CN106153712A - 一种多肽二硫键的定位方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽二硫键的定位方法，包括：将待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中部分还原化；对部分还原化的多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中烷基化；对烷基化的多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中完全还原化；使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对产物进行分子量检测；对检测合格的样品进行液质联用串联质谱检测，得到质谱数据；将质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。该方法样本量需求小、纯度要求较低、操作简单、重现性高、解析难度小、结果准确度高、通量高且成本低。

Description

一种多肽二硫键的定位方法

技术领域

本发明涉及多肽的结构测定技术领域，尤其涉及一种多肽二硫键的定位方法。

背景技术

二硫键是一种广泛存在于天然蛋白质和多肽中的常见翻译后修饰，共价交联于两个半胱氨酸之间(仇晓燕，崔勐，刘志强，刘淑莹.蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析.化学进展.第20卷,第6期,975-983)。二硫键的形成对于蛋白质和多肽的空间结构(Wedemeyer W J，Welker E，Narayan M，Scheraga HA.Biochemistry.2000，39：4207-4216)、维持正确的折叠构象(Pitt J J，da SilvaE，Gorman J J.J.Bio1.Chem.，2000，275:6469-6478)、保持及调节其生物活性(Abkevich V I，Shakhnovich E I.J.Mo1.Bio1.，2000，300:975-985)等都起着至关重要的作用。因此，对蛋白质和多肽中二硫键的定位，即二硫键的具体连接位置以及不同二硫键之间的组合排列关系，具有重要意义，有助于蛋白质和多肽的功能活性研究和结构解析，也为蛋白多肽类药物开发和改进奠定了重要基础。

对于二硫键定位，传统的研究方法有以下几种：X射线晶体衍射法(Hart PJ，Deep S，Taylor A B，et a1.Nat.Struct.Bio1.，2002，9：203-208)、核磁共振法(Fadel V，Bettendoif P，Herrmann T，et a1.Toxicon，2005，46：759-767)、对角线电泳法(Brown J R，Hartley B S.Biochem.J.，1966，101：214-228)、HPLC分离法(Stewart A E，Raffioni S，Chaudhary T，Chait B T，LupofiniP，Bradshaw R A.Protein Sci.，1992.1：777-785)、Edman降解(Haniu M，Acklin C，Kenney W C，Rohde M F.Int.J.Pept.Protein Res.，1994，43：81-86)和氨基酸序列分析法(Akashi S，Hirayama K，Seino T，et a1.Biomed.EnvironMassSpectrom.1988，15：541-546)等，但是这些方法各存在一些缺点和需要解决的问题。

X射线晶体衍射法依赖于很高纯度的蛋白多肽，对样品量需求大，且需要形成高度有序的晶体结构。后来发展的核磁共振(NMR)可以在近似自然生理条件状态的溶液中检测样品，但是需要的样品量更大，且通常谱图复杂，解谱难度大。经典的对角线电泳法主要基于将为还原二硫键的样品进行酶切，然后通过第一向和第二向电泳，使含有二硫键的酶切片段偏离对角线，然后取下进行氨基酸序列分析，这种方法同样需要较大样本量，且分辨率低，检测精度差。类似基于分离原理的方法还有HPLC法，具有同样的缺点和问题。Edman降解法是操作相对简单且检测结果相对准确的一种方法，但是仍然需要样本量较大，纯度很高的样品才能满足要求。

随着质谱技术的发展，由于质谱具有样本量用量少，检测快速，耐受度高，通量高等优点，结合质谱检测，利用质谱鉴定的方法越来越多。如酶切、分离后进行质谱分子量测定从而推导二硫键连接位置，或者通过同位素标记或生物衍生后再进行质谱分子量检测。但是这种方法依然存在假阳性高和准确性低的问题，尤其是存在两个或两个以上相邻半胱氨酸的情况下，无法判断二硫键的位置。

利用部分还原法结合二级质谱(MS/MS)解析多肽二硫键定位的方法也已有报道(中国发明专利CN 102721734 B)，但是该方法的样本处理过程仍然是较复杂的部分，上样量要求较大(2mg)，样品纯度要求较高，还原后需要经过高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化，部分还原烷基化需要在高温条件下进行，质谱数据质量较差，手工分析因素很大，导致结果的可控性和可重复性差，并且只能得到定性结果而难以得到定量结果，不易同时对大量不同的样品进行高通量分析。总之，现有的基于部分还原法结合二级质谱解析多肽二硫键定位的方法存在样本量需求大、纯度要求高、操作复杂、重现性低、解析难度大、通量低、结果准确度低、成本高和检测周期长的问题。

发明内容

本发明提供一种样本量需求小、纯度要求较低、操作简单、重现性高、解析难度小、结果准确度高、通量高且成本低的多肽二硫键的定位方法，该方法可获得多肽的二硫键连接位置以及不同二硫键连接组合方式之间的存在比例关系。

本发明的方法是通过如下技术方案实现的：

一种多肽二硫键的定位方法，该方法包括：

1)将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；

2)对上述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；

3)对上述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；

4)使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5)对上述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6)将上述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

本发明中，上述液质联用串联质谱可以采用LC-MS/MS质谱仪进行，优选Orbitrap质量分析器类型质谱仪，更优选Q-Exactive质谱仪，采用一级质谱和二级质谱串联检测模式。

本发明中，上述质谱鉴定软件可以选用Mascot、Maxquant、Sequest、X！tandem或OMSSA软件，优选Mascot软件。

作为本发明的优选技术方案，上述步骤1)中的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯。

作为本发明的优选技术方案，上述溶液环境中的含有二硫键的待测多肽的浓度为0.01～10μg/μL，优选为0.1～1μg/μL。

作为本发明的进一步改进的技术方案，如果上述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，上述溶液环境为双蒸水溶液，上述二硫苏糖醇的终浓度为1～100mmol/L，上述部分还原化处理的温度为15～30℃、时间为5～30min；如果上述二硫键还原剂为三(2-氯乙基)磷酸酯，上述溶液环境为柠檬酸溶液，上述三(2-氯乙基)磷酸酯的终浓度为0.01～10mmol/L，上述部分还原化处理的温度为15～30℃、时间为5～30min。

作为本发明的优选技术方案，上述步骤2)中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，上述多肽变性剂的浓度为6～8mol/L。

作为本发明的优选技术方案，上述烷基化试剂选自碘代乙酰胺；优选地，上述碘代乙酰胺的浓度为10～550mmol/L。

作为本发明的进一步改进的技术方案，上述烷基化处理在避光下进行，温度为15～30℃、时间为30min以上。

作为本发明的优选技术方案，上述步骤3)中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，上述多肽变性剂的浓度为6～8mol/L。

作为本发明的进一步改进的技术方案，上述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，上述二硫苏糖醇终浓度为5～100mmol/L，上述完全还原化处理的温度为56～65℃、时间为30～60min。

作为本发明的进一步改进的技术方案，上述步骤1)和2)完成后，采用萃取柱除去二硫键还原剂或烷基化试剂，然后将洗脱液冻干。

作为本发明的一个最优选的技术方案，上述方法包括如下步骤：

1)二硫键部分还原：以二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯作为二硫键还原剂，具体操作如下：

二硫苏糖醇还原：取10μg以上多肽样品，溶于双蒸水中，配置成0.01～10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为1～100mmol/L的二硫苏糖醇，15～30℃条件下部分还原5～30min，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的二硫苏糖醇，将洗脱液冻干；或

三(2-氯乙基)磷酸酯还原：取10μg以上多肽样品，溶于0.05～0.2M的pH为2.5～3.5的柠檬酸溶液中，配置成0.01～10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为0.01～10mmol/L的三(2-氯乙基)磷酸酯，15～30℃条件下部分还原5～30min，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的三(2-氯乙基)磷酸酯，洗脱液冻干；

2)烷基化：冻干后的样品溶于6～8mol/L的尿素溶液中，配置成0.01～10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为10～550mmol/L的碘代乙酰胺，15～30℃条件下避光反应30min以上，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的碘代乙酰胺，洗脱液冻干；

3)剩余二硫键全部还原：冻干后的样品溶于双蒸水或6～8mol/L的尿素溶液中，配置成0.01～10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为5～100mmol/L的二硫苏糖醇，在56～65℃条件下反应30～60min，使剩余二硫键全部还原；

4)使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5)对上述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6)将上述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

相比现有技术，本发明的多肽二硫键的定位方法采用改进后简便快捷的部分还原烷基化及后续完全还原过程，结合高精度、高通量的液质联用串联质谱检测，得到质谱数据采用高效的信息分析方法进行准确快速且稳定可重复的数据分析，可获得多肽具体的二硫键连接位置，以及不同二硫键连接组合方式之间的存在比例关系，并且可同时对几十个、几百个甚至上千个不同样本进行检测，克服了现有方法样本量需求大、纯度要求高、操作复杂、重现性低、解析难度大、通量低、结果准确度低、成本高和检测周期长的问题，具有非常好的多肽及蛋白质结构研究和药物改造等相关应用价值和前景。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中的含三对二硫键的芋螺毒素多肽样品的MALDI-TOF质谱检测图，示出了粒子流的强度(Intens)与质荷比(m/z)的关系；

图2为本发明的一个实施例中的三对二硫键的芋螺毒素多肽样品部分还原烷基化MALDI-TOF质谱检测图，结果显示分别打开一对、两对和三对二硫键的质谱峰；

图3为本发明的一个实施例中的Mascot搜索鉴定的二级质谱多肽匹配图谱及鉴定序列中半胱氨酸修饰位点示例图，其中所示序列中粗体带下划线的C即为烷基化修饰的半胱氨酸，b、y离子是指多肽在碎裂后形成的N端和C端对应的两种碎片离子；

图4为本发明的一个实施例中的三对二硫键多肽样品的二硫键定位结果，示出了二硫键连接方式及其所占比例；

图5为本发明的另一个实施例中的含两对二硫键多肽样品的MALDI-TOF质谱检测图；

图6为本发明的另一个实施例中的两对二硫键多肽样品部分还原烷基化MALDI-TOF检测图，结果显示分别打开一对和两对二硫键的质谱峰；

图7为本发明的另一个实施例中的Mascot鉴定二级质谱序列及半胱氨酸修饰位点匹配图，其中所示序列中粗体带下划线的C即为烷基化修饰的半胱氨酸，b、y离子是指多肽在碎裂后形成的N端和C端对应的两种碎片离子；

图8为本发明的另一个实施例中的两对二硫键多肽样品的二硫键定位结果，示出了二硫键连接方式及其所占比例。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明的关键构思之一在于：对部分还原烷基化处理然后完全还原化处理并采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)质控合格的多肽样本，采用液质联用串联质谱检测(LC-MS/MS)，并结合质谱鉴定软件对质谱数据进行分析，从而精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

相比现有的利用部分还原法结合二级质谱(MS/MS)解析多肽二硫键定位的方法，本发明的方法采用不同于现有技术中的质谱检测方法，即LC-MS/MS以及高精度的质谱鉴定软件，能够同时实现多肽二硫键的连接位置的定位以及不同连接形式存在比例的定量，即兼具有定性和定量分析特性。

对本发明的技术方案说明如下：

一种多肽二硫键的定位方法，该方法包括：

1)将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；

2)对上述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；

3)对上述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；

4)使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5)对上述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6)将上述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

上述方案中，步骤1)的作用在于使得含有二硫键的待测多肽发生部分还原化。所谓“部分还原化”是指还原化不充分的状态，比如在多肽内存在多对(比如3对)二硫键的情况下，有1对、2对和3对二硫键被还原打开的多肽同时存在。

相比现有技术，本发明中步骤1)要求的条件更加宽松，例如CN 102721734B中公开的部分还原化反应在高温下进行，而本发明的步骤1)可以在常温(或室温)下进行；CN 102721734 B中公开的部分还原化以及烷基化之后都需要采用HPLC进行纯化才能进行后续操作，因为其对样品的纯度要求较高，而本发明的部分还原化以及烷基化之后不需要进行HPLC纯化，为了防止还原化或烷基化在后续操作中继续进行，只需要进行简单的萃取柱处理即可。

本发明中的二硫键还原剂是指能够将二硫键还原打开形成半胱氨酸残基的还原剂，这样的还原剂可以采用二硫苏糖醇(DDT)或三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)。

考虑到不同还原剂适宜的溶液环境可能不同，可以针对不同还原剂采用不同的溶液环境。例如，本发明人经研究发现：在采用二硫苏糖醇作为还原剂的情况下，以双蒸水(ddH₂O)溶液作为还原反应的溶液环境相比其它类型的溶液环境效果更好，并且在双蒸水溶液中待测多肽的浓度在0.01～10μg/μL范围内、优选在0.1～1μg/μL范围内，同时二硫苏糖醇的终浓度在1～100mmol/L范围内、优选为10mmol/L能取得较好的部分还原效果；部分还原化处理的温度在15～30℃(室温)范围内效果较好，而部分还原化处理的时间在5～30min范围内、优选10min效果较好，温度过高或者时间过长可能导致还原化程度过大，而温度过低或者时间过短可能导致还原化程度不够。

本发明人还发现：在采用三(2-氯乙基)磷酸酯作为还原剂的情况下，以柠檬酸溶液作为反应的溶液环境相比其它类型的溶液环境效果更好，尤其是浓度为0.05～0.2M、pH为2.5～3.5的柠檬酸溶液(优选浓度为0.1M、pH为3.0的柠檬酸溶液)；并且柠檬酸溶液中待测多肽的浓度在0.01～10μg/μL范围内、优选在0.1～1μg/μL范围内，同时三(2-氯乙基)磷酸酯的终浓度在0.01～10mmol/L范围内、优选0.03～0.1mmol/L范围内能取得较好的部分还原效果；部分还原化处理的温度在15～30℃(室温)范围内效果较好，而部分还原化处理的时间在5～30min范围内、优选10min效果较好，温度过高或者时间过长可能导致还原化程度过大，而温度过低或者时间过短可能导致还原化程度不够。

需要说明的是：本发明中含有二硫键的待测多肽一般是指含有两对以上二硫键的多肽，因为含有一对二硫键的多肽的定位比较简单。本发明中所谓“多肽”应作广义理解，即多肽性物质，包括蛋白质在内，这是因为根据本发明的精神，本发明的二硫键定位方法显然适合于含有二硫键的蛋白质。

本发明上述方案的步骤2)中，多肽变性剂可以选用尿素、盐酸胍或硫脲等，浓度一般是6～8mol/L，尤其是6～8mol/L的尿素溶液，更优选8mol/L的尿素溶液。

本发明上述方案的步骤2)中，烷基化试剂可以选用碘代乙酰胺(IAM)；一般碘代乙酰胺的浓度为10～550mmol/L、优选55mmol/L。经研究发现，烷基化处理在避光下进行，温度为15～30℃、时间为30min以上(优选45min)，能取得较好的烷基化效果。

所谓“部分还原烷基化”是指部分还原化的多肽中二硫键打开形成的半胱氨酸残基发生烷基化。烷基化可能是不充分的，即可能打开的二硫键并非完全被烷基化，但是并不影响本发明的方法的实现。

本发明上述方案的步骤3)中，多肽变性剂可以与步骤2)中的多肽变性剂相同，二硫键还原剂可以与步骤1)中的二硫键还原剂相同。例如，多肽变性剂采用6～8mol/L的尿素溶液，更优选8mol/L的尿素溶液；二硫键还原剂采用二硫苏糖醇，优选二硫苏糖醇终浓度为5～100mmol/L(优选10mmol/L)。研究发现，完全还原化处理的温度为56～65℃(优选56℃)、时间为30～60min(优选60min)，能取得较好的完全还原效果。

经过步骤1)至3)生成的产物的质量状况主要通过步骤4)的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)来检测，对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格。由于每个二硫键还原烷基化后多肽的分子量大约增加116Da，因此根据MALDI-TOFMS的质谱图，可以清楚地看到多肽的还原烷基化情况。

上述步骤5)中，液质联用串联质谱可以采用高精度LC-MS/MS质谱仪进行，优选Orbitrap质量分析器类型质谱仪，如Q-Exactive质谱仪(ThermoFisherScientific)，采用一级质谱(MS)和二级质谱(MS/MS)串联检测模式。

基于LC-MS/MS质谱检测的特性，可同时对几十个、几百个甚至上千个不同样本进行检测，可将不同分子量和不同序列的多肽样本区分并同时进行检测和解析，实现高通量高深度信息采集和分析，大大节约了时间和实验成本，具有非常好的多肽及蛋白质结构研究和药物改造等相关应用价值和前景。

上述步骤6)中，质谱数据被转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，如适用于Mascot质谱搜索鉴定软件的.mgf格式等。所使用的质谱鉴定软件可以是例如Mascot(来源于Matrix Science)、Maxquant(来源于Max Planck Institute ofBiochemistry)、Sequest(来源于Thermo Fisher Scientific)、X！tandem(来源于The Global Proteome Machine Organization)、OMSSA(来源于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15473683？dopt＝Abstract)等，优选Mascot。参考多肽序列数据库可以从美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)或Uniprot网络数据库搜索下载，参考多肽序列数据库中含相关背景序列，以提供假阳性率(FDR)计算和过滤。经过质谱鉴定软件的计算，能够得到多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例，即除了二硫键定位的定性信息外，还能得到相对定量结果。其中，定性方面，二硫键连接位置推算方法为：同时出现烷基化修饰的仅两个半胱氨酸位点，或者同时未被修饰的仅两个半胱氨酸位点，即为二硫键连接位点，将多种此类二硫键连接组合即为多肽二硫键连接形式。定量方面，在多肽色谱出峰时间范围内，先将每个二硫键连接位点的多肽出现的强度求和，然后再将不同二硫键连接位点的强度之和做乘积，该乘积所占总乘积的比例即为该二硫键连接形式所占的存在比例。本发明的方法不但能够定性分析多肽二硫键的连接位置，而且能够定量分析各种不同连接形式存在的比例，这是现有技术做不到的。

本发明的一个最优选的技术方案中，多肽二硫键的定位方法包括如下步骤：

1)二硫键部分还原：以二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯作为二硫键还原剂，具体操作如下：

二硫苏糖醇还原：取10μg以上多肽样品，溶于双蒸水(ddH₂O)中，配置成0.01～10μg/μL(优选0.1～1μg/μL)的多肽浓度，然后加入终浓度为1～100mmol/L(优选10mmol/L)的二硫苏糖醇，室温(15～30℃)条件下部分还原5～30min(优选10min)，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的二硫苏糖醇(以避免后续烷基化时有二硫键被进一步还原)，将洗脱液冻干；或

三(2-氯乙基)磷酸酯还原：取10μg以上多肽样品，溶于0.05～0.2M的pH为2.5～3.5的柠檬酸溶液(优选0.1M的pH为3.0的柠檬酸溶液)中，配置成0.01～10μg/μL(优选0.1～1μg/μL)的多肽浓度，然后加入终浓度为0.01～10mmol/L(优选0.03～0.1mmol/L)的三(2-氯乙基)磷酸酯，室温(15～30℃)条件下部分还原5～30min(优选10min)，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的三(2-氯乙基)磷酸酯(以避免后续烷基化时有二硫键被进一步还原)，洗脱液冻干；

2)烷基化：冻干后的样品溶于偏碱性且带变性剂的溶液(例如6～8mol/L的尿素溶液、优选8mol/L的尿素溶液)中，配置成0.01～10μg/μL(优选0.1～1μg/μL)的多肽浓度，然后加入终浓度为10～550mmol/L(优选55mmol/L)的碘代乙酰胺，15～30℃条件下避光反应30min以上(优选45min)，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的碘代乙酰胺，洗脱液冻干；

3)剩余二硫键全部还原：冻干后的样品溶于双蒸水或偏碱性且带变性剂的溶液(例如6～8mol/L的尿素溶液、优选8mol/L的尿素溶液)中，配置成0.01～10μg/μL(优选0.1～1μg/μL)的多肽浓度，然后加入终浓度为5～100mmol/L(优选10mmol/L)的二硫苏糖醇，在56～65℃(优选56℃)条件下反应30～60min(优选60min)，使剩余二硫键全部还原；

4)使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3)的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5)对上述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6)将上述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

下面通过实施例更具体地说明本发明的特征、效果和优势，应当理解实施例仅是示例性的，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例一、简便快捷的部分还原剂烷基化及后续全部还原

本实施例以含有三对二硫键的芋螺毒素多肽样品(分子量1769.69Da，序列为：RCCVHPACHDCICCIT，MALDI-TOF检测质谱图如图1)为例说明多肽二硫键的定位方法。

1、部分还原

称取含有三对二硫键的芋螺毒素多肽样品0.1mg，溶于1ml ddH₂O中，加入使得终浓度为10mM的DTT(sigma)，室温下部分还原10min。反应结束后使用C18萃取柱(strata^TM-X，phenomenex)去除剩余DTT(避免后续烷基化时有二硫键被继续还原)，洗脱液冻干；

2、IAM烷基化

冻干后的样品溶于1ml 8M尿素(BBI)溶液中，再加入使得终浓度为55mM的IAM(sigma)，室温避光反应45min，使用C18萃取柱去除溶液中剩余IAM及尿素，洗脱液冻干；

3、后续二硫键全部还原

冻干后的多肽样品用0.4ml 8M尿素溶液复溶，加入使得终浓度为10mM的DTT，56℃反应1h，使剩余二硫键全部还原。

实施例二、MALDI-TOF检测部分还原烷基化效果

取部分还原烷基化并后续完全还原后的样品1μL，点于MALDI-TOF(Bruker)样品靶上，待样品干燥后加上0.3μL基质(CHCA，英文全称α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，中文全称α-氰基-4-羟基肉桂酸)，干燥后，再加上2.5μL 0.1％TFA水溶液，放置5秒后迅速吸走，起到简易除盐的作用。然后将样品靶放入质谱仪中，选择一级质谱反射模式检测方法进行部分还原烷基化效果检测，结果如图2所示，分别打开一对、两对和三对二硫键对应的质谱峰都明显出现，部分还原烷基化效果较好。

实施例三、LC-MS/MS质谱检测

经MALDI-TOF质谱检测合格的部分还原烷基化多肽样品进行LC-MS/MS(采用ThermoFisher Scientific公司的Q-Exactive质谱仪)质谱检测，检测总时间为65min，核心质谱参数如下：

一级质谱分辨率：70,000；扫描范围：350-1800m/z；二级质谱分辨率：7,500；数据依赖采集为一级质谱的前20强母离子进行二级质谱采集；二级质谱碎裂能量为27％；动态排除时间设置为8秒；

实施例四、质谱数据解析及多肽二硫键定位

质谱数据首先经过格式转换为.mgf格式，然后采用Mascot软件(来源于Matrix Science)与参考序列数据库(NCBI)进行搜索比对鉴定，其中Mascot搜索鉴定核心参数如表1所示。

表1

经过Mascot搜索鉴定，得到多肽序列及序列中具体的半胱氨酸修饰位点，如图3所示。Mascot搜索鉴定结果中，根据多肽序列中不同半胱氨酸修饰位点及其多肽强度和色谱保留时间计算，得到多肽二硫键连接方式及不同连接方式分别所占的比例，如图4所示。

实施例五

本实施例以含两对二硫键多肽样品(分子量1635.65Da，氨基酸序列为RPCCPRDTWCCGFP，MALDI-TOF检测质谱图如图5)为例说明多肽二硫键的定位方法。

取100μg含两对二硫键的多肽样品，其部分还原烷基化、后续全部还原、MALDI-TOF质控、LC-MS/MS质谱检测及数据解析二硫键定位分析方法同实施例一、二、三、四。其部分还原烷基化效果如图6，多肽鉴定二级谱比对情况如图7、最终二硫键定位结果如图8。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1. 一种多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述方法包括：

1）将含有二硫键的待测多肽在含二硫键还原剂的溶液环境中进行部分还原化处理，得到部分还原化的待测多肽；

2）对所述部分还原化的待测多肽在含多肽变性剂和烷基化试剂的溶液环境中进行烷基化处理，得到部分还原烷基化的待测多肽；

3）对所述部分还原烷基化的待测多肽在含多肽变性剂和二硫键还原剂的溶液环境中进行完全还原化处理；

4）使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3）的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5）对所述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6）将所述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。

2. 根据权利要求1所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述液质联用串联质谱采用LC-MS/MS质谱仪进行，优选Orbitrap质量分析器类型质谱仪，更优选Q-Exactive质谱仪，采用一级质谱和二级质谱串联检测模式。

3. 根据权利要求1所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述质谱鉴定软件选用Mascot、Maxquant、Sequest、X!tandem或OMSSA软件，优选Mascot软件。

4. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤1）中的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯。

5. 根据权利要求4所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述溶液环境中的含有二硫键的待测多肽的浓度为0.01~10μg/μL，优选为0.1~1μg/μL。

6. 根据权利要求5所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，如果所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，所述溶液环境为双蒸水溶液，所述二硫苏糖醇的终浓度为1~100mmol/L，所述部分还原化处理的温度为15~30℃、时间为5~30min；如果所述二硫键还原剂为三(2-氯乙基)磷酸酯，所述溶液环境为柠檬酸溶液，所述三(2-氯乙基)磷酸酯的终浓度为0.01~10mmol/L，所述部分还原化处理的温度为15~30℃、时间为5~30min。

7. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤2）中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，所述多肽变性剂的浓度为6~8mol/L；

优选地，所述烷基化试剂选自碘代乙酰胺；优选地，所述碘代乙酰胺的浓度为10~550mmol/L；

优选地，所述烷基化处理在避光下进行，温度为15~30℃、时间为30min以上。

8. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤3）中的多肽变性剂选自尿素、盐酸胍或硫脲；优选地，所述多肽变性剂的浓度为6~8mol/L；

优选地，所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇终浓度为5~100mmol/L，所述完全还原化处理的温度为56~65℃、时间为30~60min。

9. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述步骤1）和2）完成后，采用萃取柱除去二硫键还原剂或烷基化试剂，然后将洗脱液冻干。

10. 根据权利要求1-3任一项所述的多肽二硫键的定位方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）二硫键部分还原：以二硫苏糖醇或三(2-氯乙基)磷酸酯作为二硫键还原剂，具体操作如下：

二硫苏糖醇还原：取10μg以上多肽样品，溶于双蒸水中，配置成0.01~10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为1~100mmol/L的二硫苏糖醇，15~30℃条件下部分还原5~30min，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的二硫苏糖醇，将洗脱液冻干；或

三(2-氯乙基)磷酸酯还原：取10μg以上多肽样品，溶于0.05~0.2M的pH为2.5~3.5的柠檬酸溶液中，配置成0.01~10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为0.01~10mmol/L的三(2-氯乙基)磷酸酯，15~30℃条件下部分还原5~30min，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的三(2-氯乙基)磷酸酯，洗脱液冻干；

2）烷基化：冻干后的样品溶于6~8mol/L的尿素溶液中，配置成0.01~10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为10~550mmol/L的碘代乙酰胺，15~30℃条件下避光反应30min以上，反应结束后使用C18萃取柱去除剩余的碘代乙酰胺，洗脱液冻干；

3）剩余二硫键全部还原：冻干后的样品溶于双蒸水或6~8mol/L的尿素溶液中，配置成0.01~10μg/μL的多肽浓度，然后加入终浓度为5~100mmol/L的二硫苏糖醇，在56~65℃条件下反应30~60min，使剩余二硫键全部还原；

4）使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对步骤3）的产物进行样品的分子量检测，若出现部分还原状态对应分子量的质谱峰即为合格；

5）对所述合格的样品进一步进行液质联用串联质谱检测，得到用于质谱分析的质谱数据；

6）将所述质谱数据转换成质谱鉴定软件所兼容的数据格式，然后使用质谱鉴定软件将转换好格式的质谱数据与参考多肽序列数据库进行搜索比对，得到各种不同位置半胱氨酸残基烷基化修饰位点的多肽鉴定信息，根据多肽的序列、修饰位点、强度、色谱出峰时间及组合，精确计算出多肽二硫键的连接位置及不同连接形式存在的比例。