的总核酸，其包括来自上文所述痘苗病毒的插入片段。

图11显示了用抗聚组氨酸探测的在获自细胞混合物的质粒上进行的翻译反应。

图12A-12D显示了图11的蛋白的斑点印迹，所述蛋白不经过纯化而施加到硝酸纤维素上，以提供痘苗病毒蛋白的阵列。图12A-D分别显示了当用抗组氨酸、抗HA、不含裂解物的VIG、含裂解物的VIG探测斑点印迹时的结果。

图13显示了更小的蛋白阵列，其显示有和没有大肠杆菌裂解物时的结果。

图14A和14B显示了未接触过抗原和痘苗病毒免疫的小鼠和人血清的痘苗病毒斑点印迹结果。

图15显示了痘苗病毒的H3L包膜蛋白的扫描，其中将蛋白序列分成10个片段，每个片段与其相邻的片段重叠20个氨基酸，参见实施例8的描述。

实施本发明的模式

本发明的一个实施方案提供了获得代表在感染剂的基因组中编码的蛋白和/或肽的蛋白和/或肽的阵列的高通量方法，使得能够测试该阵列引起体液和/或细胞免疫应答的能力。制备阵列中的蛋白的方法适用于普遍制备任何来源的蛋白。具体地，该方法中固有的高通量优点适用于提供来自感染剂的蛋白和肽的所有组成成分。该方法也可以用于提供由已知序列的任何核酸编码的多种蛋白和/或肽，使得可以将各个扩增的部分或插入片段提供给能够在含有重组酶的微生物中复制的质粒。本发明的制备所述蛋白的方法与以前采用的方法的不同之处在于它采用从微生物的混合物提取的DNA，所述微生物的混合物是通过培养转化混合物而不是通过分离单个克隆而获得的。这是有利的，因为克隆的分离通常导致获得突变体而不是需要的蛋白的天然形式。此外，在筛选阶段，本发明的方法可以采用获自这些混合物的载体编码并表达的蛋白的未纯化形式。因此，本发明的方法显著简化了总体程序的自动化，并且采用了高通量加工。

采用本发明的方法，可以鉴定来自痘苗病毒的特定蛋白，其将是有效的疫苗。这是非常有意义的，因为减毒病毒的使用有时会带来不利的副作用。优选利用单个蛋白或蛋白的确定混合物，而不是减毒形式的复杂感染剂。目前，例如，使用乙型肝炎病毒表面抗原实现了这一点。

如上文所述，本发明的方法适用于总体上编码多种蛋白和肽的核酸(其中已知相关的核苷酸序列)，使得可以用合适的引物实现需要的插入片段的扩增。如在此引入作为参考的US2003/0082579和US2003/0044820所述，设计的引物可以包括给需要的同源重组提供线性化载体的衔接序列。延伸的引物自身和/或线性化的载体随后可以提供合适的控制序列，如启动子和终止子，以实现表达和“标记”，如组氨酸标记、FLAG标记等，以允许与合适的固体表面的结合加强，或如果需要，允许表达的蛋白的纯化。通常，也通过PCR扩增线性化的载体，而不是采用更常规的载体消化方法，所述常规方法会得到不能含有插入片段的载体。

在本发明的总体方法中，编码多种蛋白或肽，并且核苷酸序列已知的核酸分子，如感染剂基因组，被用作底物。用PCR或其它扩增技术单独扩增(即在单个反应混合物中)每个编码感兴趣的蛋白或肽的片段，其中采用含有与编码序列的一个末端部分互补的序列和可以编码标记和/或控制表达的序列的衔接子，但是，其在任何事件中都与线性化质粒上提供的序列同源。然后，将单独扩增的片段和线性化的质粒共转染到含有重组酶的微生物中，以进行体内重组。含有重组酶的生物可以是，例如，酵母，或可以是化学感受态大肠杆菌(或，其次理想的，是电穿孔感受态大肠杆菌)。合适的化学感受态大肠杆菌包括菌株JC8679、TB1、DH5α、HB101、JM101、JM109和LE392。啤酒糖酵母是特别有效的含重组酶的酵母。

转染反应中DNA与细胞的比例可以高达100ng/一百万个细胞；但是，低至1-10ng、5-10ng、1-5ng或1-3ng/一百万个细胞的比例也可以使用。通常需要提供线性化的质粒，理想的核苷酸序列是大约1：1的摩尔比，但也可以使用5:1至10:1至100：1的比例，也可是使用1:5至1：10至1：100的比例。

由此用扩增的插入片段处理细胞，在合适的培养基上培养扩增的线性化载体，通常培养过夜。得到了细胞的混合物，大多数含有需要的重组载体，所述载体具有以正确方向插入的所需核苷酸序列的扩增的片段。(通过设计引物以匹配线性化质粒的同源部分而确保方向性)。直接从培养物收获细胞并且提取获得质粒DNA，而不是分离单个集落，因为分离单个集落有损失需要的插入片段的风险，而有利于得到突变体。然后通过将DNA转染到合适的宿主细胞，或者通常为了达到高通量，在体外翻译系统中使质粒混合物进行转录/翻译。所述体外翻译系统是可商购的，使用它们的方法是本领域技术人员公知的。然后，可以直接将得到的蛋白或肽点样在固体支持物上，所述支持物可以是在任何合适的表面制备的蛋白和肽的阵列，所述表面如微量滴定板的孔或分段的硝酸纤维素。如果需要，可以通过本领域公知的方法纯化蛋白，或者采用从引物或质粒编码到蛋白中的标记纯化蛋白，或者，可以直接使用转录/翻译混合物，而不进一步纯化蛋白，以便给固体支持物提供蛋白或肽。通过该方法生产的纯化或基本纯化的蛋白是本发明的一方面。这些蛋白或肽可以是天然存在的肽，或包含一个或多个添加，如下文进一步描述的表位标记的修饰形式。当蛋白附着于支持物时，可以给固体支持物自身提供蛋白或肽上的标记的对应配体。

为了获得蛋白的阵列，对需要数目的ORF或其部分进行前述顺序的步骤。如果对于在阵列上进行的任何筛选，可能的候选物是已知的，仅仅获得相对小数目的蛋白或肽作为蛋白/肽阵列的成员可能是有利的。但是，可以将多种核苷酸序列转变为蛋白或肽；如多至50、100、500、1,000或更多。例如，如果采用感染剂的基因组，或任何原核生物的基因组，阵列可以包括至少10％、20％、50％、75％、90％、95％或100％表达的蛋白和肽。得到的阵列可以代表生物的基本完整的蛋白组，即至少约98％的蛋白组或其仅仅一部分，或可以代表蛋白组中的蛋白的单个肽部分，全长蛋白和部分序列的组合。

为了促进肽或蛋白的阵列的制备，可能有利的是将感兴趣的肽或蛋白与短肽标记融合，所述标记通常的长度是6-20个氨基酸，其结合于特定官能团。然后，可以将所述结合标记用于纯化蛋白或将蛋白固定于测试表面，或检测蛋白的存在。所述由短的氨基酸序列组成的结合标记是公知的，通常称作表位标记。例如，通过将合适的核苷酸序列掺入用于将基因组核酸插入表达质粒的衔接子中，可以将血凝素(HA)表位标记(如人流感病毒血凝素蛋白YPYDVPDYA)或c-Myc表位标记(人原癌基因myc的10个氨基酸的片段，EQKLISEEDL)融合于要表达的肽或蛋白。然后，可以用c-Myc、HA或其它表位标记的抗体检测或定位表达的肽。

类似地，聚组氨酸标记可以用作表位标记，并且可以通过衔接子的合适设计，掺入表达的蛋白中，所述衔接子用于将基因组核酸插入用于表达蛋白的载体中。聚组氨酸表位标记可以包含3-12个连续组氨酸残基，通常6-10个连续组氨酸残基。所述聚组氨酸标记将特异性和紧密结合于镍表面；由此，含有所述标记的表达的肽或蛋白将紧密结合于镍珠、镍包被的表面或包含镍或镍盐或络合物，如次氮基三乙酸镍(Ni-NTA)的亲和柱。因此，通过用镍或镍盐或络合物包被每个孔，然后将每种蛋白或肽的溶液置于所述镍包被的孔中，并且使蛋白固定于表面，以96孔形式生产含有聚组氨酸标记的蛋白或肽的阵列。类似地，通过制备镍珠，或通过用镍或镍盐或络合物涂布其它物质的珠子，可以将所述蛋白附着于珠子，用于方便地展示。在一种实施方案中，用包含至少6个连续组氨酸残基的聚组氨酸标记对基因组的蛋白进行标记，使其附着于1um的镍珠；然后将这些珠子用于测定T细胞的免疫应答，如下文实施例9的描述。

需要时，也可以连接两种不同的标记：编码第一标记的核苷酸序列，它可以包含在插入质粒的核酸的5’末端附近，以便在表达的蛋白的N末端连接标记，和编码第二标记的核苷酸序列，它可以包含在插入质粒的核酸的3’末端附近，以便在表达的蛋白的C末端连接标记。这些标记可以是相同的，以确保当一个末端被掩盖因此不可及情况下的识别；或它们可能是不同的，以确保使用两种不同的捕获或检测方法。用于检测、定位或纯化的其它标记也可以根据需要连接于基因组蛋白。所述标记包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、生物素化信号、绿色荧光蛋白(GFP)等，通过本领域公知的方法可以掺入每一种所述标记。

一旦获得了需要的肽/蛋白或肽/蛋白的阵列，可以对其进行筛选，得到任何需要的特性或反应性。所述用途一个实例是筛选免疫活性肽和蛋白。免疫活性可以是针对体液或细胞系统。在任一种情况下，需要获得从已经暴露于感染剂或其一些部分的受试者获得筛的选剂。任选地，可以用来自于多个受试者的一个或多个免疫成分(血清、痰、血浆、T细胞等)筛选蛋白或肽的阵列，所述受试者均已经暴露于感染剂或其部分，如其包膜蛋白或裂解的细胞，或其一种或多种蛋白。这使得能够确定多个受试者中哪些抗原诱导了免疫应答，其中最常识别的那些称作免疫优势抗原。一个家族的抗原可以用于血清学诊断测试或用于包含一些所述免疫优势抗原的疫苗中。

本发明的方法可以适用于多种基因组，并且通常适用于感染剂，包括病毒、真菌、细菌、原生动物等以及多细胞寄生虫如扁形虫、吸虫、蛔虫等的基因组。通过提供迅速生产代表所述感染剂的大部分或所有蛋白组的蛋白的阵列，本发明使得能够迅速鉴定对于开发针对特定感染剂的疫苗或诊断测试最有用的那些基因和蛋白。

因此，此处用到的术语“免疫活性”是指蛋白或肽诱导免疫应答的能力，无论所述应答是体液还是细胞应答，或这两者。体液免疫应答是一种获得性免疫机制，其特征在于抗体的产生，而细胞免疫应答的特征在于诸如激活的天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(T细胞或CTL)的细胞的产生和/或激活。类似地，“抗原”是指所述免疫活性蛋白或肽，而不论诱导的免疫应答的性质如何。“免疫优势抗原”是指在暴露于抗原的大多数或所有受试者中诱导免疫应答的抗原；所述免疫优势抗原最有可能提供用于被动免疫方法中的疫苗成分或抗体产生的诱导剂，因此，对于用作免疫组合物的成分特别有用，并且也将可以用于血清学诊断测试。

T细胞识别其它细胞表面的肽/MHC复合物。所述细胞通常称作抗原呈递细胞(APCs)。尽管效应细胞可以通过识别基本任何细胞类型上的所述复合物介导它们的功能，但通过一组特化的APCs，即树突细胞(DCs)未接触过抗原的细胞被最有效地激活。

此处用到的“阵列”是指系统地位于至少一个测试表面上的物质的集合，包括包含在所述表面上形成的孔或凹陷中的物质，其中该物质的放置与物质的身份相关。阵列通常包含至少约10种如此放置的物质，通常包含至少100或200或500种，或可以包含1000或更多种物质。它包括点样在芯片、板或硝酸纤维素基质上的物质，例如，包含在96孔和384孔板以及类似板的孔中的物质，只要这些物质保留在放置它们的位置中，不论是由于物理还是化学力而保留。阵列可以包含多个板、芯片或其它表面。微阵列是一种微型化的阵列，例如，它们可以设计为使试剂体积最小。尽管此处描述的阵列通常是抗原性肽的阵列，本发明包括对于所述肽具有选择性的抗体的阵列。

本发明的方法鉴定的抗原可以是肽或蛋白，并且可以用于制备保护受试者抗感染剂感染的免疫原性组合物，或产生用于提供被动免疫或用于纯化或检测抗原的单克隆抗体。所述免疫原性组合物可以是能够诱导受试者产生免疫应答，如产生抗体的疫苗，或它们自身可以是提供被动免疫的抗体或活性免疫学物质。产生它们的抗独特型抗体或核酸可以用于代替抗原。它们也可以是产生一个或多个抗原性表位的核酸疫苗，其中核酸可以由受试者自身的细胞摄取。它们可以伴随功能元件，如实现编码的抗原性蛋白或肽的产生的启动子，或可以是裸DNA。

本发明也包括与通过本发明的方法鉴定的肽和抗原基本同源的肽和抗原，以及来源于所述基本同源的抗原的免疫组合物。因此，本发明包括含有与通过此处描述的方法鉴定的肽或蛋白基本同源的肽或蛋白的诊断测试或疫苗；本发明包括与通过此处描述的方法鉴定的抗原基本同源的抗原的特异性抗体；并且本发明包括具有编码这些基本同源的肽或蛋白的核苷酸序列的核酸。

此处针对蛋白或肽使用的术语“基本同源”表示相应于参比蛋白或肽的蛋白或肽，其中所述蛋白或肽具有与参比物基本相同的结构和功能，例如，仅仅是氨基酸序列的改变，不影响功能。因此，在本申请中，基本同源的肽和蛋白是免疫活性的，并且与参比物具有相似的结构。至于结构，基本同源的蛋白或肽与参比蛋白或肽之间的同一性百分比是至少65％，或至少75％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少99％。

可以通过本领域公知的方法进行用于同一性比较的蛋白序列比对。比较蛋白序列的有用方法包括Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；Needleman&Wunsch，J.MoI.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性法检索；这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)和目测观察(通常参见下文引用的Ausubel et al)。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul et al，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。进行BLAST分析的软件可以从国家生物技术信息中心的网站www.ncbi。nlm.nih.gov公开获得。该算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度W的短字长鉴定高得分序列对(HSPs)，所述询问序列当与数据库序列中相同字长比对时，匹配或满足一些正值阈值得分。T称作相邻字得分阈值(Altschul et al，1990)。这些最初的相邻字命中作为启动发现含有它们的更长HSPs的检索的种子。然后，沿着每个序列的两个方向延伸字命中，直到可以增加累积的比对得分。对于核苷酸序列，累积的评分是用参数M(对于一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)计算。对于氨基酸序列，用评分矩阵计算累积得分。当累积的比对得分从其达到的最大值下降的量为X时，每个方向的字命中的延伸停止，累积的得分达到0或以下，这是由于一个或多个得负分的残基比对的累积，或达到任意序列的末端。BLAST算法参数W，T和X确定了比对的灵敏度和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值是字长(W)为3，预期值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)89：10915)。

可以用LASERGENE生物信息学计算程序组(DNASTARInc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对。可以用Clustal比对法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对，其中采用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝10)。用Clustal法进行逐对比对的默认参数可以是例如KTUPLE1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALSSAVED＝5。

或者，当蛋白或肽是免疫交叉发应性时，考虑蛋白或肽也是基本同源的。可以用多种免疫测定形式选择与特定蛋白或肽特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定、蛋白印迹或免疫组化选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。对于可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件，参见Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York″Harlow and Lane″)。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪音的至少2倍，更典型是超过背景的10-100倍。

本领域普通技术人员可以理解，序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸(例如，小于约5％，或例如小于约1％)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。以下五组均包含彼此保守取代的氨基酸：脂族氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族氨基酸：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。也参见Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman andCompany。每个描述的序列暗含描述的核酸的核苷酸序列或多肽的氨基酸序列的保守修饰的变异。

本发明的一方面涉及编码特定氨基酸序列的全部或主要部分的核苷酸序列，所述特定氨基酸序列编码此处鉴定的蛋白或其主要部分。(所述蛋白的一个实例是H3L西方保留株、H3L哥本哈根株和H3L天花孟加拉株蛋白)。蛋白的“主要部分”包括足够提供推测性鉴定的氨基酸序列，所述鉴定是通过本领域技术人员对序列的人工评估，或通过计算机自动化的序列比较和鉴定，其采用诸如BLAST(基本的局部比对检索工具；Altschul，S.F.，et at，(1993)J.MoI.Biol.215：403-410)的算法。概言之，9个或更多连续氨基酸的序列对于推测性鉴定一种蛋白与已知蛋白同源是必要的。可以通过片段与此处公开的蛋白相比的氨基酸序列的同一性百分比而鉴定基本同源的蛋白片段。

如下文更详细指出的，可以合成制备免疫原性肽，如通过化学合成或通过重组DNA技术，或从天然来源如完整病毒或其它感染剂分离免疫原性肽。尽管肽通常基本不含其它天然存在的宿主细胞蛋白及其片段，在某些实施方案中，肽可以与天然片段或克隆合成地缀合。

可以根据需要修饰具有所需活性的肽，以提供某些需要的特性，如改进的药理学特征，同时增加或至少基本保留未修饰肽的所有抗原性活性。例如，肽可以进行多种改变，如保守或非保守取代，其中所述改变可能给它们的用途提供某些益处，如改进的MHC结合。氨基酸取代的范围也可以包括使用D-氨基酸。可以用公知的肽合成程序进行所述修饰，如Merrifield，Science232：341-347(1986)，Baranyand Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds。(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；和Stewart and Young，Solid PhasePeptide Synthesis，(Rockford，Ill.，Pierce)，2d Ed.(1984)中的描述，在此引入上述每篇文献作为参考。

用于治疗性处理的药物组合物意欲用于肠胃外、表面、口服或局部给药。在一些实施方案中，可能需要在本发明的药物组合物中包含至少一种激发CTL的成分。已经鉴定出脂质是能够体内激发抗病毒抗原的CTL的试剂。例如，棕榈酸残基可以连接于Lys残基的α和ε氨基，然后例如通过一个或多个连接残基，如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等连接于免疫原性肽。然后可以将脂质体化的肽以胶束形式直接注射、掺入脂质体中或乳化在诸如弗氏不完全佐剂的佐剂中。在一种实施方案中，特别有效的免疫原包连接于Lys的α和ε氨基的棕榈酸，所述Lys通过诸如Ser-Ser的键连接于免疫原性肽的氨基末端。

可以通过多种途径制备本发明的肽。由于它们相对短，可以根据常规技术，在溶液中或在固体支持物上合成一些这样的肽(离散的表位或多表位肽)。多种自动化合成仪是可商购的，并且可以根据公知的方案使用。参见，例如，Stewart and Young，Solid Phase PeptideSynthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.(1984)，在此引入作为参考。

本发明的肽及其药物和疫苗组合物可以给予哺乳动物，特别是人，以便治疗性处理和/或预防感染。对于药物组合物，本发明的免疫原性肽通常给予已经感染了感兴趣的感染剂的个体。可以根据需要，用单独或与其它治疗联合的免疫原性肽处理潜伏期或急性期的感染。在治疗应用中，给予患者组合物，其量足以诱导对感染剂抗原的有效CTL应答并且治愈或至少部分缓解症状和/或并发症。足以实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”或“单位剂量”。为此用途的有效量通常依赖于例如肽组成、给药方式、治疗的疾病的分期和严重程度、患者的体重和一般健康状况、处方医生的判断。通常对于人类，初次免疫(用于治疗或预防给药)的剂量范围对于70kg的患者是大约1.0μg-大约20,000μg肽，典型地是大约50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg或500μg、1000μg、2000μg、5,000μg、10,000μg、15,000μg或20,000μg，有时随后给予相同剂量范围的加强剂量，但实际剂量不一定相同，加强是根据加强方案，进行数周至数月，这取决于通过测量患者血液中的特异性CTL活性而确定的患者的反应和状况。

用所述疫苗组合物进行治疗的患者和用所述疫苗组合物进行预防给药的患者群的确定是本领域技术人员公知的。对于治疗用途，应该在首次出现感染体征或诊断急性感染后短时间开始给药。随后给予加强剂量，直到症状至少基本消除和随后的一段时间。在慢性感染中，可能需要加载剂量和随后的加强剂量。

也可以将肽组合物用于治疗慢性感染和刺激免疫系统，以消除例如携带者中的受病毒感染的细胞。提供制剂中的免疫加强量的肽和足以有效刺激细胞毒性T细胞应答的给药模式通常是重要的。因此，对于治疗慢性感染，可能需要给予免疫剂量，然后以确定的间隔，如1-4周，给予加强剂量，优选给予长时间，以有效免疫个体。

通常，需要制备含有至少两种或至少三种或五种或更多种来自感染剂的抗原的鸡尾酒，以便确保疫苗对于宽范围的接受者有效。除了肽的主要的抗原性活性，它有时也用于确定未免疫的受试者是否也表现出对肽的免疫应答。用作疫苗的免疫原性肽的鸡尾酒有时被选择包含至少两种或至少三种与来自免疫的受试者的血清反应但不与来自未免疫的受试者的血清反应的蛋白。

可以通过本领域技术人员熟悉的任何方法，包括口服、吸入、表面和注射方法送递本发明的组合物。通常，肠胃外给予药物组合物，如静脉内、皮下、皮内或肌内给予。因此，本发明提供用于肠胃外给药的组合物，其包含溶解于或悬浮于可接受的载体，优选含水载体中的免疫原性肽的溶液。可以使用多种含水载体，如水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可以通过常规的公知灭菌技术对组合物进行灭菌，或可以进行无菌过滤。可以将得到的水溶液进行包装，以原有的形式使用或冻干，冻干制剂在给药前与无菌溶液混合。组合物可以根据大致的生理状况的需要含有可药用的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂等，例如乙二胺四乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

也可以通过脂质体给予本发明的组合物。脂质体包括乳状液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄层等。在这些制剂中，掺入了要送递的肽制剂作为脂质体的一部分，所述肽是单独的或与结合于例如在淋巴样细胞中普遍存在的受体的分子或其它治疗或免疫原性组合物组合，所述分子如结合于CD45抗原的单克隆抗体。因此，用本发明的需要的肽进行了填充或修饰的脂质体可以针对淋巴样细胞的位点，然后脂质体可以在此处送递选定的治疗性/免疫原性肽组合物。用于本发明的脂质体是从标准的形成液泡的脂质形成的，所述脂质通常包括中性和带负电的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常根据以下考虑，如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性。多种方法可以用于制备脂质体，如Szoka，et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利Nos.4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369中的描述。也可以使用其它类型的佐剂和乳状液，如SAF-1、PROVAX和番茄苷。也可以用明矾辅助刺激抗制剂化的蛋白或肽抗原的免疫应答。

对于固体组合物，可以采用常规的无毒固体载体，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过掺入任何正常情况下采用的赋形剂，如前面列出的载体，和通常0.01-95％的活性成分，即本发明的一种或多种肽而制备可药用的无毒组合物，所述活性成分更优选的浓度是0.1％-75％或0.2％-50％或1％-20％。

对于气雾剂给药，通常以精细分割的形式与表面活性剂和推进剂一起提供免疫原性肽。肽的典型百分比是0.01重量％-20重量％或l重量％-10重量％。当然，表面活性剂必须是无毒的，通常在推进剂中是可溶的。所述试剂的代表是含有6-22个碳原子的脂肪酸与脂族多元醇形成的酯或部分酯，或其环状酐，所述脂肪酸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸和油酸。可以采用混合酯，如混合或天然的甘油酯。表面活性剂可以占组合物的1重量％-20重量％，通常0.25重量％-5重量％。组合物的通常是推进剂。也可以按照需要包含载体，对于鼻内送递，如卵磷脂。

本发明的肽也可以由减毒病毒宿主如痘苗病毒或禽痘病毒表达。该方法涉及将痘苗病毒用作表达编码本发明的肽的核苷酸序列的载体。用于免疫方案的痘苗病毒载体和方法描述于例如美国专利No.4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于例如Stover，et al.(Nature351：456-460(1991))，在此引入作为参考。根据此处的说明，本领域技术人员可以理解可以用于本发明的肽的治疗性给药或免疫的多种其它载体，如伤寒沙门氏菌载体等。

对于治疗或免疫目的，可以用编码一种或多种本发明的肽的核酸的形式给予本发明的肽。核酸可以编码本发明的肽并且任选编码一种或多种额外的分子。常规用许多方法将核酸送递给患者。例如，可以将核酸作为“裸DNA”直接送递。该方法描述于例如Wolff，et al，Science247：1465-1468(1990)以及美国专利Nos.5,580,859和5,589,466，在此引入作为参考。可以按照例如美国专利No.5,204,253中的描述用弹道送递给予核酸。可以给予完全由DNA组成的颗粒。或者，可以将DNA粘附于颗粒，如金颗粒。至于肽的送递，通常需要制备含有至少两种、至少三种、或五种或更多种编码来自于感染物种的抗原性肽的鸡尾酒，以确保DNA对宽范围的接受者有效。

也可以将核酸与阳离子化合物如阳离子脂质复合送递。脂质介导的基因送递方法描述于例如WO96/18372；WO93/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques6(7)：682-691(1988)；Rose美国专利No.5,279,833；WO91/06309；和Feigner，et al，Proc.Natl.Acad.Sd.USA84：7413-7414(1987)，在此引入作为参考。

可以制备纯化的质粒DNA，用于采用多种制剂进行注射。这些方法中最简单的是在无菌磷酸缓冲液(PBS)中对冻干的DNA进行重配。已经描述了多种方法，并且可以获得很多新技术。如上文所述，核酸通常是用阳离子脂质配制的。此外，统称为保护性、相互作用的、非凝聚(PINC)的糖酯、致融合的脂质体、肽和化合物也可以与纯化质粒DNA复合，以影响各种变量，如稳定性、肌肉内分散或运输到特定器官或细胞类型。

免疫原性组合物将含有有效量的一种或多种鉴定的抗原和合适的赋形剂。注射用疫苗将典型地含有赋形剂和赋予稳定性的其它成分。组合物的性质将依赖于给药途径，所述途径可以是例如静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射，或可以是经粘膜、经皮或口组。用于疫苗的组合物的设计已经充分确立，并且描述于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，最新版，Mack Publishing Co.，Easton，PA和Plotkin和Orenstein的名为《疫苗》的书，第4版，Saunders，Philadelphia，PA(2004)，在此引入作为参考。

与灭活的病毒颗粒相反，用单个蛋白进行免疫，可能需要佐剂，以便诱导强免疫应答。尽管矿物油可能是足够的，已经报道了通过称作pluronic多元醇的线性两亲聚合物稳定的角鲨烯乳状液的使用对于诱导免疫应答是更优越的。参见Hunter，et al，Vaccine，20Suppl.3，S7-12(2002)，在此引入作为参考。此外，脂质体制剂可以有利地用于增加对蛋白的免疫应答。参见Lidgate，et al，Pharm.Research，5，pg.759-764(1988)；Hjorth，et al，Vaccine15，541-46(1997)，在此引入作为参考。给予疫苗的通用方法和方案也描述于Plotkin and Orenstein，Vaccines，第4版。

由本发明提供的抗原也可以用于诊断目的和用于给药以诱导免疫。可以用通过对上述方法鉴定的一种或多种、或两种或多种，或优选三种或多种特异性抗原的特异性反应对感染剂的抗体进行检测或定量，这使得能够快速鉴定受感染的受试者中的所述感染剂和感染剂的特定株。抗原的阵列可以用于非常精确地区分感染剂的特定菌株。这使得能够甚至在出现症状前检测暴露的受试者中的感染剂。这允许确定受试者是否具有对特定感染剂的免疫性，如此可以避免不必要的免疫。这也使得能够鉴定抗生素抗性细菌感染或抗病毒抗性病毒感染，例如，由此允许医生避免给予无效药物，并且能够快速选择合适的药物或治疗。此外，使得用户能够鉴定特定疾病状态：具有慢性结核的患者的血清曲线将不同于具有新的或活跃感染的患者，因此，采用本发明诊断性提供的抗原，可以更精确鉴定疾病状态。

本发明也包括本发明的蛋白的抗体和所述抗体的阵列。抗体可以由任何合适的方法制备，例如，在诸如兔、小鼠或家养狗的实验室动物中制备。包含本发明的蛋白的抗原可以与不完全弗氏佐剂、明矾佐剂混合，或不与佐剂混合(仅仅是PBS)，并且用一种或多种注射液注射到实验室动物中。任何形式的抗原都可以用于产生抗体，以便足够产生特定抗原的特异性抗体。诱导性抗原可以是单独或与一种或多种本领域公知的免疫原性增强剂组合的单个表位、多个表位，或完整蛋白。诱导性抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(如用至少一部分抗原转染的细胞免疫)，或可溶蛋白(如仅仅用蛋白的细胞外结构域部分免疫)。

如此处用到“抗体”是指完整的免疫球蛋白和所述抗体的免疫原性反应片段，如Fab、Fab′、F(ab′₂)、片段、重组产生的单链可变区，即sFv形式，和能够特异性识别表位的任何其它片段。

在一些实施方案中，优选单克隆抗体。制备单克隆抗体的方法是本领域公知的，并且概括地描述于Janeway，et al，Immunobiology，第5版，Garland Publishing，New York，NY(2001)，在此引入作为参考。固定抗体以制备阵列的方法是本领域公知的，如施加到诸如硝酸纤维素的保持性表面。

可以筛选抗体与抗原性蛋白的正常或表型变体形式的结合。参见，例如，ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICALAPPROACH(Oxford University Press，1996)，在此引入作为参考。这些单克隆抗体通常将以至少约1μM，更通常是至少约300nM，典型地至少约30nM，通常至少约10nM，通常至少约3nM或更佳的Kd结合，所述Kd通常是通过ELISA确定的。单克隆抗体的定义中包括了嵌合形式的那些(即包含来自不同物种的重链和轻链的部分)或通过标准人源化或受试者适应技术产生的人源化形式，或适于特定受试者的形式。

此处提供的抗体可以用于诊断应用，以及赋予被动免疫。它们包括产生的分离抗体和用本领域公知的方法至少部分纯化的抗体。这些抗体可以用于对感染剂进行检测或定量，抗原是从所述感染剂获得的；例如，它们可以用于检测受试者或可能受污染的物质中的生物武器感染剂，因为可以非常快速地从新株产生它们。它们也可以用于为了治疗或流行病学目的而区分感染剂的菌株，或鉴定诸如那些对特定药物敏感或不敏感的特定菌株。抗体的阵列可以用于鉴定感染剂的特定株。抗体是抗原纯化的有用试剂。

提供了以下实施例来说明而不是限制本发明。在这些实施例中，使用的痘苗病毒株是WR株。该株的基因组的可读框的序列以带有数字的VACWR名称保藏于GenBank。可读框的基因座的列表见表8，表8列于实施例后。列于表8中的WR株的可读框的直向同源物(其存在于哥本哈根株中)也通过它们在GenBank中的序列鉴定，其中它们具有如表8的第2列示出的名称。

可以看出，WR株中的一个基因座，即VACWR148不具有哥本哈根株中的相应直向同源物；它部分相应于天花中的具有名称A29L的抗原，并且最初是这样鉴定的。更进一步详细观察，WR148显示出强免疫优势抗原性反应，但不作图于相关物种中的单个基因。相反，WR146、WR147、WR148和WR149基因相应于A型包含体蛋白组或ATI基因座蛋白。ATI基因座相应于牛痘中的A26L和A27L，以及天花中的A26L、A27L、A28L、A29L和A30L。

在实施例和权利要求中，对于VACWR148抗原的其它基因和基因产物，以及ATI基因座基因或ATI基因座蛋白使用了相应于哥本哈根直向同源物的命名。表8中可以找到用于实施例中的与WR株的相关性。

实施例1

制备载体和插入片段

通过广泛限制消化和随后的PCR制备编码N末端组氨酸标记和C末端HA标记的线性T7载体；在没有互补的插入片段进入化学感受态大肠杆菌的情况下转化时，该程序使残留的环状载体和背景集落的量减少至接近。

用于制备线性重组载体pXT7的质粒示于图1。该载体包含T7启动子，其后是ATG起始密码子、10×组氨酸序列、要克隆的可读框的第一个密码子前面的间隔序列、BamH1位点和T7终止子。该载体在BamH1位点是双消化的，以消除残留的环状载体，因为不完全消化的载体产生缺乏插入片段的背景集落。通过PCR扩增该线性化的载体，以产生线性重组载体的储存。将每批线性载体转化到感受态大肠杆菌中，以证实其不产生背景集落。

更详细地，用BamH1(0.1μg/μl DNA，0.1mg/ml BSA，0.2U/μlBamH1，37℃，4h；将额外的BamH1加至0.4U/μl，37℃，过夜)对质粒pXT7(10μg；3.2kb，KanR)进行线性化。纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)消化物，通过荧光计定量，并且通过琼脂糖凝胶电泳(1μg)证实。将1纳克该物质用于在50μl-PCR(引物，各0.5μM：5′CTACCCATACGATGTTCCGGATTAC，5′CTCGAGCATATGCTTGTCGTCGTCG；0.02U/μl Taq DNA聚合酶[Fisher Scientific，缓冲液A]；0.1mg/ml明胶[来自于猪，Bloom300；Sigma，G-1890]；0.2mM每种dNTP；起始变性：95℃，5分钟；30个循环：95℃，0.5分钟/50℃，0.5分钟/72℃，3.5分钟；最终延伸：72℃，10分钟)中制备线性接受载体。通过琼脂糖凝胶电泳(3μl)观察PCR产物，纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)，并且根据制造商的说明书用picogreen(Molecular Probes)通过荧光术进行定量。检查每批线性接受载体中的背景KanR转化体(每40ng无KanR转化体)。

用基因特异性引物扩增来自痘苗病毒和土拉热弗朗西丝氏菌的ORF，所述引物含有与线性T7载体的末端互补的33个核苷酸的延伸。

在50μl-PCR中将1-10纳克基因组DNA用作模板：引物，各0.5μM(5′CATATCGACGACGACGACAAGCATATGCTCGAG[在5′末端的20聚体ORF特异性]；5′ATCTTAAGCGTAATCCGGAACATCGTATGGGTA[在3′末端的20聚体ORF特异性]；0.02U/μlTaq DNA聚合酶[Fisher Scientific，缓冲液A]；0.1mg/ml明胶[来自于猪，Bloom300；Sigma，G-1890]；0.2mM每种dNTP；初始变性：95℃，5分钟；30个循环：95℃下20秒，50℃下0.5分钟，72℃下每1kb1分钟，基于ORF大小，平均1-3分钟；最终延伸：72℃下10分钟)。用45和40℃下(而不是50℃)退火0.5分钟，重新扩增更难制备的PCR产物。纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)PCR产物，用picogreen(MolecularProbes，Eugene OR)通过荧光术进行定量，显现以通过琼脂糖凝胶电泳证实大小和纯度。

用基因特异性引物从基因组模板扩增每个可读框。5′寡核苷酸含有53个核苷酸；其中的33个核苷酸包含5′通用末端序列，另外20个核苷酸组成基因特异性序列。第一个起始密码子ATG位于线性载体上的聚组氨酸标记的上游，每个可读框也以ATG开始。3′定制寡核苷酸也含有53个核苷酸；其中33个组成通用末端序列，另外20个核苷酸对于感兴趣的基因是特异性。在基因序列的末端添加终止密码子序列TTA，以实现表达的基因的翻译终止。

引物示于图1，显示一组从痘苗病毒和土拉热弗朗西丝氏菌扩增的清洁的PCR产物的凝胶示于图2。对于短于1,000bp的基因，得到预测的PCR产物的成功比例是大于99％。对于这些短基因，通过调整新引物，可以改正失败。可以用方法部分详细说明的程序扩增32种1,000-2,000bp之间的基因中的28种(81％)。通过这些方法仅仅能够扩增8种超过2,000bp的基因中的3种。可以将这些更长的基因扩增为重叠片段，或可以采用有利于扩增更长产物的不同PCR条件。

实施例1A：将这些方法应用于痘苗病毒，需要制备213种基因的引物，其中分离了211种PCR产物(>99％)。对全部211种进行了克隆，对产物中的181种进行了测序；93％(181种中的169种)提供了预测的序列。

实施例1B：类似地，将该方法应用于恶性疟原虫，需要制备720种基因的引物。由此获得了462种PCR产物(64％)，产生了266个克隆(58％)。对其中的一组(63)个进行了测序，97％产生了预期的序列。

实施例1C：将上述方法用于结核分枝杆菌，为此制备了108种基因的引物。由此获得了87种PCR产物(80％)，产生了80个克隆(92％)，其中每一个都在一个末端具有抗His标记，在另一个末端具有抗HA标记。测序证实了79个测试的克隆中的70个(88％)含有预期的序列。在大多数产生的蛋白中，His和HA标记都可以用于结合，但在很多情况下，仅仅结合一个标记；通常，当仅仅可以结合一个标记时，His标记保持可以用于结合，而HA表位标记不能用于结合。

扩展了该方法，以便从结核分枝杆菌H37Rv的4,000种基因组成的基因组中表达312种基因。

实施例1D：将上述方法用于土拉热弗朗西丝氏菌，为此制备了1933种基因的引物。由此获得了1842种PCR产物(95％)，产生了1720个克隆(93％)。对其中的684个进行测序，表明643个(94％)含有预期的序列。

实施例2

体内重组和集落选择

混合实施例1的PCR扩增的ORF和线性T7载体的混合物，导入化学感受态大肠杆菌，得到含有具有插入片段的质粒的转化的集落。这种高效重组克隆方法导致了ORF的框内方向插入。

通过18℃下在500ml SOB培养基(2％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl和20mM MgSO₄)中生长DH5α细胞至0.5-0.7O.D.的光密度，在我们的实验室中制备感受态细胞。洗涤细胞，重悬于冰上的10ml预先冷却的PCKMS缓冲液(10mMPIPES，15mM CaCl₂，250mM KCl，55mM MnCl₂和5％蔗糖，pH6.7)，持续搅拌下逐滴加入735μlDMSO。在干冰乙醇上以100μl等分物冷冻感受态细胞，在-80℃下储存。

每次转化由以下成分组成：10μl感受态DH5α(按照上文在我们的实验室中制备，效率是10⁹cfu/μg超螺旋的质粒DNA)和10μlDNA混合物(40ng PCR-产生的线性载体，10ng PCR-产生的ORF片段；摩尔比1:1，载体：1kb ORF片段)。将混合物在冰上温育45分钟；热激(42℃，1分钟)，在冰上冷却1分钟；与250μlSOC培养基(2％胰化蛋白胨，0.55％酵母提取物，10mM NaCl，10mM KCl，10mMMgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖)混合，37℃下温育1小时，稀释到3ml补加了50μg卡那霉素/ml(LB Kan50)的LB(Luria Bertani培养基)中，振荡下温育过夜。通过划线到LB Kan50琼脂上从过夜培养物获得单个集落。从每次转化，选择2-3个集落进行进一步分析。通过凝胶电泳观察获自Qiagen miniprep的质粒DNA，用于选择具有插入片段的克隆。

用摩尔比为1:1的PCR片段和线性载体的混合物和50ng用于转化的总DNA完成DH5α感受态细胞的转化。转化感受态细胞，生长过夜，并且观察由于细菌生长导致的混浊，然后铺板和进行集落选择。在这些条件下，克隆效率>90％，但如果在转化当天对细胞进行铺板，观察到的成功率较低。随着用于转化的总DNA减少到25和10ng，成功转化的比例逐渐减少(未示出)。

图3显示了用图2所示PCR片段从过夜培养物得到的“破裂的凝胶”(苯酚-氯仿裂解的细菌，显示总核酸)。这些凝胶上的顶部条带是基因组DNA，底部两个条带是重和轻核糖体RNA，中间的条带是通过与线性载体和PCR片段重组形成的质粒。该凝胶中包括了空载体作为参照。在该图中示出的87个质粒中，仅仅有3个缺乏合适大小的插入片段。

将图3所示的过夜培养物划线在琼脂板上，选择2个集落，生长并进行微量制备。来源于过夜培养物的单个集落的微量制备物示于图4。对纯化的质粒进行测序，证明重组产物的保真度。根据基因组序列数据库对大部分插入片段进行准确测序。74％无突变，20％具有单个点突变，6％具有一个以上点突变。41％的点突变是A→G；其余的突变在其它11类可能的点突变中随机分布。

实施例3

蛋白的体外转录和翻译检测

在基于大肠杆菌的无细胞体外转录/翻译系统中表达图4所示的质粒上编码的蛋白，所述系统补充了T7RNA聚合酶。用Qiagen微量制备试剂盒制备作为0.5μg每种微量制备物的模板的质粒，并且包括了“任选”步骤，所述步骤包括了蛋白变性剂，以消除RNA酶活性。如果不包括该步骤，体外转录/翻译反应中的表达水平将是低的和不一致的。在0.2ml PCR12空条带管中建立具有25μl反应体积的体外转录/翻译反应(获自Roche的RTS100大肠杆菌HY试剂盒)，根据制造商的说明，30℃下温育5小时。用小鼠抗组氨酸抗体和与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体进行蛋白印迹。

为了得到图5所示的结果，在体外转录/翻译反应中将50个不同的土拉热弗朗西丝氏菌和痘苗病毒质粒温育4小时，将产物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用抗聚组氨酸抗体对凝胶进行印迹和探测。图5中的蛋白印迹显示了具有预测分子量的组氨酸标记的产物的表达，50个质粒中只有3个是阴性的。

也可以在斑点印迹上检测来自无细胞反应的未变性蛋白(图6)。将1微升每种体外转录/翻译反应直接点样在硝酸纤维素上，而没有SDS变性，用抗组氨酸或抗HA抗体探测斑点印迹。示出了来自50个痘苗病毒克隆和45个土拉热弗朗西丝氏菌克隆的反应产物(图6)。当用抗组氨酸抗体探测斑点印迹时，一个痘苗病毒反应和3个土拉热弗朗西丝氏菌没有高于背景。当用抗HA抗体探测斑点印迹时，存在更大数目的阴性反应，推测是表明该表位在未变性蛋白的三维结构中更经常被隐藏，因为电泳和蛋白印迹分析没有发现充足的成熟前蛋白产物，这是由于翻译过程中的早期终止。(制备斑点印迹的其它细节描述于实施例4)。

实施例4

微阵列和血清学筛选

采用了购自Cangene Corp(Winnipeg，Canada)的痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)。VIG是从多个供体合并的超免疫血清的免疫球蛋白级分。其用作正在经历痘苗病毒接种导致的全身病毒血症和其它不良反应的患者的紧急治疗。

为了免疫斑点印迹，将0.3μl体积的全RTS反应人工点样在硝酸纤维素膜上，晾干，然后用TBS-Tween中的5％脱脂奶粉封闭。用VIG探测印迹，在含有或不含10％大肠杆菌裂解物的封闭缓冲液中稀释到1/1,000。采用了三批不同的VIG：批号1730204(56mg/ml)、批号1730208(53mg/ml)和批号1730302(56mg/ml)。通过在碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgA+IgG+IgM(H+L)第二抗体(JacksonImmunoResearch)中温育并且用硝基-BT显影剂观察而检测人抗体。常规地，也用单克隆抗聚组氨酸(克隆His-1；Sigma H-1029)和单克隆大鼠抗血凝素(克隆3F10；Roche 1 867 423)抗体，然后分别用AP偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)(BioRad)或山羊抗大鼠IgG(H+L)第二抗体(Jackson ImmunoResearch)染色，以证实重组蛋白的存在。

以25μl规模建立体外转录/翻译反应，也建立了采用非重组表达质粒作为模板的对照反应，以便作为大肠杆菌抗原存在的对照。在5小时的合成反应结束后，立即将蛋白点样或排列在硝酸纤维素基质上，而不进行进一步纯化，或保持在4℃下不超过12小时，然后印迹。在非变性条件下进行RTS反应的点样，而不进行进一步纯化(图7)。发现大肠杆菌的抗体在人血清和VIG中都是高滴度的，并且除非被封闭，则导致掩盖任何抗原特异性反应的高背景染色。这是通过用固定在硝酸纤维素膜上的大肠杆菌蛋白除去抗大肠杆菌反应性或通过在血清或VIG中引入10％大肠杆菌裂解物以阻断抗体而克服的。实际上，我们发现吸附免疫印迹的效果与通过加入裂解物而阻断相比没有什么不同(数据未示出)。因此，后一种技术被采用作为阻断大肠杆菌背景染色的常规方法，这是因为它允许与高通量筛选的相容性和人血清的经济使用(典型是每个微阵列2-3μl)。当引入裂解物时，对照反应中斑点的强度显著减少，导致针对抗原性痘苗病毒蛋白的更强的信噪比。也应该注意VIG对A11L的反应性是构象依赖性的。在蛋白印迹中容易识别该特定抗原，但在斑点印迹的非变性形式中不识别。

实施例5

微阵列

图8示出了采用相同RTS反应的飞行微阵列，所述RTS反应用于图7中描述的免疫斑点印迹。对于微阵列，首先将15μl体积转移到384孔板中，1,600 x g离心，以沉淀出所有沉淀物，在不进一步纯化的情况下用Omni Grid100微阵列印迹仪(Gene Machines)将上清液印迹到硝酸纤维素包被的FAST^TM载玻片(Schleicher&SchuellBioscience)上。对于所有染色，首先将载玻片在蛋白阵列封闭缓冲液(Schleicher&Schuell)中封闭1小时，用与斑点印迹相同的第一和第二抗体(采用购自Jackson的Cy3偶联的第二抗体)染色，在激光共焦扫描仪中扫描。用QuantArray软件(GSI Lumonics，Inc)对荧光强度进行定量。当在斑点印迹和阵列上采用全RTS反应时，VIG具有高滴度的掩盖任何抗原特异性反应的抗大肠杆菌抗体。这是通过使VIG吸附大肠杆菌裂解物的免疫印迹或通过将大肠杆菌裂解物加入VIG而克服的。在前一种方法中，将大肠杆菌溶解于SDS PAGE样品缓冲液中，在制备凝胶上分辨裂解物，然后转移到Optitran硝酸纤维素膜(Schleicher&Schuell)上。然后将印迹切成小(5x5mm)片，并且在5％的脱脂奶粉中封闭1小时。然后冲洗所述小片，放置到预先用封闭缓冲液稀释到1/1000的VIG中，持续搅拌下温育1小时。从重悬于25ml TBS-Tween中的1升大肠杆菌(DH5)静止期培养物制备大肠杆菌裂解物，用2cm直径的探针超声处理。将1ml等分物在-80℃下储存。

在不纯化的条件下将体外转录/翻译反应印迹到硝酸纤维素包被的载玻片上，用含有和不含有10％大肠杆菌裂解物的VIG探测。对照斑点由具有非重组表达质粒作为载体的RTS反应组成。通过计算对照斑点的荧光强度的平均值和标准差，建立任意“截至值”(高于它的染色可以认为是阳性的)。可以看出，当VIG中存在裂解物时，通过微阵列也检测出了在免疫斑点印迹中检测到的相同蛋白。荧光偶联的第二抗体提供了比用免疫斑点印迹观察到的更广泛的信号强度。此外，微阵列也似乎产生了比免疫斑点印迹更高的灵敏度，因为我们观察到了一些情况，其中在阵列中检测到的蛋白低于斑点印迹的检测阈值(未示出)。

图9显示了96种痘苗病毒和土拉热弗朗西丝氏菌蛋白、加上一个对照反应的更大的阵列，它们在PCR Express^TM平台上表达。该阵列显示7种蛋白由VIG强识别，其中6种是痘苗病毒蛋白。在这些蛋白中，4种(H3L，D8L，A56R和F13L)是能够被完整病毒颗粒表面上的抗体接触到的包膜抗原。因此，该系统中的蛋白的检测显示了高度抗原特异性和生物学相关性。未变性的形式具有额外的优点，即蛋白很可能保留它们的构象依赖性表位。

实施例6

从转化混合物制备质粒

将按照实施例2的描述获得的转化混合物用作含有需要的插入片段的质粒来源，而不是按照实施例2-5选择单个克隆用于进一步的评估。如上文所述，每次转化由以下成分组成：10μl感受态DH5α和10μl DNA混合物(40ng PCR-产生的线性载体，10ng PCR-产生的来自痘苗病毒的ORF片段；摩尔比1:1，载体：1kb ORF片段)。将混合物在冰上温育45分钟；热激(42℃，1分钟)，在冰上冷却1分钟；与250μl SOC培养基(2％胰化蛋白胨，0.55％酵母提取物，10mM NaCl，10mM KCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖)混合，37℃下温育1小时，稀释到3ml补加了50μg卡那霉素/ml(LB Kan50)的LB(Luria Bertani培养基)中，振荡下温育过夜。从该培养物分离和纯化质粒，而不进行集落选择。基本按照前面实施例的描述翻译得到的质粒模板，按照下文转移到免疫斑点印迹。

用Qiagen微量制备试剂盒制备用于体外转录/翻译的质粒模板，包括了“任选”步骤，所述步骤包括了蛋白变性剂，以消除RNA酶活性。如果不包括该步骤，体外转录/翻译反应中的表达水平将是低的和不一致的。图10用来自痘苗病毒的PCR片段显示了来自过夜培养物的“破裂的凝胶”(苯酚-氯仿裂解的细菌，显示总核酸)。这些凝胶(方向朝右)上的顶部条带是基因组DNA，底部两个条带是23S和16S核糖体RNA，中间的条带是通过与线性载体和PCR片段重组形成的质粒。该凝胶中包括了空载体作为参照。在该图中示出的42个质粒中，仅仅有1个(E9L)缺乏合适大小的插入片段。为了校准总体系统的效率，扩增、克隆和表达了一组来自土拉热弗朗西丝氏菌的测试基因。在尝试的1,933种基因中，96％被成功扩增，93％被成功克隆。

在0.2ml PCR12空条带管中建立具有25μl反应体积的体外转录/翻译反应(获自Roche的RTS100大肠杆菌HY试剂盒)，根据制造商的说明，30℃下温育5小时。在基于大肠杆菌的无细胞体外转录/翻译系统中表达在T7质粒上编码的代表一组8种痘苗病毒和40种土拉热弗朗西丝氏菌蛋白的蛋白，所述系统补充了T7RNA聚合酶。将25μl体外转录/翻译反应37℃下温育4小时，将粗产物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分辨，用抗聚组氨酸抗体对凝胶进行印迹和探测(图11)。蛋白印迹显示了预定分子量的组氨酸标记的产物的表达。48个反应中的3个反应太弱，不能评分为阳性。

为了免疫斑点印迹，将0.3μl体积的全RTS反应人工点样在硝酸纤维素膜上，晾干，然后用TBS-Tween中的5％脱脂奶粉封闭。用在含有或不含10％大肠杆菌裂解物的封闭缓冲液中稀释到1/1000的购自Cangene Corporation(Winnipeg，Manitoba，Canada)的痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)探测印迹。采用了三批不同的VIG：批号1730204(56mg/ml)、批号1730208(53mg/ml)和批号1730302(56mg/ml)。通过在碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgA+IgG+IgM(H+L)第二抗体(Jackson ImmunoResearch)中温育并且用硝基-BT显影剂观察而检测人抗体。常规地，也用单克隆抗聚组氨酸(克隆His-1；SigmaH-1029)和单克隆大鼠抗血凝素(克隆3F10；Roche1867423)抗体，然后分别用AP偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)(BioRad)或山羊抗大鼠IgG(H+L)第二抗体(Jackson ImmunoResearch)染色，以证实重组蛋白的存在。对于微阵列，将10μl0.125％的Tween20与15μl RTS反应混合(以得到0.05％Tween的终浓度)，将15μl体积转移到384孔板中。将板1,600xg离心，以沉淀出所有沉淀物，在不进一步纯化的情况下用Omni Grid100微阵列印迹仪(Gene Machines)将上清液印迹到硝酸纤维素包被的FAST^TM载玻片(Schleicher&Schuell Bioscience)上。对于所有染色，首先将载玻片在蛋白阵列封闭缓冲液(Schleicher&Schuell)中封闭30分钟，用与斑点印迹相同的第一和第二抗体(采用购自Jackson的Cy3偶联的第二抗体)染色，在激光共焦扫描仪中扫描。用QuantArray软件(GSI Lumonics，Inc)对荧光强度进行定量。当在斑点印迹和阵列上采用全RTS反应时，VIG具有高滴度的掩盖任何抗原特异性反应的抗大肠杆菌抗体。这是通过使VIG吸附大肠杆菌裂解物的免疫印迹或通过将大肠杆菌裂解物加入VIG而克服的。在前一种方法中，将大肠杆菌溶解于SDS PAGE样品缓冲液中，在制备凝胶上分辨裂解物，然后转移到Optitran硝酸纤维素膜(Schleicher&Schuell)上。然后将印迹切成小(5x5mm)片，并且在5％的脱脂奶粉中封闭1小时。然后冲洗所述小片，放置到预先用封闭缓冲液稀释到1/1000的VIG中，持续搅拌下温育1小时。从重悬于25ml TBS-Tween中的1升大肠杆菌(DH5)静止期培养物制备大肠杆菌裂解物，用2cm直径的探针超声处理。将1ml等分物在-80℃下储存。缺乏内源性抗大肠杆菌反应性的小鼠血清不需要用大肠杆菌预先处理来减少背景。

也可以在免疫斑点印迹上检测来自不含细胞的反应的非变性蛋白(图12)。体外表达了128个编码112种不同的痘苗病毒蛋白的质粒，将1微升每个未纯化的反应双份点样在硝酸纤维素膜上。将每种基因的可读框设计为包括N-末端10×组氨酸(HIS)标记和C末端血凝素标记(序列YPYDVPDYA)。也建立了缺乏质粒模板的对照反应(′c′)；如果使用空载体，由于产生了小的10×组氨酸阳性片段，观察到了阳性信号(数据未示出)。用抗HIS标记抗体(图12A)、抗HA标记抗体(图12B)、痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)(图12C)或VIG+10％大肠杆菌裂解物(图12C)探测膜。抗HIS和HA标记抗体没有显示与体外反应中其它蛋白的交叉反应，因此常规用于监测大量反应的表达。在表达的112种不同的蛋白中，仅有3种对HIS(图12A)和HA(图12B)标记都是阴性的。为了评估表达的总体效率，表达了390种克隆的土拉热弗朗西丝氏菌基因，将反应点样到硝酸纤维素膜上，用抗组氨酸或抗HA抗体探测。82％的反应是HA阳性的，84％是10×聚组氨酸阳性的，73％是组氨酸和HA阳性的，7％是HA和组氨酸阴性的。

从图12C的印迹可以看出，VIG具有高滴度的抗大肠杆菌抗体，掩盖了与痘苗病毒蛋白的所有反应性。但是，在VIG中加入大肠杆菌裂解物(图12D)，使该背景减少到能够检测到痘苗病毒蛋白的水平。该印迹上的阳性蛋白是A10L，A27L，D8L，D13L，F13L，H3L和H5R，在标题中用红色强调。

用大肠杆菌裂解物处理血清也可以有效减少微阵列上的大肠杆菌背景反应性。用含有和不含大肠杆菌裂解物的VIG探测的23种痘苗病毒和22种土拉热弗朗西丝氏菌蛋白组成的飞行微阵列示于图13。高滴度的抗大肠杆菌抗体的作用(如图12C的斑点印迹所示)，在微阵列上也是明显的(图13，顶部阵列)。对照制备物中也存在的高背景掩盖了对痘苗病毒蛋白的特异性反应性。在探测微阵列前加入10％大肠杆菌裂解物，减少了大肠杆菌背景，显示了特异性反应性(图13，下图)。该阵列显示了5种痘苗病毒蛋白由VIG(加框的)，D13L，D8L，F13L，H3L和H5L强识别。

图14显示了来自估计代表>95％的完整痘苗病毒基因组的194种蛋白组成的阵列的结果。用人痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)，以及来自用痘苗病毒接种前和接种后的小鼠和猕猴的血清筛选该阵列。图14A显示了未接触过抗原的未免疫小鼠完全缺乏对阵列上所有蛋白的反应性，但来自痘苗病毒免疫过的小鼠的血清与阵列上一个亚组的抗原反应。与未接触过抗原的小鼠不同，未免疫的人与阵列上一个亚组的抗原反应，但用痘苗病毒免疫后，与阵列上另一亚组的抗原反应。数据的定量图示于图14B的上图。VIG识别26种不同的蛋白，其中通过来自未接触过痘苗病毒的个体的血清也观察到了13种，因此认为代表抗体对其它环境抗原的非特异性交叉反应。其余的13种是在痘苗病毒免疫过程中产生的抗体特异性识别的抗原。在来自猕猴和小鼠的血清中也观察到了相似图谱(图14B)。尽管存在物种特异性应答(例如，在小鼠中仅仅是A3L或A4L)，但也存在很多由人和任一种动物模型共同识别的蛋白，和由所有三个物种识别的10种蛋白(表1)。这些特定抗原将是用于人类的疫苗的临床前测试的优先候选物。总体上，对病毒结构蛋白的应答是应答的主要部分，所述蛋白的一半以上都是包膜蛋白(表1)。血清阳性蛋白包括具有和不具有跨膜结构域和PI为4-10的蛋白，所述结构域具有和不具有信号肽。此外，以前已经报道了一些所述蛋白在动物和人类中产生体液应答，而其它蛋白则不产生。

表1中的抗原都是来自西方保留(WR)株的抗原，但在此处通过它们与痘苗病毒哥本哈根株的最近的直向同源物的名称而鉴定的，因为蛋白功能在该株中的表征更好。然而，来自WR株的每个ORF和编码的蛋白的序列可以从GenBank数据库获得，该数据库可以从网上查询，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi。表1中的说明与数据库中的说明相匹配。WR株的蛋白和基因序列位于痘苗病毒WR基因组中，用表1的基因名称可以在GenBank中找到。采用通过GenBank可以获得的blast用途，可以容易地鉴定与上述序列和它们的相应基因序列基本相似的蛋白。

表1

通过该血清学筛选鉴定的免疫反应性蛋白

^＊A26L蛋白包括VACWR146和VACWR149。

诱导与VIG的非常强的血清阳性反应的蛋白包括A14L，A27L，H5R，D8R，D13L，D8L，H3L和F13L。这些具有中等免疫反应性的蛋白鉴定为A10L，A11R，LlR，B5R，A17L，I15L，F5L，A34L，A36R，A56R和A13L。也鉴定了另一种产生与VIG的非常强的血清阳性反应的蛋白；其也称作VACWR148，并且在哥本哈根株中没有密切的直向同源物，但是与天花中的称作A29L的蛋白同源。以前没有将该蛋白鉴定为抗原性的，并且在此处称作ATI基因座蛋白。

仅仅是举例，而不是限定本发明包括的蛋白或DNA序列的范围，本发明鉴定的一些免疫活性蛋白最近的直向同源物包括：

VACWR101(VACV-COP H3L)其它直向同源物：

             VACV-MVA:MVA093L

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_090

             VACV-AMVA:AMVA095

             CPXV-GRI:J3L

             VACV-TAN:Tan-TH3L

             VARV-GAR:J3L

             VARV-BSH:I3L

             VARV-IND:I3L

             CMLV-CMS:98L

VACWR118(VACV-COP D13L)其它直向同源物：

             VACV-MVA:MVA110L

             VACV-TAN:an-TD15L

             VACV-AMVA:AMVA112

             CPXV-GRI:E13L

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_107

             VARV-BSH:N3L

             VARV-IND:N3L

             CMLV-CMS：115L

             CMLV-M96:CMLV116

VACWR113(VACV-COP D8L)其它直向同源物：

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_102

             VACV-MVA:MVA105L

             VACV-AMVA:AMVA107

             VACV-TAN:Tan-TD8L

             VARV-IND:F8L

             VARV-BSH:F8L

             VARV-GAR:F8L

             ECTV-NAV:EV-N-114

             ECTV-MOS:EVM097

VACWR052(VACV-COP F13L)其它直向同源物：

             VACV-TAN:an-TF13L

             ECTV-NAV:EV-N-53

             ECTV-MOS:EVM036

             CPXV-GRI:G13L

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_041

             VACV-AMVA:AMVA045

             VACV-MVA:MVA043L

             CPXV-BR:V061

             VARV-GAR:E13L

VACWR103(VACV-COP H5R)其它直向同源物：

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_092

             VACV-TAN:Tan-TH6R

             VACV-AMVA:AMVA097

             VACV-MVA:MVA095R

             CPXV-GRI:J5R

             MPXV-ZRE:H5R

             VARV-BSH:I5R

             CPXV-BR:V114

             VARV-GAR:J5R

VACWR187(VACV-COP B5R)其它直向同源物：

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_167

             VACV-TAN:Tan-TB5R

             VACV-MVA:MVA173R

             VACV-AMVA:AMVA173

             CPXV-GRI:B4R

             MPXV-ZRE:B6R

             ECTV-MOS:EVM155

             ECTV-NAV:EV-N-182

             VARV-GAR:H7R

VACWR149+VACWR146(VACV-COP A26L)其它直向同源物：

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_134

             VACV-MVA:MVA137L

             VACV-AMVA:AMVA139

             CPXV-GRI:A27L

             VACV-TAN:an-TA35L

             MPXV-ZRE:A28L

             CMLV-M96:CMLV145

             CMLV-CMS:143L

             CPXV-BR:V161

VACWR129(VACV-COP A10L)其它直向同源物：

             VACV-MVA:MVA121L

             VACV-AMVA:AMVA123

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_118

             CPXV-GRI:A11L

             VACV-TAN:an-TA11L

             CMLV-M96:CMLV127

             CMLV-CMS:126L

             VARV-GAR:A11L

             VARV-BSH:A11L

VACWR130(VACV-COP A11R)其它直向同源物：

             VACV-AMVA:AMVA124

             VACV-MVA:MVA122R

             CPXV-BR:V143

             CPXV-GRI:A12R

             MPXV-ZRE:A12R

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_119

             VACV-TAN:an-TA12R

             ECTV-NAV:EV-N-131

             ECTV-MOS:EVM114

VACWR181(VACV-COP A56R)其它直向同源物：

             VACV-AMVA:AMVA167

             VACV-MVA:MVA165R

             VACV-TAN:an-TA66R

             CPXV-GRI:A58R

             MPXV-ZRE:B2R

             CMLV-CMS:173R

             VARV-GAR:K9R

             CMLV-M96:CMLV176

             VARV-BSH:J7R

VACWR091(VACV-COP L4R)其它直向同源物：

             VACV-MVA:MVA083R

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_080

             VACV-AMVA:AMVA085

             CPXV-BR:V102

             CPXV-GRI:N4R

             VACV-TAN:Tan-TL4R

             VARV-IND:M4R

             CMLV-M96:CMLV089

             VARV-BSH:M4R

             CMLV-CMS:88R

VACWR156(VACV-COP A33R)其它直向同源物：

             RPXV-UTR:RPXV-UTR_141

             CPXV-GRI:A34R

             VACV-TAN:R(TA43R)

             VACV-MVA:MVA144R

             VACV-AMVA:AMVA146

             CMLV-M96:CMLV152

             CMLV-CMS:150R

             CPXV-BR:V168

             MPXV-ZRE:A35R

用于描述这些直向同源物的缩写：

VACV-Cop＝痘苗病毒哥本哈根株

VACV MVA＝痘苗病毒株改进的病毒ankra

VACV-AMVA＝痘苗病毒Acambis3000MVA株

VACVWR＝痘苗病毒西方保留株

VACV-TAN＝痘苗病毒Tian Tan株

CPXV-GRI＝牛痘GRI-90株

RPV-UTR＝兔痘病毒Utrecht株

VARV-GAR＝轻型天花病毒Garcia株

VARV-BSH＝大天花病毒孟加拉株

VARV-IND＝大天花病毒印度株

CMLV-CMS＝骆驼痘病毒CMS株

CMLV-M96＝骆驼痘病毒M96株

ECTV-NAV＝缺肢病毒Naval株(未发表)

ECTV-MOS＝缺肢病毒莫斯科株

CPXV-BR＝牛痘病毒Brighton Red株

MPXV-ZRE＝猴痘病毒Zaire-96-I-16株

基于上文所述，合适的免疫组合物包含选自在此处鉴定为抗原性的一组痘苗病毒蛋白的至少三种蛋白，该组包括ATI基因座蛋白，A10L，A11R，A13L，A33R，A56R，B5R，D8L，D13L，F13L，H3L，H5R，A26L，A27L，E3L，L4R，H7R，A17L，A3L，A4L，D11L，H6R，K2L，NIL，A41L，A47L，B2R，D10R，E1L，F2L，F9L，G5R，G7L，H7R，I1L，L5R和O2L。本发明的第二种免疫组合物包含选自在至少一种检测的免疫的哺乳动物物种中有活性的蛋白的至少三种蛋白，所述蛋白包括ATI基因座蛋白，A10L，A11R，A13L，A33R，A56R，B5R，D8L，D13L，F13L，H3L，H5R，A26L，A27L，E3L，L4R，H7R，A17L，A3L，A4L，D11L，H6R，K2L和N1L。本发明的第三种免疫组合物包含选自一组在免疫的人中具有活性的蛋白的至少三种蛋白，该组包括A10L，A11R，A13L，A33R，A56R，B5R，D8L，D13L，F13L，H3L，H5R，A26L，A27L，E3L和L4R。

本发明范围内的其它免疫组合物包含至少三种通过本发明的方法发现在免疫的人、小鼠和猕猴(所有三个物种)中具有反应性的蛋白，该组包括A10L，A11R，A13L，A33R，A56R，B5R，D8L，D13L，F13L，H3L和H5R。本发明范围内的另一种免疫组合物包含选自一组由多种免疫的个体最一致地识别的抗原的至少一种蛋白，该组包括ATI基因座蛋白，A10L，A13L，H3L，D13L，A11R和A17R。基于应答的强度和一致性的总体印象、蛋白类型和相似考虑，本发明范围内的另一种优选的免疫组合物包括至少两种，或更优选至少三种以下痘苗病毒蛋白：ATI基因座、A10L，A13L，A26L，A56R，D8L，D13L，F13L，H5R和H3L。

本发明范围内的优选组合物包含选自ATI基因座蛋白，A10L，D13L和H3L的至少两种蛋白。其它优选的免疫组合物包含与其它痘苗病毒抗原组合的选自A10L，D13L，H3L和ATI基因座蛋白的一致地具有免疫活性的蛋白或肽或其基本同源的形式或免疫活性片段之一。因此，例如，特别优选的组合将包括组合了H3L(或其基本同源物或免疫活性片段)和其它免疫原性痘苗病毒蛋白的那些组合。另一种所述组合包含由ATI基因座编码的蛋白或其基本同源物或免疫活性片段和其它免疫原性痘苗病毒蛋白。另一种实施方案包括与至少一种其它抗原性痘苗病毒蛋白组合的选自一组包含A11R，A23L，A56R和H5R的新抗原的至少一种蛋白。

对于前述每一种疫苗组合物，本发明也包括相应的DNA疫苗。因此，对于此处所述的每组蛋白，包含一组相应于指定蛋白的基因的疫苗组合物也包含在本发明的范围中，所述基因与相应痘苗病毒抗原性蛋白基因的相应组合也包含在本发明的范围中。

因此，该方法鉴定了新的免疫反应性抗原，并不是所有这些抗原都能够由常规的预测方法进行鉴定。用阵列获得的数据与我们以前报道的免疫印迹一致，参见Crotty，S.，et al，J.Immunol.(2003)171：4969-4973，在此全文引入作为参考。明显地，在接种的人中，我们发现了在初次免疫后进行多年加强后对一个亚组的优势抗原的强记忆应答，显著地是对H3L，D13L和A10L蛋白的应答。

实施例7

用分离自单个集落/克隆或分离自转化培养物的

混合物的质粒比较蛋白表达

选择了28种来自土拉热弗朗西丝氏菌的大小为300bp-2000bp的靶基因，按照上文所述，通过PCR进行扩增，扩增中采用含有与线性pIX表达载体(赋予T7启动子和N末端聚组氨酸融合体)的相应末端同源的20bp基因特异性序列和30bp衔接序列的引物。

将25ng PCR产物与相同量的线性pIX制备物预先混合。将DNA混合物转化到50μl化学感受态大肠杆菌DH5α细胞中，在冰上放置30分钟，45℃下热激45秒，与500μl SOC培养基混合，然后37℃下温育。1小时后，加入500μl含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基，然后振荡下37℃连续温育大于14-24小时。

对于单个克隆程序，随后将50μl培养物铺板在具有卡那霉素选择(25μg/ml)的LB琼脂板上，在37℃下再次温育12-14小时。然后挑选单个集落，用相同培养基再次培养过夜，然后用Qiagen微量制备试剂盒进行DNA分离。

或者，从上文第一步中的过夜转化混合物直接分离质粒DNA。

将来自步骤2和3的质粒DNA(5μl)加入20μl Roche RTS100不含细胞的转录/翻译混合物，30℃下温育4小时。将0.5μl表达混合物点样在硝酸纤维素膜上，然后用抗聚组氨酸标记单克隆抗体对表达的蛋白进行标准蛋白印迹检测。

表2

来自单个克隆和转化混合物的蛋白表达

(显示两种方法之间差异的结果以红色强调)

单个克隆：28个样品中的18个样品显示了靶基因的表达。10个样品没有产生任何可检测水平的蛋白表达。

转化混合物：28个样品中的23个样品显示了表达。来自单个克隆方案的10个阴性样品中的5个显示了表达，表明来自单个集落的质粒可能含有防止编码的蛋白表达的突变。

实施例8

H3L表位扫描

将痘苗病毒包膜蛋白H3L分成10个由50个氨基酸组成的重叠片段，如图15所示。对于每个片段，设计了长度均为53bp的正向和反向引物，如表3所示。当在BamH1位点线性化时，引物序列包括与pXi(来源)载体的末端互补的33bp的DNA，和与特定片段末端互补的20bp的DNA。

为了PCR扩增每个片段，将痘苗病毒基因组DNA与10μM特异性正向和反向引物、水和Eppendorf HotMaster混合到终体积为50ul。对于30个循环，变性在94℃下进行30秒，然后在50℃下退火30秒，在68℃下延伸30秒。PCR后，在1％琼脂糖上对产物进行电泳，以评估扩增的成功。一个凝胶显示片段1、2和6的足够产物，扫描的凝胶显示足够的3、4、8和10，第三个凝胶显示足够的9。PCR反应都没有成功扩增片段5和7。因此，分别用4和6的正向和反向引物扩增5(而不是扩增这两个150bp的片段)，并且用6和8的正向和反向引物扩增7。这些450bp序列的扩增是成功的。

用Qiagen PCR纯化试剂盒进行PCR扩增和清洁PCR产物后，用重组克隆方法克隆片段。将40ng线性化的pXi载体与10ng清洁的PCR产物进行混合，在该混合物中加入10ul DH5α大肠杆菌感受态细胞。然后将混合物放置在冰上45分钟，42℃下热激1分钟，然后返回冰上再放置1分钟。除去混合物，在每个试管中加入200ul SOC培养基，将混合物在37℃水浴中温育1小时。将转化混合物与3mL LB+卡那霉素混合，在37℃下温育过夜。

用微量制备试剂盒从转化混合物分离质粒DNA。进行凝胶电泳，以确定质粒是否具有插入序列。作为对照，对环形pXi载体进行电泳。结果表明，设计含有片段1，2，3，6，8，9和10的质粒具有插入序列。

                        表3

                      H3L引物

                                       引物序列

片段DNA序列     　　　　     FP(5’-3’)    RP(5’-3’)

    ATGGCGGCGGCGAAAACTCC     CATATCGAC      ATCTTAAGCG

    TGTTATTGTTGTGCCAGTTAT    GACGACGAC      TAATCCGGA

    TGATAGACTTCCATCAGAAAC    AAGCATATG      ACATCGTATG

    ATTTCCTAATGTTCATGAGCA    CTCGAGATG      GGTAGCACA

(1) TATTAATGATCAGAAGTTCGA    GCGGCGGCG      ACATTTCTTT

    TGATGTAAAGGACAACGAAG     AAAACTCC    　 TTTCTG

    TTATGCCAGAAAAAAGAAAT

    GTTGTG

                                    引物序列

片段DNA序列         　　　 FP(5’-3’) RP(5’-3’)

    GATCAGAAGTTCGATGATGT   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

    AAAGGACAACGAAGTTATGC   GACGACGAC   TAATCCGGA

    CAGAAAAAAGAAATGTTGTG   AAGCATATG   ACATCGTATG

(2) GTAGTCAAGGATGATCCAGA   CTCGAGGAT   GGTAGGTGA

    TCATTACAAGGATTATGCGTT  CAGAAGTTC   GTATACTTGT

    TATACAGTGGACTGGAGGAA   GATGATGT    CATCAT

    ACATTAGAAATGATGACAAGT

    ATACTCAC

    GATTATGCGTTTATACAGTGG  CATATCGAC   ATCTTAAGCG

    ACTGGAGGAAACATTAGAAA   GACGACGAC   TAATCCGGA

    TGATGACAAGTATACTCACTT  AAGCATATG   ACATCGTATG

(3) CTTTTCAGGGTTTTGTAACAC  CTCGAGGAT   GGTAGAAAA

    TATGTGTACAGAGGAAACGA   TATGCGTTTA  AAATTAGAAT

    AAAGAAATATCGCTAGACATT  TACAGTG       CCCATA

    TAGCCCTATGGGATTCTAATT

           TTTTT

    ACAGAGGAAACGAAAAGAAA   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

    TATCGCTAGACATTTAGCCCT  GACGACGAC   TAATCCGGA

    ATGGGATTCTAATTTTTTTAC  AAGCATATG   ACATCGTATG

(4) CGAGTTAGAAAATAAAAAGG   CTCGAGACA   GGTAGCAAG

    TAGAATATGTAGTTATTGTAG  GAGGAAACG   ACGGGACGA

    AAAACGATAACGTTATTGAG   AAAAGAAA    AGAAACG

    GATATTACGTTTCTTCGTCCC

    GTCTTG

    GTAGTTATTGTAGAAAACGAT  CATATCGAC   ATCTTAAGCG

    AACGTTATTGAGGATATTACG  GACGACGAC   TAATCCGGA

    TTTCTTCGTCCCGTCTTGAAG  AAGCATATG   ACATCGTATG

(5) GCAATGCATGACAAAAAAAT   CTCGAGGTA   GGTAGTTTGT

    AGATATCCTACAGATGAGAG   GTTATTGTA   CCATTACAAG

    AAATTATTACAGGCAATAAAG  GAAAACGA      CTCGG

    TTAAAACCGAGCTTGTAATGG

    ACAAA

                                    引物序列

片段 DNA序列                 FP(5’-3’) RP(5’-3’)

     CTACAGATGAGAGAAATTATT   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

     ACAGGCAATAAAGTTAAAAC    GACGACGAC   TAATCCGGA

     CGAGCTTGTAATGGACAAAA    AAGCATATG   ACATCGTATG

(6)  ATCATGCCATATTCACATATA   CTCGAGCTA   GGTAGATCT

     CAGGAGGGTATGATGTTAGC    CAGATGAGA   ACGATGTTCA

     TTATCAGCCTATATTATTAGA   GAAATTAT    GCGCCG

     GTTACTACGGCGCTGAACAT

     CGTAGAT

     TATGATGTTAGCTTATCAGCC   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

     TATATTATTAGAGTTACTACG   GACGACGAC   TAATCCGGA

     GCGCTGAACATCGTAGATGA    AAGCATATG   ACATCGTATG

(7)  AATTATAAAGTCTGGAGGTCT   CTCGAGTAT   GGTAGCAGT

     ATCATCGGGATTTTATTTTGA   GATGTTAGC   ATCTGCCTAT

     AATAGCCAGAATTGAAAACG    TTATCAGC      TGATCT

     AAATGAAGATCAATAGGCAG

     ATACTG

     GGATTTTATTTTGAAATAGCC   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

     AGAATTGAAAACGAAATGAA    GACGACGAC   TAATCCGGA

     GATCAATAGGCAGATACTGG    AAGCATATG   ACATCGTATG

(8)  ATAATGCCGCCAAATATGTAG   CTCGAGGGA   GGTAGTATTC

     AACACGATCCCCGACTTGTTG   TTTTATTTTG  TAGACCAAA

     CAGAACACCGTTTCGAAAAC    AAATAGC     AATTCG

     ATGAAACCGAATTTTTGGTCT

     AGAATA

     CCCCGACTTGTTGCAGAACA    CATATCGAC   ATCTTAAGCG

     CCGTTTCGAAAACATGAAACC   GACGACGAC   TAATCCGGA

     GAATTTTTGGTCTAGAATAGG   AAGCATATG   ACATCGTATG

(9)  AACGGCAGCTACTAAACGTT    CTCGAGCCC   GGTAGAACA

     ATCCAGGAGTTATGTACGCG    CGACTTGTT   TTAATATCAA

     TTTACTACTCCACTGATTTCA   GCAGAACA    ACAATC

     TTTTTTGGATTGTTTGATATT

     AATGTT

                                    引物序列

片段 DNA序列                 FP(5’-3’) RP(5’-3’)

     GTTATGTACGCGTTTACTACT   CATATCGAC   ATCTTAAGCG

     CCACTGATTTCATTTTTTGGA   GACGACGAC   TAATCCGGA

     TTGTTTGATATTAATGTTATA   AAGCATATG   ACATCGTATG

(10) GGTTTGATTGTAATTTTGTTT   CTCGAGGTT   GGTAGTTAG

     ATTATGTTTATGCTCATCTTT   ATGTACGCG   ATAAATGCG

     AACGTTAAATCTAAACTGTTA   TTTACTAC    GTAACGA

     TGGTTCCTTACAGGAACATTC

     GTTACCGCATTTATCTAA

实施例9

用固定在珠子上的蛋白检测T细胞激活

采用上文所述的方法，用T7载体(pTX7)克隆考虑的生物(如痘苗病毒)的基本全部蛋白组，并且用无细胞的体外系统表达蛋白。用于将每种蛋白插入载体的衔接子包括聚组氨酸标记，因此表达的蛋白可以捕获在预先用加样缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，10mM咪唑，pH8.0)平衡的1μm的镍包被的珠子上。镍包被的珠子可以是任何大小，但有利的是小于APC细胞，典型是直径大约10-20微米；可以获得1-3微米大小的镍包被的珠子，并且足以用于该目的。然后在洗涤缓冲液(除了含有的咪唑是20mM外，与上文一样)中将蛋白包被的珠子洗涤5次，在组织培养基中洗涤两次，然后重悬于无血清的培养基中到达最初的12.5μl体积。将这些珠子与抗原呈递细胞一起温育，然后与T细胞以96孔测定形式进行混合。

从病原体(如腹膜内给予的2x10⁵pfu痘苗病毒)或在佐剂中腹膜内或尾基底部皮下给予的各个重组蛋白免疫的小鼠获得，或从受感染/免疫的人供体获得应答T细胞。在小鼠的情况下，免疫后7-10天取出脾或引流淋巴结。然后将抗原包被的珠子(通常是每孔1-5μl)加入预先用抗小鼠或人IFN-γ(来自Pharmingen)包被的Multiscreen96孔板(Millipore MAHAS45)中的鼠脾细胞或人外周血单核细胞(PBMC；5x10⁵细胞/孔)，在含有10％胎牛血清(FCS)(鼠测定)或5％人AB血清(人测定)的组织培养基中封闭1小时。例如，可以将抗小鼠或人IFN-γ固定在硝酸纤维素基质上的孔中；在此情况下，用血清处理可以封闭纤维素上的未占据的位点，否则所述位点会结合捕获抗体并且干扰用于检测形成的干扰素或其它细胞因子的ELISPOT测定。当识别的抗原刺激T细胞(脾细胞或PBMC)时，IFN-γ抗体捕获任何产生的IFN-γ。因此，在洗掉未结合的物质后，形成的IFN-γ保持结合于IFN-γ捕获抗体，并且通过加入能够与结合的IFN-γ结合的第二抗体而得到检测。对该第二抗体进行标记，以容易观察。

使用的培养基可以是含有青霉素/链霉素/谷氨酰胺，并且补充了10-50μg/ml多粘菌素B以抑制任何污染性LPS的Iscove改良的Dulbecco培养基。对于鼠T细胞测定，也在培养基中补充2-巯基乙醇，达到5x10^-5M的终浓度。用于人测定的阳性对照抗原可以包括以1/160使用的吸附在明矾(Colorado Serum Co)上的破伤风类毒素，在TB接种的供体中，是纯化的蛋白衍生物(来自Aventis Pasteur的Tubersol)。可以用于证实测定和细胞存活力的促分裂原包括用于小鼠细胞的伴刀豆球蛋白A和用于人细胞的植物血凝素，都是以lμg/ml使用。通过ELISPOT进行IFN-γ检测的抗体是来自Pharmingen的匹配的对。

在18-20小时的共培养后，用生物素化的抗IFN-γ检测抗体(Pharmingen)检测捕获的干扰素，并且用链亲和素-碱性磷酸酶，然后用硝基-BT显影剂进行显现。也在6小时、12小时、24小时和48小时取人和小鼠培养物的上清液，进行多重细胞因子分析(用来自Linco Research Inc的常规的10重试剂盒)，以分析Th1(IFN-γ，TNF-α和IL-12)、Th2(IL-4，IL-6，IL-10和IL-13)和炎性细胞因子(IL-Iβ，IL-2和GM-CSF)，并且可以用Luminex100仪器同时进行分析。一种或多种所述细胞因子的存在证明了检测的蛋白诱导了细胞免疫应答，使得能够鉴定用于诱导免疫的蛋白或肽。

实施例10

用APCs中的蛋白表达检测T细胞激活

将考虑的生物(如痘苗病毒)的几乎全部的蛋白组克隆到CMV(gWIZ)载体中。用质粒送递(通过″Lipofection″，采用特殊脂质试剂，如来自Invitrogen的Lipofectin^TM、Bio-Rad的Cytofectene^TM转染试剂，或Roche Applied Science的FuGENE6^TM转染试剂；参见Feigner，et al，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U S A.Nov.198784(21)，7413-7，在此引入作为参考)将质粒导入抗原呈递细胞(APCs)。1天后，使蛋白表达，然后以96孔形式混合T细胞。从病原体(如腹膜内给予的2x10⁵pfu痘苗病毒)或在佐剂中腹膜内或尾基底部皮下给予的各个重组蛋白免疫的小鼠获得，或从受感染/免疫的人供体获得应答T细胞。在小鼠的情况下，免疫后7-10天取出脾或引流淋巴结。然后将转染的抗原呈递细胞加入预先用抗小鼠或人IFN-γ(来自Pharmingen)包被的Multiscreen96孔板(Millipore MAHAS45)中的鼠脾细胞或人外周血单核细胞(PBMC；5x10⁵细胞/孔)，在含有10％胎牛血清(FCS)(鼠测定)或5％人AB血清(人测定)的组织培养基中封闭1小时。

使用的培养基可以是含有青霉素/链霉素/谷氨酰胺，并且补充了10-50μg/ml多粘菌素B以抑制任何污染性LPS的Iscove改良的Dulbecco培养基。对于鼠T细胞测定，也在培养基中补充2-巯基乙醇，达到5x10^-5M的终浓度。用于人测定的阳性对照抗原可以包括以1/160使用的吸附在明矾(Colorado Serum Co)上的破伤风类毒素，在TB接种的供体中，是纯化的蛋白衍生物(来自Aventis Pasteur的Tubersol)。可以用于证实测定和细胞存活力的促分裂原包括用于小鼠细胞的伴刀豆球蛋白A和用于人细胞的植物血凝素，都是以lμg/ml使用。通过ELISPOT进行IFN-γ检测的抗体是来自Pharmingen的匹配的对。

在18-20小时的共培养后，用生物素化的抗IFN-γ检测抗体(Pharmingen)检测捕获的干扰素，并且用链亲和素-碱性磷酸酶，然后用硝基-BT显影剂进行显现。也在6小时、12小时、24小时和48小时取人和小鼠培养物的上清液，进行多重细胞因子分析(用来自Linco Research Inc的常规的10重试剂盒)，以分析Th1(IFN-γ，TNF-α和IL-12)、Th2(IL-4，IL-6，IL-10和IL-13)和炎性细胞因子(IL-Iβ，IL-2和GM-CSF)，并且可以用Luminex100仪器同时进行分析。一种或多种所述细胞因子的存在证明了检测的蛋白诱导了细胞免疫应答，使得能够鉴定用于诱导免疫的蛋白或肽。

实施例11

用疟原虫(恶性疟原虫)验证抗原鉴定方法

选择一组218种恶性疟原虫(Pf)基因用于克隆、表达和蛋白微阵列芯片印刷。基于亚细胞定位(如分泌的蛋白和存在于细胞培养物上清液中的其它蛋白)、在恶性疟原虫的人和动物模型中的已知免疫原性和基因表达与疟原虫生长状态的模式选择基因。每一种都适合九类之一：i)仅仅通过生物信息学标准鉴定(n＝25)；ii)通过约氏疟原虫肝内分期的激光捕获显微解剖鉴定，和通过MudPIT在子孢子蛋白组中鉴定(n＝16)；iii)通过Py肝内分期的激光捕获显微解剖鉴定的蛋白的Pf直向同源物，但不存在于子孢子蛋白组中(肝内分期特异性的；n＝52)；iv)通过MudPIT鉴定在子孢子蛋白组中高度表达(n＝10)；v)通过MudPIT在子孢子蛋白组中鉴定，并且测定由来自经过辐射的子孢子(irr-spz)免疫的志愿者的PBMCs产生的免疫识别(n＝27)；vi)临床开发中公知和充分表征的Pf抗原(n＝21)；vii)通过Affymetrix基因芯片对子孢子进行基因转录谱分析证明在子孢子期中高度表达(n＝53)；viii)通过MudPIT在滋养体和裂殖体期蛋白组中鉴定(n＝11)；和ix)表明在体内具有保护性的约氏疟原虫的恶性疟原虫直向同源物(n＝2)。包括的一种额外的感兴趣的基因PFB0645c不适合任意所述分类。

用恶性疟原虫基因组DNA模板进行PCR扩增。由于很多恶性疟原虫基因含有内含子，设计了跨每个外显子的引物。以片段形式扩增超过3000碱基对的大基因(和外显子)，每个片段重叠150个核苷酸(即50个氨基酸)。通过UC Irvine的基因组和生物信息学院的ArIo Randall进行覆盖整个恶性疟原虫基因组的引物设计，通过网页界面可以读取引物数据库。该数据库含有14，446种实体。因此，为了扩增每个独立的外显子和扩增以小于3000bp的片段存在的大基因，需要14，446个引物对。但是，大约40％的ORFs编码少于50个氨基酸的短肽，因此扩增每个大于150个核苷酸的ORF需要大约8000个引物对。将此在线数据库用作以下研究的引物序列来源。

用前面描述的表达系统扩增、克隆和表达来源于218个基因靶组的总共266个ORFs。采用了需要3天完成的方法，从恶性疟原虫基因组DNA PCR扩增了266个ORFs，将片段克隆到T7表达载体中，在无细胞的体外转录/翻译系统中表达，将表达的蛋白点样到微阵列芯片上。用来自经过辐射的子孢子免疫的人类志愿者的血清处理的大肠杆菌裂解物探测芯片，用Cy3标记的抗人抗体使载玻片显色，用激光共焦微阵列芯片读数器读数。疟原虫免疫个体与一亚组的恶性疟原虫蛋白反应，而未接触过抗原的个体不反应。将蛋白印刷到微阵列芯片上，用来自11个供体的血清探测芯片，所述供体天然暴露于肯尼亚高发病率区的疟疾，或曾经用辐射过的子孢子免疫。未接触过抗原的供体缺乏对芯片上印刷的一组完整的表达蛋白的反应性(图6)，但来自免疫的个体的血清与芯片上的一亚组蛋白反应。这些结果的概述示于表4。表4中的“基因座”代码代表相应于GenBank数据库中使用的“基因座标签”代码，该数据库可以在线获得，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi。因此，可以容易地用这些代码获得表中每种蛋白的DNA序列和肽序列。

从该分析鉴定了9种强反应蛋白。9种高度反应性蛋白中的7种是公知的、充分表征的Pf血液期抗原，其中很多正在进行临床开发和评估(LSA3，MSP4，EBA175，RESA)。有趣的是，PF10_0356，即肝内期抗原1是肝内期特异性抗原；它不在生物的子孢子或血液期表达，仅仅在肝内期表达。因此，11份血清中的6份血清识别该抗原的事实，证明了蛋白组阵列具有不仅仅鉴定血液期抗原的能力。同样，PFD0310w是SHEBA/Pfsl6，即一种作为疫苗抗原候选物而正在进行临床开发的有性期抗原。具有最强反应性的抗原之一，即PFE1590w，以前没有被认识到是可能的疫苗抗原候选物。

表4.疟原虫免疫的受试者中的血清反应性

 

反应者的数目	基因座	蛋白名称
			11	PFB0300c	裂殖子表面蛋白2前体(MSP2)
11	PFB0915w*	肝内期抗原3(LSA3)
			10	PFB0310c*	裂殖子表面蛋白4(MSP4)
9	PFE1590w	早期转录的膜蛋白
			8	PFD0310w	有性期特异性蛋白前体(SHEBA/Pfs16)
6	PF07_0128	红细胞结合抗原(EBA175)75)
			6	PF10_0343*	S-抗原
6	PF10_0356	肝内期抗原，推测的(LSA1)
			6	PF11_0509*	环感染的红细胞表面抗原(RESA)

^＊这些基因包括内含子，并且表达为两个独立的蛋白，它们重叠了20个氨基酸。这两种蛋白中的至少一种是抗原性的。

仅仅是为了举例，而不是限制本发明包括的蛋白或DNA序列的范围，表4中没有包含的、通过本发明的方法鉴定的一些免疫活性蛋白的一些最近的直向同源物包括：

PFB0310c：

      约氏疟原虫：PY05967(MSP4/5相关的)

      约氏疟原虫：PY07543(MSP4/5)

PFE1590w：

      约氏疟原虫：PY02667(整合膜蛋白)

PFB07_0128：

      恶性疟原虫：Chr.13，MAL13P1.60(红细胞结合抗原140)

      恶性疟原虫：Chr.1，PFA0125c(Eb1-1样蛋白，推测的)

      恶性疟原虫：Chr.1，PFA0065w(假定蛋白)

      恶性疟原虫：Chr.4，PFD1155w(红细胞结合抗原，推测的)

      约氏疟原虫：PY04764(duffy受体，β型前体)

PF10_0343：

      约氏疟原虫：PY04926(假定蛋白)

PF11_0509：

             基因        物种                  说明

             MAL6P1.19   恶性疟原虫            假定蛋白

             MAL7P1.174  恶性疟原虫            假定蛋白

             MAL7P1.7    恶性疟原虫            RESA-样蛋白

             MAL8P12     恶性疟原虫            具有DNAJ结构域的假定蛋白

             PF10_0378   恶性疟原虫            假定蛋白

             PF11_0037   恶性疟原虫            假定蛋白

             PF11_0509   恶性疟原虫            环感染的红细胞表面抗原，推测的

                                               环感染的红细胞表面抗原2，RESA-2

             PF11_0512   恶性疟原虫

                                               疟原虫(恶性疟原虫)相关的

             PF11_0513   恶性疟原虫             假定蛋白

             PF14_0018   恶性疟原虫             假定蛋白

             PF14_0732   恶性疟原虫             假定蛋白

             PF14_0746   恶性疟原虫             假定蛋白

             PFA0110w    恶性疟原虫             环感染的红细胞表面抗原前体

             PFB0080c    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFB0085c    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFB0920w    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFD0095c    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFD1170c    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFD1180w    恶性疟原虫             恶性疟原虫滋养体抗原样蛋白

             PFE1600w    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFE1605w    恶性疟原虫             具有DNAJ结构域的蛋白

             PFI0130c    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFI1785w    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFI1790w    恶性疟原虫             假定蛋白

             PFL0055c    恶性疟原虫             具有DNAJ结构域的蛋白(resa样)，推测的

             PFL2535w    恶性疟原虫              RESA样蛋白，推测的

             PFL2540w    恶性疟原虫             假定蛋白

PF13_0197：

       恶性疟原虫：CHR13/MAL13P1.173/MSP7-样蛋白

       恶性疟原虫：CHR13/MAL13P1.174/MSP7-样蛋白

       恶性疟原虫：CHR13/PF13_0193/MSP7-样蛋白

       恶性疟原虫：CHR13/PF13_0196/MSP7-样蛋白

       恶性疟原虫：CHR13/PF13_0197/裂殖子表面蛋白7前体，

MSP7

       约氏疟原虫：PY02147/南方根结线虫COL-1相关的

PF14_0486：

      约氏疟原虫：PY05356(延伸因子2)

PF08_0054：

      约氏疟原虫：PY06158(热激蛋白70)

PF11_0344：

     约氏疟原虫：PY01581(顶端膜抗原-1)

在这些方法各自的应用中，用此处描述的方法表达和了300种来自恶性疟原虫的基因，并且在阵列上展示。用来自12个受试者的血清探测阵列，所述受试者在早期接触过疟疾，并且因此对此产生了免疫。对于以下每一种基因产物，我们观察到12个血清样品中至少6个具有阳性反应：

表4b.疟原虫免疫的受试者中的血清反应性

 

基因(用于GenBank中的基因座标签)	来自GenBank的说明	阳性反应者(12个血清中的反应者数目)
			PFB0915w	LSA-3-e2s1	12
PFB0310c	MSP-4-e1	12
			PFB0300c	MSP-2	12
PFB0305c	MSP·5-e1	12
			PFL2410w	假定蛋白-e1	12
PFC0210c	环子孢子(CS)蛋白	12
			PFD0310w	有性期特异性蛋白前体a	11
PFD0310w	有性期特异性蛋白前体b	11
			PF13_0197	MSP7前体	11
PF10_0138	假定蛋白-s1	11
			PF1520w	假定蛋白b	11
PFI1520w	假定蛋白a	11
			PF11_0344	顶端膜抗原1前体	11
PF13_0012	假定蛋白	10
			PFD0310w	有性期特异性蛋白前体	10
PF11_0358	定向于DNA的RNAP，B亚基-e1	10
			PF07_0029	HSP86-e1	10
PFL1605w	假定蛋白-s2	10
			PFE1590w	早期跨膜蛋白	10
MAL6P1.201	亮氨酰-trna合成酶，细胞质-s2	10
			PFD0235c	假定蛋白-e1	9
PF13_0201	子孢子表面蛋白2	9
			PF13_0267	假定蛋白a	9
PF07_0128	红细胞结合抗原-els2	9
			PF10_0343	S-抗原a	9
PF10_0343	S-抗原	9
			PFI1520w	假定蛋白	8
PFI0580c	假定的富含Asn的蛋白w/N末端信号肽-e2	8
			PF07_0020	假定蛋白-els2	8

 

PFE0520c	拓扑异构酶I	8
			MAL7P1.29	假定蛋白-els2	8
PF10_0260	假定蛋白-e2s2	8
			PF11_0358	定向于DNA的RNAP，B亚基-e2s2	7
MAL8P1.139	假定蛋白-e3	7
			PF13_0228	PF01092Rib蛋白S6e	7
PF10_0132	磷脂酶C样-els2	7
			PFB0855c	假定蛋白-e2	7
PF10_0125	假定蛋白	7
			PF13_0350	SRP54型蛋白，GTP酶结构域	7
PFD0665c-e2		7
			MAL7P1.32	假定蛋白	7
PF07_0016	假定蛋白-s1	7
			PF10_0098a		6
PF08_0056	锌指蛋白-e2	6
			PFB0640c-e1s1		6
PF14_0230	Rib蛋白家族L5-e2	6
			PF14_0315	假定蛋白-e2s1	6
PF08_0088	假定蛋白	6
			PFL0685w	假定蛋白-e2	6
MAL7P1.23	假定蛋白-els2	6
			PFE0060w	假定蛋白-e2	6
MAL8P1.23	遍在蛋白连接酶1-s8	6
			PF07_0029	HSP86-e2	6
PF10_0356	LSA-e2s2	6

实施例12

疟疾疫苗和诊断测试

从实施例11获得的数据组中，选择蛋白或编码蛋白的核酸的鸡尾酒，用于疫苗组分。基于这些结果的疟疾疫苗鸡尾酒包含至少三种以下基因或相应肽，或四种或更多，或五种或更多，或包含所有以下这些：PFB0300c，PFE1590w，PFB0915w，PFB0310c，PFB0310w，PF11_0509和PF10_0343。用此处公开的赋形剂、组合物和方法给予该疫苗，以便对具有感染疟疾的危险的人类受试者进行免疫，前提是该受试者的免疫系统没有受到破坏。

或者，疫苗包含至少三种相应于表4中鉴定的基因的核酸或三种蛋白，作为表达抗原性蛋白的基因或蛋白。在一种优选实施方案中，疫苗包含这些蛋白或核酸中的三种以上或四种以上，或至少六种。典型地，疫苗包含至少三种相应于特定基因的核酸或蛋白，所述特定基因产物在至少6份测试的血清或至少8份测试的血清；或至少9份测试的血清；或至少10份测试的血清；或或至少11份测试的血清中产生阳性反应。在一些实施方案中，疫苗包含至少一种相应于在10份或更多份测试的血清中诱导阳性反应的基因之一的成分。在其它实施方案中，疫苗包含至少两种或至少三种相应于在测试的12份血清中的10份或更多份血清中诱导阳性反应的基因的蛋白或核酸成分。在另一种实施方案中，将免疫优势抗原用于血清学诊断测试，如ELISA，以便明确诊断个体是否曾经暴露于恶性疟原虫，或受到其感染。

实施例13

在土拉热弗朗西丝氏菌中鉴定的抗原性蛋白

在采用来自土拉热弗朗西丝氏菌的实施例1D的蛋白进行上文所述方法后，鉴定了一些与来自暴露于弗朗西丝氏菌的非感染性菌株的小鼠，或来自于暴露于具有毒力的Schu S4菌株的小鼠的血清具有反应性的抗原性蛋白。这些蛋白的数据参见下文表5和6。蛋白的序列可以从GenBank数据库获得，该数据库可以在线获得，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi。表中的基因代码相应于鉴定的基因和蛋白的基因座标签。

表5.用来自暴露于非感染性菌株的小鼠的血清检测的抗原

表6.用来自Schu S4侵袭的小鼠的血清检测的抗原性蛋白

上表显示了用有毒力的生物侵袭的小鼠比仅仅用非感染性菌株侵袭的小鼠产生了更多的抗体，某些抗体的产生是非常一致的，而不论用哪个菌株免疫小鼠。

仅仅是为了举例，而不是限制本发明包括的蛋白或DNA序列的范围，通过本发明的方法鉴定的一些免疫活性蛋白的一些最近的变体和直向同源物包括：

FTT1269(DnaK)：

铜绿假单胞菌PAO1

恶臭假单胞菌KT2440

嗜肺军团菌

伯氏考克斯氏体RSA493株

嗜肺军团菌Lens株

嗜肺军团菌Paris株

伯氏考克斯氏体dnaK

嗜肺军团菌grpE，dnaK，dnaJ

肠沙门氏菌

肠沙门氏菌血清变型伤寒(伤寒沙门氏菌)CT18株

FTT1696(Hsp60)：

不动杆菌种ADP1

嗜线虫致病杆菌GroEL样蛋白基因

霍乱弧菌O1eltor生物变型N16961株染色体I

铜绿假单胞菌PAO1

GroES蛋白同源物的肺炎克雷伯氏菌基因，GroEL蛋白同源物

GroES蛋白同源物的成团肠杆菌基因，GroEL蛋白同源物

GroES蛋白同源物的阿氏肠杆菌基因，GroEL蛋白同源物

铜绿假单胞菌GroEL(mopA)基因

GroES蛋白同源物的产气肠杆菌基因，GroEL蛋白同源物

GroES的Pseudoalteromonas种PS1M3基因，GroEL

FTT0901(17kd蛋白)

Dermacentor albipictus克隆T1G的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor variabilis克隆01-109的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor occidentalis克隆02-241的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor hunteri克隆01-113的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor andersoni克隆01-151-1的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor andersoni克隆01-171的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor nitens克隆DnT2-1的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor hunteri克隆02-249的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor hunteri克隆01-112的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

Dermacentor andersoni克隆02-31的弗朗西丝氏菌内共生体17kDa脂蛋白基因

FTT1477c：

恶臭假单胞菌KT2440

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000株

铜绿假单胞菌PAO1

地毯草黄单胞菌citri致病变种306株

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913株

Photobacterium profundum SS9

荚膜甲基球菌Bath株

嗜肺军团菌Paris株

嗜肺军团菌Lens株

大豆慢生根瘤菌USDA110DNA

FTT0472(生物素羧基载体)：

铜绿假单胞菌PAO1

铜绿假单胞菌生物素羧基载体蛋白和生物素羧化酶(accB和accC)基因

嗜肺军团菌嗜肺亚种Philadelphia1株

嗜肺军团菌Paris株

多杀巴斯德氏菌多杀亚种Pm70株

嗜肺军团菌Lens株

荚膜甲基球菌Bath株

弗氏志贺氏菌2a株

鼠伤寒沙门氏菌LT2

弗氏志贺氏菌2a2457T株

实施例14

来自结核分枝杆菌的抗原性蛋白

按照上文描述的方法，用来自结核分枝杆菌H37Rv的实施例1C的蛋白鉴定了以下蛋白(选定的公知变体和直向同源物也作为非限制性实例显示)：

Rv3333c(假定的富含脯氨酸的蛋白)

变体/直向同源物：Mb2765c(牛分枝杆菌)

                 ML0981(麻风分枝杆菌)

Rv0440(60kDa伴侣蛋白)

变体/直向同源物：Mb0448(牛分枝杆菌)

                 ML0317(麻风分枝杆菌)

Rv1860(富含丙氨酸和脯氨酸的分泌的蛋白APA)

变体/直向同源物：Mb1891(牛分枝杆菌)

Rv3763(19kDa脂蛋白抗原前体LPQH)

变体/直向同源物：Mb3789(牛分枝杆菌)

                 MLl966(麻风分枝杆菌)

Rv3874(10kDa培养物滤液抗原ESXB)

变体/直向同源物：Mb2765c(牛分枝杆菌)

Rv3875(6kDa早期分泌抗原性靶ESXA)

变体/直向同源物：Mb3905(牛分枝杆菌)

实施例15

来自结核分枝杆菌的抗原性蛋白

采用上文所述方法和来自实施例1C获得的基因的蛋白，用来自兔、小鼠和猴的血清测试来自结核分枝杆菌H37Rv的312种表达的基因的蛋白。下表列出了用来自每一物种的血清检测的抗原：通过公共可获得的GenBank数据库中采用的相应基因的基因座标签，鉴定每种蛋白。未感染的动物的血清与列出的所有抗原反应；用粗体列出并且强调了仅仅用来自感染TB的动物的血清检测的抗原。

表7

实施例16

结核疫苗和诊断测试

从实施例15获得的数据组中，选择蛋白或编码蛋白的核酸的鸡尾酒，用于疫苗组分。基于这些结果的结核诊断测试或疫苗鸡尾酒包含至少三种以下基因或相应肽，并且可以包括四种或更多，或五种或更多，或包含以下这些的大部分或全部：Rv0440，Rv0467，Rv0475，Rv0538，Rv0674，Rv0685，Rv0798c，Rv0916c，Rv0934，Rv1801，Rv1860，Rv1926c，Rv1980c，Rv1984c，Rv2007c，Rv2031c，Rv2190c，Rv2220，Rv2376c，Rv2389c，Rv2446c，Rv2744c，Rv2873，Rv2875，Rv2875，Rv3270，Rv3330，Rv3333c，Rv3418c，Rv3763，Rv3803c，Rv3828c，Rv3846，Rv3874，Rv3875，Rv3881c和Rv3914。特别合适的抗原包括与来自多个物种的受感染动物的血清特异性反应的那些抗原，包括Rv0440，Rv1801，Rv2031c，Rv2376c，Rv2875和Rv3875。特别感兴趣的是被来自受感染的猴的血清特异性识别的抗原，包括Rv0440，Rv0475，Rv1801，Rv1980c，Rv2220，Rv2873，Rv2875，Rv3270，Rv3763和Rv3875。因此，疫苗或诊断测试可以包含选自这些组抗原的两种或多种，或三种或更多，或三种以上的蛋白或核酸。

用此处公开的赋形剂、组合物和方法给予该疫苗，以便对具有感染结核的危险的人类受试者进行免疫，前提是该受试者的免疫系统没有受到破坏。

表8

 

基因座名称	VACV·COP直向同源物	大小	链	起始	结束
						VACWR129	A10L	891	-	121844	119169
VACWR130	A11R	318	+	121859	122815
						VACWR131	A12L	192	-	123395	122817
VACWR132	A13L	70	-	123631	123419
						VACWR133	A14L	90	-	124011	123739
VACWR135	A15L	94	-	124463	124179
						VACWR138	A16L	377	-	125580	124447
VACWR137	A17L	203	-	126194	125583
						VACWR138	A18R	493	+	126209	127690
VACWR139	A19L	77	-	127904	127671
						VACWR119	A1L	150	-	110357	109905
VACWR141	A20R	426	+	128257	129537
						VACWR140	A21L	117	-	128258	127905
VACWR142	A22R	187	+	129467	130030
						VACWR143	A23R	382	+	130050	131198
VACWR144	A24R	1164	+	131195	134689
						VACWR145	A25L	65	-	134891	134694
VACWR146	A26L-a	154	-	135324	134860
						VACWR148	ATI基因座蛋白			136239	138416
VACWR149	A26L-b	500	-	139963	138461
						VACWR150	A27L	110	-	140345	140013
VACWR151	A28L	146	-	140786	140346
						VACWR152	A29L	305	-	141704	140787
VACWR120	A2L	224	-	111052	110378
						VACWR153	A30L	77	-	141900	141667
VACWR154	A31R	124	+	142060	142434
						VACWR155	A32L	270	-	143213	142401
VACWR156	A33R	185	+	143331	143888
						VACWR157	A34R	168	+	143912	144418
VACWR158	A35R	176	+	144462	144992
						VACWR159	A36R	221	+	145059	145724
VACWR160	A37R	263	+	145788	146579
						VACWR162	A38L	277	-	147687	146854
VACWR164	A39R	142	+	148474	148902
						VACWR122	A3L	644	-	113228	111294
VACWR165	A40R	159	+	148928	149407
						VACWR166	A41L	219	-	150164	149505
VACWR167	A42R	133	+	150328	150729

 

基因座名称	VACV·COP直向同源物	大小	链	起始	结束
						VACWR168	A43R	194	+	150767	151351
VACWR170	A44L	346	-	152733	151693
						VACWR171	A45R	125	+	152780	153157
VACWR172	A46R	240	+	153147	153869
						VACWR173	A47L	252	-	154675	153917
VACWR174	A48R	227	+	154706	155389
						VACWR175	A49R	162	+	155437	155925
VACWR123	A4L	281	-	114126	113281
						VACWR176	A50R	552	+	155958	157616
VACWR177	A51R	334	+	157669	158673
						VACWR178	A52R	190	+	158743	159315
VACWR179	A53R	103	+	159621	159932
						VAGWR180	A55R	564	+	160439	162133
VACWR181	A56R	314	+	162183	163127
						VACWR182	A57R	151	+	163272	163727
VACWR124	A5R	164	+	114164	114658
						VACWR125	A6L	372	-	115773	114655
VACWR126	A7L	710	-	117929	115797
						VACWR127	A8R	288	+	117983	118849
VACWR128	A9L	108	-	119168	118842
						VACWR192	B10R	166	+	171672	172172
VACWR193	B11R	72	+	172244	172462
						VACWR194	B12R	283	+	172529	173380
VACWR195	B14R	345	+	173473	174510
						VACWR196	B15R	149	+	174585	175034
VACWR197	B16R	326	+	175118	176098
						VACWR198	B17L	340	-	177166	176144
VACWR199	B18R	574	+	177306	179030
						VACWR203	B18R	309	+	180898	181827
VACWR200	B19R	351	+	179102	180157
						VACWR183	B1R	300	+	163878	164780
VACWR202	B20R	53	+	180482	180643
						VACWR184	B2R	219	+	164870	165529
VACWR185	B3R	167	+	165565	166068
						VACWR186	B4R	558	+	166594	168270
VACWR187	B5R	317	+	168374	169327
						VACWR188	B6R	173	+	169409	169930
VACWR189	B7R	182	+	169968	170516
						VACWR190	B8R	272	+	170571	171389

 

基因座名称	VACV·COP直向同源物	大小	链	起始	结束
						VACWR191	B9R	77	+	171476	171709
VACWR209	C10L	331	+	185807	186802
						VACWR210	C11R	140	-	187379	186957
VACWR205	C12L	353	+	182511	183572
						VACWR206	C14L	190	+	183734	184306
VACWR017	C17L	71	-	12682	12467
						VACWR008	C19L	112	-	7060	6722
VACWR027	C1L	229	-	21832	21143
						VACWR212	C20L	109	+	188295	188624
VACWR006	C21L	64	-	6155	5961
						VACWR004	C22L	122	-	5460	5092
VACWR001	C23L	244	-	4375	3641
						VACWR026	C2L	512	-	21073	19535
VACWR025	C3L	263	-	19468	18677
						VACWR024	C4L	316	-	18610	17660
VACWR023	C5L	204	-	17597	16983
						VACWR022	C6L	151	-	16856	16401
VACWR021	C7L	150	-	16168	15716
						VACWR020	C8L	177	-	15644	15111
VACWR019	C9L	634	-	15068	13164
						VACWR115	D10R	248	+	104655	105401
VACWR116	D11L	631	-	107297	105402
						VACWR117	D12L	287	-	108195	107332
VACWR118	D13L	551	-	109881	108226
						VACWR106	D1R	844	+	93948	96482
VACWR107	D2L	146	-	96881	96441
						VACWR108	D3R	237	+	96874	97587
VACWR109	D4R	218	+	97587	98243
						VACWR110	D5R	785	+	98275	100632
VACWR111	D6R	637	+	100673	102586
						VACWR112	D7R	161	+	102613	103098
VACWR113	D8L	304	-	103975	103061
						VACWR114	D9R	213	+	104017	104658
VACWR066	E10R	95	+	56688	56975
						VACWR067	E11L	129	-	57359	56970
VACWR057	E1L	479	-	45443	44004
						VACWR058	E2L	737	-	47653	45440
VACWR059	E3L	190	-	48352	47780
						VACWR060	E4L	259	-	49187	48408

 

基因座名称	VACV·COP直向同源物	大小	链	起始	结束
						VACWR061	E5R	341	+	49236	50261
VACWR062	E6R	567	+	50398	52101
						VACWR063	E7R	166	+	52183	52683
VACWR064	E8R	273	+	52808	53629
						VACWR065	E9L	1006	-	56656	53636
VACWR049	F10L	439	-	37778	36459
						VACWR050	F11L	348	-	38847	37801
VACWR051	F12L	635	-	40797	38890
						VACWR052	F13L	372	-	41949	40831
VACWR053	F14L	73	-	42188	41967
						VACWR054	F15L	147	-	42903	42460
VACWR055	F16L	231	-	43639	42944
						VACWR056	F17R	101	+	43702	44007
VACWR040	F1L	226	-	31026	30346
						VACWR041	F2L	147	-	31481	31038
VACWR042	F3L	480	-	32947	31505
						VACWR043	F4L	319	-	33917	32958
VACWR044	F5L	322	-	34917	33949
						VACWR045	F6L	74	-	35171	34947
VACWR046	F7L	80	-	35429	35187
						VACWR047	F8L	65	-	35774	35577
VACWR048	F9L	212	-	36472	35834
						VACWR078	G1L	591	-	70752	68977
VACWR080	G2R	220	+	71078	71740
						VACWR079	G3L	111	-	71084	70749
VACWR081	G4L	124	-	72084	71710
						VACWR082	G5R	434	+	72087	73391
VACWR084	G6R	165	+	73592	74089
						VACWR085	G7L	371	-	75169	74054
VACWR086	G8R	260	+	75200	75982
						VACWR087	G9R	340	+	76002	77024
VACWR099	H1L	171	-	87737	87222
						VACWR100	H2R	189	+	87751	88320
VACWR101	H3L	324	-	89297	88323
						VACWR102	H4L	795	-	91685	89298
VACWR103	H5R	203	+	91871	92482
						VACWR104	H6R	314	+	92483	93427
VACWR105	H7R	146	+	93464	93904
						VACWR070	I1L	312	-	60804	59866

 

基因座名称	VACV·COP直向同源物	大小	链	起始	结束
						VACWR071	12L	73	-	61032	60811
VACWR072	13L	269	-	61842	61033
						VACWR073	14L	771	-	64240	61925
VACWR074	15L	79	-	64506	64267
						VACWR075	16L	382	-	65673	64525
VACWR076	17L	423	-	66937	65666
						VACWR077	18R	676	+	66943	68973
VACWR093	J1R	153	+	80247	80708
						VACWR094	J2R	177	+	80724	81257
VACWR095	J3R	333	+	81323	82324
						VACWR096	J4R	185	+	82239	82796
VACWR097	J5L	133	-	83258	82857
						VACWR098	J6R	1286	+	83365	87225
VACWR032	K1L	284	-	25925	25071
						VACWR033	K2L	369	-	27258	26147
VACWR034	K3L	88	-	27572	27306
						VACWR035	K4L	424	-	28898	27624
VACWR037	K5L	134	-	29479	29075
						VACWR038	K6L	81	-	29693	29448
VACWR039	K7R	149	+	29832	30281
						VACWR088	L1R	250	+	77025	77777
VACWR089	L2R	87	+	77809	78072
						VACWR090	L3L	350	-	79114	78062
VACWR091	L4R	251	+	79139	79894
						VACWR092	L5R	128	+	79904	80290
VACWR030	M1L	472	-	24296	22878
						VACWR031	M2L	220	-	24936	24274
VACWR028	N1L	117	-	22172	21819
						VACWR029	N2L	175	-	22836	22309
VACWR068	O1L	666	-	59346	57346
						VACWR069	O2L	108	-	59720	59394

以下实施例仅仅是用于说明本发明的某些实施方案，因此不应解释为限制性的。本领域技术人员应该能够理解各种变化形式，因此，这些变化形式也包括在本发明的范围内。本领域技术人员可以意识到，此处描述的本发明的很多方面和实施方案可以组合，并且本发明特意包括了此处描述的多个方面和实施方案的所述组合。

Claims (20)

1.获得需要的核苷酸序列的表达系统从而制备肽或蛋白阵列的方法，该方法包括

从转化的细胞的混合物提取所述表达系统；

所述混合物是在不分离单个克隆的条件下通过从培养物收获所述细胞而获得的；所述培养物是通过用所述核苷酸序列的表达系统或所述表达系统的成分转化宿主细胞而获得的；并且

表达所述核苷酸序列，以便在来源于细胞的系统中获得编码的蛋白或肽，其中所述表达是多种核苷酸序列的表达，以获得多种蛋白或肽，并且将所述多种蛋白或肽施加在测试表面上，以得到蛋白/肽阵列。

2.权利要求1的方法，其中所述表达系统包含在质粒上。

3.权利要求2的方法，其中所述质粒是通过包含所述核苷酸序列的核酸和线性化的质粒在所述细胞中的同源重组而获得的。

4.权利要求3的方法，其中包含了至少一个衔接子，所述衔接子是与所述线性化的质粒的至少一个末端互补，并且与所述核苷酸序列的至少一个末端互补的多核苷酸，从而控制所述核苷酸序列与所述线性化的质粒连接的方向性。

5.权利要求4的方法，其中使用两个衔接子，所述衔接子是与所述线性化的质粒的第一末端和所述核苷酸序列的第一末端互补的第一衔接子，和与所述线性化的质粒的第二末端和所述核苷酸序列的第二末端互补的第二衔接子。

6.权利要求1的方法，其中核苷酸序列与启动子、终止子序列或编码融合标记或信号肽的序列可操作性连接。

7.权利要求6的方法，其中所述融合标记是聚组氨酸标记、血凝素标记、生物素-连接酶识别位点、GST标记、荧光蛋白标记、FLAG标记或接头序列。

8.制备含有需要的核苷酸序列的表达系统的质粒从而制备肽或蛋白阵列的方法，该方法包括用包含所述核苷酸序列的核酸和线性化的质粒转化宿主细胞，其中所述核酸和线性化的质粒的量是每一百万个细胞1-10ng核酸，并且其中所述核酸和线性化的质粒通过PCR扩增，以获得实现所述核酸与所述线性化的质粒的重组的转化的细胞，使得所述质粒含有所述表达系统，并且

表达所述核苷酸序列，以便在来源于细胞的系统中获得编码的蛋白或肽，其中所述表达是多种核苷酸序列的表达，以获得多种蛋白或肽，所述多种蛋白或肽是由感染剂的基因组编码的，并且其中将所述多种蛋白或肽施加在测试表面上，以得到蛋白/肽阵列，所述多种蛋白或肽得到了代表所述感染剂整个基因组的至少50％的蛋白/肽阵列。

9.权利要求8的方法，其中使用了至少一千万个所述细胞。

10.权利要求8的方法，其中所述细胞是化学感受态细胞和/或包括大肠杆菌或酵母。

11.权利要求10的方法，其中所述大肠杆菌选自JC8679、TB1、DH5α、DH5、HB101、JM101、JM109和LE392。

12.权利要求8的方法，进一步包括从转化的细胞提取所述含有所述表达系统的质粒。

13.权利要求1或8的方法，其中所述来源于细胞的系统是无细胞系统。

14.权利要求13的方法，其中无细胞系统是来源于微生物、真核细胞或麦胚的转录/翻译系统。

15.权利要求1或8的方法，其中所述来源于细胞的系统在细胞内部。

16.权利要求15的方法，其中所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

17.权利要求16的方法，其中所述APC选自巨噬细胞、树突细胞和B细胞。

18.权利要求8的方法，其中所述多种蛋白或肽得到了代表所述感染剂整个基因组的至少98％的蛋白/肽阵列。

19.权利要求8的方法，其中所述感染剂是痘苗病毒、土拉热弗朗西丝氏菌、人乳头瘤病毒、西尼罗河病毒、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、结核分枝杆菌或恶性疟原虫。

20.由权利要求1或8的方法制备的肽/蛋白阵列。

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