JPH05184369A - 免疫原蛋白及びｃＤＮＡクローン - Google Patents
免疫原蛋白及びｃＤＮＡクローンInfo
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- JPH05184369A JPH05184369A JP3096760A JP9676091A JPH05184369A JP H05184369 A JPH05184369 A JP H05184369A JP 3096760 A JP3096760 A JP 3096760A JP 9676091 A JP9676091 A JP 9676091A JP H05184369 A JPH05184369 A JP H05184369A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 エンタモエバヒストリチカの表面膜抗原及び
セリンリッチなＥ．ヒストリチカ蛋白をコードするＥ．
ヒストリチカ特異的ｃＤＮＡクローンを提供する。 【構成】 ｃ１ ｃＤＮＡは７２２のヌクレオチドとＯ
ＲＦ１及びＯＲＦ２と呼ぶ二つのオープンリーディング
フレームを含んでいる。ＯＲＦ１は、ヌクレオチド４の
イニシエータメチオニンからヌクレオチド７０３のＴＡ
Ａターミネータまでの連続オープンリーディングフレー
ムを含んでいる。ＯＲＦ２は、ヌクレオチド８８に、ｍ
ｏｓｔ５’メチオニンを持ち、ヌクレオチド６８９でタ
ーミネートする。ｃＤＮＡ配列は、２３３アミノ酸の２
５ｋＤの蛋白質である。セリンは、２３３アミノ酸のう
ちの５２を構成しているので、ＯＲＦ１の派生アミノ酸
配列は、セリンリッチなＥ．ヒストリチカ蛋白とされ
る。
セリンリッチなＥ．ヒストリチカ蛋白をコードするＥ．
ヒストリチカ特異的ｃＤＮＡクローンを提供する。 【構成】 ｃ１ ｃＤＮＡは７２２のヌクレオチドとＯ
ＲＦ１及びＯＲＦ２と呼ぶ二つのオープンリーディング
フレームを含んでいる。ＯＲＦ１は、ヌクレオチド４の
イニシエータメチオニンからヌクレオチド７０３のＴＡ
Ａターミネータまでの連続オープンリーディングフレー
ムを含んでいる。ＯＲＦ２は、ヌクレオチド８８に、ｍ
ｏｓｔ５’メチオニンを持ち、ヌクレオチド６８９でタ
ーミネートする。ｃＤＮＡ配列は、２３３アミノ酸の２
５ｋＤの蛋白質である。セリンは、２３３アミノ酸のう
ちの５２を構成しているので、ＯＲＦ１の派生アミノ酸
配列は、セリンリッチなＥ．ヒストリチカ蛋白とされ
る。
Description
【０００１】本発明は免疫原蛋白（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその蛋白をコードするｃ
ＤＮＡに関する。更に、本発明は、エンタモエバ ヒス
トリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃ
ａ）の表面膜抗原（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｎｔｉｇｅｎ）及びセリンに富んだエンタモエバヒ
ストリチカ蛋白をコードするエンタモエバ ヒストリカ
特異的ｃＤＮＡに関係する。
ｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその蛋白をコードするｃ
ＤＮＡに関する。更に、本発明は、エンタモエバ ヒス
トリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃ
ａ）の表面膜抗原（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｎｔｉｇｅｎ）及びセリンに富んだエンタモエバヒ
ストリチカ蛋白をコードするエンタモエバ ヒストリカ
特異的ｃＤＮＡに関係する。
【０００２】プロトゾアの病原体エンタモエバ ヒスト
リカは、世界中で病気及び死亡の大きな原因であり、５
００，０００，０００人以上が感染し、１年間でおおよ
そ５０，０００，０００例の下痢、５０，０００人の死
亡をひきおこしている〔（Ｗａｌｓｈ ｉｎ Ａｅｍｂ
ｉａｓｉｓ，Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙＥ
ｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｒｉｃａ），Ｒａｖｄｉ
ｎ，Ｊ．Ｉ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＰＰ，９３−１０５（１
９８８）〕。Ｅ．ヒストリカ感染の定着、又は侵略的病
気を防止することが緊急に必要である。動物モデルによ
るこれまでの研究により、Ｅ．ヒストリチカ感染への免
疫が、Ｅ．ヒストリチカ溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）によ
る免疫処置によって生産されうることが説明されている
〔Ｇｈａｄｉｒｉａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅ
ｄ．Ｈｙｇ．２９，７７９−７８４（１９８０）；Ｋｒ
ｕｐｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２３，
３５５−３６０（１９７４）；及びＳｗａｒｔｚｗｅｌ
ｄｅｒ ａｎｄ Ａｖａｎｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．１，５６７−５７５（１９５２）〕。し
かしながら、大量の栄養体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ
ｓ）を得る際の困難及び、免疫調製物（ｉｍｍｕｎｉｚ
ｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の比較的クルード
（ｃｒｕｄｅ）な性質が、これら従前の研究範囲を厳し
く制限してきた。
リカは、世界中で病気及び死亡の大きな原因であり、５
００，０００，０００人以上が感染し、１年間でおおよ
そ５０，０００，０００例の下痢、５０，０００人の死
亡をひきおこしている〔（Ｗａｌｓｈ ｉｎ Ａｅｍｂ
ｉａｓｉｓ，Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙＥ
ｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｒｉｃａ），Ｒａｖｄｉ
ｎ，Ｊ．Ｉ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＰＰ，９３−１０５（１
９８８）〕。Ｅ．ヒストリカ感染の定着、又は侵略的病
気を防止することが緊急に必要である。動物モデルによ
るこれまでの研究により、Ｅ．ヒストリチカ感染への免
疫が、Ｅ．ヒストリチカ溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）によ
る免疫処置によって生産されうることが説明されている
〔Ｇｈａｄｉｒｉａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅ
ｄ．Ｈｙｇ．２９，７７９−７８４（１９８０）；Ｋｒ
ｕｐｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２３，
３５５−３６０（１９７４）；及びＳｗａｒｔｚｗｅｌ
ｄｅｒ ａｎｄ Ａｖａｎｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．１，５６７−５７５（１９５２）〕。し
かしながら、大量の栄養体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ
ｓ）を得る際の困難及び、免疫調製物（ｉｍｍｕｎｉｚ
ｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の比較的クルード
（ｃｒｕｄｅ）な性質が、これら従前の研究範囲を厳し
く制限してきた。
【０００３】最近、病原性と非病原性Ｅ．ヒストリチカ
との間のゲノム上の差異がＴａｎｎｉｃｈ等によって報
告されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６，５１１８−５１２２（１９８
９）〕。この科学者達は、抗体スクリーニングを利用
し、部分的ｃＤＮＡクローン由来のアミノ酸配列を報告
している。推定上のイニシエーター メチオニンは発見
されず、ヌクレオチドデータは報告されなかった。又、
いかなるタンデム反覆（ｒｅｐｅａｔ）や部分的アミノ
酸配列の他の特性もＴａｎｎｉｃｈ等によって提供され
なかった。Ｔａｎｎｉｃｈ等の蛋白質の持つ生物学的役
割は彼らの報告中には見出し得ない。その代わり、この
論文はＥ．ヒストリチカ株間の遺伝子上の差異を検出す
るためのそれらの部分的ｃＤＮＡクローンの使用に完全
に向けられている。しかしながら、アクチン〔ほとんど
すべての生物に見出されるコンサーブド（ｃｏｎｓｅｒ
ｖｅｄ）蛋白質、及び、最初他の科学者グループによっ
て単離された〕を伴うサザンブロッティングは、プルー
ブとしてＥ．ヒストリチカの株間を区別する同一の能力
を示し、従って、プルーブがＥ．ヒストリチカ株間を区
別する能力において唯一のものでないことを示唆してい
る。
との間のゲノム上の差異がＴａｎｎｉｃｈ等によって報
告されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６，５１１８−５１２２（１９８
９）〕。この科学者達は、抗体スクリーニングを利用
し、部分的ｃＤＮＡクローン由来のアミノ酸配列を報告
している。推定上のイニシエーター メチオニンは発見
されず、ヌクレオチドデータは報告されなかった。又、
いかなるタンデム反覆（ｒｅｐｅａｔ）や部分的アミノ
酸配列の他の特性もＴａｎｎｉｃｈ等によって提供され
なかった。Ｔａｎｎｉｃｈ等の蛋白質の持つ生物学的役
割は彼らの報告中には見出し得ない。その代わり、この
論文はＥ．ヒストリチカ株間の遺伝子上の差異を検出す
るためのそれらの部分的ｃＤＮＡクローンの使用に完全
に向けられている。しかしながら、アクチン〔ほとんど
すべての生物に見出されるコンサーブド（ｃｏｎｓｅｒ
ｖｅｄ）蛋白質、及び、最初他の科学者グループによっ
て単離された〕を伴うサザンブロッティングは、プルー
ブとしてＥ．ヒストリチカの株間を区別する同一の能力
を示し、従って、プルーブがＥ．ヒストリチカ株間を区
別する能力において唯一のものでないことを示唆してい
る。
【０００４】本発明によって、多数のタンデム反覆を有
する抗原表面膜蛋白をコードするＥｎｔａｍｏｅｂａ
ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ特異的ｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中で単離し、発現させた。
する抗原表面膜蛋白をコードするＥｎｔａｍｏｅｂａ
ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ特異的ｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中で単離し、発現させた。
【０００５】特に、鑑別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）
ハイブリダイゼーションスクリーを使用してＣｌとして
表わす、Ｅ．ヒストリチカ特異的ｃＤＮＡクローンを単
離した。ｃＤＮＡは多数タンデム反覆を有するセリンリ
ッチのＥ．ヒストリチカ蛋白（以下、ＳＲＥＨＰとも言
う）をコードすることが分かった。ＳＲＥＨＰの構成モ
チーフは、マラリア種の反覆抗原特に、サーカムスポロ
ゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）蛋白、の
いくつかに似ている。ＳＲＥＨＰのタンデム反覆を有す
る組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ｔｒｐＥ融合蛋白
が、アメーバ症（ａｍｅｂｉａｓｉｓ）の患者から免疫
セーラム（ｓｅｒｕｍ）により認められ、これは、ＳＲ
ＥＨＰが自然的免疫原蛋白であることを表わしている。
組換え融合蛋白に対して生じた抗血清は、Ｅ．ヒストリ
チカ栄養体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）膜の粗製造にお
いて、見かけ分子量（ａｐｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）４６及び５２ｋｄを有する２つ
の明確なバンドに結合した。この抗血清は又、インビト
ロでチャイニーズハムスターオバリー細胞へのＥ．ヒス
トリチカ栄養体の付着を阻害した。これらの特性から、
ＳＲＥＨＰが、Ｅ．ヒストリチカの病因の鍵となる部分
（付着）を荷なっていることを示唆している。ＳＲＥＨ
Ｐは又、侵襲性アメーバ症の血清学試験において標的抗
原として使用することができる。
ハイブリダイゼーションスクリーを使用してＣｌとして
表わす、Ｅ．ヒストリチカ特異的ｃＤＮＡクローンを単
離した。ｃＤＮＡは多数タンデム反覆を有するセリンリ
ッチのＥ．ヒストリチカ蛋白（以下、ＳＲＥＨＰとも言
う）をコードすることが分かった。ＳＲＥＨＰの構成モ
チーフは、マラリア種の反覆抗原特に、サーカムスポロ
ゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）蛋白、の
いくつかに似ている。ＳＲＥＨＰのタンデム反覆を有す
る組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ｔｒｐＥ融合蛋白
が、アメーバ症（ａｍｅｂｉａｓｉｓ）の患者から免疫
セーラム（ｓｅｒｕｍ）により認められ、これは、ＳＲ
ＥＨＰが自然的免疫原蛋白であることを表わしている。
組換え融合蛋白に対して生じた抗血清は、Ｅ．ヒストリ
チカ栄養体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）膜の粗製造にお
いて、見かけ分子量（ａｐｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）４６及び５２ｋｄを有する２つ
の明確なバンドに結合した。この抗血清は又、インビト
ロでチャイニーズハムスターオバリー細胞へのＥ．ヒス
トリチカ栄養体の付着を阻害した。これらの特性から、
ＳＲＥＨＰが、Ｅ．ヒストリチカの病因の鍵となる部分
（付着）を荷なっていることを示唆している。ＳＲＥＨ
Ｐは又、侵襲性アメーバ症の血清学試験において標的抗
原として使用することができる。
【０００６】組換えｔｒｐＥ融合蛋白は、Ｅ．ｃｏｌｉ
のｔｒｐＥ遺伝子のＮ末端側２／３へのタンデム反覆を
少くとも含むＳＲＥＨＰ又はそのフラグメントを融合す
ることによって構築する。この融合は、従来方法、例え
ば、ハーディ及びストラウス（Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｓ
ｔｒａｕｓｓ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（３），９９８
−１００７（１９８８）記述の方法にしたがって、シン
ドビスビールス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリ
ペプチドとＥ．ｃｏｌｉのｔｒｐＥ遺伝子のＮ末端２／
３を融合させることによって、実行することができる。
のｔｒｐＥ遺伝子のＮ末端側２／３へのタンデム反覆を
少くとも含むＳＲＥＨＰ又はそのフラグメントを融合す
ることによって構築する。この融合は、従来方法、例え
ば、ハーディ及びストラウス（Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｓ
ｔｒａｕｓｓ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（３），９９８
−１００７（１９８８）記述の方法にしたがって、シン
ドビスビールス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）のポリ
ペプチドとＥ．ｃｏｌｉのｔｒｐＥ遺伝子のＮ末端２／
３を融合させることによって、実行することができる。
【０００７】Ｅ．ヒストリチカ特異的遺伝子を単離し、
及びＥ．ｃｏｌｉ中で、その遺伝子を発現することがで
きることは、Ｅ．ヒストリチカ病因の分子ベースを研究
する上で、医学にとって又ワクチン及び診断の発展に重
要なことである。
及びＥ．ｃｏｌｉ中で、その遺伝子を発現することがで
きることは、Ｅ．ヒストリチカ病因の分子ベースを研究
する上で、医学にとって又ワクチン及び診断の発展に重
要なことである。
【０００８】ｃｌ ｃＤＮＡ配列は、７２２の核酸から
成り、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２として示す２つのオープン
リーディングフレームを含んでいる。ＯＲＦ１は、ヌク
レオチド４で開始する推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）イニシ
エーターメチオニンからヌクレオチド７０３のＴＡＡタ
ーミネーションまでの連続するオープンリーディングフ
レームを含む。ＯＲＦ２はヌクレオチド１８８で、モー
スト（ｍｏｓｔ）５′メチオニンを有し、ヌクレオチド
６８９でターミネートする。
成り、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２として示す２つのオープン
リーディングフレームを含んでいる。ＯＲＦ１は、ヌク
レオチド４で開始する推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）イニシ
エーターメチオニンからヌクレオチド７０３のＴＡＡタ
ーミネーションまでの連続するオープンリーディングフ
レームを含む。ＯＲＦ２はヌクレオチド１８８で、モー
スト（ｍｏｓｔ）５′メチオニンを有し、ヌクレオチド
６８９でターミネートする。
【０００９】ｃＤＮＡ配列は、２３３のアミノ酸の２５
ＫＤａ蛋白質をコードする。セリンは２３３のアミノ酸
中５２を構成するために、ＯＲＦ１の派生アミノ酸配列
は、セリンリッチＥ．ヒストリチカ蛋白（ＳＲＥＨＰ）
と呼ぶ。これに対し、ＯＲＦ２の派生１６７アミノ酸配
列は、セリンプアである。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２でコー
ドされたｃ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列及び２個の各
アミノ酸配列は以下のとおりである。ヌクレオチド及び
アミノ酸の右側に番号をふった。
ＫＤａ蛋白質をコードする。セリンは２３３のアミノ酸
中５２を構成するために、ＯＲＦ１の派生アミノ酸配列
は、セリンリッチＥ．ヒストリチカ蛋白（ＳＲＥＨＰ）
と呼ぶ。これに対し、ＯＲＦ２の派生１６７アミノ酸配
列は、セリンプアである。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２でコー
ドされたｃ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列及び２個の各
アミノ酸配列は以下のとおりである。ヌクレオチド及び
アミノ酸の右側に番号をふった。
【式３】
【式４】
【式５】
【００１０】本発明の新規なＳＲＥＨＰの実用性を示す
ために、８８人の患者からの９０血清を、セリンリッチ
Ｅ．ヒストリチカ蛋白に対する抗体の存在に対して、ウ
エスタンブロッティングにより試験を行った。標的抗原
は、大部分のＳＲＥＨＰ配列を含み、タンデム反覆を含
む、組換えｔｒｐＥ融合蛋白であった。ダーバン、サン
ディエゴ及びメキシコ市からのアメーバ性肝膿瘍を有す
る患者６１のうち４９（７９％）が、ＳＲＥＨＰに対す
る抗体を有していた。これに対し、急性侵襲性アメーバ
症でない２４人中たった１人（４％）がＳＲＥＨＰ抗体
を有していた。急性侵襲性アメーバ症の検出において、
抗−ＳＲＥＨＰ抗体の特異性は、ダーバンからの患者を
分析した時、非常に高かった。即ち、ＳＲＥＨＰに血清
陽性の患者１２人中１１人（９２％）が急性侵襲性アメ
ーバ症であり、これに対し、２６患者中１７人（６５
％）が寒天ゲル拡散により陽性であった。このような組
換ＳＲＥＨＰ融合蛋白に基づく血清学的試験の使用は、
風土病領域における急性侵襲性アメーバ症の診断に有効
な補助となると思われる。
ために、８８人の患者からの９０血清を、セリンリッチ
Ｅ．ヒストリチカ蛋白に対する抗体の存在に対して、ウ
エスタンブロッティングにより試験を行った。標的抗原
は、大部分のＳＲＥＨＰ配列を含み、タンデム反覆を含
む、組換えｔｒｐＥ融合蛋白であった。ダーバン、サン
ディエゴ及びメキシコ市からのアメーバ性肝膿瘍を有す
る患者６１のうち４９（７９％）が、ＳＲＥＨＰに対す
る抗体を有していた。これに対し、急性侵襲性アメーバ
症でない２４人中たった１人（４％）がＳＲＥＨＰ抗体
を有していた。急性侵襲性アメーバ症の検出において、
抗−ＳＲＥＨＰ抗体の特異性は、ダーバンからの患者を
分析した時、非常に高かった。即ち、ＳＲＥＨＰに血清
陽性の患者１２人中１１人（９２％）が急性侵襲性アメ
ーバ症であり、これに対し、２６患者中１７人（６５
％）が寒天ゲル拡散により陽性であった。このような組
換ＳＲＥＨＰ融合蛋白に基づく血清学的試験の使用は、
風土病領域における急性侵襲性アメーバ症の診断に有効
な補助となると思われる。
【００１１】本明細書においては、標準生化学命名法を
用い、ヌクレオチド塩基をアデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；及びシトシン（Ｃ）として表
した。対応するヌクレオチドは、例えば、デオキシアデ
ノシン−５′−トリホスフェート（ｄＡＴＰ）である。
ＤＮＡヌクレオチド配列の構造表現において便利のため
従来と同様、一本鎖のみ示し、従って、一本鎖上のＡ
は、その相補鎖上のＴを含み、ＧはＣを含むものであ
る。
用い、ヌクレオチド塩基をアデニン（Ａ）；チミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）；及びシトシン（Ｃ）として表
した。対応するヌクレオチドは、例えば、デオキシアデ
ノシン−５′−トリホスフェート（ｄＡＴＰ）である。
ＤＮＡヌクレオチド配列の構造表現において便利のため
従来と同様、一本鎖のみ示し、従って、一本鎖上のＡ
は、その相補鎖上のＴを含み、ＧはＣを含むものであ
る。
【００１２】アミノ酸は、普通の３文字によるか、又は
以下の１文字の略字により示す。 ──────────────────────────────── 略 字 アミノ酸 ──────────────────────────────── Ａ Ａｌａ Ａｌａｎｉｎｅ Ｃ Ｃｙｓ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｄ Ａｓｐ Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ Ｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ Ｆ Ｐｈｅ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｈ Ｈｉｓ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｉ Ｉｌｅ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｋ Ｌｙｓ Ｌｙｓｉｎｅ Ｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｍ Ｍｅｔ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｎ Ａｓｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｑ Ｇｌｎ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｒ Ａｒｇ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒｉｎｅ Ｔ Ｔｈｒ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｖ Ｖａｌ Ｖａｌｉｎｅ Ｗ Ｔｒｐ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ────────────────────────────────
以下の１文字の略字により示す。 ──────────────────────────────── 略 字 アミノ酸 ──────────────────────────────── Ａ Ａｌａ Ａｌａｎｉｎｅ Ｃ Ｃｙｓ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｄ Ａｓｐ Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ Ｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ Ｆ Ｐｈｅ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｈ Ｈｉｓ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｉ Ｉｌｅ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｋ Ｌｙｓ Ｌｙｓｉｎｅ Ｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｍ Ｍｅｔ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｎ Ａｓｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｑ Ｇｌｎ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｒ Ａｒｇ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒｉｎｅ Ｔ Ｔｈｒ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｖ Ｖａｌ Ｖａｌｉｎｅ Ｗ Ｔｒｐ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ────────────────────────────────
【００１３】本発明の特定の好ましい例を更に詳細に説
明するために、下記する例示的な実験室内製造を行なっ
たが、発明をこれらの特定の例に限定するものではない
ことが分かるであろう。
明するために、下記する例示的な実験室内製造を行なっ
たが、発明をこれらの特定の例に限定するものではない
ことが分かるであろう。
【００１４】実施例１ 本実施例は、ｃ１として示すＥ．ヒストリチカ特異的ｃ
ＤＮＡクローンの単離、及びＳＲＥＨＰの性格化及び特
性を説明する。
ＤＮＡクローンの単離、及びＳＲＥＨＰの性格化及び特
性を説明する。
【００１５】材料及び方法 Ｅ．ヒストリチカ単離及び培養条件 Ｅ．ヒストリチカ 株ＨＭ１：ＩＭＳＳは、インビボ及び
インビトロで病毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）である〔Ｌｉ
ｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７，８−１２（１
９８９）；Ｍａｔｔｅｒｎ及びＫｅｉｓｔｅｒ、Ａｍ．
Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２７，８８２−８８７
（１９７７）〕。Ｅ．ヒストリチカ様ラレド株（Ｌａｒ
ｅｄｏ ｓｔａｉｎ）を下痢患者から単離したが〔Ｄｉ
ａｍｏｎｄ．Ｉ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５４，１０４７
−１０５６（１９６８）〕，インビトロ細胞毒アッシー
及び動物モデルによれば非病毒生である。２つの株を以
前Ｄｉａｍｏｎｄ等がＴｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏ
ｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４，４３１−４３２（１９７８）
で述べた従来方法により、ＴＹＩ−Ｓ−３３培地中で無
菌的に生育させた。
インビトロで病毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）である〔Ｌｉ
ｅ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７，８−１２（１
９８９）；Ｍａｔｔｅｒｎ及びＫｅｉｓｔｅｒ、Ａｍ．
Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２７，８８２−８８７
（１９７７）〕。Ｅ．ヒストリチカ様ラレド株（Ｌａｒ
ｅｄｏ ｓｔａｉｎ）を下痢患者から単離したが〔Ｄｉ
ａｍｏｎｄ．Ｉ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５４，１０４７
−１０５６（１９６８）〕，インビトロ細胞毒アッシー
及び動物モデルによれば非病毒生である。２つの株を以
前Ｄｉａｍｏｎｄ等がＴｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏ
ｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４，４３１−４３２（１９７８）
で述べた従来方法により、ＴＹＩ−Ｓ−３３培地中で無
菌的に生育させた。
【００１６】ＨＭ１：ＩＭＳＳ ｃＤＮＡライブラリー
の構築及びスクリーニング 全細胞ＲＮＡを対数増殖期ＨＭ１：ＩＭＳＳ及びラレド
栄養体から、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ１８，５２９４−５２９９（１９７９）の方法を
用いて単離した。ポリ−（Ａ）+ −ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロース上でクロマトグラフィーにより精製し
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８
２）〕，２本鎖ｃＤＮＡを調製した〔Ｇｕｂｌｅｒ ａ
ｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６
９，（１９８３）〕。この２重鎖ｃＤＮＡを酵素末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてＣ−
テイル（Ｃ−ｔａｉｌ）し、Ｇ−ティルＰｓｔＩダイジ
ェストされたｐＵＣ１３によりアニールした〔Ｖｉｌｌ
ａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，３７２７−３７３１（１９
７８）〕。このキメラ化プラスミドをＤＨ−５ Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質変換するのに使用し〔Ｈａｎａｂａｎ，
Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９
８３）〕、５０，０００の組み換え体を含むｃＤＮＡラ
イブラーを生成した。１０，０００組み換え体のレプリ
カフィルターをそれぞれ、ＨＭ１：ＩＭＳＳ又は非病原
性Ｅ．ヒストリチカ−様ラレド株から放射能標識１本鎖
ｃＤＮＡでプルーブした。
の構築及びスクリーニング 全細胞ＲＮＡを対数増殖期ＨＭ１：ＩＭＳＳ及びラレド
栄養体から、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ１８，５２９４−５２９９（１９７９）の方法を
用いて単離した。ポリ−（Ａ）+ −ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロース上でクロマトグラフィーにより精製し
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８
２）〕，２本鎖ｃＤＮＡを調製した〔Ｇｕｂｌｅｒ ａ
ｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６
９，（１９８３）〕。この２重鎖ｃＤＮＡを酵素末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてＣ−
テイル（Ｃ−ｔａｉｌ）し、Ｇ−ティルＰｓｔＩダイジ
ェストされたｐＵＣ１３によりアニールした〔Ｖｉｌｌ
ａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，３７２７−３７３１（１９
７８）〕。このキメラ化プラスミドをＤＨ−５ Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質変換するのに使用し〔Ｈａｎａｂａｎ，
Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９
８３）〕、５０，０００の組み換え体を含むｃＤＮＡラ
イブラーを生成した。１０，０００組み換え体のレプリ
カフィルターをそれぞれ、ＨＭ１：ＩＭＳＳ又は非病原
性Ｅ．ヒストリチカ−様ラレド株から放射能標識１本鎖
ｃＤＮＡでプルーブした。
【００１７】ノーザンブロット分析 ２０μｇの全細胞ＲＮＡサンプルを、ホルムアルデヒド
を含む１．５％アガロースゲルを通して電気泳動にかけ
た後、ノーザンブロットを調製した〔Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，５
２０１−５２０５（１９８０）〕。ノーザンブロットを
〔α−32Ｐ〕ＡＴＰで、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｃ
ｌｓｔｅｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｃｏｃｈｅｍ．１３２，
６−１３（１９８３）のランダムプライマー法により、
特異活性１０００ｃｐｍ／ｐｇにラベルされたｃＤＮＡ
でプルーブした。ハイブリダイゼーション及び洗條条件
は、最後の３回の洗條が６０℃で行なった点を除き、Ｌ
ｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８３，５７７９−５７８３（１９８６）で掲げられたも
のと同一であった。オートラジオグラフを２４時間露光
した。
を含む１．５％アガロースゲルを通して電気泳動にかけ
た後、ノーザンブロットを調製した〔Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，５
２０１−５２０５（１９８０）〕。ノーザンブロットを
〔α−32Ｐ〕ＡＴＰで、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｃ
ｌｓｔｅｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｃｏｃｈｅｍ．１３２，
６−１３（１９８３）のランダムプライマー法により、
特異活性１０００ｃｐｍ／ｐｇにラベルされたｃＤＮＡ
でプルーブした。ハイブリダイゼーション及び洗條条件
は、最後の３回の洗條が６０℃で行なった点を除き、Ｌ
ｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８３，５７７９−５７８３（１９８６）で掲げられたも
のと同一であった。オートラジオグラフを２４時間露光
した。
【００１８】ヌクレオチド配列分析 ｃＤＮＡクローンをＭａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９−５６０
（１９８０）の技術を用いて配列した。クローンｃ１の
ｃＤＮＡ配列を、ｃ１配列由来のオリゴヌクレオチドＴ
ＴＣＡＧＧＡＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴを用いて、
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ等、Ｊ，Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２，９７０９−９７１７（１９８７）に記述されたプ
ライマーエクステンション（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎ）を用いて完成した。
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９−５６０
（１９８０）の技術を用いて配列した。クローンｃ１の
ｃＤＮＡ配列を、ｃ１配列由来のオリゴヌクレオチドＴ
ＴＣＡＧＧＡＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴを用いて、
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ等、Ｊ，Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２，９７０９−９７１７（１９８７）に記述されたプ
ライマーエクステンション（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎ）を用いて完成した。
【００１９】ｔｒｐＥハイブリッド遺伝子融合の構築 ｐＡＴＨ２及びｐＡＴＨ３プラスミド〔Ｈａｒｄｙ及び
Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２，９９８
−１００７（１９８８）記載〕をｔｒｐＥ融合蛋白同
様、Ｅ．ｃｏｌｉ中、ｃ１ ｃＤＮＡクローンの両オー
プンリーディングフレームを発現させるために用いた。
ｃ１のＨｉｎｄ III−ＳｍａＩフラグメント（ヌクレオ
チド１２８−７２２及びｐＵＣ１３ポリリンカー領域の
一部分を含む）をｐＡＴＨ３のＨｉｎｄ III サイト及
びＣｌａＩサイト（ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端化されていた）にライゲート（ｌｉｇａｔｅ）
し、ｐＯＲＦ１を構築した。このＨｉｎｄ III −Ｓｍ
ａ IフラグメントをＨｉｎｄ IIIに及びＰＡＴＨ２の平
滑末端化ＣｌａＩサイトにライゲートしてｐＯＲＦ２を
構築した。ｔｒｐＥ融合蛋白の発現及び部分精製 細菌をβ−インドールアクリル酸で２４時間培養後に収
穫した点を除いて、ｔｒｐＥ融合蛋白を、前述のＨａｒ
ｄｙ及びＳｔｒａｕｓｓの記述に従って発現させた。不
溶性蛋白分画を小球状細胞から、Ｈａｒｄｙ及びＳｔｒ
ａｕｓｓに記述された様に調製して、ｔｒｐＥ蛋白を部
分的に精製した。比較用分子量標準を用いた非連続ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより決定した融合蛋白の収率は、培養液
１ｍｌ当り１５から３０μｇ蛋白質であった。
Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２，９９８
−１００７（１９８８）記載〕をｔｒｐＥ融合蛋白同
様、Ｅ．ｃｏｌｉ中、ｃ１ ｃＤＮＡクローンの両オー
プンリーディングフレームを発現させるために用いた。
ｃ１のＨｉｎｄ III−ＳｍａＩフラグメント（ヌクレオ
チド１２８−７２２及びｐＵＣ１３ポリリンカー領域の
一部分を含む）をｐＡＴＨ３のＨｉｎｄ III サイト及
びＣｌａＩサイト（ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端化されていた）にライゲート（ｌｉｇａｔｅ）
し、ｐＯＲＦ１を構築した。このＨｉｎｄ III −Ｓｍ
ａ IフラグメントをＨｉｎｄ IIIに及びＰＡＴＨ２の平
滑末端化ＣｌａＩサイトにライゲートしてｐＯＲＦ２を
構築した。ｔｒｐＥ融合蛋白の発現及び部分精製 細菌をβ−インドールアクリル酸で２４時間培養後に収
穫した点を除いて、ｔｒｐＥ融合蛋白を、前述のＨａｒ
ｄｙ及びＳｔｒａｕｓｓの記述に従って発現させた。不
溶性蛋白分画を小球状細胞から、Ｈａｒｄｙ及びＳｔｒ
ａｕｓｓに記述された様に調製して、ｔｒｐＥ蛋白を部
分的に精製した。比較用分子量標準を用いた非連続ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより決定した融合蛋白の収率は、培養液
１ｍｌ当り１５から３０μｇ蛋白質であった。
【００２０】免疫感作（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ） ＨＭ１：ＩＭＳＳ栄養体に対して関係したポリクローナ
ルラビット血清を完全フロインドアジュバント中にサス
ペンドした２×１０6 ＨＭ１：ＩＭＳＳ栄養体調製物で
皮下的に免疫化することによって得た。追加免疫感作
（ｂｏｏｓｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を不完全
フロインドアジュバント中の同一の調製物を用いて実施
した。最初の追加免疫注射後２週間で血清をはじめて収
集し、引き続き、その後の追加免疫後２週間づつ血清を
収集した。
ルラビット血清を完全フロインドアジュバント中にサス
ペンドした２×１０6 ＨＭ１：ＩＭＳＳ栄養体調製物で
皮下的に免疫化することによって得た。追加免疫感作
（ｂｏｏｓｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を不完全
フロインドアジュバント中の同一の調製物を用いて実施
した。最初の追加免疫注射後２週間で血清をはじめて収
集し、引き続き、その後の追加免疫後２週間づつ血清を
収集した。
【００２１】融合蛋白の精製、及び雌のニュージーラン
ドホワイトラビットの融合蛋白での免疫感作を前述のＨ
ａｒｄｙ及びＳｔｒａｕｓｓ記述に性格に一致させ、注
射１回当り７５から１００μｇ蛋白質を用いて、実施し
た。血清を各ラビットから免疫感作所にコントロール保
存用として、それから最初の免疫から６週間後（最初の
追加免疫から２週間後）、その後追加免疫から２週間後
づつ収集した。
ドホワイトラビットの融合蛋白での免疫感作を前述のＨ
ａｒｄｙ及びＳｔｒａｕｓｓ記述に性格に一致させ、注
射１回当り７５から１００μｇ蛋白質を用いて、実施し
た。血清を各ラビットから免疫感作所にコントロール保
存用として、それから最初の免疫から６週間後（最初の
追加免疫から２週間後）、その後追加免疫から２週間後
づつ収集した。
【００２２】ウエスタンブロット Ｅ．ヒストリチカ 免疫ヒト及びラビット血清による融合
蛋白のウエスタンブロッティング用に、０．３ｍｌの培
養液からの細菌細胞の不溶蛋白分画を還元条件下に、１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後ニトロセル
ロースに移した。ブロットを１／５００稀釈免疫又は前
−免疫血清に反応させ、そしてイムノグロブリン結合を
125Ｉ標識スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃａｌ）蛋白−Ａを用いて検出した。ブロットを１２
時間オートラジオグラフした。
蛋白のウエスタンブロッティング用に、０．３ｍｌの培
養液からの細菌細胞の不溶蛋白分画を還元条件下に、１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後ニトロセル
ロースに移した。ブロットを１／５００稀釈免疫又は前
−免疫血清に反応させ、そしてイムノグロブリン結合を
125Ｉ標識スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃａｌ）蛋白−Ａを用いて検出した。ブロットを１２
時間オートラジオグラフした。
【００２３】組換え蛋白に対する抗血清を有するアメー
バ性の溶解物のウエスタンブロッティングのために、７
２時間培養液からの５×１０6 の栄養体をリン酸バッフ
ァー食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗條した。それから、５
ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ロイペプチン／５ｍＭ Ｎ−
エチルマレイミド／２ｍＭ フェニルメチルスルホニル
フルオライド／２ｍＭ ベンズアミジン／５ｍＭ トラ
ンス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−
グアニジノ）−ブタン（Ｅ−６４）を含むＰＢＳ２ｍｌ
中に浸漬した。栄養体を超音波処理により溶解し、この
ＨＭ１：ＩＭＳＳ栄養体の均質物を１００，０００×
ｇ、１時間遠心分離した。
バ性の溶解物のウエスタンブロッティングのために、７
２時間培養液からの５×１０6 の栄養体をリン酸バッフ
ァー食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗條した。それから、５
ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ロイペプチン／５ｍＭ Ｎ−
エチルマレイミド／２ｍＭ フェニルメチルスルホニル
フルオライド／２ｍＭ ベンズアミジン／５ｍＭ トラ
ンス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−
グアニジノ）−ブタン（Ｅ−６４）を含むＰＢＳ２ｍｌ
中に浸漬した。栄養体を超音波処理により溶解し、この
ＨＭ１：ＩＭＳＳ栄養体の均質物を１００，０００×
ｇ、１時間遠心分離した。
【００２４】この１００，０００×ｇ上澄液のアリコッ
ト及び１０5 栄養体に対応するペレットフラクション１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより変性、分離し、その後、ニ
トロセルロースに移した。ブロットを融合蛋白のラビッ
ト抗血清の１／１０００稀釈と反応させ、上記したと同
じようにその後の処理を行なった。
ト及び１０5 栄養体に対応するペレットフラクション１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより変性、分離し、その後、ニ
トロセルロースに移した。ブロットを融合蛋白のラビッ
ト抗血清の１／１０００稀釈と反応させ、上記したと同
じようにその後の処理を行なった。
【００２５】 3Ｈ−チミジン標識Ｅ．ヒストリチカ栄養
体の１０２１チャイニーズハムスーオバリー細胞の単一
層への付着 これらの試験を、Ｌｉ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
７，１７２５−１７３０（１９８８）記述の従来の手法
により行なった。試験する抗血清有りと無しの媒体０．
２５ｍｌを８×１０5 細胞／ｍｌでサスペンドしている
栄養体０．２５ｍｌを添加する直前に単一層に添加し
た。各試験抗血清１：１０稀釈を使用した。各アッシー
に対し、２つのウエルを使用した。媒体コントロール群
±標準偏差中に見られる栄養体付着％としてデータを示
した。
体の１０２１チャイニーズハムスーオバリー細胞の単一
層への付着 これらの試験を、Ｌｉ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
７，１７２５−１７３０（１９８８）記述の従来の手法
により行なった。試験する抗血清有りと無しの媒体０．
２５ｍｌを８×１０5 細胞／ｍｌでサスペンドしている
栄養体０．２５ｍｌを添加する直前に単一層に添加し
た。各試験抗血清１：１０稀釈を使用した。各アッシー
に対し、２つのウエルを使用した。媒体コントロール群
±標準偏差中に見られる栄養体付着％としてデータを示
した。
【００２６】結果 病原性Ｅ．ヒストリチカＨＭ１：ＩＭＳＳ株からのｃＤ
ＮＡクローンの単離 ＨＭ１：ＩＭＳＳ ｍＲＮＡ由来ｐＵＣ１３ｃＤＮＡか
らの１０，０００組換体をＨＭ１：ＩＭＳＳ又は非病原
性Ｅ．ヒストリチカ様ラレド株それぞれからのポリＡ+
ＲＮＡから転写された放射線標識された一本鎖ｃＤＮＡ
によりスクリーンした。４つのＨＭ１：ＩＭＳＳ ｃＤ
ＮＡにハイブリダイズするがラレドｃＤＮＡにはハイブ
リダイズしないユニークなクローンを単離した。このク
ローンのひとつであるｃ１の特性をここに詳細に述べ
る。
ＮＡクローンの単離 ＨＭ１：ＩＭＳＳ ｍＲＮＡ由来ｐＵＣ１３ｃＤＮＡか
らの１０，０００組換体をＨＭ１：ＩＭＳＳ又は非病原
性Ｅ．ヒストリチカ様ラレド株それぞれからのポリＡ+
ＲＮＡから転写された放射線標識された一本鎖ｃＤＮＡ
によりスクリーンした。４つのＨＭ１：ＩＭＳＳ ｃＤ
ＮＡにハイブリダイズするがラレドｃＤＮＡにはハイブ
リダイズしないユニークなクローンを単離した。このク
ローンのひとつであるｃ１の特性をここに詳細に述べ
る。
【００２７】ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションに
よるｃ１遺伝子発現の分析 ｃ１クローンに対応する遺伝子の発現を４つのＥ．ヒス
トリチカ株、ラレド、エンタモエバインバデンス（Ｅｎ
ｔａｍｏｅｂａ ｉｎｖａｄｅｎｓ）、及びエンタモエ
バモシコフスキイ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｍｏｓｈｋｏ
ｖｓｋｉｉ）から単離したＲＮＡのブロットハイブリダ
イゼーションにより試験した（第１図）。このｃ１クロ
ーンは、４つの無菌Ｅ．ヒストリチカ株すべてにおい
て、０．８ｋｂ種とハイブリダイズしたが、ラレド、又
は２つの非−Ｅ．ヒストリチカ種、すなわち、Ｅ．イン
バデンス及びＥ．モシコフスキイからのＲＮＡとはハイ
ブリダイズしなかった。
よるｃ１遺伝子発現の分析 ｃ１クローンに対応する遺伝子の発現を４つのＥ．ヒス
トリチカ株、ラレド、エンタモエバインバデンス（Ｅｎ
ｔａｍｏｅｂａ ｉｎｖａｄｅｎｓ）、及びエンタモエ
バモシコフスキイ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｍｏｓｈｋｏ
ｖｓｋｉｉ）から単離したＲＮＡのブロットハイブリダ
イゼーションにより試験した（第１図）。このｃ１クロ
ーンは、４つの無菌Ｅ．ヒストリチカ株すべてにおい
て、０．８ｋｂ種とハイブリダイズしたが、ラレド、又
は２つの非−Ｅ．ヒストリチカ種、すなわち、Ｅ．イン
バデンス及びＥ．モシコフスキイからのＲＮＡとはハイ
ブリダイズしなかった。
【００２８】同じアメーバからのＥ．ｃｏＲ１消化ゲノ
ムＤＮＡのサザンブロットをｃ１クローンとプローブし
た時、４．４ｋｂフラグメントが全ての４つのＥ．ヒス
トリチカ株でノート（ｎｏｔｅ）されたが、ラレド、
Ｅ．インバデンス、又はＥ．モシコフスキイではされな
かった。ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼーション試験
の結果は、ｃ１クローンに対応する遺伝子はＥ．ヒスト
リチカ株にのみ存在し発現するものであって、他の調べ
たＥｎｔａｍｏｅｂａ種では否定された。
ムＤＮＡのサザンブロットをｃ１クローンとプローブし
た時、４．４ｋｂフラグメントが全ての４つのＥ．ヒス
トリチカ株でノート（ｎｏｔｅ）されたが、ラレド、
Ｅ．インバデンス、又はＥ．モシコフスキイではされな
かった。ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼーション試験
の結果は、ｃ１クローンに対応する遺伝子はＥ．ヒスト
リチカ株にのみ存在し発現するものであって、他の調べ
たＥｎｔａｍｏｅｂａ種では否定された。
【００２９】ｃ１ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配
列 ｃ１ ｃＤＮＡ配列は７２２ヌクレオチドで構成され
（図、２Ａ）、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２で示す２つのオー
プンリーディングフレームを含んでいた。ＯＲＦ１は、
ヌクレオチド４に始まる推定イニシエーターメチオニン
からヌクレオチド７０３のＴＡＡターミネーターまでの
連続するオープンリーディングフレームを含んでいた。
ヌクレオチド２４７に始まって、ＯＲＦ１は、ドデカペ
プチドＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
をコードする３６のヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒ
ｅｔｃｈ）を含んでいた。
列 ｃ１ ｃＤＮＡ配列は７２２ヌクレオチドで構成され
（図、２Ａ）、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２で示す２つのオー
プンリーディングフレームを含んでいた。ＯＲＦ１は、
ヌクレオチド４に始まる推定イニシエーターメチオニン
からヌクレオチド７０３のＴＡＡターミネーターまでの
連続するオープンリーディングフレームを含んでいた。
ヌクレオチド２４７に始まって、ＯＲＦ１は、ドデカペ
プチドＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
をコードする３６のヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒ
ｅｔｃｈ）を含んでいた。
【００３０】類似のオクタペプチドをコードする２４ヌ
クレオチド空間の後に、このドデカペプチドは、タンデ
ム的に５回反覆し、続いてオクタペプチドＳｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ，を４反覆した。トデカペプチド反覆のヌクレオチド
配列は、各反覆の最初のＳｅｒで、コドンの３番目のＣ
又はＵを使用している点が唯一相違しながら、高度にコ
ンサーブ（ｃｏｎｓｅｒｖｅ）していた。反覆するオク
タペプチドは、ドデカペプチドの一部を切りとったバー
ジョンを示し、３番目のセリンをスレオニンで置換した
ひとつのヌクレオチド変化及び両方のＡｓｐ残基をコー
ドするヌクレオチドを伴い、Ｌｙｓ及びＰｒｏ残基のひ
とつが欠落している。セリンは、２３３アミノ酸のうち
５２を構成していた。従って、ＯＲＦ１の派生（ｄｅｒ
ｉｖｅｄ）アミノ酸配列は、セリンリッチなＥ．ヒスト
リチカ蛋白質（ＳＲＥＨＰ）と呼ぶ。
クレオチド空間の後に、このドデカペプチドは、タンデ
ム的に５回反覆し、続いてオクタペプチドＳｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ，を４反覆した。トデカペプチド反覆のヌクレオチド
配列は、各反覆の最初のＳｅｒで、コドンの３番目のＣ
又はＵを使用している点が唯一相違しながら、高度にコ
ンサーブ（ｃｏｎｓｅｒｖｅ）していた。反覆するオク
タペプチドは、ドデカペプチドの一部を切りとったバー
ジョンを示し、３番目のセリンをスレオニンで置換した
ひとつのヌクレオチド変化及び両方のＡｓｐ残基をコー
ドするヌクレオチドを伴い、Ｌｙｓ及びＰｒｏ残基のひ
とつが欠落している。セリンは、２３３アミノ酸のうち
５２を構成していた。従って、ＯＲＦ１の派生（ｄｅｒ
ｉｖｅｄ）アミノ酸配列は、セリンリッチなＥ．ヒスト
リチカ蛋白質（ＳＲＥＨＰ）と呼ぶ。
【００３１】３つの隣接するセリン残基は、ドデカペプ
チド反覆の部分であり、蛋白中で５つの別の位置を発見
した。この反覆の前に、多数のリジン、グルタメート及
びアスパルテート残基から成る高度にチャージされた領
域が先行していた。ＯＲＦ１は、将来の膜挿入又はスパ
ン領域と合致する、プライマリー疎水性アミノ酸をコー
ドする５４ヌクレオチドで終了していた。
チド反覆の部分であり、蛋白中で５つの別の位置を発見
した。この反覆の前に、多数のリジン、グルタメート及
びアスパルテート残基から成る高度にチャージされた領
域が先行していた。ＯＲＦ１は、将来の膜挿入又はスパ
ン領域と合致する、プライマリー疎水性アミノ酸をコー
ドする５４ヌクレオチドで終了していた。
【００３２】Ｎ末端の初めの１３アミノ酸は、位置１３
のＡｌと位置１４のＴｈｒの間の将来の開裂部位を有す
るｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４，４６８３−４６９０（１９８６）のアルゴリ
ズムで示す真核生物のシグナル配列の特徴のいくつかを
持っている。この配列は、他のシグナル配列と、疎水性
コア（ｈ−ｄｏｍａｉｎ）の前のひとひつ以上のチャー
ジされたアミノ酸（ｎ−ｄｏｍａｉｎ）が欠けている点
で異なっていた。次のＯＲＦであるＯＲＦ２は、５′端
に５つのメチオニンコドンを有し、ヌクレオチド１８８
で始まるｍｏｓｔ５′を伴っていた（図２Ａ）。ＯＲＦ
２は又、タンデム的に反覆ドデカペプチド、Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ又は、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−
Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓをコ
ードしており、これは、ヌクレオチド２４５で始まっ
て、ＯＲＦ１に類似する反覆パターンを有し、５つの追
加のドデカペプチド反覆、その後４つのオクタペプチド
反覆Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｌｙｓを伴なっていた。ＯＲＦ２は、比較的
疎水性の領域で終了していた。
のＡｌと位置１４のＴｈｒの間の将来の開裂部位を有す
るｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４，４６８３−４６９０（１９８６）のアルゴリ
ズムで示す真核生物のシグナル配列の特徴のいくつかを
持っている。この配列は、他のシグナル配列と、疎水性
コア（ｈ−ｄｏｍａｉｎ）の前のひとひつ以上のチャー
ジされたアミノ酸（ｎ−ｄｏｍａｉｎ）が欠けている点
で異なっていた。次のＯＲＦであるＯＲＦ２は、５′端
に５つのメチオニンコドンを有し、ヌクレオチド１８８
で始まるｍｏｓｔ５′を伴っていた（図２Ａ）。ＯＲＦ
２は又、タンデム的に反覆ドデカペプチド、Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ又は、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−
Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓをコ
ードしており、これは、ヌクレオチド２４５で始まっ
て、ＯＲＦ１に類似する反覆パターンを有し、５つの追
加のドデカペプチド反覆、その後４つのオクタペプチド
反覆Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｌｙｓを伴なっていた。ＯＲＦ２は、比較的
疎水性の領域で終了していた。
【００３３】ジーンバンク及びＮＢＲＦデータバンクで
調査しても、ヌクレオチド又はｃ１からの派生アミノ酸
配列のいずれも同一の配列のものは発見されなかった。
さらにｃ１からの派生アミノ酸配列は、Ｔａｎｎｉｃｈ
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６，５１１８−５１２２（１９８９）により最近報告
されたＥ．ヒストリチカｃＤＮＡクローンの部分配列と
は異なっている。タンデム反覆は、別の寄生虫からの抗
原で発見されたが、マラリヤ種の抗原の中で最も顕著で
ある〔Ｋｅｍｐ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．４１，１８１−２０８（１９８７）〕。ＳＲＥＨＰ
の始めの構造モチーフは、マラリア種とりわけサーカム
スポロゾイトの反覆抗原と類似である〔ｋｅｍｐ等、前
述、オザキ等、Ｃｅｌｌ ３４，８１５−８２２（１９
８３）〕。サーカムスポロゾイト蛋白は、マラリア寄生
中のスポロゾイト期の表面を覆う蛋白であり、４０から
６０ｋＤａの大きさに亘り、種特異的パターンの多数の
タンデム反覆を含んでいる。Ｐ．Ｋｎｏｗｌｅｓｉサー
カムスポロゾイト蛋白の予想される構造は、疎水性ＮＨ
2 末端領域；ひきつづき、チャージしたアミノ酸を優勢
に含む２つの領域を側部に持つ、タンデム的に反覆した
アミノ酸のシリーズ、そして疎水性アンカー領域から成
るＣＯＯＨ−末端領域で終っている（図２Ｂ）。Ｐ．Ｋ
ｎｏｗｌｅｓｉサーカムスポロゾイト蛋白のＮＨ2 −末
端疎水性領域において、４８アミノ酸残基のうち２７が
チャージされており（主として、リジン及びグルタミン
酸塩残基、オザキ、前出）、一方、対比する、ＳＲＥＨ
ＰのＮＨ2 末端では３６残基のうち、２１がチャージさ
れている（主として；リジン；グルタミン酸塩及びアス
パラギン酸塩）。サーカムスポロゾイト蛋白と異なりＳ
ＲＥＨＰは、第２のチャージアミノ酸のＣＯＯＨ−末端
を有していない。ＳＲＥＨＰとサーカムスポロゾイト蛋
白との更に類似点は、反覆単位中のアミノ酸に存在す
る。サーカムスポロゾイト蛋白反覆は、８つのアミノ
酸、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｓ
ｐ，Ａｒｇ，及びＧｌｕのレパートリーから由来してい
るようである〔Ｇａｌｉｎｉｓｋｉ等、Ｃｅｌｌ ４
８，３１１−３１９（１９８７）〕これら８アミノ酸の
うち５つ、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，及びＧｌ
ｕが、ＳＲＥＨＰのドデカペプチド反覆を形成する７つ
のアミノ酸に含まれている。
調査しても、ヌクレオチド又はｃ１からの派生アミノ酸
配列のいずれも同一の配列のものは発見されなかった。
さらにｃ１からの派生アミノ酸配列は、Ｔａｎｎｉｃｈ
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６，５１１８−５１２２（１９８９）により最近報告
されたＥ．ヒストリチカｃＤＮＡクローンの部分配列と
は異なっている。タンデム反覆は、別の寄生虫からの抗
原で発見されたが、マラリヤ種の抗原の中で最も顕著で
ある〔Ｋｅｍｐ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．４１，１８１−２０８（１９８７）〕。ＳＲＥＨＰ
の始めの構造モチーフは、マラリア種とりわけサーカム
スポロゾイトの反覆抗原と類似である〔ｋｅｍｐ等、前
述、オザキ等、Ｃｅｌｌ ３４，８１５−８２２（１９
８３）〕。サーカムスポロゾイト蛋白は、マラリア寄生
中のスポロゾイト期の表面を覆う蛋白であり、４０から
６０ｋＤａの大きさに亘り、種特異的パターンの多数の
タンデム反覆を含んでいる。Ｐ．Ｋｎｏｗｌｅｓｉサー
カムスポロゾイト蛋白の予想される構造は、疎水性ＮＨ
2 末端領域；ひきつづき、チャージしたアミノ酸を優勢
に含む２つの領域を側部に持つ、タンデム的に反覆した
アミノ酸のシリーズ、そして疎水性アンカー領域から成
るＣＯＯＨ−末端領域で終っている（図２Ｂ）。Ｐ．Ｋ
ｎｏｗｌｅｓｉサーカムスポロゾイト蛋白のＮＨ2 −末
端疎水性領域において、４８アミノ酸残基のうち２７が
チャージされており（主として、リジン及びグルタミン
酸塩残基、オザキ、前出）、一方、対比する、ＳＲＥＨ
ＰのＮＨ2 末端では３６残基のうち、２１がチャージさ
れている（主として；リジン；グルタミン酸塩及びアス
パラギン酸塩）。サーカムスポロゾイト蛋白と異なりＳ
ＲＥＨＰは、第２のチャージアミノ酸のＣＯＯＨ−末端
を有していない。ＳＲＥＨＰとサーカムスポロゾイト蛋
白との更に類似点は、反覆単位中のアミノ酸に存在す
る。サーカムスポロゾイト蛋白反覆は、８つのアミノ
酸、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ａｓ
ｐ，Ａｒｇ，及びＧｌｕのレパートリーから由来してい
るようである〔Ｇａｌｉｎｉｓｋｉ等、Ｃｅｌｌ ４
８，３１１−３１９（１９８７）〕これら８アミノ酸の
うち５つ、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，及びＧｌ
ｕが、ＳＲＥＨＰのドデカペプチド反覆を形成する７つ
のアミノ酸に含まれている。
【００３４】ｃ１ ｃＤＮＡは自然的免疫原Ｅ．ヒスト
リチカ蛋白をコードする。ｃ１のＯＲＦのどちらがＥ．
ヒストリチカで翻訳されるか知られていなかったので、
ｔｒｐＥ含有ベクターｐＡＴＨ２及びｐＡＴＨ３を用い
てＥ．ｃｏｌｉ中の両方のｃ１のオープンリーディング
フレームを発現させた。適当なリーディングフレーム中
でＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐＥ遺伝子のＮ−末端２／３に融
合したｃ１挿入配列の大部分を含むコンストラクト（ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ）であるｐＯＲＦ１及びｐＯＲＦ２を
発現させた。β−インドールアクリル酸によりｔｒｐＥ
をインデュースして生産するｐＯＲＦ１又はｐＯＲＦ２
を含む細胞から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染
色分離された不溶性ペレットは、分子量およそ６０ｋＤ
ａの融合蛋白が現れた（ＯＲＦ１及びＯＲＦ２によりコ
ードされた融合蛋白の予想分子量は、それぞれ５７ｋＤ
及び５９ｋｄである）。ｃ１のＯＲＦのいずれかが自然
的免疫原Ｅ．ヒストリチカ蛋白を製造するかどうかをは
っきりさせるために、ウエスタンブロッティングを実施
した（図３）。
リチカ蛋白をコードする。ｃ１のＯＲＦのどちらがＥ．
ヒストリチカで翻訳されるか知られていなかったので、
ｔｒｐＥ含有ベクターｐＡＴＨ２及びｐＡＴＨ３を用い
てＥ．ｃｏｌｉ中の両方のｃ１のオープンリーディング
フレームを発現させた。適当なリーディングフレーム中
でＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐＥ遺伝子のＮ−末端２／３に融
合したｃ１挿入配列の大部分を含むコンストラクト（ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ）であるｐＯＲＦ１及びｐＯＲＦ２を
発現させた。β−インドールアクリル酸によりｔｒｐＥ
をインデュースして生産するｐＯＲＦ１又はｐＯＲＦ２
を含む細胞から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染
色分離された不溶性ペレットは、分子量およそ６０ｋＤ
ａの融合蛋白が現れた（ＯＲＦ１及びＯＲＦ２によりコ
ードされた融合蛋白の予想分子量は、それぞれ５７ｋＤ
及び５９ｋｄである）。ｃ１のＯＲＦのいずれかが自然
的免疫原Ｅ．ヒストリチカ蛋白を製造するかどうかをは
っきりさせるために、ウエスタンブロッティングを実施
した（図３）。
【００３５】アメーバ肝膿瘍患者からの免疫血清及びＨ
Ｍ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスにより免疫したラビット
からの血清の両方は、ｐＯＲＦ１によりコードされた融
合蛋白（予想分子量５７ｋＤａ）を発現する細菌中で、
一連のバンド（分子量最高約６０ｋＤａ）ト結合した
（図３Ｂ及びＤ，レーン２）。免疫血清は、ｐＯＲＦ２
によりコードされた融合蛋白とは結合しなかった。コン
トロールのヒト血清及びあらかじめ免疫したラビット血
清は、融合蛋白のいずれにも結合しなかった（図３Ａ及
びＣ）。その後の研究で、侵襲性アメーバ症患者さらに
２５名からの血清も又、ｐＯＲＦ１により作られた融合
蛋白と結合することが分かった。ドデカペプチド反覆Ｓ
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａを含む合
成ペプチドに対する抗血清は、組換え蛋白と結合するこ
とが示されたことによって、免疫血清で認識された組換
え蛋白は、ＯＲＦ１によりコードされたタンデム的に反
覆するペプチドを含んでいることが確認された。
Ｍ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスにより免疫したラビット
からの血清の両方は、ｐＯＲＦ１によりコードされた融
合蛋白（予想分子量５７ｋＤａ）を発現する細菌中で、
一連のバンド（分子量最高約６０ｋＤａ）ト結合した
（図３Ｂ及びＤ，レーン２）。免疫血清は、ｐＯＲＦ２
によりコードされた融合蛋白とは結合しなかった。コン
トロールのヒト血清及びあらかじめ免疫したラビット血
清は、融合蛋白のいずれにも結合しなかった（図３Ａ及
びＣ）。その後の研究で、侵襲性アメーバ症患者さらに
２５名からの血清も又、ｐＯＲＦ１により作られた融合
蛋白と結合することが分かった。ドデカペプチド反覆Ｓ
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａを含む合
成ペプチドに対する抗血清は、組換え蛋白と結合するこ
とが示されたことによって、免疫血清で認識された組換
え蛋白は、ＯＲＦ１によりコードされたタンデム的に反
覆するペプチドを含んでいることが確認された。
【００３６】ＳＲＥＨＰは膜蛋白である ＳＲＥＨＰがＥ．ヒストリチカの膜フラクションに関係
しているかどうかを決定するために、ＨＭ１：ＩＭＳＳ
トロホゾイトを融かし、１００，０００×ｇでスピン
し、上澄み液とペレットフラクションとしてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにロードした。ウエスタンブロットに示すように
（図４）、抗−ＳＲＥＨＰ融合蛋白抗血清は分子量４６
ＫＤａ及び５２ＫＤａで、１００，０００×ｇペレット
フラクションにおいて、２つの明瞭なバンドと特異的に
結合した。１００，０００ｇ上澄み液においては、ほと
んどバンドは検出されず、ネィティブなＳＲＥＨＰが原
始的に結合した膜であることを示唆している。この知見
は、プライマリー構造データと一致している。抗−ＳＲ
ＥＨＰ融合蛋白抗血清は全ラレド溶解物における、いか
なる種とも結合を示さず、これは、ＳＲＥＨＰがＥ．ヒ
ストリチカ−特異的であることを示唆している。
しているかどうかを決定するために、ＨＭ１：ＩＭＳＳ
トロホゾイトを融かし、１００，０００×ｇでスピン
し、上澄み液とペレットフラクションとしてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにロードした。ウエスタンブロットに示すように
（図４）、抗−ＳＲＥＨＰ融合蛋白抗血清は分子量４６
ＫＤａ及び５２ＫＤａで、１００，０００×ｇペレット
フラクションにおいて、２つの明瞭なバンドと特異的に
結合した。１００，０００ｇ上澄み液においては、ほと
んどバンドは検出されず、ネィティブなＳＲＥＨＰが原
始的に結合した膜であることを示唆している。この知見
は、プライマリー構造データと一致している。抗−ＳＲ
ＥＨＰ融合蛋白抗血清は全ラレド溶解物における、いか
なる種とも結合を示さず、これは、ＳＲＥＨＰがＥ．ヒ
ストリチカ−特異的であることを示唆している。
【００３７】今のところ何故組換えＳＲＥＨＰ融合蛋白
に対する抗血清が、Ｅ．ヒストリチカ溶解物中のＳＲＥ
ＨＰ ｃＤＮＡ（２５ＫＤａ）の派生アミノ酸配列から
予想されるもののほぼ２倍の分子量を有する２つの種を
検出するのか不明である。ノーザンブロッティング（図
１）の結合は、ｃ１クローン（７２２ヌクレオチド）の
大きさが、ＳＲＥＨＰトランスクリプト（約８００ヌク
レオチド）の大きさに近く、もし全てでなければ大部分
のコード領域がｃ１クローン中に含まれることを示唆し
ている。従って、大きさの不一致がアミノ酸の追加によ
るものということはありそうもなく、翻訳後の修飾の２
次的なものによるということは、もっとありそうにな
い。ｐＯＲＦ２にコードされた融合蛋白の抗血清は、ウ
エスタンブロットによってＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイ
ト溶解物に結合を示さなかった。従って、この結果は、
ｃ１ ＯＲＦ２によりコードされたＨＭ１：ＩＭＳＳト
ロホゾイト蛋白の存在を示すものではない。ＯＲＦ２
が、病原菌のシストフォーム（ｃｙｓｔ ｆｏｒｍ）に
おいて翻訳される可能性を否定するものではない。
に対する抗血清が、Ｅ．ヒストリチカ溶解物中のＳＲＥ
ＨＰ ｃＤＮＡ（２５ＫＤａ）の派生アミノ酸配列から
予想されるもののほぼ２倍の分子量を有する２つの種を
検出するのか不明である。ノーザンブロッティング（図
１）の結合は、ｃ１クローン（７２２ヌクレオチド）の
大きさが、ＳＲＥＨＰトランスクリプト（約８００ヌク
レオチド）の大きさに近く、もし全てでなければ大部分
のコード領域がｃ１クローン中に含まれることを示唆し
ている。従って、大きさの不一致がアミノ酸の追加によ
るものということはありそうもなく、翻訳後の修飾の２
次的なものによるということは、もっとありそうにな
い。ｐＯＲＦ２にコードされた融合蛋白の抗血清は、ウ
エスタンブロットによってＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイ
ト溶解物に結合を示さなかった。従って、この結果は、
ｃ１ ＯＲＦ２によりコードされたＨＭ１：ＩＭＳＳト
ロホゾイト蛋白の存在を示すものではない。ＯＲＦ２
が、病原菌のシストフォーム（ｃｙｓｔ ｆｏｒｍ）に
おいて翻訳される可能性を否定するものではない。
【００３８】ＳＲＥＨＰ融合蛋白の抗血清は、チャイニ
ーズハムスターオバリー細胞へのＥ．ヒストリチカＨＭ
１：ＩＭＳＳ付着を阻害する Ｅ．ヒストリチカ ＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスのチ
ャイニーズハムスターオバリー細胞パネル（ｐａｎｅ
ｌ）への付着は、これまでに研究され、トロホゾイテス
は、１０２１チャイニーズハムスターオバリーセルライ
ンに最も良く付着することが分かっている〔Ｌｉ等、
Ｊ．Ｅｘｐ．ＭｅＤ．１６７，１７２５−１７３０（１
９８８）〕。放射線標識Ｅ．ヒストリチカＨＭ１：ＩＭ
ＳＳトロホゾイテスの１０２１細胞への結合を阻害する
ＳＲＥＨＰ融合蛋白の抗血清能力を評価した。あらかじ
め免疫した血清を有するＳＲＥＨＰ融合蛋白に対する抗
血清、ｐＯＲＦ２によりコードされた融合蛋白に対する
抗血清及び媒質コントロールを比較した。ＳＲＥＨＰ融
合蛋白に対する抗血清は、１０２１細胞へのＨＭ１：Ｉ
ＭＳＳトロホゾイトの結合をコントロールのレベルの３
０±２％に低下させた（表１）。あらかじめ免疫した血
清でｐＯＲＦ２によりコードされた融合蛋白に対する抗
血清は：阻害効果を示さなかった。この知見は、ＳＲＥ
ＨＰがトロホゾイト細胞表面上に位置し、且つＥ．ヒス
トリチカ付着において役割を演じることができることを
示唆している。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等による、全アメー
バ蛋白に対するポリクローナル抗血清を用いた最近の研
究により、分子量５０ＫＤａの、Ｅ．ヒストリチカ蛋白
が、トロホゾイトと共に培養された赤血球細胞の表面上
に見出された７つのＥ．ヒストリチカ蛋白のうちのひと
つであることが見出されたことは、この面で注目に値す
る〔Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒｉｓｔｏｔ．３７，８７−１００（１９８
９）〕。
ーズハムスターオバリー細胞へのＥ．ヒストリチカＨＭ
１：ＩＭＳＳ付着を阻害する Ｅ．ヒストリチカ ＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスのチ
ャイニーズハムスターオバリー細胞パネル（ｐａｎｅ
ｌ）への付着は、これまでに研究され、トロホゾイテス
は、１０２１チャイニーズハムスターオバリーセルライ
ンに最も良く付着することが分かっている〔Ｌｉ等、
Ｊ．Ｅｘｐ．ＭｅＤ．１６７，１７２５−１７３０（１
９８８）〕。放射線標識Ｅ．ヒストリチカＨＭ１：ＩＭ
ＳＳトロホゾイテスの１０２１細胞への結合を阻害する
ＳＲＥＨＰ融合蛋白の抗血清能力を評価した。あらかじ
め免疫した血清を有するＳＲＥＨＰ融合蛋白に対する抗
血清、ｐＯＲＦ２によりコードされた融合蛋白に対する
抗血清及び媒質コントロールを比較した。ＳＲＥＨＰ融
合蛋白に対する抗血清は、１０２１細胞へのＨＭ１：Ｉ
ＭＳＳトロホゾイトの結合をコントロールのレベルの３
０±２％に低下させた（表１）。あらかじめ免疫した血
清でｐＯＲＦ２によりコードされた融合蛋白に対する抗
血清は：阻害効果を示さなかった。この知見は、ＳＲＥ
ＨＰがトロホゾイト細胞表面上に位置し、且つＥ．ヒス
トリチカ付着において役割を演じることができることを
示唆している。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等による、全アメー
バ蛋白に対するポリクローナル抗血清を用いた最近の研
究により、分子量５０ＫＤａの、Ｅ．ヒストリチカ蛋白
が、トロホゾイトと共に培養された赤血球細胞の表面上
に見出された７つのＥ．ヒストリチカ蛋白のうちのひと
つであることが見出されたことは、この面で注目に値す
る〔Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐａｒｉｓｔｏｔ．３７，８７−１００（１９８
９）〕。
【表１】組換えＳＲＥＨＰ融合蛋白に対する抗血清は、
１０２１チャイニーズハムスターオバリーセルラインへ
のＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスの結合を阻害する。 ──────────────────────────────── 血 清 １０２１細胞への結合 コントロールの％ ──────────────────────────────── あらかじめ免疫 ９４±２５ 抗−ＳＲＥＨＰ融合蛋白 ３０±２ 抗−ＯＲＦ２融合蛋白 １２０±２５ ───────────────────────────────
１０２１チャイニーズハムスターオバリーセルラインへ
のＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスの結合を阻害する。 ──────────────────────────────── 血 清 １０２１細胞への結合 コントロールの％ ──────────────────────────────── あらかじめ免疫 ９４±２５ 抗−ＳＲＥＨＰ融合蛋白 ３０±２ 抗−ＯＲＦ２融合蛋白 １２０±２５ ───────────────────────────────
【００３９】結果は、３試験の平均であり、媒体コント
ロール群に観察されるトロホゾイテス付着の％±標準偏
差で示す。
ロール群に観察されるトロホゾイテス付着の％±標準偏
差で示す。
【００４０】実施例２ 本実施例は、侵襲性アメーバ症の血清学的試験における
標的抗原としてのＳＲＥＨＰの使用を説明する。
標的抗原としてのＳＲＥＨＰの使用を説明する。
【００４１】はじめに 侵襲性アメーバ症の血清学的診断は、問題が残ってい
る。間接ヘマグルチニンテスト（ＩＨＡ）は、侵襲性ア
メーバ症の検出には感度は良いが、セロポジティビティ
（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）が、感染後何年間も
持続してしまう〔Ｋｒｕｐｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．１９，５７−６２（１９７０）；Ｌｏｂ
ｅｌ及びＫａｇｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．
３２，３２９−４７（１９７８）〕。寒天ゲル拡散（Ａ
ＧＤ）及び向流免疫電気泳動（ＣＩＥ）は急性疾患をよ
り良好に検出するが、セロポジティビティーが、感染後
６ケ月以上も持続してしまう〔Ｌｏｂｅｌ及びＫａｇｅ
ｎ，前出；Ｋｒｕｐｐ及びＰｏｗｅｌｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｔ
ｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２０，４２１−２４（１９７
１）；Ｊｕｎｉｐｅｒ等、Ｉｂｉｄ．２１，１５７−６
８（１９７２）；Ｊａｃｋｓｏｎｓ等、Ｔｒａｎｓ．Ｒ
ｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．７８，３４
２−４５（１９８４）〕。これらのことがらが分かった
ため、侵襲性アメーバ症の流行地域では、６から２０％
の健康な被験者が、ポジティブセロロジー、おそらく感
染性Ｅ．ヒストリチカの最初の感染の２次的なものであ
るということは驚くべきことではない〔Ｌｏｂｅｌ及び
Ｋａｇｅｎ，前出；Ｊａｃｋｓｏｎ等、Ｌａｎｃｅｔ
１９８５；ｉ：７１６−７１９〕。風土病地域における
セロポジティビィティーの基礎レベルのこの高さは、急
性侵襲性アメーバ症の診断に際し、血清学の有用性を制
限する。
る。間接ヘマグルチニンテスト（ＩＨＡ）は、侵襲性ア
メーバ症の検出には感度は良いが、セロポジティビティ
（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）が、感染後何年間も
持続してしまう〔Ｋｒｕｐｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．１９，５７−６２（１９７０）；Ｌｏｂ
ｅｌ及びＫａｇｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．
３２，３２９−４７（１９７８）〕。寒天ゲル拡散（Ａ
ＧＤ）及び向流免疫電気泳動（ＣＩＥ）は急性疾患をよ
り良好に検出するが、セロポジティビティーが、感染後
６ケ月以上も持続してしまう〔Ｌｏｂｅｌ及びＫａｇｅ
ｎ，前出；Ｋｒｕｐｐ及びＰｏｗｅｌｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｔ
ｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２０，４２１−２４（１９７
１）；Ｊｕｎｉｐｅｒ等、Ｉｂｉｄ．２１，１５７−６
８（１９７２）；Ｊａｃｋｓｏｎｓ等、Ｔｒａｎｓ．Ｒ
ｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．７８，３４
２−４５（１９８４）〕。これらのことがらが分かった
ため、侵襲性アメーバ症の流行地域では、６から２０％
の健康な被験者が、ポジティブセロロジー、おそらく感
染性Ｅ．ヒストリチカの最初の感染の２次的なものであ
るということは驚くべきことではない〔Ｌｏｂｅｌ及び
Ｋａｇｅｎ，前出；Ｊａｃｋｓｏｎ等、Ｌａｎｃｅｔ
１９８５；ｉ：７１６−７１９〕。風土病地域における
セロポジティビィティーの基礎レベルのこの高さは、急
性侵襲性アメーバ症の診断に際し、血清学の有用性を制
限する。
【００４２】ＳＲＥＨＰはＥ．ヒストリチカにのみ存在
するように見え、そしてマラリアのサーカムスポロゾイ
テ蛋白に類似して、多数のタンデム反覆から成る構造を
有している。上記実施例１において、侵襲性アメーバ症
の患者からの血清は、ＳＲＥＨＰ遺伝子によってコード
された多数のタンデム反覆を含む組換え融合蛋白と結合
することを説明した。この実施例２は、更に、ＳＲＥＨ
Ｐへの血清学的反応を分析する。目的物を２つの異なる
風土病地域において、アメーバ肝膿瘍の患者の間でＳＲ
ＥＨＰに対する抗体の事前価（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）
を調べ、組換えＳＲＥＨＰ融合蛋白が侵襲性アメーバ症
の診断用の血清学的テストに有用であるかどうかを調べ
た。この実施例２は、ＳＲＥＨＰに対する抗体の存在が
急性侵襲性アメーバ症の存在と高い相関関係を有してい
ることを述べる。
するように見え、そしてマラリアのサーカムスポロゾイ
テ蛋白に類似して、多数のタンデム反覆から成る構造を
有している。上記実施例１において、侵襲性アメーバ症
の患者からの血清は、ＳＲＥＨＰ遺伝子によってコード
された多数のタンデム反覆を含む組換え融合蛋白と結合
することを説明した。この実施例２は、更に、ＳＲＥＨ
Ｐへの血清学的反応を分析する。目的物を２つの異なる
風土病地域において、アメーバ肝膿瘍の患者の間でＳＲ
ＥＨＰに対する抗体の事前価（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）
を調べ、組換えＳＲＥＨＰ融合蛋白が侵襲性アメーバ症
の診断用の血清学的テストに有用であるかどうかを調べ
た。この実施例２は、ＳＲＥＨＰに対する抗体の存在が
急性侵襲性アメーバ症の存在と高い相関関係を有してい
ることを述べる。
【００４３】材料及び方法 ＳＲＥＨＰ融合蛋白の製造 ｐＡＴＨ３プラスミドベクターを使用して実施例１で述
べた６０ｋＤａｔｒｐＥ融合蛋白として、Ｅ．ｃｏｌｉ
中でＳＲＥＨＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド１２８から７
２２まで（多数のタンデム反覆を含んでいる）を発現さ
せた。Ｅ．ヒストリチカトロホゾイテスでは発現しない
と思われるＳＲＥＨＰ ｃＤＮＡの第２の、より小さな
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）をｐＡＴＨ
２中で発現され、そして、ウエスタンブロッティング用
コントロール融合蛋白として役立てた。この融合蛋白は
実施例１で述べたようにｔｒｐＥを製造するようにイン
デュースされた細菌から部分精製した。
べた６０ｋＤａｔｒｐＥ融合蛋白として、Ｅ．ｃｏｌｉ
中でＳＲＥＨＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド１２８から７
２２まで（多数のタンデム反覆を含んでいる）を発現さ
せた。Ｅ．ヒストリチカトロホゾイテスでは発現しない
と思われるＳＲＥＨＰ ｃＤＮＡの第２の、より小さな
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）をｐＡＴＨ
２中で発現され、そして、ウエスタンブロッティング用
コントロール融合蛋白として役立てた。この融合蛋白は
実施例１で述べたようにｔｒｐＥを製造するようにイン
デュースされた細菌から部分精製した。
【００４４】ウエスタンブロッティング ウエスタンブロッティングのため、融合蛋白を発現する
細菌からの不溶性蛋白フラクションを還元条件下、１０
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後実施例１で述
べたようにニトロセルロースに移した。ブロットをヒト
血清サンプルと反応させ、１：５００稀釈でテストし、
そしてイムノグロブリン結合を 125Ｉ標識スタフィロコ
ッカル蛋白−Ａを用いて検出した。ブロットを１２時間
オートラジオグラフした。ブロットを４人の観察者によ
って独立して読みとった（ＳＬＳ，ＣＫＪ，ＡＢ及びＥ
Ｌ）。ポジティブブロット用の基準は、ＳＲＥＨＰ組換
え融合蛋白への結合であり、そしてコントロールＯＲＦ
２融合蛋白への最小か又はゼロの結合である。
細菌からの不溶性蛋白フラクションを還元条件下、１０
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後実施例１で述
べたようにニトロセルロースに移した。ブロットをヒト
血清サンプルと反応させ、１：５００稀釈でテストし、
そしてイムノグロブリン結合を 125Ｉ標識スタフィロコ
ッカル蛋白−Ａを用いて検出した。ブロットを１２時間
オートラジオグラフした。ブロットを４人の観察者によ
って独立して読みとった（ＳＬＳ，ＣＫＪ，ＡＢ及びＥ
Ｌ）。ポジティブブロット用の基準は、ＳＲＥＨＰ組換
え融合蛋白への結合であり、そしてコントロールＯＲＦ
２融合蛋白への最小か又はゼロの結合である。
【００４５】ポプレーション研究 ポプュレーション研究は、以下の表２に概要を示す。メ
キシコシティーからの３３の血清サンプルを、臨床プレ
ゼンテーション及びポジティブ血清学に基づくアメーバ
肝濃瘍の診断をされた患者３３名から得た。サンジエゴ
で見た患者から１４のサンプルを得、この４つは腸侵襲
性アメーバ症で（大腸炎３、アメーバ腫１）、９つはア
メーバ性肝濃瘍（１人の患者が各エピソードから与えら
れた血清サンプルを持つ２つの別々のアメーバ性肝濃瘍
のエピソードを有していた）で、全てポジティブのセロ
ロジーを有していた。ダーバンの３６患者から３６血清
を得たが、このサンプル群はダーバンで特異的に選択さ
れ且つアメーバ性肝濃瘍の患者（１７）からの血清及び
他の病気の患者（１９）からの血清で、これらのいくつ
かはポジティブなＡＧＤセロロジーを有するものを含ん
でいた。サンプルをコードするか、又はブロットの知識
を持たない観察者によって読みとった。メキシコでアメ
ーバ性肝濃瘍に接触したセントルイスの患者からの２血
清、即ち急性及び１ｙｒ回復期の血清を調べ、セントル
イスの健常人からの５つの血清をネガティブコントロー
ルとして含めた。
キシコシティーからの３３の血清サンプルを、臨床プレ
ゼンテーション及びポジティブ血清学に基づくアメーバ
肝濃瘍の診断をされた患者３３名から得た。サンジエゴ
で見た患者から１４のサンプルを得、この４つは腸侵襲
性アメーバ症で（大腸炎３、アメーバ腫１）、９つはア
メーバ性肝濃瘍（１人の患者が各エピソードから与えら
れた血清サンプルを持つ２つの別々のアメーバ性肝濃瘍
のエピソードを有していた）で、全てポジティブのセロ
ロジーを有していた。ダーバンの３６患者から３６血清
を得たが、このサンプル群はダーバンで特異的に選択さ
れ且つアメーバ性肝濃瘍の患者（１７）からの血清及び
他の病気の患者（１９）からの血清で、これらのいくつ
かはポジティブなＡＧＤセロロジーを有するものを含ん
でいた。サンプルをコードするか、又はブロットの知識
を持たない観察者によって読みとった。メキシコでアメ
ーバ性肝濃瘍に接触したセントルイスの患者からの２血
清、即ち急性及び１ｙｒ回復期の血清を調べ、セントル
イスの健常人からの５つの血清をネガティブコントロー
ルとして含めた。
【００４６】結果 ８８人の患者からのトータル９０血清について、ＳＲＥ
ＨＰの抗体の存在を調べた。アメーバ性肝濃瘍の診断さ
れた患者６１人のうちで、４８人又は７９％がＳＲＥＨ
Ｐ融合蛋白に対する抗体を持っていた（表３）。セロポ
ジティビティーはダーバン（１１／１７，６５％）又は
サンジエゴ（７／１０，７０％）よりも、メキシコのサ
ンプル（３０／３３，９１％）の方が高かった。２つの
顕著なアメーバ性肝濃瘍のエピソードのあるサンディエ
ゴの１人の患者は、２番目のアメーバ性肝濃瘍の後で取
ったサンプルでは、セロポジティブであったが、第１の
エピソードの後で取ったサンプルではセロネガティブで
あった。セントルイスの１人の患者は、アメーバ性肝濃
瘍の発現期（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に抗−ＳＲＥ
ＨＰ抗体を持っていたが、１年後には抗体がなくなって
いた。腸アメーバ症の４患者だけを調べ、この４人全て
が抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持っていた。セントルイスの健
常人コントロールは、いずれも抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持
っていなかった。流行の激しい地域において、ＡＧＤを
有するＳＲＥＨＰ融合蛋白を用いたウエスタンブロッテ
ィングの感度及び特異性を比較するために、ダーバンの
３６患者の血清を別個に分析した（表４）。アメーバ性
肝濃瘍でＡＧＤポジティブの患者１７名のうちで、１１
名又は６５％は、抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持っていた。Ａ
ＧＤポジティブの９患者は急性アメーバ疾患を有してい
なかった。これらの患者のうち１人だけが、ＳＲＥＨＰ
の抗体を持っていた。
ＨＰの抗体の存在を調べた。アメーバ性肝濃瘍の診断さ
れた患者６１人のうちで、４８人又は７９％がＳＲＥＨ
Ｐ融合蛋白に対する抗体を持っていた（表３）。セロポ
ジティビティーはダーバン（１１／１７，６５％）又は
サンジエゴ（７／１０，７０％）よりも、メキシコのサ
ンプル（３０／３３，９１％）の方が高かった。２つの
顕著なアメーバ性肝濃瘍のエピソードのあるサンディエ
ゴの１人の患者は、２番目のアメーバ性肝濃瘍の後で取
ったサンプルでは、セロポジティブであったが、第１の
エピソードの後で取ったサンプルではセロネガティブで
あった。セントルイスの１人の患者は、アメーバ性肝濃
瘍の発現期（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に抗−ＳＲＥ
ＨＰ抗体を持っていたが、１年後には抗体がなくなって
いた。腸アメーバ症の４患者だけを調べ、この４人全て
が抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持っていた。セントルイスの健
常人コントロールは、いずれも抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持
っていなかった。流行の激しい地域において、ＡＧＤを
有するＳＲＥＨＰ融合蛋白を用いたウエスタンブロッテ
ィングの感度及び特異性を比較するために、ダーバンの
３６患者の血清を別個に分析した（表４）。アメーバ性
肝濃瘍でＡＧＤポジティブの患者１７名のうちで、１１
名又は６５％は、抗−ＳＲＥＨＰ抗体を持っていた。Ａ
ＧＤポジティブの９患者は急性アメーバ疾患を有してい
なかった。これらの患者のうち１人だけが、ＳＲＥＨＰ
の抗体を持っていた。
【００４７】この実施例から３つの知見が判明した。第
１は、ＳＲＥＨＰの抗体は、、アメーバ性肝膿瘍の診断
の患者の大部分で見出されるという発見である。これ
は、ザイモデム（ｚｙｍｏｄｅｍ）分布の異なる２つの
流行地域、メキシコ市、及びダーバンの患者での事実と
合っていた〔Ｇａｔｈｉｒａｍ及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｌ
ａｎｃｅｔ １９８５；７１９−７２１〕。これは、Ｓ
ＲＥＨＰがＥ．ヒストリチカ病原株のもし全てでなけれ
ば、大部分に見出されることを示唆しており、実施例１
の無菌株のノーザンブロット研究の限られたデータとも
一致している。肝膿瘍患者の２１％の抗−ＳＲＥＨＰ抗
体を検出することの不可能は、それら個人がＳＲＥＨＰ
抗体を作ることができなかったこと、アッシーの感度上
の問題、或いは、ＳＲＥＨＰ血清学的反応の進展上のタ
イミングの差異を表わしているかもしれない。しかしな
がら、抗原的に類似の分子を持つＥ．ヒストリチカの株
が存在するかもしれないという可能性を否定することは
できない。
１は、ＳＲＥＨＰの抗体は、、アメーバ性肝膿瘍の診断
の患者の大部分で見出されるという発見である。これ
は、ザイモデム（ｚｙｍｏｄｅｍ）分布の異なる２つの
流行地域、メキシコ市、及びダーバンの患者での事実と
合っていた〔Ｇａｔｈｉｒａｍ及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｌ
ａｎｃｅｔ １９８５；７１９−７２１〕。これは、Ｓ
ＲＥＨＰがＥ．ヒストリチカ病原株のもし全てでなけれ
ば、大部分に見出されることを示唆しており、実施例１
の無菌株のノーザンブロット研究の限られたデータとも
一致している。肝膿瘍患者の２１％の抗−ＳＲＥＨＰ抗
体を検出することの不可能は、それら個人がＳＲＥＨＰ
抗体を作ることができなかったこと、アッシーの感度上
の問題、或いは、ＳＲＥＨＰ血清学的反応の進展上のタ
イミングの差異を表わしているかもしれない。しかしな
がら、抗原的に類似の分子を持つＥ．ヒストリチカの株
が存在するかもしれないという可能性を否定することは
できない。
【００４８】第２の知見は、組換えＥ．ヒストリチカ抗
原は侵襲性アメーバ症のテストに使用することができる
ということである。組換え融合蛋白の使用は、多くのア
ッシーで用いられるアメーバ溶解物の粗調製物以上に特
定の抗原でテストする利点を提供し、アメーバ症のアッ
シーの標準を備えることができる。更に、Ｅ．ヒストリ
チカ・トロホゾイテスの原料の必要なしに大量に作られ
た、組換え融合蛋白は、大量使用の抗原を製造するコス
ト上効率の良い方法でありうる。このことは保健サービ
スの資源が限られているアメーバ症流行地域において重
要な考慮である。
原は侵襲性アメーバ症のテストに使用することができる
ということである。組換え融合蛋白の使用は、多くのア
ッシーで用いられるアメーバ溶解物の粗調製物以上に特
定の抗原でテストする利点を提供し、アメーバ症のアッ
シーの標準を備えることができる。更に、Ｅ．ヒストリ
チカ・トロホゾイテスの原料の必要なしに大量に作られ
た、組換え融合蛋白は、大量使用の抗原を製造するコス
ト上効率の良い方法でありうる。このことは保健サービ
スの資源が限られているアメーバ症流行地域において重
要な考慮である。
【００４９】最も注目に値する知見は、ＳＲＥＨＰの抗
体の存在と急性アメーバ症との間の関係である。アメー
バ肝膿瘍患者のダーバンポプュレーションのより少ない
感度（６５％）がはっきりしている一方（患者すべてが
ＡＧＤポジティブ）、ＳＲＥＨＰの抗体の検出は、急性
アメーバ疾患の更により特異的なインジケータであっ
た。急性侵襲性アメーバ症を持たない病人患者１９名の
うち、たった１名が、ＳＲＥＨＰテストで“偽ポジティ
ブ”（５％）であった。これに対して、ＡＧＤでは９人
が“偽ポジティブ”（４７％）（かなり真のポジティ
ブ、以前に病原性Ｅ．ヒストリチカ株に感染したことを
示す）であった。この差異は、マルチプル抗原ＡＧＤテ
ストに対して、ＳＲＥＨＰを用いる単一抗原テストの減
少した感度を反映しているかもしれない。
体の存在と急性アメーバ症との間の関係である。アメー
バ肝膿瘍患者のダーバンポプュレーションのより少ない
感度（６５％）がはっきりしている一方（患者すべてが
ＡＧＤポジティブ）、ＳＲＥＨＰの抗体の検出は、急性
アメーバ疾患の更により特異的なインジケータであっ
た。急性侵襲性アメーバ症を持たない病人患者１９名の
うち、たった１名が、ＳＲＥＨＰテストで“偽ポジティ
ブ”（５％）であった。これに対して、ＡＧＤでは９人
が“偽ポジティブ”（４７％）（かなり真のポジティ
ブ、以前に病原性Ｅ．ヒストリチカ株に感染したことを
示す）であった。この差異は、マルチプル抗原ＡＧＤテ
ストに対して、ＳＲＥＨＰを用いる単一抗原テストの減
少した感度を反映しているかもしれない。
【００５０】ポジティブＩＨＡセロロジー患者のモノク
ローナル抗体精製Ｅ．ヒストリチカ抗原の血清学的反応
を測定する最近の研究でも、単一抗原テストの感度減少
及び特異性増加を示している〔Ｔｏｒｉａｎ等、Ｊ．Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５９，７９４−９７（１９８
９）〕。アメーバ性肝膿瘍患者の長期研究が、患者のど
の部分がＳＲＥＨＰセロポジティビィティーを進展させ
るのか及び、ＳＲＥＨＰセロポジティビィティーがＡＧ
Ｄ、ＣＩＥ，又はＩＨＡテストにより検出されるものよ
りもより短命であるか否かを決定するのに必要であろ
う。
ローナル抗体精製Ｅ．ヒストリチカ抗原の血清学的反応
を測定する最近の研究でも、単一抗原テストの感度減少
及び特異性増加を示している〔Ｔｏｒｉａｎ等、Ｊ．Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５９，７９４−９７（１９８
９）〕。アメーバ性肝膿瘍患者の長期研究が、患者のど
の部分がＳＲＥＨＰセロポジティビィティーを進展させ
るのか及び、ＳＲＥＨＰセロポジティビィティーがＡＧ
Ｄ、ＣＩＥ，又はＩＨＡテストにより検出されるものよ
りもより短命であるか否かを決定するのに必要であろ
う。
【表２】
【表３】
【表４】
【００５１】本明細書の開示の後では、本発明の精神及
び範囲を離れることなく、種々の他の実施例が当業者に
とって明白であろう。それらの他の実施例は、本発明の
特許請求の範囲内に含まれるべきである。
び範囲を離れることなく、種々の他の実施例が当業者に
とって明白であろう。それらの他の実施例は、本発明の
特許請求の範囲内に含まれるべきである。
【図１】本発明のｃ１クローンとプローブしたアメーバ
ＲＮＡのノーザンブロットを示す。 レーン１，分子量スタンダード； レーン２，ＨＭ１：ＩＭＳＳ； レーン３，ＨＫ９； レーン４，Ｎ１Ｈ：２００； レーン５，ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）； レーン６，ラレド（Ｌａｒｅｄｏ）； レーン７，Ｅ．インバデンス（Ｅ．ｉｎｖａｄｅｎ
ｓ）； レーン８，Ｅ．モスコフスキイ（Ｅ．ｍｏｓｈｋｏｖｓ
ｋｉｉ）； レーン９，分子量スタンダード．
ＲＮＡのノーザンブロットを示す。 レーン１，分子量スタンダード； レーン２，ＨＭ１：ＩＭＳＳ； レーン３，ＨＫ９； レーン４，Ｎ１Ｈ：２００； レーン５，ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）； レーン６，ラレド（Ｌａｒｅｄｏ）； レーン７，Ｅ．インバデンス（Ｅ．ｉｎｖａｄｅｎ
ｓ）； レーン８，Ｅ．モスコフスキイ（Ｅ．ｍｏｓｈｋｏｖｓ
ｋｉｉ）； レーン９，分子量スタンダード．
【図２】Ａ．は、ｃ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド及び派
生アミノ酸配列を示す。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２両方の派
生アミノ酸配列を示す。２つのＯＲＦのドデカペプチド
及びオクタペプチド反覆をボックスで示す。 Ｂ．は、本発明のＳＲＥＨＰの全体構造を、オザキ等Ｃ
ｅｌｌ３４、８１５−８２２（１９８３）の報告による
プラスモジウム ノウレジイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）のサーカムスポロゾイテ蛋白（ＣＳ
Ｐ）と比較して示す。Ｐ．ノウレジ ・ドデカペプチド反覆は、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａから成る。
生アミノ酸配列を示す。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２両方の派
生アミノ酸配列を示す。２つのＯＲＦのドデカペプチド
及びオクタペプチド反覆をボックスで示す。 Ｂ．は、本発明のＳＲＥＨＰの全体構造を、オザキ等Ｃ
ｅｌｌ３４、８１５−８２２（１９８３）の報告による
プラスモジウム ノウレジイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｋｎｏｗｌｅｓｉ）のサーカムスポロゾイテ蛋白（ＣＳ
Ｐ）と比較して示す。Ｐ．ノウレジ ・ドデカペプチド反覆は、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａから成る。
【図３】本明細書中の材料及び方法で実施した、 パネルＡ，正常ヒト血清、 〃 Ｂ，アメーバ性肝膿瘍患者の免疫血清、 〃 Ｃ，あらかじめ免疫したラビット血清、及び 〃 Ｄ，ＨＭ１：ＩＭＳＳトロホゾイテスに免疫したラ
ビットの血清と、ｔｒｐＥ融合蛋白のウエスタンブロッ
ティング。ｔｒｐＥ融合蛋白を含む不溶蛋白フラクショ
ンは、材料及び方法で述べた方法に従って、 レーン１，ｐＯＲＦ２（Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｌｙｏ反覆をコードする）； レーン２，ｐＯＲＦ１（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ反覆を含むＳＲＥＨＰの部分をコー
ド）； レーン３，ｐＡＴＨ２ベクターのみ レーン４，ｐＡＴＨ３、ベクターのみ レーン５，プラスミドなし ＫＤａでの分子量標準は各パネルの左側に示した。
ビットの血清と、ｔｒｐＥ融合蛋白のウエスタンブロッ
ティング。ｔｒｐＥ融合蛋白を含む不溶蛋白フラクショ
ンは、材料及び方法で述べた方法に従って、 レーン１，ｐＯＲＦ２（Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｌｙｏ反覆をコードする）； レーン２，ｐＯＲＦ１（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ反覆を含むＳＲＥＨＰの部分をコー
ド）； レーン３，ｐＡＴＨ２ベクターのみ レーン４，ｐＡＴＨ３、ベクターのみ レーン５，プラスミドなし ＫＤａでの分子量標準は各パネルの左側に示した。
【図４】ＳＲＥＨＰ融合蛋白に対する抗血清を用いて、
ネーティブＨＭ１：ＩＭＳＳＳＲＥＨＰの同定及びＨＭ
１：ＩＭＳＳトロホゾイテ溶解物及び全ラレド溶解物の
１００，０００×ｇ遠心分離からの上澄み液（Ｓ）及び
ぺレット（Ｐ）のウエスタンブロット分析を示す。ＫＤ
ａでの分子量標準は、右側に示す。
ネーティブＨＭ１：ＩＭＳＳＳＲＥＨＰの同定及びＨＭ
１：ＩＭＳＳトロホゾイテ溶解物及び全ラレド溶解物の
１００，０００×ｇ遠心分離からの上澄み液（Ｓ）及び
ぺレット（Ｐ）のウエスタンブロット分析を示す。ＫＤ
ａでの分子量標準は、右側に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列： 【式１】 を有する免疫原蛋白。
- 【請求項２】 式のヌクレオチド配列： 【式２】 を有する請求項１の蛋白をコードするｃＤＮＡ。
- 【請求項３】Ｅ．ｃｏｌｉの ｔｒｐＥ遺伝子のＮ末端
２／３に融合した少くともＳｅｒ８２からＡｌａ１９３
までのタンデム反覆を含む請求項１の蛋白又はそのフラ
グメントを含む融合蛋白。 - 【請求項４】試験ホストの血清の水性稀釈サンプルを請
求項１の蛋白又は請求項３の融合蛋白と処理し、その免
疫学的反応生成物をアッシーし、そして標準コントロー
ルと比較することからなるアメーバ症を検出する血清学
的方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US516388 | 1990-04-30 | ||
| US07/516,388 US5130417A (en) | 1990-04-30 | 1990-04-30 | Entamoeba histolytical immunogenic protein and cdna clone |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184369A true JPH05184369A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=24055358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3096760A Pending JPH05184369A (ja) | 1990-04-30 | 1991-04-26 | 免疫原蛋白及びｃＤＮＡクローン |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130417A (ja) |
| EP (1) | EP0455620B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05184369A (ja) |
| AT (1) | ATE126273T1 (ja) |
| CA (1) | CA2041395A1 (ja) |
| DE (1) | DE69111880T2 (ja) |
| DK (1) | DK0455620T3 (ja) |
| ES (1) | ES2077837T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017826T3 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5422427A (en) * | 1991-09-17 | 1995-06-06 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Health And Human Services | Pneumococcal fimbrial protein A |
| US6312944B1 (en) | 1991-11-14 | 2001-11-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pneumococcal fimbrial protein A |
| US5854416A (en) | 1991-11-14 | 1998-12-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Streptococcus pneumoniae 37-KDA surface adhesin a protein and nucleic acids coding therefor |
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