CN106918636A

CN106918636A - 蛋白质组的鉴定方法及其应用

Info

Publication number: CN106918636A
Application number: CN201510993915.1A
Authority: CN
Inventors: 曲乐庆; 荣立伟; 田丽宏
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2017-07-04

Abstract

本发明公开了蛋白质组的鉴定方法及其应用。本发明所提供的蛋白质组的鉴定方法，包括：1)提取生物的总蛋白，用蛋白裂解液溶解所述总蛋白，得到蛋白溶液；2)将蛋白溶液中的蛋白依次进行还原、烷基化，得到还原烷基化产物；3)用蛋白酶酶解还原烷基化产物中的蛋白质，得到酶解产物；4)用iTRAQ试剂标记酶解产物中的蛋白质，得到标记产物；5)利用UPLC-Q-TOF-MS对标记产物进行预分级，并分成不同小组样品；用MALDI-TOF-TOF-MS对各小组样品进行初步鉴定，将吸收峰无遮盖的小组合并，得到不同的大组样品；6)用NanoLC-Q-TOF-MS对不同的大组样品进行蛋白质组鉴定，得到蛋白质组鉴定的数据。

Description

蛋白质组的鉴定方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中蛋白质组的鉴定方法及其应用。

背景技术

蛋白质是基因表达的产物，也是基因功能的主要执行者和体现者，蛋白质的研究对揭示基因的功能及生命现象的本质有着重要意义。蛋白质组学是在基因组学的研究和高通量的蛋白质分析技术取得突破的背景下产生的新兴学科，能够对细胞和组织内蛋白质的结构、修饰、作用和表达等进行大规模、全方位的研究，从而阐明其生物学功能。目前，蛋白质组学技术包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标签技术、同位素标记蛋白质定量技术在内的多种蛋白质分离鉴定技术。

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是美国应用生物系统公司于2004年开发的一种新型功能强大的蛋白质组学定量研究技术(Ross et al.2004)，可以对4种或8种蛋白样品进行同步比较的相对定量分析，具有定量效果好和重复性高的特性。作为最新发展起来的蛋白组学技术，iTRAQ在通量分析能力、蛋白质信息量的获取能力、获取信息的准确性和便捷性等方面，有着既往定量技术所无法比拟的优势。

iTRAQ试剂盒中包括4种或8种同重的胺活性试剂。iTRAQ试剂(Ross et al.2004)包括三个部分：报告基团、肽反应基团、平衡基团。报告基团目前共开发出8种：113～121(无120)，可标记4种或8种实验样品；肽反应基团能与肽段的N端及赖氨酸侧链的氨基而标记肽段；平衡基团保证了标记后的肽段具有相同的质核比。

iTRAQ的操作程序通常如下：首先将适当方法提取出的蛋白质还原、烷基化和酶解为肽段，然后用iTRAQ试剂对不同蛋白样品进行标记；再将这些标记后的样品混合，根据不同的样品选择合适的质谱仪进行鉴定。质谱鉴定后肽段采用Protein Pilot等软件进行鉴定。

iTRAQ的实验过程非常简单，标记效率高，重复性好，可用于蛋白组定量的自动化分析。iTRAQ的另一大优势是：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量或低分子量的蛋白质、酸性蛋白质和碱性蛋白质。

小麦是我国和世界上最重要的粮食作物之一，开展小麦蛋白组学研究，可以从分子水平上更加全面地了解小麦自身品质品性、抗病虫害机理以及抵御外界不良环境机制等。小麦种子总蛋白由四部分组成：水溶性清蛋白类、盐溶性球蛋白类、醇溶性麦醇溶蛋白类和酸碱溶性麦谷蛋白类。其中麦醇溶蛋白类及麦谷蛋白类约占小麦种子总蛋白的80％，而清蛋白和球蛋白仅占胚乳总蛋白的20％。在小麦种子全蛋白的研究中，高丰度的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白的存在会对清蛋白和球蛋白的鉴定造成一定的影响。在iTRAQ的纳升级质谱鉴定时，高丰度的麦谷蛋白会遮盖低丰度清蛋白和球蛋白的质谱信号，从而降低了iTRAQ的鉴定数目。另外，由于小麦全基因组的序列未完全测序，数据库中的小麦蛋白条目远少于拟南芥、水稻等物种的蛋白数目，这也为小麦蛋白质的质谱鉴定增加了难度。

目前，使用iTRAQ技术鉴定小麦种子蛋白质组的报道较少，Ma等(2014)首次使用iTRAQ串联LC-MS/MS技术分析了小麦种子发育过程中的蛋白质表达图谱，他们共鉴定到了1146个蛋白质，该蛋白质数目远低于基因组预测蛋白数量，因此改良小麦种子蛋白组分的提取方法，提高iTRAQ质谱鉴定蛋白的数目，对于小麦种子蛋白质组的研究具有重要意义和实质性推动作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定含有高丰度蛋白质的生物或其器官和/或组织的蛋白质组，尤其是如何鉴定小麦种子蛋白质组。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质组鉴定方法。

本发明所提供的蛋白质组鉴定方法，包括1)-6)：

1)提取待鉴定生物的总蛋白，用蛋白裂解液溶解所述总蛋白，得到蛋白溶液；

2)将所述蛋白溶液中的蛋白依次进行还原、烷基化，得到还原烷基化产物；

3)用蛋白酶酶解所述还原烷基化产物中的蛋白质，得到酶解产物；

4)用iTRAQ试剂标记所述酶解产物中的蛋白质，得到标记产物；

5)对所述标记产物进行液相色谱分离，收集洗脱出的液体，将单位时间内洗脱出的液体作为一个液体组，得到多个液体组；对所述多个液体组分别进行质谱鉴定，将吸收峰无遮盖的液体组进行合并，得到不同的大组样品，使同一大组样品达到a)和/或b)的目的：a)同一大组样品的不同吸收峰能够相互区分，b)同一大组样品的吸收峰的相对强度不会过高或过低，确保相对强度低的吸收峰不会被误认为噪音而被舍弃；

6)用液相色谱串联质谱对步骤5)得到的所有不同的大组样品进行蛋白质鉴定，得到待鉴定生物的蛋白质组数据。

上述方法中，所述iTRAQ试剂可为iTRAQ试剂盒中的iTRAQ试剂。所述iTRAQ试剂盒可为SCIEX公司产品，货号为lot#：A4063。

上述方法中，所述蛋白质组鉴定方法还可包括对所述蛋白质组鉴定的数据在数据库中进行检索。所述数据库具体可为Uniprot-Triticum aestivum数据库。

上述方法步骤5)中，所述对所述标记产物进行液相色谱分离可利用液相色谱串联质谱进行。所述液相色谱串联质谱可为UPLC-Q-TOF-MS(超高压液相色谱-四级杆- 飞行时间质谱)。具体可采用Agilent 1290/6540进行。设定程序时间可为65分钟，色谱柱可为Agela Durashell(18CL)。

将所述标记产物分成不同小组样品可根据步骤5)中所述液相色谱的保留时间确定，也还可依据所述生物的种类和/或其器官/组织进行确定，使不同小组间的吸收峰无遮盖。

在本发明的一个实施例中，所述不同小组样品可为在6-50分钟内每分钟收集一个样品得到的共45个小组样品。

上述方法步骤5)中，所述对所述多个液体组分别进行质谱鉴定可利用MALDI-TOF-TOF-MS进行。所述MALDI-TOF-TOF-MS的仪器具体可为Bruker公司产品，型号为ultrafleXtreme。

在本发明的一个实施例中，所述不同的大组样品具体可为将6-12分钟内与38-50分钟内各小组样品合并、将13-14分钟内与34-37分钟内各小组样品合并、将15-16分钟内与32-33分钟内各小组样品合并、将17-18分钟内与30-31分钟内各小组样品合并、将19-20分钟内与28-29分钟内各小组样品合并、将21-22分钟内与26-27分钟内各小组样品合并以及将23-25分钟内各小组样品合并得到的七个大组样品。

上述方法步骤6)中，所述液相色谱串联质谱可为NanoLC-Q-TOF-MS(纳升级液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨率质谱)。

上述方法步骤3)中，所述酶解前包括采用超滤离心管收集所述还原烷基化产物中的蛋白质，用所述iTRAQ试剂盒中的溶解缓冲液溶解所述还原烷基化产物中的蛋白质，得到蛋白质溶液。

其中，所述还原烷基化产物中非蛋白质物质可为尿素、SDS、乙酸铵等伯胺基物质。所述超滤离心管由内管和外管组成，所述内管带有截留分子量为10000道尔顿的半透膜。

上述方法中，所述蛋白质溶液可按照如下方法得到：将所述还原烷基化产物转移至超滤离心管的内管中，离心；向所述超滤离心管的内管中加入所述溶解缓冲液，使所述还原烷基化产物中的蛋白质处于所述溶解缓冲液中，得到所述蛋白质溶液。

上述方法中，向所述超滤离心管的内管中加入所述溶解缓冲液后可进行离心，并再向所述超滤离心管的内管中加入所述溶解缓冲液。该步骤可重复2～3次。离心的条件可为4℃、7000g离心5分钟。

上述方法中，所述超滤离心管可为millipore的超滤离心管，具体型号可为UFC501096。

上述方法中，所述提取待鉴定生物的总蛋白可包括：

11)破碎所述待鉴定生物器官和/或组织，得到样品粉末；将所述样品粉末和溶液 S1按照1g:8mL的比例混合，得到液体1；

所述溶液S1由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为308g/L蔗糖、1.5mol/L Tris-HCl、50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0.4％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述溶液S1的pH值为8.8；

12)提取所述液体1中的蛋白质，得到所述总蛋白。

上述方法中，所述提取所述液体1中的蛋白质可包括：

12a)向所述液体1中加入Tris饱和酚(pH＝8.0)进行抽提，得到抽提液；

12b)离心所述抽提液，是蛋白质浸入上相中，向所述上相中加入0.1M乙酸铵的甲醇溶液，离心，使蛋白质进入沉淀中，收集沉淀，即得到所述生物的总蛋白。

所述生物的总蛋白可用所述0.1M乙酸铵的甲醇溶液、80％(体积百分比浓度)的丙酮水溶液和/或70％(体积百分比浓度)甲醇水溶液进行洗涤。

其中，所述Tris饱和酚(pH＝8.0)为Kechuang公司产品，货号为141105。

所述0.1M乙酸铵的甲醇溶液为向甲醇中加入乙酸铵，得到的乙酸铵浓度为0.1M的溶液。

上述方法中，所述蛋白裂解液可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％(质量百分比浓度)CHAPS、10mmol/L TCEP、0.1％(质量百分比浓度)Rapigest和1％(质量百分比浓度)Cocktail。

上述方法中，所述蛋白酶为可胰蛋白酶。所述胰蛋白酶具体可为Waters公司产品，货号为lot#：143071)。

上述方法中，所述生物可植物，如单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦或水稻。所述器官可为所述生物各类型器官，如种子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于蛋白质组鉴定的成套试剂。

本发明所提供的用于蛋白质组鉴定的成套试剂，由所述蛋白裂解液、所述iTRAQ试剂、所述蛋白酶、所述溶解缓冲液和所述溶液S1这五种中的至少两种组成。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白裂解液。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

Ⅰ、所述方法在鉴定蛋白质组中的应用；

Ⅱ、所述成套试剂在鉴定蛋白质组中的应用；

Ⅲ、所述蛋白裂解液在提取生物蛋白质中的应用；

Ⅳ、所述蛋白裂解液在鉴定蛋白质组中的应用。

实验证明，利用本发明的蛋白质组鉴定方法鉴定的蛋白质数目达到2710个，而未进行本发明的预分级和预分级后的蛋白样品合并，共得到985个蛋白质，通过利用本发明的蛋白质组鉴定方法鉴定的蛋白数目与未进行预分级与和蛋白样品合并相比提高了近3倍，远远高于现已报道的其他方法，并且合并之后可以大大节省鉴定成本和时间。

利用本发明的蛋白裂解液将提取得到的总蛋白质溶解后，再进行蛋白质的酶解，然后直接用NanoLC-Q-TOF-MS进行鉴定，并使用ProteinPilot程序进行检索Uniprot-Triticum aestivum数据库，结果共得到1185个蛋白质，而未利用本发明的蛋白裂解液最终得到的蛋白数目为964个。本发明的蛋白裂解液提高了蛋白质样品的溶解性，蛋白质量好，纯度高。

本发明的蛋白质组鉴定方法有效的提高了含有高丰度蛋白质的蛋白质组的检测数目和效率，对蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。

附图说明

图1为UPLC-Q-TOF-MS图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所提供的蛋白质组鉴定方法，包括如下1)-6)：

1)提取生物的总蛋白，用蛋白裂解液溶解所述总蛋白，得到蛋白溶液；蛋白裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水，溶质及其浓度分别为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％(质量百分比浓度)CHAPS、10mmol/L TCEP、0.1％(质量百分比浓度)Rapigest和1％(质量百分比浓度)Cocktail；

2)将蛋白溶液中的蛋白依次进行还原、烷基化，得到还原烷基化产物；

3)用蛋白酶酶解还原烷基化产物中的蛋白质，得到酶解产物；

4)用iTRAQ试剂标记酶解产物中的蛋白质，得到标记产物；

5)对标记产物进行UPLC-Q-TOF-MS分离，收集洗脱出的液体，将单位时间内洗脱出的液体作为一个液体组，得到多个液体组，对多个液体组分别进行MALDI-TOF-TOF-MS，将吸收峰无遮盖的液体组进行合并，得到不同的大组样品；

6)用NanoLC-Q-TOF-MS对步骤5)得到的不同的大组样品进行蛋白质组鉴定，得到蛋白质组鉴定的数据。

下面以小麦的种子为例，具体阐述蛋白质组鉴定方法。

下述实施例中的济麦19号(宋建民等,济麦19号高产稳产性分析，山东农业科学，2002(5)13-15)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的溶液S1由溶质和溶剂组成；溶剂为水，溶质及其浓度分别为308g/L蔗糖、1.5mol/L Tris-HCl、50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0.4％(体积百分含量)β-巯基乙醇，所述溶液S1的pH值为8.8。

下述实施例中的蛋白裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水，溶质及其浓度分别为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％(质量百分比浓度)CHAPS、10mmol/L TCEP、0.1％(质量百分比浓度)Rapigest和1％(质量百分比浓度)Cocktail。其中，CHAPS、TCEP、Rapigest和Cocktail分别为Sigma公司、Sigma公司、Waters公司和Amresco公司产品。

下述实施例中的iTRAQ试剂盒为SCIEX公司产品，货号为lot#:A4063。

下述实施例中的胰蛋白酶为Promega公司产品，货号为000076530。

下述实施例中的Tris饱和酚为Kechuang公司产品，货号为141105，该Tris饱和酚为用1M Tris(pH8.0)饱和过的重蒸酚，为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液层，pH>7.5，溶液内加有抗氧化的0.25％8-羟基喹啉和0.1％β-巯基乙醇。

下述实施例中的0.1M乙酸铵的甲醇溶液为向甲醇中加入乙酸铵，得到的乙酸铵浓度为0.1M的溶液。

实施例1、小麦种子蛋白质组鉴定方法

一、小麦种子总蛋白质的提取

将去壳小麦济麦19号成熟种子研磨成粉末，取粉末0.05g和400μL溶液S1至一离心管中，然后加入400μL的Tris饱和酚(pH＝8.0)，使用振荡器4℃充分混合30分钟以上，4℃、20000g离心20分钟，离心管中液体分层，即上层的苯酚一相和下层的水相；将上层苯酚一相吸取至新的离心管中得到抽提液1，向剩余的下层水相中加入400μL的Tris饱和酚抽提水相，4℃振荡20分钟后，4℃、20000g离心20分钟，离心管中液体分层，即上层的苯酚一相和下层的水相；将上层苯酚一相吸取至新的离心管中得到抽提液2，将抽提液1和抽提液2混合，得到抽提混合液。

将上述抽提混合液4℃、5000g离心15分钟，将上相转移至新的2mL离心管中，向上相中加入是上相5倍体积的0.1M乙酸铵的甲醇溶液沉淀蛋白，涡旋混合后-20℃过夜。第二天4℃、20000g离心20分钟，弃上清液，收集沉淀。先用0.375mL的0.1M乙酸铵的甲醇溶液洗涤沉淀，之后将溶液再补至1.5mL，-20℃下放置30分钟。4℃、20000g离心20分钟，弃上清液，收集沉淀。用80％(体积百分比浓度)的丙酮水溶液洗涤沉淀，-20℃下放置30分钟，4℃、20000g离心20分钟，弃去上清，收集沉淀，重复一次。用70％(体积百分比浓度)甲醇水溶液洗涤沉淀，-20℃下放置30分钟，4℃、20000g离心20分钟，弃上清液，收集沉淀。将沉淀于通风橱内晾干，加入80-120μL的蛋白裂解液振荡溶解蛋白沉淀，4℃、14000rpm离心15分钟，上清液即为小麦种子总蛋白质的提取液，将其命名为蛋白溶液1，经蛋白定量后，-80℃保存。

二、酶解

1、还原烷基化

向100μg步骤一的蛋白溶液1中加入2μL的Reducing Reagent(iTRAQ试剂盒中试剂)进行蛋白的还原，涡旋以充分混匀，37℃下孵育1小时(如果蛋白溶液中不含尿素，则置于60℃)，得到反应液1，向反应液1中加入1μL的Cysteine Blocking Reagent(iTRAQ试剂盒中试剂)以烷基化，室温孵育10分钟，得到还原烷基化产物1。

2、还原烷基化产物1中非蛋白质物质的替换

利用Fasp方法将还原烷基化产物1中非蛋白质物质的替换，具体操作如下：将步骤2的还原烷基化产物1转移至millipore的超滤离心管(具体型号为UFC501096)的内管中，4℃、7000g离心5分钟；向millipore的超滤离心管的内管中加入400μL的Dissolution Buffer(iTRAQ试剂盒中试剂)，4℃、7000g离心5分钟，重复2～3次，得到蛋白质溶液，将其命名为还原烷基化产物2。

3、酶解

按照还原烷基化产物2中的蛋白质与胰蛋白酶的质量比为50:1的比例向内衬管中中加入胰蛋白酶，密封后37℃下过夜酶解12～16小时，得到位于内衬管中的酶解产物。

三、iTRAQ试剂标记

向步骤二中3的含有酶解产物的内衬管中加入200～400μL的HPLC水，充分混匀后，于4℃、7000g下离心5分钟，将酶解产物离心出内衬管，使用浓缩仪真空干燥酶解产物3小时，得到干燥的酶解产物。

取出-80℃下保存的iTRAQ试剂，室温下解冻，向解冻后的iTRAQ试剂中加入100μL的无水乙醇，得到iTRAQ试剂溶液。将iTRAQ试剂溶液加入干燥的酶解产物中，室温下孵育1小时，得到标记混合物；向标记混合物中加入100μL去离子水终止标记反应，室温下放置2小时后，使用浓缩仪进行真空干燥(干燥后会呈现橘红色)，得到标记产物。

四、高效液相色谱预分级

采用超高压液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS，Agilent1290/6540)，保留时间在65分钟的程序对步骤三的标记产物进行预分级(图1)，具体操作如下：

向步骤三的标记产物中加入110μL的溶液A，涡旋溶解。14000rpm离心30分钟取上清液，约100μL进行高效液相色谱分级。液相色谱程序设置为65分钟，固相为十八烷基硅烷键合硅胶。具体设置如下：

0分钟：98％溶液A，2％溶液B

0-5分钟(不包括0分钟)：98％(体积百分含量)溶液A，2％(体积百分含量)溶液B

5-30分钟(不包括5分钟)：溶液A的体积百分含量由98％匀速降低到70％，溶液B的体积百分含量由2％匀速增加到30％

30-40分钟(不包括30分钟)：溶液A的体积百分含量由70％匀速降低到10％，溶液B的体积百分含量由30％匀速增加到90％

40-50分钟(不包括40分钟)：10％(体积百分含量)溶液A，90％(体积百分含量)溶液B

50-55分钟(不包括50分钟)：溶液A的体积百分含量由10％匀速增加到98％，溶液B的体积百分含量由90％匀速增加到2％

55-65分钟(不包括55分钟)：98％(体积百分含量)溶液A，2％(体积百分含量)溶液B

其中，溶液A：20mmol/L甲酸胺水溶液，pH＝10(用氨水调)

溶液B：含有20mmol/L甲酸胺的80％(体积百分比浓度)乙腈水溶液，pH＝10(用氨水调)

UPLC-Q-TOF-MS中使用色谱柱的型号为Agela Durashell(18CL)，规格为5μm，150A，4.6×250mm；紫外波长为210nm。

UPLC-Q-TOF-MS的结果，从5分钟开始到50分钟结束，每分钟一管收集分级液，并对这些分级液按保留时间进行编号，随后使用浓缩仪真空干燥这些分级液，得到45个小组样品。

五、预分级后的蛋白样品合并

利用MALDI-TOF-TOF-MS(基质辅助激光解离-飞行时间串联质谱)仪(UltrafleXtreme)MALDI-TOF-TOF-MS初步鉴定步骤四中的45个小组样品。根据MALDI-TOF-TOF-MS鉴定结果，将各分级液分成七个组，每组中的吸收峰均无遮盖。步骤四中的45个小组样品均进行以下步骤：将步骤四中的各小组样品真空抽干后用10μL的70％CAN(加入0.1％TFA)重悬，取1μL加到AnchorChip^TM MALDI的靶板上，晾干后加入1μL的基质(1mg/mL,a-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 70％acetonitrile containing 0.1％TFA)加到相应位置，直到晾干。使用UltrafleXtreme公司的 MALDI-TOF/TOF质谱仪检测，参数如下：MS spectra＝400laser shots per spectrum，MS/MS spectra＝1500laser shots per fragmentation spectrum。

分别向步骤四的各分级样品中加入10μL的70％(体积百分比浓度)乙腈水溶液，涡旋震荡以充分溶解。按表1的分组方法进行分级样品的合并，合并时分别对每个分级样品用50μL的70％(体积百分比浓度)乙腈水溶液分别进行溶解和清洗，最后按照表1将相应的分级样品的溶液进行合并得到七个组的样品。使用浓缩仪真空干燥七个组的样品。这七个组中，同一大组样品均达到a)和b)的目的：a)同一大组样品的不同吸收峰能够相互区分，b)同一大组样品的吸收峰的相对强度不会过高或过低，确保相对强度低的吸收峰不会被误认为噪音而被舍弃。

表1、各分级液的分组方法

组别	步骤四中的保留时间
		第一组	6-12分钟，38-50分钟
第二组	13-14分钟，34-37分钟
		第三组	15-16分钟，32-33分钟
第四组	17-18分钟，30-31分钟
		第五组	19-20分钟，28-29分钟
第六组	21-22分钟，26-27分钟
		第七组	23-25分钟

六、NanoLC-Q-TOF-MS鉴定蛋白样品

采用NanoLC-Q-TOF-MS(SCIEX公司Triple TOF 5600⁺)鉴定蛋白样品。将步骤五的七个组的样品真空干燥后，在一个100μm×20mm真空管中进行脱盐，脱盐后的蛋白样品进入75μm×150mm分析真空管中。流动相A与流动相B组成的液体中，流动相A的体积百分比以300nL/分钟的速度在75分钟之内由5％增加到30％，从而分离多肽。质谱鉴定是使用TripleTOF 5600+(AB SCIEX)系统。质核比在350～1500m/z被收集。FDR＝0.1％。

流动相A：0.1％(体积百分比浓度)FA(甲酸)水溶液

流动相B：FA与乙腈的体积百分比为99.9:0.1的由FA与乙腈组成的液体

质谱数据使用ProteinPilot程序进行检索Uniprot-Triticum aestivum数据库。预分级后的蛋白样品通过质谱鉴定后的蛋白数目达到2710个。

按照上述方法中的步骤一、二、三和六，将标记产物直接用NanoLC-Q-TOF-MS进行鉴定，并使用ProteinPilot程序进行检索Uniprot-Triticum aestivum数据库，结果发现，未进行预分级的iTRAQ标记样品通过质谱鉴定后的质谱数据检索数据库共得到985个蛋白质，通过预分级鉴定的蛋白数目与未进行预分级相比提高了近3倍，远远高于现已报道的其他方法。

按照上述方法中的步骤一、二和六，将酶解产物直接用NanoLC-Q-TOF-MS进行鉴定，并使用ProteinPilot程序进行检索Uniprot-Triticum aestivum数据库，结果发现，未进行预分级与iTRAQ标记的样品通过质谱鉴定后的质谱数据检索数据库共得到1185个蛋白质。

本发明有效的提高了小麦种子蛋白的检测数目和效率，对植物蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。

对比例1、未改进的蛋白提取方法及蛋白质组的鉴定

一、正丙醇与蛋白提取液结合提取小麦种子总蛋白

利用正丙醇与蛋白提取液结合提取小麦种子总蛋白，将该方法命名为提取方法1，具体步骤如下：

将去壳小麦成熟种子济麦19研磨成粉末，称取粉末0.03g(不超过0.05g，否则会出现抽提不完全现象)置于1.5mL离心管中，加入1mL的90％(体积百分比浓度)正丙醇水溶液。涡旋混匀，冰上孵育30分钟，期间超声破碎3分钟，4℃、14000rpm，离心15分钟，去上清液，重复一次。向沉淀中加入500μL的蛋白提取液(蛋白提取液由水和溶质组成，溶质及其浓度分别为0.125mol/L Tris-HCl，4mol/L尿素，4％(质量百分比浓度)SDS和5％(体积百分含量)的β-巯基乙醇)过夜震荡，4℃、14000rpm，离心15分钟，收集上清液，即为小麦种子总蛋白质的提取液，将其命名为蛋白溶液2，经蛋白定量后，-80℃保存。

二、酶解

按照实施例1中步骤二的方法，将蛋白溶液1替换为蛋白溶液2，其他均不变，对提取方法1得到的小麦种子总蛋白质进行酶解，得到酶解产物2。

三、NanoLC-Q-TOF-MS鉴定蛋白样品

将酶解产物2直接用NanoLC-Q-TOF-MS进行鉴定，并使用ProteinPilot程序进行检索Uniprot-Triticum aestivum数据库，结果发现，未进行预分级与iTRAQ标记样品通过质谱鉴定后的质谱数据检索数据库共得到964个蛋白质，低于采用实施例1的蛋白质提取方法得到的蛋白数目。

Claims

1.蛋白质组鉴定方法，包括如下1)-6)：

4)用iTRAQ试剂标记所述酶解产物中的蛋白质，得到标记产物；

5)对所述标记产物进行液相色谱分离，收集洗脱出的液体，将单位时间内洗脱出的液体作为一个液体组，得到多个液体组；对所述多个液体组分别进行质谱鉴定，将吸收峰无遮盖的液体组进行合并，得到不同的大组样品；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述对所述标记产物进行液相色谱分离利用液相色谱串联质谱进行；所述对所述多个液体组分别进行质谱鉴定利用MALDI-TOF-TOF-MS进行；

和/或，步骤6)中，所述液相色谱串联质谱为NanoLC-Q-TOF-MS。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蛋白裂解液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％CHAPS、10mmol/L TCEP、0.1％Rapigest和1％Cocktail；和/或，所述蛋白酶为胰蛋白酶。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述酶解前包括采用超滤离心管收集所述还原烷基化产物中的蛋白质，用iTRAQ试剂盒中的溶解缓冲液溶解所述还原烷基化产物中的蛋白质，得到蛋白质溶液。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述提取待鉴定生物的总蛋白包括：

11)破碎所述待鉴定生物器官和/或组织，得到样品粉末；将所述样品粉末和溶液S1按照1g:8mL的比例混合，得到液体1；

所述溶液S1由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为308g/L蔗糖、1.5mol/L Tris-HCl、50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0.4％β-巯基乙醇，所述溶液S1的pH值为8.8；

12)提取所述液体1中的蛋白质，得到所述总蛋白。

6.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述生物为下述a)-c)中的任一种：

a)植物；

b)单子叶植物或双子叶植物；

c)小麦或水稻。

7.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述器官为种子。

8.用于蛋白质组鉴定的成套试剂，由权利要求3中所述蛋白裂解液、所述iTRAQ试剂、权利要求1-3中任一所述蛋白酶、权利要求4中所述溶解缓冲液和权利要求5中所述溶液S1这五种中的至少两种组成。

9.权利要求3中所述蛋白裂解液。

10.下述任一应用：

Ⅰ、权利要求1-7中任一所述方法在鉴定蛋白质组中的应用；

Ⅱ、权利要求8所述成套试剂在鉴定蛋白质组中的应用；

Ⅲ、权利要求3中所述蛋白裂解液在提取生物蛋白质中的应用；

Ⅳ、权利要求3中所述蛋白裂解液在鉴定蛋白质组中的应用。