CN103097897A - 表征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的工艺方法，用以表征和多维演示蛋白质的折叠卷曲过程(图9)，是一种方法上的新组合，包含有对蛋白质在其折叠过程中进行化学修饰并对其形成的水合折叠中间体进行分子大小的动态排列、对蛋白质折叠中间体的酶解片断依据生物信息学识别模板进行归类、对蛋白质折叠中间体进行折叠途径归属关系的分类和由此对蛋白质折叠过程做出的表征以及对表征结果的电脑辅助多维可视化。此工艺方法的特殊性在于，所有在折叠过程中通过化学修饰捕捉到的不同构象的蛋白质折叠中间体，采用其各自拥有的4个特性，即其水合动力学分子大小、其形成时间点、其归属的折叠路径以及其形成量的多少来辨别和数字化描绘。此工艺可广泛应用于蛋白质折叠和蛋白质疾病的研究，蛋白质工程、抗体工程、分子生物学、治疗医学、生物技术、蛋白质生物药品的生产、蛋白分类学以及制造蛋白质新功能材料的纳米技术。本发明还涉及制造和使用各种不同类型的产品，用以该工艺方法的实际操作执行，如不同的检测实验试剂盒、实验室设备，软件和自动装置。

Description

表征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法

本发明涉及一种多维表征蛋白质折叠过程的新方法，由多步骤组成，包含对蛋白质在其折叠过程中进行化学修饰并对其形成的水合折叠中间体进行分子大小的动态排列、对蛋白质折叠中间体的酶解片断依据生物信息学识别模板进行归类、对蛋白质折叠中间体进行折叠途径归属关系的分类、和由此对蛋白质折叠过程做出的表征以及对表征结果的电脑辅助多维可视化展示。 

使用这种新方法，对蛋白质折叠中间体的鉴定不同于现有技术那样，仅仅依据二硫键的形成，而是依据蛋白质折叠中间体各自具有的4项个性特征，即其水合动力学分子大小、其形成时间点、其归属的折叠路径以及其形成的量的多少来表征和数字化描绘。这种方法不仅可用以检测含有二硫键的蛋白质，也可检测不含二硫键的蛋白质，且不受蛋白质分子种类、类型和大小的限制。 

本发明还涉及实施这种新方法的手段工具，包括各种不同的检测实验试剂盒，仪器设备，软件和自动化设备。 

技术领域

本发明涉及的应用领域包含蛋白质折叠及其途径的研究，蛋白质工程，抗体工程，分子生物学，免疫生物学，治疗性药物，生物技术，生物技术蛋白药物产品，蛋白质分类学，和用以开发新型功能性蛋白质材料的纳米技术。 

技术背景

蛋白质必须正确折叠才能够实现其生物学功能。其线性多肽链在核糖体上合成后需被转运到其他部位形成适当的二级、三级、四级结构。蛋白质的错误折叠会引发许多疾病，如肌肉萎缩性疾病，老年痴呆症（Alzheimer’sdisease），皮质纹状体脊髓变性综合症（the Creutzfeld Jakob disease），羊瘙痒症和疯牛病(Bovine spongiforme Enzephalopathie BSE)。研究发明一种行之有效的工艺方法用来解释蛋白质的折叠机制，说明疾病的成因继而开发新型的治疗药物，至今仍是生命科学界一项重大的挑战。安芬森（Christian Anfinsen，1972，诺贝尔化学奖）关于蛋白质复性的实验使人们知道，蛋白质的一级结构含有蛋白质结构的全部信息。然而他仍无法解释蛋白质如何折叠以及如何找到它们的天然构象。近几十年来，世界各国的科学家都非常重视寻找解决“蛋白质折叠难题”的方法。近年来，一些用来检测，解释和特征性描述蛋白质折叠的理论和方法及技术得到相应的发展。 

1.蛋白质结构的预测 

蛋白质的结构预测可用于帮助解释其折叠机制，到目前为止有两种已知的适用方法。第一种是以氨基酸序列为参照的方法，也就是同源建模（Guex，1997年;Schwede，2003年;Kopp，2004年）和串线算法（Hendlich，1990年;Sippl，1996年;Madej，1995年）。这个方法基于一些蛋白质具有相似的氨基酸序列的特性。一个未知结构的蛋白质的序列与已知结构的蛋白质的序列进行比较，如果序列的相似性被确定，已知结构的蛋白质可被作为未知结构蛋白质的结构预测模板。到目前为止这是唯一的一个实用方法，用于同源蛋白的三级结构的研究。第二种是从头计算预测法(Karplus,1990;Sippl,1995;Shortle,1997),在此方法中氨基酸链的折叠不用参考其他已知蛋白的结构就能被预测。借助于计算机， 通过计算未知结构蛋白质的分子能量最小化也可模拟折叠过程。为达到这个目标，1994年举行了全球蛋白结构预测竞赛CASP(the Critical Assessment of Techniques for protein Structure Prediction)(www.predictioncenter.org)每两年举行一次。在这个竞赛中，先公开一些待预测结构的蛋白质的氨基酸序列，这些蛋白质的三维结构正在被测定并即将公布，参赛者将自己对这些蛋白质结构的预测结果与公布的结果相比较，检验预测效果，推测其折叠机制。 

2．蛋白质折叠的经典模型 

以前，蛋白质折叠方面的研究主要以观察实验结果为主，建立起了许多模型。其中最简单的是双态模型(Two-State Model)。大多数的模型都认为折叠是一个分步过程。这些模型共同之处是对蛋白质折叠机理解释的局限性，一般只适用于各自用以研究的模型蛋白质。总体来说，认为蛋白质的二级结构与疏水性塌陷在折叠初期就已形成。微小结构域和拼图折叠模型(jigsaw puzzles model)及熔融球态模型(Ohgushi M&Wada A,1983)也解释了一些蛋白质的折叠过程。 

双态模型(Two-State Model)是关于一些小蛋白质折叠的最简单的模型，在这个模型中只存在两种稳定状态：折叠或未折叠。序变模型表明折叠过程由未折叠到折叠要经过中间产物阶段。Tsong等人（Tsong et al）认为，可用折叠过程形成的系列中间产物来定义折叠的途径(Tsong et al.,1972)。框架模型(Kim and Baldwin,1990)认为，折叠时，局部独立的单个的二级结构单元先形成，然后这些单元彼此扩延相连形成三级结构。与之相反的是建立在以折叠核形成为基础的成核模型(Wetlaufer,1973)，他认为蛋白质的天然结构由折叠核诱发形成。疏水塌陷模型(Dill ef al.,1995)假设，蛋白质肽链在开始折叠时，由于氨基酸侧链的疏水相互作用，使其在不同的肽链部位首先发生收缩，然后经过局部构象的重整形成其天然结构。 

微小结构域折叠模型认为，蛋白质折叠时，微小结构子域的天然构象首先形成，然后这些结构域经过扩延或与其他子结构域的碰撞形成蛋白质的完整天然结构。拼图模型像其他模型一样，认为蛋白质折叠可形成唯一的天然结构，不过像拼图一样，可经过多种不同的途径而来完成。熔球态假说认为，熔球状折叠中间产物会出现在所有蛋白质的折叠过程中。这种折叠中间产物具有完全折叠复性蛋白质所含有的所有二级结构，但其三级结构尚未完全形成。 

所有折叠模型认为，在折叠之初，二级结构单元(α-helices andβ-sheets)都会在纳秒至秒的极短的时间内形成。蛋白质的进一步折叠，要经过二级结构的扩延、碰撞和由此引发的体积收缩，最终形成蛋白质的天然结构。这个过程相对不同的蛋白质，需要几毫秒到几天的时间。 

3.蛋白质折叠的热力学模型 

安芬森（Christian Anfinsen）和其他研究者所做的实验表明，蛋白质的天然构象处于热力学的稳定状态，因此具有最低的吉布斯自由能。列文托(Levinthal,1968)认为，在适当的条件下蛋白质折叠会沿着特定的折叠途径(加"(folding pathway"))进行，先形成一系列结构（中间态），直到达到具有最低能级的天然结构。统计力学的模型则认为，这种连续折叠的理念可用能量漏斗模型理论(Schultz,2000)来取代。 

蛋白质折叠的能量漏斗理论将所有可能的蛋白质的结构自由能（纵轴）作为构象自由度的函数（横轴）来表示。由此想象，尚未折叠且构象各异的肽链状蛋白质涌入漏斗状折叠通道中，通道拥有很多不同的局域能量极小值，它们相对于拥有最小能量的天然态蛋白质，位于能量的中间阶段（中间体）。正在折叠卷曲中的蛋白质肽链可以在里面找到相应位置，从而形成折叠中间体。一部分中间体已经是相 对稳定的紧凑结构“熔球体”，它阻止蛋白质发生错误折叠。大多数蛋白质分子依照漏斗模型沿各自路径达到最终折叠状态，折叠时并非沿光滑的漏斗斜面滑下，可能会遇到各种障碍，经历不同的途径，直到完全复性。 

4.蛋白质折叠的动力学 

蛋白质折叠需要一个过程，通常经历快速和慢速阶段。在快速阶段，蛋白质肽链经历疏水折拢，形成氢键和二级结构单元。这些过程在毫微秒与微秒时间内完成。缓慢的阶段则需要在几秒钟甚至几小时内完成。缓慢的折叠过程以核糖核酸酶A(ribonuclease A)或硫氧化还原蛋白为例，而较快的折叠过程以溶菌酶和细胞色素C为例。仅有极少数蛋白质没有缓慢折叠阶段。 

大的蛋白质原则上折叠较慢，在细胞中折叠时要由两类附加蛋白质辅助完成。这两种辅助蛋白分别称作折叠酶和分子伴侣。折叠酶如PPI肽酰辅氨酰顺反异构酶（peptidylprolyl c/s-transisomerase位于外周胞质），蛋白质二硫键异构酶PDI和DsbA,B,C,D,G（Protein Disulfide Isomerase位于胞外质），这些酶的催化活性都已明确定义，它们催化加速肽链形成共价分支。分子伴侣则执行很多功能，其中为初生蛋白链创造折叠环境可能是最重要的功能，在分子伴侣创造的环境中初生蛋白可以很好地完成折叠，同时不受自缔合竞争的影响。例如细菌的分子伴侣GroEL(热休克蛋白)，它能帮助将近一半中等大小(30-60kDa)新合成的细菌蛋白质完成折叠。折叠酶与分子伴侣的区别尚无清晰的定义，因为一些蛋白如二硫键异构酶(PDI)在体外环境中既能作为折叠酶又能作为分子伴侣。 

5.研究蛋白质折叠的方法与技术 

蛋白质折叠的实验研究可以归纳为两种类型。一类是指平衡态的实验，将蛋白构象表达为变性剂浓度或温度的函数。另一类是动力学研究，将蛋白质结构变化表达为溶剂条件快速变化的时间函数。目前应用于蛋白折叠研究的技术、方法和重要的化学品如下： 

-NMR（核磁共振光谱），X-晶体分析法射线衍射，电子显微镜和AFM（原子力显微镜）,用以研究在去折叠与复折叠过程中形成的蛋白质中间产物结构的动态变化，这些蛋白质中间产物可通过色谱光谱分析法选择性的分开。 

-所应用的色谱光谱包括荧光、UV（紫外线）、VIS（可见光光谱法）、ESR（电子自旋共振）光谱，CD（圆二色）光谱法和傅里叶变换红外光谱法。这些光谱可研究在未折叠与复折叠过程中蛋白质的结构变化。DLS（动态光散射）和SLS（静态光散射）用于测定蛋白质的分子半径。不同类型的ESI-MS（电喷雾质谱法）和MALDI-MS（基质辅助激光解吸电离质谱法）用于蛋白质和其酶切片段的质量测定。 

-停流技术，淬灭流和梯度淬灭技术。这些方法在截流试验中可达到几微秒的时间分辨率，蛋白质的复折叠可由逐渐稀释的变性溶液或采用所谓的连续流技术极大地改变pH所引发。蛋白质折叠过程的检测范围可达50-100ps。 

-与光谱法相结合的氢氘交换法用于研究蛋白质折叠途径的动力学。 

-MD（分子动力学）方法使用计算机模拟蛋白质折叠过程中分子结构的变化。 

-二维纸电泳，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），毛细血管电泳（CE)和液相色谱法，包括反向高效液相色谱法（RP-HPLC)用于蛋白质中间产物和酶切片段的分离、分析和检测。 

-高时空分辨率的荧光显微镜用于研究细胞内蛋白质的折叠与转运，蛋白质间的相互作用以及折叠过程中蛋白质的结构变化，它包括荧光去极化，共区域化测量，荧光共振能量转移（FRET)，时间解析共振能量转移（TRFREIT），荧光寿命成像(FLIM)，荧光漂白恢复(FRAP)，不同类型的荧光波动方法，尤其是，荧光关联光谱(FCS)。 

-捕获与鉴定含二硫键的中间体。给含二硫键的蛋白质(氧化蛋白)加入已知的变性和还原反应剂，使其发生还原和变性反应，然后去除还原剂与变性剂，进行再氧化和化学修饰，例如用碘乙酸修饰胱氨酸残基的硫醇基，捕获蛋白质折叠的中间体。这些中间体经过色谱分离、蛋白质酶解、选择性部分测序及光谱分析，最终依据二硫键在其酶解蛋白质片段的位置对其进行辨别鉴定。(Creighton,1978)。 

-依据对中间体二硫键的归类来表征和图示蛋白质中间体在折叠过程中的相互关系(Creighton,1988,Weissman&Kim,1991)。 

-利用原子力显微镜直接观察单个蛋白的折叠过程(Cecconi,et al,2005;Walther,et al,2007)。 

-化学试剂包括已知的变性剂、还原剂、再氧化剂、修饰剂、折叠稳定剂、折叠酶、折叠过程中生化分子伴侣与抑制剂以及细胞提取物等等。 

表征蛋白质折叠过程的现有技术 

1.表征蛋白质折叠过程的方法 

人们已经为研发一种有效的表征蛋白质折叠过程的方法做了许多的开拓性的工作。但是，到目前为止尚未发现一种有前景的方法，它结合前面所介绍的现有技术，作为市场标准化的商品满足生命科学领域的需求。 

最近几十年，世界上占主导地位的描述蛋白折叠过程的传统方法大多涉及含二硫键的小的球状蛋白质，也称为氧化蛋白质，很少涉及多域的大蛋白质。传统方法基于一个理论假设，即依据二硫键的形成顺序来推演蛋白质的折叠过程。它可以通过两个技术步骤来实现，即对折叠时出现的含有单个二硫键的中间体进行鉴定和归类，随后根据已鉴定的中间产物中二硫键的形成顺序和可能检测到的分子间二硫键重排的相互关系来解释蛋白质的折叠过程。 

上述根据所含二硫键的形成顺序来鉴定中间产物的方法最初由Creighton TE(Creighton,1978,1988)提出。蛋白质经过变性剂GdmCL（盐酸胍）和还原剂DTE（二硫苏糖醇）处理发生变性和还原，然后经过凝胶过滤去除变性剂和还原剂。将还原的蛋白质再用含有GSH和GSSG（还原和氧化态谷胱甘肽）的缓冲液进行再氧化处理，使其可以形成二硫键。与此同时，在不同的时间间隔加入化学捕获剂碘乙酸或碘乙酰胺，封锁游离巯基从而阻断中间体的折叠过程。由此捕捉到的重折叠中间体随后采用IEC（离子交换色谱法）分离并进一步采用酶法切割成片段再采用二维纸电泳法进行分离。中间体的鉴定需要进行Edman测序（氨基酸测序），以确定单个二硫键在酶解片段中的位置。然后借助于归类片段中二硫键的形成顺序来描绘折叠路径。 

上述传统工艺方法被Kim PS和他的同事(Weissmann&Kim,1991年)所改进，获得一个更加快速和灵敏的测定中间产物中二硫键位置的方法。所用的原料是纯化过的中间体，其含有折叠时氧化形成的二硫键和由捕获剂碘乙酸共价锁定的巯基。含有二硫键的这些中间产物首先被还原剂还原得到自由巯基，随后通过共价键在巯基上标记具有荧光的碘乙酸的衍生物IAEDANS(5-[2-(2-lodacetamido)ethyl amino]-naphthalen-1-sulfonic acid)提高监测的灵敏度。中间体然后被酶切割，标记的半胱氨酸残基可显示酶解片段与原有的二硫键相关。片段采用分离分辨率和速度明显提高的RP-HPLC（高效反相液相色谱）进行分离。通过Edman测序和NMR分析已分离的蛋白片段，可确定二硫键在片段中的位置。折叠中间体可由此根据它们所具有的单个二硫键的位置分布被逐一鉴别。最终通过对中间体中二硫键的形成顺序归类和对分子间二硫键重排的相关性分析图示解说蛋白质的折叠路径。蛋白质的折叠过程由此得以表征。 

这种由Creighton和Kim开拓发展的工艺方法主导了20年来世界范围对蛋白质折叠表征的研究。大量的表征蛋白折叠研究的文献都基于这种工艺方法的原理，在操作技术上加以改良产生。操作时需要很多蛋白质样品，可达100毫克以上，且耗时数月，直到一个小蛋白质的折叠过程被表征出来。表征的结果往往是因人而异，只能通过相互补充才得以完善表述。根据目前UniProtKB/TrEMBL数据库显示，已有1100万个拥有一级结构蛋白质，和超过66,000个拥有三维结构(RCSB蛋白质数据库）的蛋白质，可供所需的折叠研究，但直到今天，人们仅能对很少一部分蛋白质运用这种工艺方法进行折叠表征研究。三个知名小蛋白：RNase A（核糖核酸酶A）,BPTI（牛胰蛋白酶抑制剂）和水蛭素，是运用这种工艺方法研究最多的蛋白质。但结果显示了有限的表征一致性，且部分还出现了根本性的意见分歧(Disulfide Folding Pathway of BPTI,Science vol.256,1992年4月3日)。这表明，此工艺方法作为现有技术的代表，不足以有效表征蛋白质的折叠过程。其实施复杂、耗工耗时，需要昂贵的设备且整体效率低，其表征结果又因人而异，因此不能开发为标准化的商业产品。其原因与相关的障碍可归因于此不适宜的基本原理和由此引发的技术方面的限制。 

2.现有技术的问题 

目前，用以表征蛋白质折叠过程的现有技术的根本问题在于,仅仅基于搜索鉴别蛋白质中间体的二硫键，对中间体的分离及归类也只专注于采用RP-HPLC（高效反相液相色谱）和CE（毛细管电泳）的常规方法。这些都不可避免的导致了工艺方法本身在原理上的限制，其限制因素如下： 

-第一，约30%的蛋白质不含有二硫键，因此不能用此类工艺方法研究这些蛋白质。 

-第二，把二硫键的形成作为折叠标志，在原则上只适用于研究小分子蛋白而不适用于大分子量蛋白质的研究，原因在于分离与鉴定单个二硫键中间产物的难度会随着蛋白质大小和二硫键数量的增加逐渐增大。一种含有3个天然二硫键的蛋白质可能会产生15种含有单个二硫键的中间产物，含有4个二硫键的蛋白质会产生28种，含有5个二硫键的蛋白质会产生45种。这种随着蛋白质分子量的增加伴随着中间产物数量激增的情况，会遇到高效液相色谱HPLC分离数量和大小功能的限制，因为高效液相色谱只适于小分子量蛋白质的分离。 

-第三，许多含二硫键蛋白质的关键折叠中间体在折叠开始阶段还没有形成二硫键，因此不能被作为蛋白质的折叠中间产物对待，在识别鉴定折叠中间体时被人为地排除。导致折叠过程不能完整地表征。 

-第四，含有二硫键的蛋白质折叠中间产物的结构是可以按照逐渐减小的分子大小进行分类，如本发明所阐明的，可作为折叠过程的重要标志，却不能被现有技术的工艺方法接纳和利用，导致折叠细节信息大量丢失，尤其在折叠的快速阶段。 

-第五，在此用以折叠研究的蛋白质，已经过还原反应和变性剂去除，是基于本能的、自发的和快速折叠阶段的产物，其往往处于熔球中间态，仅具有比其天然蛋白质稍大的分子大小。这意味着，随后的表征仅能跟踪从熔球态到复性蛋白质的缓慢折叠阶段，而非整个折叠过程。 

-第六，反向高效液相色谱法虽然可以将小分子的折叠中间体有效分离，但不能直接提供被分离中间体产生的时间及顺序的相关信息，从而延长了折叠中间体的鉴别过程，导致折叠路径的表征复杂化。 

-第七，虽然现有技术涉及到最优的技术组合和对传统方法的改良以及所有已知的新技术和方法，如电喷雾质谱法（ERI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）等等。但基于方法技术本身的根本性限制，使其组合效率很低，其功能只能得到最低限度的应用。 

-第八，昂贵的Edman测序被作为鉴定中间体不可缺少的方法。 

-第九，如上所述，现有技术只能跟踪研究折叠过程的有限部分，且对其不能详尽地表征，因为其只 能鉴定与区别在折叠过程中产生的部分折叠中间体，即所谓的较重要的中间产物。 

-第十，蛋白质折叠过程的研究结果不能在一个坐标系里准确展示，只能用概念性的图解示意表述。 

-第十一，此类研究方法费财费时，不可能实现标准化、微型化和自动化。 

本发明的目的和任务 

本发明的目的和任务是提供一种新的切实高效的研究和表征蛋白质折叠过程的工艺方法，既适用于含二硫键的蛋白也适用于不含二硫键的蛋白，应该能够研究表述蛋白质的折叠过程且不受蛋白质种类、类型和大小的限制，既可检测所有可能的折叠路径及相应的分子内部重排反应，又可辨别蛋白质错误折叠过程，还可以特征性描述整个折叠过程，包括慢速和快速折叠阶段，其表征结果可在多维水平上以多种形式形象化展示。 

本发明所述的新工艺方法可拥有多种多样的应用前景，可通过改变蛋白质折叠时的分子环境和操作实施模式来实现。本工艺方法可以在不同的物理化学和生物化学条件下阐明蛋白质生物合成过程中折叠、错误折叠、聚集、相互作用、自我装配、聚合、老化、衰变以及初生蛋白生物合成及折叠的机制，优化抗体工程与蛋白质工程的操作过程并提高其效率，提高和改进蛋白质的活性与功能，优化生物技术生产靶标药物蛋白质，研发新的纳米级蛋白材料和丰富蛋白质分类学等。 

尤其是本工艺方法既可用于体外模拟体内已知翻译后修饰的蛋白质的折叠过程，开发相应的生物制药生产工艺，也可用于寻找发现新型的影响蛋白质折叠和降解的生化药物和蛋白质类药物。 

这个新工艺方法应该只需用少量的蛋白质样品，易于操作，省时且可标准化、自动化和微型化。它应该还涉及制造和使用各种不同类型的器具产品，用以本该工艺方法的实际操作执行，如不同的检测实验试剂盒、实验室设备、软件和自动装置，包括提供实现本工艺自动化的特定构思和设计以及为优化实施和应用本工艺而建立的一个与多维能量景观理论系统相对应的蛋白质折叠多路径模型。 

任务的解决方案 

上述任务的解决方案已完成，并在本发明专利申请权力要求书的技术特征中予以表述。解决方案的特色在于，对折叠过程中经分子修饰形成的蛋白质中间体不再像使用现有技术那样，仅依据它们二硫键的形成，而是根据中间体各自特有的并可数字化的4个特性，即其水合动力学分子大小、其形成时间点、其归属的折叠路径以及其形成量的多少来辨别鉴定，从而提高了蛋白质折叠表征的总效率。其表征结果将不再像现有技术那样仅能示意性表述，而是在多维坐标系水平上以多种形式予以形象化精确展示。此外，对各个蛋白质折叠表征实施步骤的设计、验证、优化和合理化可借助新建立的多重折叠路径模型来实现。由此显示，本发明的工艺方法明显优于现有技术。 

发明概要

本发明的主体是由多步骤组成的新工艺方法，包含对蛋白质在其折叠过程中进行分子修饰、对其由此形成的水合折叠中间体进行分子大小的动态排列、对蛋白质折叠中间体的酶解片断依据生物信息学识别模板进行归类，对折叠中间体进行折叠途径的归属分类，对蛋白质折叠过程的表征以及对表征结果借助于生物信息学的工具进行多维坐标系上的直观化形象化的展示。本工艺方法涉及到针对蛋白质折叠中间体设计的各种各样的动态修饰方法，中间体分离关键技术的修改和改进，以及建立鉴定中间体折叠路径归属性的新方法。本发明主要基于发明者创建的以下基本构思和由此新建的蛋白质折叠的多路径模型： 

1）一个预先经过优化变性完全去折叠的蛋白质，其重新折叠的复性过程，可以按照折叠蛋白质逐渐变小的水合动力学分子大小对应其逐渐降低的能量状态来演示，在此可应用化学或酶修饰对蛋白质折叠结构影响的机理定时中止折叠过程，捕获处于结构变化中的折叠蛋白质，将其作为中间体进行分离并展示其水合动力学分子大小。 

水合动力学分子大小在这里被定义为一个主要由蛋白质的水合动力学半径来描述的特征，其定义可进一步通过关于蛋白质结构构建、电荷分布、极性、分子表面疏水和亲水性等等的信息加以补充。水合动力学半径R_h(或斯托克斯半径）是一个此处被定义为与蛋白质水合动力学大小等效的球体半径，区别于其他基于聚合物分析学的大小概念，它不是统计学而是现象学的定义。本发明直接用水合动力学半径表示蛋白质水合动力学分子大小，由此表述了分子运输环境（粘度、扩散、渗透）对蛋白质的影响，指出蛋白质水合动力学分子的大小很明显的取决于蛋白质自身的空间构象形式。蛋白质折叠中间体出现在特定的折叠时间点，都具有独特的空间构象，因此可以根据它们不同的水合动力学分子大小对应其所处的不同的能量状态来区分。 

测定的水合动力学分子大小可能明显与其微粒的真实大小有偏差，且大多数小于该微粒的实际大小。但这不影响将水合动力学分子大小作为指标来确定待研究的蛋白中间体的大小，因为在此主要关心水合动力学分子大小的相对性及由此确定的中间体大小顺序，而非其绝对大小。 

通过修饰后捕获到的折叠中间体的水合动力学分子大小可能有别于其在被修饰时间点的实际大小。但偏差只限于中间体结构上的波动，不会改变结构相邻折叠中间体的水合动力学分子大小的顺序，此方法学的合理性并未受到影响。原因在于，折叠时所进行的修饰反应基于分子空间结构逐渐收缩的接触限制，大多发生在蛋白质分子的表面，会干扰和中止折叠过程，导致形成中间体，不会引起能量升高的结构变化。这种由修饰干扰引起的能量波动仅限于很低的范围，不足以克服能垒改变折叠中间体水合动力学分子的大小顺序。 

水合动力学分子大小可以用光谱学的方法（光散射、荧光关联、电子自旋共振-、核磁共振光谱和荧光偏振等）来测定，首选用DSL（动态光散射仪）。水合动力学分子大小在此也可用惯性半径（回转半径，RMS半径即均方根半径）来等效定义，并用SLS（静态光散射仪器）测量。 

蛋白质折叠中间体的水合动力学分子大小原则上与其能量状态成正比，因此需要时可以用其光谱学测定的热力学大小值替换。 

2)蛋白质折叠时出现的中间体是多种多样的，可以按照其特征的共性依其归属的折叠路径进行分组归类。它们不仅具有不同的水合动力学分子大小，而且拥有各自决定分子修饰通道和效果的结构形态，是区别和鉴定蛋白质中间体的基础。这将允许使用特定的侧链修饰试剂对应于折叠中间体构象的多样性对那些处于折叠过程的氨基酸残基，例如折叠蛋白质的赖氨酸残基、半胱氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、色氨酸残基、蛋氨酸残基、天门冬氨酸-和谷氨酸残基，进行定时修饰。 

经由修饰捕获到的蛋白质中间产物不仅具有不同的水合动力学分子大小，而且具有各种多样的标记修饰位点，标明了修饰率随着折叠中间体结构的逐步收敛致使修饰试剂位障增加而降低的过程。具有共同修饰标记的折叠中间体可归类为一个特定组群，属于一条特定的折叠途径。由此，被捕获的折叠中间体不仅可以通过水合动力学分子大小和出现的时间点区别，而且还可以通过其折叠路径的归属性区分。 

定时捕获的折叠中间体既可使用根据本发明改进的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、区分，对其数量，即折叠中间体的第四个特征描述，进行量化，动力学跟踪，并以其水合动力学分子大小作为折叠时间的函数以二维方式展示折叠过程，也可首先通过液相色谱分离、量化，随后依需求和愿望 用光谱的和/或热力学的方法对其水合动力学分子大小进行区分，然后以二维形式，即以其水合动力学分子大小（拟可包括定量）作为折叠时间的函数展示折叠过程。 

这种二维表达展示了蛋白质复性折叠的指纹图谱，它明确地由折叠中间体的3个特征，即水合动力学分子大小、其形成的时间点和产生的数量，来标记展示。 

所有折叠时被捕获和分离的中间体的折叠路径的归属性可以首先借助下列基于蛋白质进化理论和蛋白质折叠动力学的准则进行鉴别分类： 

-在折叠过程中，首先出现且数量占优势的折叠中间体大多属于占主导地位的天然折叠路径，在这条折叠路径上往往显现最少的折叠中间体， 

-属于天然折叠路径的中间体通常具有收敛性结构，不属于天然的折叠路径或属于错误折叠路径的中间体相反通常具有可检测的发散性结构， 

-显示相同量化数的折叠中间体大多属于同一的折叠途径，其量化数量决定折叠路径的宽度或折叠通道的直径，体现了一条折叠路径对整个折叠过程的贡献。 

对折叠路径从属关系更加准确的辨别归类可从用酶法和化学方法对被分离折叠中间体的片段化开始。其片段随后借助于生物信息学方法与理论片段质量识别模板进行比较，既可依据修饰的种类和程度决定的片段质量分布予以分类，也可依据片段彼此间形成二硫键和/或者引入的交联剂的结合模式来分类，进而可对折叠中间体进行分组鉴别并依据同组归类从而得出折叠路径的结论。在此，质谱分析法（例如ESI-TOF-MS，电喷雾飞行时间质谱和MALDI-TOF MS，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）被用于测定片段的数量和分子量分布。 

折叠中间体由此可以按照它们特征的共性评定分组。按照折叠时间顺序分类成组的中间体标示着一条折叠路径。当所有存在的折叠路径鉴别完成时，蛋白质的折叠过程实现完整表征。 

根据本发明发现： 

-处于完全无规则（Random Coil）卷曲的变性去折叠蛋白质至少包含一小部分已经略具原始结构单元的群体组分。群体组分具有很低的能量差异，可被视为原始折叠中间体的混合物，是种子结构种群的前体，在其独立的微结构域中已含不同程度的初始二级结构，可理解为折叠路径的源头或折叠通道的起点。 

-蛋白质的复性折叠过程可划分为4个具有各自独立时间尺度和速度的连续阶段，即从纳秒到毫秒的超快速折叠阶段-I，其生成了启动构建折叠路径源头的种子结构种群;从微秒到秒的快速折叠阶段-II，其形成了并行的折叠路径；从秒到分钟的持续折叠的阶段-III，其实现了沿着已建成路径的后续折叠；速度因蛋白质结构不同而异的阶段-IV，其进一步完成了分子内重排、微结构域的演变和三级结构的形成。 

-在阶段-I中出现的不同种子结构种群并非随机形成，而是由蛋白质的一级结构定义。其决定后面的折叠途径。在阶段-II中，各种相互独立的折叠路径并行且先后形成，每个折叠路径或多或少由几个亚稳态中间体组成，像垫脚石一样标记着各个折叠路径，折叠中间体数达到最大值且出现复性蛋白质组分。在阶段-III中，蛋白质的复性折叠沿着在阶段-II中已并行形成的折叠路径和动力学轨迹持续进行，直到所有初始时在变性去折叠蛋白质池里尚未结构化的部分和大多数在折叠路径上存在过的中间体全部消失。在阶段-IV中，折叠蛋白质完全恢复了其天然构像。 

-其中每个出现的中间体都可以通过至少4个各自独特的特征，即水合动力学分子大小、出现的时间点、折叠路径的归属性和量化了的数量，进行标记和鉴定 

-折叠路径可根据其对折叠过程的贡献大致分为3种类型，即一级、二级和三级折叠路径，分别由各自的主要和次要折叠路径平行连接。在一级折叠路径上发生的折叠主导整个折叠过程，在二级折叠路径上发生的折叠产生彼此近似且具有部分天然结构域的中间体，可通过分子内重排转变为天然蛋白质。三级折叠路径可称为错误折叠主导的路径，在三级折叠路径上发生的折叠产生错误构型的中间体，它们或者非常缓慢的通过分子内重排转变为天然蛋白质，或者不发生分子内重排，直到折叠过程结束形成错误折叠蛋白。 

-二级和三级折叠路径可以发生分支交联，或者分别向低能量的一级折叠路径汇聚。次级折叠路径也可以通过分支与主导折叠路径合并，同时产生特殊的同时属于两条折叠路径的中间体。 

-各种折叠路径的比例关系可通过反应条件的改变进行调节，例如，改变变性剂的浓度、再氧化剂和稳定剂的浓度、pH、离子强度、温度，使用分子伴侣或折叠酶等等。由此，蛋白质的复性折叠可以沿着一级折叠路径加速，以便提高通过复性折叠获取有效蛋白质成分的生产能力，或者相反，通过减缓折叠速度以减少蛋白质聚集或便于表征折叠过程。但是，由蛋白质一级结构定义的主要折叠路径和次要折叠路径没有由此改变，也就是说，没有出现新的折叠路径，已有的折叠路径也没有消失。在这里不应该将通过改变反应条件呈强势显现的折叠通路标识为新的折叠路径，也不应该将由此呈弱势显现的折叠通路作为不宜存在的折叠路径而忽视。也存在这样的中间体，它是错误折叠路径的产物且具有低于其天然蛋白质的水合动力学分子大小及能量状态。 

-复性蛋白质的结构异质性呈快速且跳跃式降低，直到折叠阶段-I结束，然后缓慢逐步的减少，直到阶段-IV结束时终止。折叠动力学的各个关键历程标记如同里程碑，通常出现在阶段-I到阶段-III的结束时，并以结构异质性显著降低为标记且对应折叠速度极限的不同状态，可相应的由结构相对稳定的折叠中间体直观标示。逐步降低的折叠结构异质性通常与复性过程中水合动力学大小的降低成正比，其逐步降低的过程取决于复性蛋白质的种类、类型以及折叠路径。 

-蛋白质折叠的过程可以主要根据所有在阶段-I和阶段–II处于标准条件下出现的折叠中间体的特征来表征描述，蛋白质折叠的这种特征化描述可被称为蛋白质折叠指纹。 

-根据这个发现的新认识建立了一个与能源景观相适应的漏斗状多重折叠路径模型（图11）。该模型可在多维坐标系中转换表达。在该模型中，4-阶段折叠过程将进一步用不同的图形和5个常在实验中出现的功能区来描述，对折叠中间体的能量状态和水合动力学分子大小作为折叠时间的函数的相互关系也相应的给予了描述。以下对此进行解释说明： 

-顶端的区域-A可理解为一容池，充满了变性去折叠无规则卷曲的蛋白质，其中很小一部分已略具独立的微结构域和原始二级结构单元并由此形成原始结构种群，受一级结构本能和有利的空间自由度驱使以毫秒级的极快速度在阶段-I进行折叠。在区域-B形成一些优势导向的结构种群，它们已具有原始天然二级结构和相近的水合动力学分子大小与能量状态。这时，蛋白质的复性折叠由于其早期二级结构的形成接近枯竭达到了第一个速度极限。 

-多重折叠路径在阶段-II的形成开始于在区域-B终点出现的折叠中间体，终止于复性蛋白质组分出现的区域-E。具有最初天然二级结构的折叠分子种群，也被称为各条折叠路径的种子种群，首先克服自身的主要能垒，以各自独立的速度历经一些结构的亚稳阶段，形成折叠中间体，像先后间隔的垫脚石一样标记着各条折叠路径。各条折叠路径的中间体最终交汇于熔球中间体状态，经过分子异构重排继续折叠回到复性天然构象。 

-属于一级折叠路径的折叠种群包括它潜在的亚群具有已形成的天然二级结构，它们以极快的 速度持续折叠，几乎不产生折叠中间体，主导支配整个复性折叠过程。二级折叠路径起源于已带有部分天然二级结构的折叠种群，因此拥有或多或少的天然中间体。三级折叠路径源于带有错误折叠的非天然二级结构，因此往往伴随很多非天然的中间体。与主要折叠路径并行的次要折叠路径源自带有不规则二级结构的结构亚群，它们大多在折叠期间通过分子内重排返回到主折叠路径。 

-多重折叠路径潜在的复杂性在此模型中得到象征性的表达。它展示出，各种导致形成一级、二级和三级折叠路径的种子折叠种群，最初需要克服3种不同强度的能级障碍以便能够进入折叠过程，然后沿着3种可选择的折叠路径克服各自的次级能垒进行折叠，同时形成相应的折叠中间产物。因此在不考虑假设的分支折叠路径的情况下至少会出现27种折叠途径。但是蛋白质的复性折叠通常基于其天然结构属性，仅仅非常局限的沿着其中所属的个别折叠路径并行进行。 

-各个折叠路径交汇于区域-D的熔球状态区。在这里，发生大多数的分子内结构重排，包括来自不同折叠路径并以天然二硫键导向的中间体结构重排。 

-沿着多重折叠路径经过熔球态首先在区域-E折叠复性的蛋白质，基于其进化的原因尚具有多种灵活的微小结构区域，借此保持蛋白质对其反应底物的适应性和功能性。从阶段-III直到阶段-IV的最后阶段，复性蛋白质持续分子内微结构的异构重排，直到获得其天然结构。在区域-E不仅有复性的天然蛋白质，还有通过分子内重排得到的结构变异体，包括其水合动力学分子大小和能量状态有时甚至比天然结构更低的错误折叠结构。 

-这个模型还指出了蛋白质折叠经历的4个速度瓶颈效应。第一个位于阶段-I的终点和主要折叠路径的能垒入口。第二个是由逐渐出现的次级能垒引起，以不断生成的折叠中间体为标记。第三个是由复性蛋白质分子内结构重排能垒和折叠碍能所致，其结果是熔球中间体的出现。第四个追溯到最终完成蛋白质天然构象的位能障碍。第一和第三个呈现很强的瓶颈效应，它们主导决定蛋白质的整体折叠速率。这些速度瓶颈效应的不同强度可通过对每个限速瓶颈位段积累的中间体的数量分布进行量化。 

-这个模型指出，蛋白质的折叠过程可以通过对瓶颈限速位段并行出现的折叠中间体的鉴别来表征。一个由折叠路径和所属的折叠中间体组合描述的图样可以作为构建蛋白质折叠实验指纹图谱的基础。 

-这个模型还表明，蛋白质在多重折叠路径上的复性折叠在原则上不是相互协同发生的，只有一级折叠路径主导的折叠过程才会发生协同行为。 

-该模型适用于所有蛋白质。每个蛋白质，无论它是在单折叠路径或多重折叠路径上，超快速或缓慢折叠，或者先超快速然后缓慢折叠，或者仅缓慢折叠，都可以在该模型中找到各自对应的折叠路径。该模型有许多实际应用，首先可借助于该模型改善设计、合理化检测方法，从而可针对每个待测蛋白质来优化实施本发明的工艺步骤。 

3)由此表征的蛋白质折叠过程可以多维展示。首先可将所有中间体的特征数字化，然后把所有中间体的水合动力学分子大小作为它们的出现时间顺序、折叠路径以及量化的数量的函数在一个多维坐标系里标示展出。用折叠中间体的4个特征还可以定义新组合的坐标系，借助于计算机图像技术多样性可视化展示表征的结果。在这里，如折叠路径（折叠通道的构建），其动力学过程,其折叠贡献百分比分布，错误折叠的过程，分子间结构重排的产生，二硫键形成的前后序列，生物和化学影响因素对折叠的作用，蛋白聚合启动的过程，折叠抑制剂或折叠伴侣在体外对蛋白质的活性、功能 和降解的影响，以及在体外动态模拟的蛋白质翻译和翻译后的修饰等等的过程，都可通过多维表征折叠过程得知。所有折叠蛋白质中间体的空间结构与其能量景观之间的相互关系，既能适应于漏斗概念(Schultz，2000年)相应地定性和定量描绘，也能以其他各种多样的能量景观形式多维可视化展示出来。 

发明的详细说明 

先对该发明工艺方法的步骤进行通常的简单说明，接着再对其作详细的介绍。 

1.对所要表征的蛋白质进行总体分析 

基于对蛋白质一级结构、二级结构和有可能的多维结构特征以及蛋白质的生物和理化性质分析，制作相应的理论片段质量识别模板，确定进一步的操作步骤和方法，例如，蛋白质中间体的修饰类型，侧链修饰专用试剂和中间体分离方法。 

2.分离完全变性去折叠具有最大水合动力学分子大小的蛋白质样品 

蛋白质被变性和还原，并在必要时纯化分离。色谱法分离的最佳蛋白质样品具有最大的水合动力学分子大小，此时含二硫键蛋白质的二硫键完全还原成自由巯基并完整去折叠。 

3.蛋白质的动态修饰 

处于折叠过程中的蛋白质被定时用侧链试剂在置于或不置于影响因子的条件下进行修饰。其修饰的程度和类型取决于被修饰氨基酸残基的接近难易性。修饰产生各种各样结构相对稳定的折叠中间体，它们分别拥有各自的个性特征，即水合动力学分子大小、出现时间点、所归属的折叠路径和所占的折叠百分比。 

4.中间体的分离和定量及二维展示其水合动力学分子大小和数量对应其出现时间点的函数关系 

折叠期间在一定时间间隔通过修饰截获的中间体，可采用本发明改进的胶凝电泳法分离，并通过扫描凝胶带含量密度量化，其中位于不同凝胶分离带的中间体以其不同的水合动力学分子大小作为其折叠修饰时间点的函数二维的在凝胶上显示出来。通过修饰截获的中间体还可以先用色谱法分离，然后用光谱法确定其水合动力学分子大小，同时量化其数量，对应于本发明的4阶段多重折叠路径模型，把中间体水合动力学分子大小和其量化的数量对应其折叠修饰时间点填表记录，进行表格化归类，然后依此多维展示。中间体的水合动力学分子大小在这也可以在适当的条件下由其分离后测得的热力学参数来替换。 

一个蛋白质的折叠指纹图谱可由此至少通过两个方法展示。其一是电泳法，即把直到折叠路径形成阶段结束时所生成的所有中间体，以其不同的水合动力学分子大小和量化的数量作为其折叠时间的函数通过凝胶电泳直接在凝胶上多维表达。其二是用液相色谱分离和定量中间体并借助计算机以同理多维展示。 

5.通过胶内或溶液内酶解进行折叠中间体片段化 

通过中间体片段化可进一步精确区分辨别所有中间体折叠途径的归属性。所有依据水合动力学分子大小用凝胶电泳或色谱法分离的中间体将被酶解，首选用胰蛋白酶，切割成片段。片段化也可以使用其它内切蛋白酶如Lys-C、Glu-C和Asp-N，如果有必要还可选用外切蛋白酶或化学裂解法。 

6.片断化中间体的质谱检测 

所有单个片段的分子量和由二硫键和/或交联剂结合的中间体大片段，将使用质谱测量并记录在数据 库中（例如，ESI-TOF-MS，电离飞行时间质谱测量和MALD-TOF-MS，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱）。在这可以采用MALDI-TOF-MS/MS（基质辅助激光解析飞行时间质谱）或基质辅助激光解析飞行时间质谱源后裂解MALDI-TOF-MS-PSD（Post-Source-Decay）或胞外酶法和/或化学水解法精确区分类似的片段。 

7.中间体折叠路径归属性的确认 

通过对用质谱法整理的片段数量和质量与理论片段质量识别模板参照比较，可以确定每个中间体发生修饰的类型、数量和位置作为各自的特征。基于这些个性特征可将一些中间体按照其共同之处划分归组，赋予其组分归属性，归属于一个小组的中间体标记确定一条特定的折叠路径。一旦确认一个中间体的组归属性也就同时确定了其折叠路径的归属性。对于中间体折叠路径归属性的确定可进一步用如上所述，基于蛋白质进化理论和蛋白质折叠动力学理论的准则条件来补充和完善。 

8.中间体的识别和归类 

每一个中间体都可以用它们被测定的水合动力学分子大小大小、形成时间、数量、折叠路径这4个重要特征来标记和区分鉴定。根据其特征的一致性，所有被鉴定的中间体可以被分为若干小组，并以此划归不同折叠途径。被归类于某个折叠途径的中间体还可以满足三个标准，即它们具有相同的修饰类型，它们的水合动力学分子大小逐渐减小，它们沿着折叠路径形成的时间间隔明确。 

9.折叠过程的表征 

通过在多维坐标系里并行标记所有被鉴定的在不同折叠路径上的中间体，可以直接确定与折叠路径相应的折叠速率，天然折叠的主导路径，最快和最慢折叠的路径，导致错误折叠的路径，所有折叠路径的折叠动力学，二硫键形成和/或交联形成的次序，分子重排和折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇以及与此相关的中间体等等。蛋白质的折叠过程由此得以表征。 

10.蛋白质折叠过程的图形和可视化展示 

已表征的蛋白质折叠过程可以借助计算机图形学的方法在多维坐标系中以多种形式可视化展示，还可做成动画。在这里，折叠路径可在一个多维坐标系中展现为折叠通道，在漏斗形能量景观系统中展现为折叠隧道。 

本发明工艺方法的实施可以逐步手动完成，也可以部分或/和完全自动化完成，实施的工具及设备涉及本发明的不同检测实验试剂盒、实验仪器、执行软件以及特定构思和设计的自动化设备。 

1.对被表征蛋白质的总体分析 

第一步是分析待表征蛋白质的初级结构、二级结构和高级结构以及其物化性质，以决定进一步的操作步骤和方法，包括所有步骤和各自的操作方法、选择修饰类型和修饰专用特异反应试剂以及分离中间体、区别其水合动力学分子大小，还有反应的条件，例如蛋白质浓度、溶剂、离子强度、pH值、温度等。 

根据本发明可开发特别的程序，用于对被表征蛋白质的分析归类，如检索分子量大小、是否含有二硫键、亲水或疏水的类型和单结构域还是多结构域，也可用于侧链特定修饰试剂的选择、修饰中间体的酶解理论片段质量识别模板的制作和评价，或用来展示、区别和分析各种修饰型中间体酶解片断的质谱图谱。 

为满足该发明的应用需要，还可以开发使用额外的程序，例如用来展示和分析折叠中间体体外翻译后修饰和酶解的理论片段质量识别模板，展示和分析体外模拟在受到化学和/或生物因子影响下折叠中 间体翻译后修饰和酶解的理论片段质量识别模板。 

2.完全变性去折叠且具有最大水合动力学分子大小蛋白质样品的分离 

完全变性处于最佳伸展状态的蛋白质具有最大的水合动力学分子大小。在分离这些有或无二硫键的蛋白样品之前，要先使其变性和还原。含有二硫键的蛋白质先用变性剂和还原剂处理，随后用色谱方法分离去除还原剂，同时，得到具有不同水合动力学分子大小的蛋白质样品。针对那些容易很快发生分子间重新氧化的特殊蛋白质，去除还原剂的过程要分步缓慢进行。通过使用例如DLS等进行的光谱学分析和利用已知的Ellmann-试剂对分子内部还原性巯基的测定，可以确定待分析的蛋白质是否完全变性、二硫键有无完全打开。这些完全还原和变性的蛋白质是最佳分离的蛋白质样品，它们具有最大的水合动力学分子大小，并作为接下来动态修饰的原料。蛋白质的变性和还原都在含有已知变性剂和还原剂如：盐酸胍和DTE（1，4-二硫赤藓糖醇）的缓冲体系中进行。蛋白质浓度可达20毫克每毫升，变性剂最高8摩尔，还原剂可达0.4摩尔。通过提高温度、改变pH值、添加其它的辅助试剂，可使蛋白质最佳变性伸展。进行去除还原剂的色谱分离时，最好采用含有高浓度变性剂、低pH的缓冲液。变性去折叠不含二硫键的蛋白质通常无需还原剂。对液相色谱分离后的蛋白质样品验证确定其最大水合动力学分子大小时采用光谱学方法，可首选使用动态光散射技术（DLS）。 

3.蛋白质的动态修饰 

处于完全变性的蛋白质分子具有最大的水合动力学分子大小。通过溶液稀释快速改变变性剂的浓度或者改变体系的温度或pH值，变性的蛋白质分子会重新折叠卷曲，此时，其水合动力学分子大小会逐渐下降。在此期间，定时进行化学或生物反应修饰，蛋白质的复性重折叠将由于其侧链基团受修饰剂的空间位阻影响而终止，蛋白质转变成形式多样且结构相对稳定的中间物。此时它们结构各异的特征，对含有二硫键的蛋白质来说，取决于对已还原的含有二硫键蛋白质重新氧化的试剂及溶液条件，对不含二硫键的蛋白质来讲，取决于构建交联键时所使用的交联剂及反应条件。本发明发现，蛋白质修饰类型的多样性对于完整表征蛋白质折叠过程是必不可少的。此外，对蛋白质折叠过程，尤其是快速折叠过程，表征的准确度和精密度取决于试剂的选择和试验方法的反应速率。由此，重新折叠的蛋白质修饰的多种可能性保证了重新折叠过程中所有形式的中间物都能够用适当的试剂进行修饰，并且可以根据其结构特点被区分，根据其个体的性质特征被鉴定。 

修饰可以根据表征标的采取不同的实施形式，可根据所研究蛋白质的种类、类型、大小，组合使用适当的策略和方法以及如下所述适当的化学试剂药品和材料。本发明指出，修饰主要针对蛋白分子中一些特别的氨基酸残基，如：半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及复性折叠蛋白质的N-和C-末端。根据种类、类型、修饰范围、修饰的应用目的，蛋白质的修饰反应可以被分为以下表述的多种实施操作形式： 

–对含有二硫键蛋白质的动态修饰 

–对不含二硫键蛋白质的动态修饰 

–对多结构域蛋白质的动态修饰 

–对体外模拟共翻译和翻译后的动态修饰 

–对体外模拟蛋白质折叠的动态修饰 

–对蛋白质生物合成的体外动态修饰 

根据本发明，对含有二硫键蛋白质的动态修饰发生在原含有二硫键的已还原、变性蛋白质重新氧化的过程，在期间，按一定时间间隔依次取出样品用那些可以封闭蛋白质中游离巯基的侧链基团反应试剂进行单项修饰反应，从而固定住具有不同结构特点和水合动力学分子大小的各种含有天然和非天然二硫键的中间物。由它们所含二硫键的信息可以得知蛋白质酶解片段相互连接的识别特征图谱。与此同时，残留的巯基通过和特异的侧链试剂反应而被封锁。复性折叠过程中这种二硫键形成的状况是对折叠中间物分类划归为不同折叠途径的一个基础。为了对折叠途径以及相互关联的中间物的特性进行更精确的划分可以使用多项修饰法，即对蛋白质分子中的半胱氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基和精氨酸残基分别地用相应的特异性侧链修饰剂进行反应处理，也可用单项修饰试剂，例如碘化乙酰胺，在一个控制好的反应条件下，如梯度变化的pH值环境来处理。 

根据本发明，对不含二硫键蛋白质的动态修饰发生在不含可形成二硫键巯基的蛋白质的复性折叠过程，在期间，依据蛋白分子序列的特征和被修饰侧链基团结构上的可接触性以及可行的单项，多项修饰和/或分子内交联修饰的酶切图案，按一定时间间隔依次取出样品用相应的侧链基团反应试剂进行修饰反应。单项修饰是针对频繁出现并在蛋白分子序列中合理分布且易于与特异性侧链修饰剂反应的某种氨基酸残基。多项修饰适用于由多个不同氨基酸在蛋白质序列中优化分布的肽链，最少使用一种特异性侧链修饰剂便可对其进行修饰。对这些氨基酸可以分别使用各自特异的修饰剂通过改变反应条件来修饰，或者通过混合并行分开进行的多侧链修饰剂反应来修饰。肽链交联修饰可确保肽链内形成类似二硫键的桥状连接，使酶解的蛋白质片段相互交联，赋予折叠中间体修饰后有关修饰集团的类型、数量、修饰位点以及酶解交联片段识别模板的特征信息。这些特征信息来源于复性折叠蛋白质中间体自身所处的微环境，因此是确定折叠中间体水合动力学分子大小和对不含二硫键蛋白质折叠中间体的折叠路径归属分类的依据。 

根据本发明，对具有多结构域蛋白质的动态修饰发生在变性多结构域蛋白质的复性折叠过程中，在期间，彼此相互独立且孤立的或者彼此相互依赖且组合在一起的多结构域蛋白质，按一定时间间隔被依次取出其复性折叠样品，依据其序列、结构和酶解方面的特征和属性分别选择使用单项，多项和/或者分子内交联修饰剂进行相应的修饰反应。在这里，可使用零长度直接交联剂、双端同源功能交联剂、双端异源功能交联剂、生物素标记试剂或其他一些试剂，赋予多结构域蛋白质类似二硫键的桥状连接，使酶解的蛋白质片段相互交联。此外，还可以通过使用一些辅助试剂促使大的、多结构域蛋白分子充分变性。 

对于含有二硫键的结构域或多结构域蛋白质，在重新折叠和修饰之前，需要使其完全的变性、还原，并分离去除其还原剂。 

根据本发明，对体外模拟共翻译及翻译后修饰的动态过程被定义为： 

–第一，对不含二硫键、完全变性的蛋白质分子或者含二硫键、完全变性且还原并去除还原剂的蛋白质分子进行折叠表征，再用化学试剂或酶制剂或者专用于体外转译后修饰的细胞提取物，在该蛋白分子重新折叠时对其进行体外模拟翻译后的修饰，期间，按一定时间间隔依次取出样品，按需用相应的侧链基团反应试剂进行修饰反应，由此产生的各种中间物通过凝胶电泳或是色谱的方法分离，并依本发明工艺的后续步骤操作，通过与没有进行翻译后修饰的表征结果的对比，表征和了解体外模拟翻译后修饰的过程和程度。 

–第二，体外模拟翻译后修饰过程的表征，可通过使用相同的以氮¹⁵N和/或炭¹³C同位素标记的蛋白质以及进一步的质谱对比来量化，为此，可将两种用与未用同位素标记的同一蛋白质按照一定的比 例混合，然后根据本发明对其修饰过程进行表征。 

–第三，对一个折叠过程已得以表征的蛋白质，为了鉴定区别其共翻译修饰和翻译后修饰，可先对共翻译修饰的过程和程度使用专为共翻译修饰制备的无细胞生物合成系统依本发明的操作步骤进行表征。其表征过程的产物，即在体外生物合成且同步被修饰的蛋白质，经过电泳或/和色谱分离、变性、还原和去除还原剂，依本发明工艺的后续步骤进行复性折叠表征，然后与一般折叠过程的表征以及翻译后修饰过程的表征结果比较。 

–第四，对一个体外模拟共翻译和/或翻译后修饰过程得以表征的蛋白质，可以在相同的无细胞蛋白质表达体系中加入候选作用物质并调整生理生化条件对其修饰过程进行表征，通过比较和相关分析这两个表征的过程，筛选对其修饰过程起作用的化学和生物学的促进剂或者抑制剂以及其它影响因子，确定候选物质的作用与效果。 

–所有体外模拟的翻译后修饰过程都可以利用蛋白质固定化技术和蛋白质芯片技术实现高通量操作，并依不同的目的和愿望对这两个重要技术在本发明的应用领域进行不同形式组合使用，例如，用于优化体外翻译后修饰生物药物的生产条件。 

根据本发明，对模拟体外蛋白质折叠的动态修饰，以下列实施方式为例定义如下： 

–第一种实施方式，对一个完全变性原不含二硫键的蛋白质或完全还原、变性且与还原剂分离的原含二硫键的蛋白质，在其折叠过程已先根据本发明完整表征的情况下，可以并行的在不同的分子环境条件下，通过改变蛋白质浓度、温度（包括冻结和解冻）、溶剂、离子强度，pH值和其他使蛋白稳定或/和不稳定的试剂，进行体外折叠过程的模拟，以表征蛋白质折叠形成多聚体的过程。在这里，将没有发生聚集的折叠过程作为对比。处于折叠过程中的蛋白质样品先被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，为进一步表征其折叠过程做好准备。 

–第二种实施方式，对两个或两个以上完全变性、去折叠，必要时分离去除还原剂的蛋白质，如果其折叠过程已根据本发明完整表征，可以并行的在不同的分子环境条件下，通过改变蛋白质浓度、温度（包括冻结和解冻）、溶剂、离子强度，pH值和其他使蛋白稳定或/和不稳定的试剂，进行体外折叠过程的模拟，以表征不同蛋白质折叠时彼此间相互作用的过程。在这里，把没有发生蛋白质之间相互作用的折叠过程作为对比。处于折叠过程中的不同蛋白质，要么分别单个的进行反应，定时取样混合，用特异性的侧链试剂作选择性的修饰，为进一步表征其折叠时彼此间相互作用的过程做好准备;要么直接在一起反应，定时取样，用特异性的侧链试剂作选择性的修饰，同上，为对其进一步表征做好准备。 

–第三种实施方式，对一个完全变性原不含二硫键的蛋白质或完全还原、变性且与还原剂分离的原含二硫键的蛋白质，在其折叠过程已先根据本发明完整表征的情况下，可以并行的在含有不同的候选生物或/和化学抑制剂或/和辅助剂的反应条件下，进行体外折叠过程的模拟，以筛选寻找对蛋白质折叠产生影响的生物或化学药学物质。在这里，把不含有候选抑制剂和辅助剂的折叠过程作为对比。在样品中处于折叠过程的蛋白质先被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，然后分离、片断化、质谱测定，为进一步表征其折叠过程和对其表征结果进行比较做好准备。 

–第四种实施方式，对一个完全变性原不含二硫键的蛋白质或完全还原、变性且与还原剂分离的原含二硫键的蛋白质，在其折叠过程已先根据本发明完整表征的情况下，可以并行的在含有已知折叠酶或/和分子伴侣的反应条件下，为检验折叠酶和分子伴侣对其折叠过程的影响，模拟体外折叠过程。 在这里，把不含有折叠酶和分子伴侣的折叠过程作为对比。处于折叠过程中的蛋白质样品先被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，然后分离、片断化、质谱测定，为进一步表征其折叠过程和对其表征结果进行比较做好准备。 

–第五种实施方式，对一个完全变性原不含二硫键的蛋白质或完全还原、变性且与还原剂分离的原含二硫键的蛋白质，在其折叠过程以及某种折叠酶或/和分子伴侣对其的影响已先根据本发明完整表征的情况下，为了筛选寻找该折叠酶和分子伴侣的有效抑制剂，可在含有折叠酶或/和分子伴侣以及其候选抑制剂的反应条件下，对其进行折叠模拟。在这里，对各种候选药剂可以并行研究分析，不加候选药剂的实验组被设为阴性参照。在折叠过程中被定时取出的蛋白质样品用特异性的侧链反应试剂进行选择性的修饰。通过继续对其的表征和对表征结果的比较分析，可以确定候选药剂对折叠酶或/和分子伴侣抑制剂的影响。在实验中所用的折叠酶和分子伴侣可以直接加入反应中，对使用细胞提取物模拟无细胞蛋白质生物合成的反应，可在反应启动前将折叠酶和分子伴侣加入。这种通过对蛋白质进行体外折叠模拟及动态修饰的方法技术，可用来寻找发现蛋白质折叠或降解的辅助剂和抑制剂，开发新型生物医药。 

–第六种实施方式，对完全变性去折叠的肽链或者蛋白质，在其折叠过程已得以完全表征的情况下，为研究受控条件下多肽链和蛋白质分子的自我组装以及多聚体化过程，可以并行的在含有影响折叠的生物性或/和化学性因子的反应条件下，并在必要时加入影响肽键形成试剂的情况下，进行体外折叠过程的模拟，以研发生产纳米蛋白质材料。在这里，把不含有生物或/和化学影响因子和肽键形成试剂的折叠过程设为阴性参照。在折叠过程中同步自我组装以及多聚体化的蛋白质样品被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，为进一步表征其折叠过程做好准备。 

–第七种实施方式，对由于错误折叠而导致疾病的蛋白质先进行折叠过程的表征，然后可以并行的在含有生物性或/和化学性折叠稳定候选剂的反应条件下，对其进行体外折叠过程的模拟，筛选寻找具有药理作用的蛋白质分子伴侣用以治疗这类由蛋白错误折叠引发的分子疾病。蛋白质折叠稳定剂可以特异性的与未折叠的蛋白分子结合且稳定、促进蛋白质折叠，或是掩盖住错误折叠的蛋白分子的疏水域，从而提高其水溶性避免这些未折叠蛋白分子相互聚集。在这里，不含有生物性或/和化学性折叠稳定候选剂的折叠过程被设为阴性参照，在折叠过程中已含有生物性或化学性折叠稳定候选剂的蛋白质样品被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，为进一步表征和评估其折叠过程做好准备。 

–第八种实施方式，对朊蛋白先进行折叠过程的表征，然后可并行的在含有生物性或化学性折叠影响物质的条件下通过调节去稳定条件因子，例如温度、pH值和离子强度，一方面为了表征PrP^C（Prion Protein cellular细胞朊蛋白）向PrP^Sc致病朊蛋白（Prion Protein Scrapie羊瘙痒症朊蛋白）重折叠及产生分子聚集的过程;另一方面为了表征致病朊蛋白（PrP^Sc）向细胞朊蛋白（PrP^C）翻转折叠及减少分子聚集的过程，对其进行体外折叠过程的模拟，用以解释其发病机理及筛选寻找其治疗方法和预防的可能性。在这里，不含有生物性或化学性折叠影响物质的折叠过程被设为阴性参照，在折叠过程中已含有生物性或化学性折叠影响物质的朊蛋白质样品被定时取出，用特异性的侧链反应试剂选择性的进行修饰，为进一步表征操作做好准备 

–第九种实施方式，对一个标的蛋白质先进行折叠过程的表征，然后使其变性、还原，完全去折叠并去除还原剂，在其复性折叠过程中要么通过供给的光能和热力学能进行催化加速其异构化、脱酰胺化、外消旋化的过程；要么通过自由基作用、氧化应急效应、分子环境影响进行分子修饰，由此对 其进行体外折叠过程的模拟，用以探索、研究、解释蛋白质分子的衰老过程，研发针对蛋白质分子的生物及化学抗氧剂。在这里，不发生异构化、脱酰胺化、外消旋化、自由基反应、氧化应急效应，分子环境影响的分子修饰折叠过程被设为阴性参照，在折叠过程中蛋白质样品被定时取出，用同样的特异性侧链反应试剂选择性的进行修饰，为进一步对其的表征操作做好准备。 

根据本发明，对体外蛋白质生物合成的动态修饰定义如下：一个折叠过程已得以表征且处于无细胞生物合成体系进行快速合成的蛋白质，被定时取样冷存、混合、变性，必要时还原、去除还原剂，并通过凝胶电泳法或色谱的方法分离，产生事先依据氨基酸链长度定义的多肽链片段。每个这些片段具有一定的肽链长度和可能出现的相同分子量，但是具有不同的构型，被称作小型中间体。对这些被分离的多肽片段可用特异性侧链反应试剂进行修饰，用以进一步表征蛋白质生物合成和共翻译修饰的进行过程。在这里，被生物合成的小型中间体的长度可通过合理投放所需的同位素标记的氨基酸来实现，无同位素标记的氨基酸在此也可以使用。这些小型中间体生成的时间点可以依据其长度与完整氨基酸序列长度的比例关系来重新定义。 

根据本发明，对可选择使用的蛋白质折叠修饰操作形式定义如下： 

–单项修饰：选择性地只针对一种氨基酸的残基使用一种特异性侧链反应试剂，在最佳反应条件下进行的修饰化学反应， 

–多项修饰：选择性地对一种或多于一种氨基酸的残基使用一种或多于一种侧链反应试剂，在不同的反应条件下进行的修饰化学反应， 

–分子内交联修饰：选择性地使用双端功能侧链反应试剂，在不同的反应条件下以不同的实施方案进行的双重修饰化学反应。 

根据蛋白质折叠的特殊时间段，可从现有技术中选择适宜的修饰方法。具体方法的选择取决于修饰反应的速率，它依赖于侧链反应剂的反应速度和被修饰蛋白质的性质。因此，根据修饰反应速率的不同，我们可以将方法分成如下三类： 

–修饰反应速率的时间尺度范围从纳秒、微秒到毫秒 

这一时间速率范围适用于研究以毫秒至秒的速率折叠的蛋白质。属于这一快速折叠阶段的包括氢键的形成、二级结构单元的形成、肽链的疏水折拢。这类超快修饰反应可以，例如通过使用特异性的侧链反应试剂、或者通过由光化学能或热力学能引发的脯氨酸和天冬氨酸的异构化，以及天冬酰胺脱酰胺基的反应来实现。 

–修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到分钟 

这一通过使用微波技术可实现的时间速率范围适用于研究以毫秒至秒的速率折叠的蛋白质。这类快速修饰反应涉及到快速折叠阶段和形成折叠路径中间体的早期阶段。 

–修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到数分钟 

这一时间速率范围适用于研究以秒至数小时或数日的速率折叠的蛋白质。这类修饰反应大多涉及到缓慢折叠阶段，期间，继续产生归属不同折叠路径的中间体，出现相对稳定的溶球态紧密结构，所有中间体持续折叠，直到重新折叠到其原始天然结构状态，并达到最低能量状态。 

快速折叠阶段的修饰可以在相应的反应体系中，根据需要使用可与小型微波仪器和光谱检测器耦合连接的断流淬灭技术(Quenced-Flow）、断流分析技术(Stopped-Flow)、连续流动的方法(Continuous-Flow) 以及震荡混合技术(Turbulent Mixing)。缓慢折叠阶段的修饰可使用常规方法进行。对一个复性折叠蛋白质成功修饰的最基本的标准是，使所有通过修饰所捕获的中间产物能够成为具有结构相对稳定可以相互分离、且拥有各自独立特征的折叠中间体。 

根据本发明，修饰蛋白质的可选试剂包括，例如，如下： 

–已知和尚未知的功能相同的蛋白质的变性剂， 

–已知和尚未知的功能相同的可以有效还原蛋白分子中的二硫键的还原剂， 

–已知和尚未知的功能相同的有效的再氧化剂，包括与其相配的组合物及变量组份，主要用以修饰含有二硫键的蛋白质， 

–已知和尚未知的功能相同的含有或不含有同位素标记的有效特异性侧链基团修饰试剂， 

–已知和尚未知的功能相同的具有荧光和电子自旋标记（spin label）报告基团的修饰剂，具有较小分子质量且较少改变蛋白质分子电荷性质的修饰试剂，还有标记修饰试剂DIGE(Difference gel electrophoresis), 

–已知和尚未知的功能相同的可以用来分子内标记的零长度直接交联剂、双端同源功能交联剂、双端异源功能交联剂，包括光敏标记修饰试剂， 

–已知和尚未知的功能相同的生物素标记试剂。 

根据本发明，需要的和可供选择的特别在大分子蛋白质修饰和/或氧化时用以稳定、改进、提高自然折叠效率的辅助物质包括如下： 

–已知和尚未知的功能相同的被称为折叠因子的折叠酶、分子伴侣类辅助物质， 

–已知和尚未知的功能相同的用以减少蛋白质错误折叠，减少蛋白质分子的聚集，提高所应用的生物性/化学性物质的热力学稳定性，优化生物技术生产的药物蛋白复性折叠的辅助物质，它们在本发明各种蛋白质修饰的实施方式中都可以得到应用。 

本发明涉及执行其工艺方法的各种工具，包括系列检测实验试剂盒，特殊的实验仪器，对应的软件，用以实施各种形式和类型的蛋白质折叠修饰。为有利于对修饰反应中修饰蛋白质的分离，蛋白质分子可以先固定在基质上，修饰后冲洗去除反应体系中的其他成分，随后再通过化学或光化学方法将被修饰的蛋白质与固定基质切割，以备分离。该方法适用于所有要修饰的蛋白质。 

4.中间物的分离、量化及二维展示水合动力学分子大小和数量对其形成时间的函数关系 

根据本发明，所有上述折叠中间物的修饰可以用两种操作方式，即基于它们在不同时间点形成的水合动力学分子大小和数量进行手动或者自动化的分离、量化，并把水合动力学分子大小或热力学分子大小和数量作为其形成时间的函数，相应于4阶段多重折叠路径模型进行二维展示。由此，可以得到反映折叠路径形成过程的蛋白质折叠指纹图谱。 

第一种操作方式以电泳分析方法为基础。实验中，使用毛细管电泳，同时采用本发明的特殊聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，这种新型电泳仪及方法主要是针对球形亲水蛋白，它根据所研究蛋白质的类型、大小、数量的变化需求，设计有可以变换的功能结构单元。折叠中间体的水合动力学分子大小及其数量在电泳后直接在凝胶上以具有不同染色强度的泳带的形式，对应其先后生成的时间顺序，得以二维展示，以待扫描、数字化和进一步的研究。那些在凝胶上于不同时间样品泳道出现的具有相同泳动位置 的泳带，都具有相同水合动力学分子大小，也都是相同的折叠中间体。 

如果在一条泳带中含有多种折叠中间体，可从凝胶上取下泳带先电洗脱，再用由发明人设计的微型柱根据折叠中间体分子表面电荷、亲水基团、疏水基团的分布差异进行色谱分离，随后再用DLS（动态光散射技术），SLS（静态光散射技术），CD(圆二色法),荧光法来对其水合动力学分子大小进行区分辨别。 

根据本发明改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可以提高对折叠中间体的分离和分辨能力，优化分离选择性和清晰度，减少电泳的时间，不同于传统电泳方法，专用于分离区别只从一种蛋白质分子产生的各种折叠中间体水合动力学分子大小的细微差异。它包括了至少五点技术上的提高： 

–第一，连接一个可以在电泳过程中控制电泳缓冲液浓度、组成、pH值的输送系统，它既可以通过在缓冲液储缸的阴极端连接一个充满所需缓冲液并有渗透性元件的容器装置来实现，也可以通过在缓冲液的阴极端配装一个用细管与外面盛有所需缓冲液容器相连接的溶液分配器来实现。这可使所需的缓冲液根据需要的速度连续或不连续的且按需定量的输入电泳系统。 

–第二，通过在电泳过程中对缓冲溶液的输入调节来动态控制和优化折叠中间体的分离分辨率和清晰度。由此可行的对缓冲液的浓度、组成、pH值的动态调整和设定提高了蛋白质折叠中间体之间的电荷、极性以及离子流的差异。在这里提高的分离分辨率不再仅仅基于蛋白质分子本身的电荷分布和构型形式，还取决于那些由此新引入的辨别因子，即动态改变的折叠中间体的表面电荷和极性分布，以及它们与额外离子流不同的相互作用。 

–第三，应用脉冲驱动电泳技术，通过短时间提高电压、短时间改变缓冲液组份的极性和/或者浓度、短时间的调换电泳电极，结合使用高度疏水的反离子以便聚焦单条泳带和扩增含有折叠中间体泳带之间的距离。 

–第四，使用不同成分和性状的凝胶，比如：对于较大的蛋白，可以采用孔梯度凝胶来分离。 

–第五，为了减少折叠中间体由于热效应引起的在凝胶泳带之间的扩散，进行电泳的温度不能超过10℃，电泳设备或者和一个有效的冷却恒温器相连，或者将其和由制冷元件和液体循环冷却槽构成的装置组装在一起，以便凝胶及时得以散热。 

第二种操作方式是基于本发明的单极柱和多级柱的液相色谱分离法，包括微型化的场流分离（FFF）和必要时使用的和光谱分析仪器，如DLS和SLS，耦合连接的微型电泳层析柱，用以分离区别它们的水合动力学分子大小。这些仪器适合于分离区分所有蛋白质中间体的水合动力学分子大小，特别是针对一些不适于电泳分离的蛋白质，包括强酸性、强碱性、疏水性的蛋白质，还有膜蛋白和非常大的蛋白质，这些蛋白质的折叠中间体用凝胶电泳方法不能有效分离。所有被分离的折叠中间体被分别置于小容器，进行其水合动力学分子大小的波谱学或必要时热力学区别，然后按照其大小顺序对应它们的形成时间点，即定时取样时间点，通常以二维的形式排列在微孔试验板里以备后用，同时将数据记录入库。 

单级柱液相色谱被定义为,按照需求与波谱学设备耦合连接的用不同的分离介质填装的微型凝胶色谱柱或者微型场流分离器，用以直接确定每个分离组份里折叠中间体的水合动力学分子大小的顺序。 

多级柱液相色谱被定义为按照需求对微型分离柱串联和/或并联的组合，微型分离柱包括凝胶色谱柱、羟磷灰石柱、疏水柱、离子交换柱、反相色谱柱、亲和色谱柱，还有微型场流分离器等，专用于分离 一些水合动力学分子大小非常接近和折叠路径的归属尚未确定的折叠中间体。由此分离的折叠中间体被分别置于系列小容器内，大多使用微孔试验板，然后对其进行水合动力学分子大小的波谱学或必要时热力学鉴定区别，排列其水合动力学分子大小的顺序，数据记录入库，同时归类标示水合动力学分子大小与其形成时间的二维函数关系。 

对分离后分别置于系列小容器内的折叠中间体的水合动力学分子大小的波谱学区分与量化，首选使用DLS(动态光散射)和SLS(静态光散射)，也使用荧光、UV(紫外)/VIS(可见光)、CD(圆二色)、NMR(核磁共振)、傅立叶变换红外、ESR(电子自旋共振)等各种商业产品。 

单个分离样品中的折叠中间物，要么具有不同的水合动力学分子大小，要么具有近似的水合动力学分子大小但可能属于不同的折叠途径，可以使用本发明改进的动态和静态光散射（DLS和SLS）装置，来实现对这些中间物特异性的区分。其区分能力可以通过以下至少一种方法得以提高： 

–通过延长检测时间来提高分辨率， 

–通过程控升温的Tm(熔点温度)区分， 

–通过对样品用内置的真空蒸发或通风浓缩装置单元进行浓度改变， 

–通过使用微型自动滴定器或手动移加所需缓冲液组分来改变pH值及缓冲溶液体系， 

–通过测定并分析样品的固有黏度和界达电势，进一步对中间体进行结构性区分， 

–通过提供或去除能量，如以辐射、加热、冷却、超声波、微波、电场、磁场等的形式，来改变样品的生物流变学性质， 

–通过使用一些特别开发的测评和排比软件来对折叠中间物进行进一步的区分。 

通过使用功能改进的与双串混合式断流淬灭或断流分析设备耦合连接的动态光散射（DLS）装置可以确定一个蛋白质的折叠指纹图谱，展示其在定义的折叠阶段形成各种折叠路径的过程，并可借助图形软件将其可视化演示。在这里，完全变性去折叠的蛋白质首先在第一个混合器开始复性折叠，接着在不同的时间间隔里通过第二个混合器进入动态修饰，与此同时，为了确定折叠中间体在这些时间间隔水合动力学分子大小的分布，进行动态光散射测定。 

这种与波谱检测装置耦合连接用以区分水合动力学分子大小的液相色谱方法，将依据待测蛋白质的物理化学性质和研究目的分别用本发明定义的微量型、分析型、半制备型的色谱来进行。 

微量型级别的操作仅需要非常少的蛋白质，用以对少于100ug蛋白质的微量修饰样品的快速处理，包括并行使用本发明的串联及并联的微型凝胶色谱柱。其分离洗脱组份大多用微孔试验板收集，用波谱检测法确证其水合动力学分子大小和浓度差异，以备进一步的酶切过程。 

分析型级别的操作需要至少1mg的蛋白质，它主要用于分离一些中间物，其水合动力学分子大小非常近似，在微量级的分离中还不能被完全区分，或是其折叠路径归属性还需进一步确定。分析型级别的操作要用到多级柱的液相色谱，它为下一步动态光散射测定（DLS），波谱学的结构分析，酶解片段化和其他必要的研究提供足够的蛋白质样品。 

半制备型级别的操作需要1mg以上的蛋白质，其所用到的原理同微量型、分析型的相同，但它主要用于制备核磁共振或晶体结构分析的折叠中间体样品，以便对折叠中间体的水合动力学分子大小通过结构变化的各自特征更准确的区分辨别。其操作可通过组合现有技术仪器设备进行。 

上述的折叠中间体修饰的两种操作方式，根据本发明，可以通过选择性的组合现有技术及仪器设备，如电泳、液相色谱、电层析、场流分离以及波谱检测技术，包括动态和静态散射技术，使其标准化、部分或完全自动化和微型化，并与本发明的其它操作步骤以联机或各自独立的形式相容连接。 

5.通过胶内酶解或溶液内酶解使中间体片段化 

中间体片段化裂解是对其折叠路径进一步精确区分的第一步。对那些用电泳或色谱法分离且对其水合动力学分子大小和形成时间都已确定的中间体首选用胰蛋白酶进行酶解片段化。除了胰蛋白酶外，也可以使用其他的一些蛋白质内切酶，如Lys-C、Glu-C、Asp-N，常用于由于蛋白质修饰致使胰蛋白酶的切点被保护而产生胰蛋白酶抗性的情况，也用以获得额外的有益切点。外切酶和化学裂解可作为各类质谱方法（MALDI-TOF-MS/MS和MALDI-TOF-PSD(Post Source Decay)的补充，从蛋白质折叠中间体酶解片段的N-端或/和C-端来水解氨基酸，由此来区分原本具有相同和非常近似分子量的中间体片段。所有酶解片段化可以手工操作，也可使用已经商品化的酶解装置，或是采用本发明为此特别设计的具有样品平均通量的微波酶解仪。在微孔试验板里片段化的样品可以与质谱仪以联机或脱机耦合操作的形式进行进一步检测。 

用电泳分离后经考马斯亮蓝或银法染色的折叠中间体,以不同染色泳带的形式，对应其电泳给样的时间间隔及顺序，在电泳凝胶上形成二维展示，随后给予拍照，数字化扫描。对各泳带染色密度的评价及对其中所含折叠中间体的量化可使用密度测定仪。折叠中间体之间的动力学关系可以用相关软件表述。用不同的荧光染料标记并通过电泳分离的样品可用荧光检测器检测并把结果数字化。若一条泳带里含有多种中间体，那么这些混合中间体可先通过微型柱色谱分离，随后再对每个组分进行酶切。所有处于凝胶泳带中的折叠中间体既可采用专用工具人工取出，也可以使用凝胶色带样品识选机自动将其取出，随后用标准方法进行酶解，还可以用本发明的酶解器和多功能微孔试验板使其在胶内酶解片段化。酶解样品用于质谱分析，外切酶或者化学降解可进一步在剩余的胶内酶解样品中进行。 

对用色谱法分离到的折叠中间体的片段化，既可在微孔试验板里用标准溶液内酶解法进行，也可以类推使用本发明的酶解器和多功能微孔试验板进行溶液内酶解。 

6.用质谱仪检测片段化的折叠中间体 

质谱检测是对每一中间体的折叠路径进行精确区分的第二步，使用的质谱仪包括ESI-TOF-MS（电喷雾离子化-飞行时间-质谱），MALD-TOF-MS（基质辅助激光解析/电离-质谱），MALDI-TOF-MS/MS（串联质谱）和MALDI-TOF-MS-PSD（Post Source Decay源后衰减质谱）等等。 

用质谱检测所有酶解的单体分子片段和由二硫键和/或其他交联键连接的大分子片段的分子量。所有得到的信息存入数据库中。使用该数据库可对所有可能存在的中间体和其酶解片段，包括所有由交联键形成的大片段，借助于商业化软件或由本发明专为此开发的软件进行分析和信息储存。 

7.对折叠中间体折叠路径归属的确定 

确定中间体折叠路径归属的关键一步是把用质谱收集到的所有折叠中间体的单体片段，以及由二硫键和/或其他交联键连接的多体片段的数量和质量，与在数据库里储存的理论片段质量识别模板相比较。如前面所述，蛋白质进化理论和蛋白质折叠动力学理论的准则，在这里可用来补充和完善对中间体折叠路径归属性的确定。 

每个片段化的折叠中间体的特征取决于在折叠过程中对其进行修饰时的条件，其特征可以通过比较来 识别并用一定的名称标志注释。所有在不同时间点产生并分离的中间体的各自特征可按同理进行比较、识别和赋名注释。由此可借助于专用软件自动排列，制成表格。在表格第一列填入的水合动力学分子大小，从上到下逐渐减小。在连续纵列中填入的折叠中间体生成时间，从左到右逐渐增长。所有被检验的中间体将由此根据其特征，即水合动力学分子大小、生成时间点和必要时对其的量化值在这个表格中给予定义，并在接着的纵格中相应填入对各个中间体的标志注释。具有标志注释共性的中间体被划分归组，并用一个自然数标记，然后将其填入后边的纵格。如果一个中间体归属于其中的一个小组，其折叠路径的归属性将由该小组标记的自然数确定，并将其填入后边相邻的纵格。 

若中间体的折叠路径仍然不能确定，则可用在第四步骤中所述的分析型和半制备型色谱进行进一步分析，其中色谱装置要和改良的DLS动态散射仪和SLS静态散射仪偶联。必要时，这些中间物还要通过CD,UV,NMR波谱学分析等来研究其结构和热力学性质，来最终区分其不同的折叠途径。 

这表明一个中间物的折叠路径不能通过本身而确定，而由它被分类归组后的组员属性及由此而定义的折叠路径归属性来确定。 

8.中间体的识别鉴定及分类 

鉴定一个蛋白质的折叠中间体是通过先确定其水合动力学分子大小、形成时间、数量和接着的确定折叠途径来实现的。 

所有已鉴定的中间体可依据其各自标志注释的共性分成不同的小组。属于一个小组的中间体都具有一定的特点。这些特点因组而异，可以以如下所述采用各种形式显示： 

它们应当有相似的修饰图案。它们的水合动力学分子大小会随着折叠时间朝着天然结构的方向逐渐变小。它们至少有一种重要的中间态，这种中间态有一个相对稳定紧凑的结构，可称之为溶球态，可含有水合动力学分子大小相近且会发生分子内重排的中间物，还可以含有比较特殊的同时属于不同折叠小组的中间体，它们是形成分子重排和折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇的原因及载体。 

它们常具有相同的数量，这决定了折叠途径的动力性竞争能力。那些快速折叠的中间体常常涉及天然构象，而慢速折叠的中间体则相反，大多是非天然构象。快速折叠的那组很少存在蛋白质分子内的分子重排，而慢速折叠的那组中，则有若干中间物会发生分子间重排的现象，这会引起分子结构微环境的变化，进而导致折叠中间体之间修饰特征的变化。分子内的重排现象常常发生于溶球态。其会发生分子内重排的折叠中间体分子具有相似的水合动力学分子大小，它们可以通过由中间体修饰反应引入的不同结构特征来区分。 

被归入不同小组的中间体可根据其各组的特点进一步归类为不同的折叠途径。所有中间体的折叠途径都可以由此区分且鉴定。所有折叠中间体的水合动力学分子大小、形成时间、数量、折叠途径以及可能解析的结构信息都在该表格中被确定，以备对折叠过程进行下一步表征。 

9.折叠过程的表征 

根据本发明，对一个简单折叠过程的表征是一个二维演示的过程，即把所有折叠中间体的水合动力学分子大小对应其产生的时间顺序在一个二维坐标体系中依次并行展开，对其进行系统评价，从而达到表征。如果折叠过程具有多种途径，对折叠过程的表征可以根据相同原理在多维坐标体系中演示，包括用其附加的坐标轴来表示折叠通道或折叠路径。 

从实验结果展示中可以得出，蛋白质重折叠过程经过四个不同的阶段：即伸展的蛋白质以超快速度形 成折叠路径的种子结构的阶段；继续形成折叠路径或折叠通道的阶段；沿着已经构建好的路径或通道进行后续折叠的阶段；通过分子内重排和微结构域的调整重组的阶段，形成蛋白质的天然结构。蛋白质的折叠过程可以通过其前2个折叠阶段出现的所有中间体来表征，在这2个阶段形成折叠通道或折叠路径的实验图示可被命名为蛋白质折叠指纹。 

不同的折叠路径作为以不同速度发生的并行事件在折叠指纹里可以很清楚的得以识别，其并行事件包括分子重排和折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇等。由此可直接确定折叠路径、其相应的折叠速率和对折叠过程的贡献百分率，错误折叠的过程，折叠中间体分子内重排的产生和进行过程，天然和非天然二硫键的形成过程，天然二硫键形成的顺序，主导折叠过程的折叠中间体等等。蛋白质的折叠过程由此得以完整表征。 

由此获得的有关蛋白质折叠过程动力学的参数可以作为一个新纬度引入多维坐标系，用以更精细的表征和可视化表述蛋白质的折叠过程。 

蛋白质折叠过程的表征也可以在所有中间体的三维结构的水平上进行。这里，先对一种蛋白质的折叠过程进行表征，然后对其所有中间体按照NMR核磁共振或/和晶体结构分析所需量，根据本发明依次进行折叠修饰、构型截获、色谱分离和结构测定。这种中间体的半制备型生产可用本发明专门开发的特定方法来进行，该方法专门用以分离中间体浓度高差异的样品。 

本发明对蛋白质折叠过程进行的表征涉及到它在蛋白质功能水平上的各种应用和与其相关的各种实施方式。在这里，蛋白质的折叠过程首先根据本发明进行表征，然后进一步对其折叠过程在影响其结构变化或改变其分子生化环境的条件下进行表征，用以检验研究蛋白质在折叠分子环境改变的情况下对其功能和活性的影响。这些应用延伸包括很多内容，例如对在体外模拟翻译后和翻译中修饰的动力学过程进行表征，体外模拟蛋白质折叠动力学修饰过程和模仿体外蛋白质生物合成的过程。 

10.蛋白质折叠过程的图形化和可视化表示 

如果一种蛋白质的折叠过程根据本发明进行表征，所有参与的中间体具备4个独有特性，可以在三维的或四维的数字化的多维坐标体系中表示出来，这些中间体特性包括水合动力学分子大小、形成时间、归属的折叠路径和对再折叠所贡献的百分比。例如，可以以根据水合动力学分子大小和凝胶泳带所确定的中间体能量状态为y轴，以形成时间为x轴，以根据折叠途径特性定义的折叠路径或通道为z轴，同时适当地加入中间体对再折叠所贡献的百分比作为整合的第四维，做出多维坐标系图。这样，辅助运用适当的电脑图形软件，使蛋白质的折叠过程用不同的方式以图形可视化和动画展示成为可能。 

所有运用本发明以各种不同的实施方式表征的折叠过程，可以根据相同原理多维可视化和/或者动画形式展示。 

从用中间体的4个特性所定义的坐标轴的可转换性和这些坐标轴的重新组合的特性，可以看出，怎样在不同的多维坐标体系展现蛋白质的折叠过程有很多的可能性，同时上文提到的各种表征实施方式及表征的折叠过程都可由此多样化的可视化展示。蛋白质折叠的特征化体现和过程也可以用很多不同的方式展示出来。4个坐标轴的可转换性意味着各个坐标轴表示意义的可代替性，例如：可以用折叠中间体的能量状态数值代替其水合动力学分子大小或凝胶泳带迁移率，用折叠过程中构象的减少量代替折叠的时间顺序;用折叠路径的运行特性代替折叠路径归属性;用中间体折叠贡献百分比代替中间体数量。可组合性意味着不同的坐标轴可以相互搭配融合，例如：折叠时间和中间体数量结合可以用来表述蛋白质折叠动力学;中间体能量状态和数量可以共同说明中间体对折叠所做贡献的大小;中间体 折叠运行走向和数量共同表示折叠能力的情况等等。 

折叠蛋白质中间体的空间结构与其能量状态之间的对应关系,可以用多维能图模型以不同的形式定量地展示出来。折叠的各条个路径可以在八分圆角坐标系中表示，例如，可形象地用从顶端山谷延伸的滑雪道表示；或用根据对折叠贡献大小定义的2个或4个八分圆坐标轴表示；不同的折叠路径就像是从山谷高端滑落到谷底留下的各种轨迹。折叠路径也可以用已知的折叠漏斗模型（Schultz,2000）相应的展示。 

另外，还可以通过核磁共振技术NMR和晶体衍射技术分析鉴定所有或者关键中间体的三维结构，引入折叠中间体的第5个特征参数，扩展本发明的方法和应用范围。蛋白质折叠过程由此将以其中间体的5个特征为基础来表征，即水合动力学分子大小、形成时间、折叠路径属性、对折叠贡献的百分比和三级结构，对蛋白质折叠过程的表征结果可同时在至少5个坐标轴的多维坐标体系中进行展示并且以各种不同的方式可视化。 

本发明方法的优点 

本发明已经解决了上述在现有技术中存在的问题，并对其在本发明权力要求书的技术特征中给与表述。本发明方法与先前的技术相比的优点总结如下： 

本发明方法以蛋白质中间体的至少四个独立可数字化的特征为基础，即水合动力学分子大小、形成时间、归属的折叠途径和数量。对此，可通过各种技术性的灵活组合更好高效地应用许多现有的生物学分析方法。这令蛋白质折叠过程的表征具有以下优点：仅仅需要少量的蛋白质材料、操作简易、节省时间、可以标准化和操作常规化。对本方法的实施可由此自动化和微型化。 

本发明方法以对折叠中间体修饰的多样性为基础来确定中间体所属的折叠路径。这种修饰折叠蛋白质的多种可能性确保每个生成的中间体相应地通过修饰被独特地标记，从而可以与其他的中间体区分开来。本方法适用于各种蛋白质，例如大分子和小分子蛋白质、包含和不包含二硫键的蛋白质、强酸和强碱类蛋白质、亲水性和疏水性蛋白质，膜蛋白和多结构域蛋白质等等。 

对上述蛋白质的各类中间体的分离和对其水合动力学分子大小、形成时间和数量的确定，既可以直接通过本发明的针对亲水性和球状蛋白质的凝胶电泳技术，也可以通过液相色谱技术和随后的光谱测定方法，特别是使用DLS（动态光散射仪）来进行。 

由胰蛋白酶、其它内切酶Lys-C、Glu-C、Asp-N，外切酶以及化学分解组成的系统可以确保所有的蛋白质中间体酶解后，以合适的片段形式存在，它们均具有可形成片段识别模板的适当的修饰特征，并可用MALDI-TOF-MS/MS（基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术）和MALDI-TOF-MS-PSD（Post Source Decay质谱）等光谱学方法进行鉴定，相应地数字化处理，以备后用。 

由此表征的蛋白质折叠过程可以以多种形式进行多维展示，其中，中间体的立体构型和其能量之间的关系可以与折叠漏斗概念相对应的定量化图示（Schulz，2000）。 

本发明方法的优点也体现在其各种不同的应用上。本发明第一个首要的应用是用于表征所有类型和大小的蛋白质的折叠过程，阐明蛋白质折叠时的各种机制，包括折叠途径的形成，蛋白质错误折叠过程和分子内重排的过程等，也用于检测特定蛋白质分子病的发病原因。 

本发明的第二个应用是研究、检验和评估蛋白质复性折叠时其活性和功能的变化过程，从而提高或优化这种蛋白质生物技术生产的产率，其中，将要检测的蛋白质的折叠过程分别在有和没有底物的不同 分子环境下进行表征，然后把得到的结果进行对比和评估。 

本发明的第三个应用是用于蛋白质工程，例如，其中以表征蛋白质折叠过程的结果为基础的蛋白质修饰，蛋白质的重新设计和蛋白质之间的融合以及由此发生的蛋白质的功能和活性的改变，都可根据本发明进行分析、检测和评估。 

本发明的第四个应用是动态表征和量化体外模拟生物合成及可能出现的翻译中和翻译后修饰的过程，以优化如体外翻译后修饰蛋白质药物生物技术生产的条件和筛选对翻译中或翻译后修饰有辅助或抑制作用的化学和生物物质，其中根据本发明对模拟的动态体外翻译中和翻译后修饰过程进行表征，并对其实验结果进行相关的对比和评估研究。 

本发明的第五个应用是动态表征蛋白质在体外模拟已知体内翻译后修饰时的折叠过程，以发展翻译后修饰蛋白质药物生物技术生产的工艺方法。这些过程的表征按照本发明定义的步骤进行。被检测的蛋白质可运用蛋白质固定化和蛋白质芯片相结合的技术固定在载体上，在结束模拟体内翻译后修饰之后，将它们从包含反应溶液的化学物质、酶或细胞提取液的混合物中分离出来，然后用热学方法、光化学法、化学法或酶切法将蛋白质从支持物上切割下来，继续进行本发明下一步骤。 

本发明的第六个应用是寻找发现影响蛋白质折叠过程的生物或化学药物。其中，候选的对标的蛋白质折叠有影响的生物或/和化学抑制剂或/和辅助蛋白被整合纳入到对标的蛋白质折叠进行表征的过程中。 

本发明的第七个应用是研究检验折叠酶或分子伴侣对蛋白质折叠的影响，其中，这种影响通过对比在含有和不含有折叠酶或分子伴侣的反应条件下的表征结果予以定义。 

本发明的第八个应用是寻找发现抑制折叠酶/分子伴侣的生物和化学药性物质以及影响蛋白质降解的药物，其中，以分别含有比如折叠酶或分子伴侣的蛋白质折叠过程表征为对照，通过平行的含有和不含有折叠酶、分子伴侣候选抑制剂及蛋白质降解影响剂的表征试验，比较、评估、确定候选抑制剂对折叠酶/分子伴侣的抑制药效，以及候选药物对蛋白质降解的促进或阻断功能。 

本发明的第九个应用是研究检验多肽或蛋白质在折叠过程中受控的自组装和聚合作用，开发和制作纳米蛋白质材料，其中，对蛋白质自组装和聚合作用的初始过程进行平行的在不同的生理和生化条件下及各种生物和/或化学影响因子作用下的表征和评价。 

本发明的第十个应用是寻找发现治疗蛋白质分子结构异常病的药物分子伴侣，这些药物分子伴侣可以与折叠中的蛋白质分子特异性结合，结合后可加快折叠过程稳定蛋白质分子结构，或者可以覆盖错误折叠蛋白质分子的疏水性区域增加蛋白质的溶解度从而阻止未折叠蛋白质分子的聚集，其中，作为候选药物分子伴侣的生物和/或化学性折叠辅助稳定剂的药效，将通过对病源蛋白质进行的并行对比折叠表征来确定。 

本发明的第十一个应用就是，一方面可用于对正常朊病毒蛋白质PrP^C（Prion Protein cellular）转变到PrP^Sc（Prion Protein Scrapie致病朊病毒蛋白质)的过程进行折叠表征，包括随后的聚合过程；另一方面可用于表征研究从致病朊病毒转变为正常朊病毒的逆过程，包括为阐明发病机理而对聚集物进行的降解过程表征，由此寻找发现新的治疗手段和可能的预防方法，其中，运用对其折叠过程有影响的生物和/或化学物质，通过调节实验条件例如温度、pH和离子强度等，对朊病毒蛋白质的折叠过程进行并行表征对比实验。 

本发明的第十二个应用是研究、检测、解释蛋白质分子由于异构化、脱氨基作用和外消旋作用而导致的老化和由于自由基作用、氧化压力和环境的影响而引起的衰老的过程，开发针对蛋白质分子的生物及化学抗老抗衰药剂，其中，在标的蛋白质的折叠期间，通过光化学和热能催化加速其异构化、脱氨基和外消旋反应，或通过自由基反应及氧化压力和环境的影响引发其导致老化和衰变的修饰反应，并对由此变化的折叠过程进行表征，再将实验结果与没有这些特征化影响因子时的折叠过程进行对比。 

本发明的第十三个应用是用于蛋白质的分类（分类学范畴）和对蛋白质的进化在其分子折叠水平上的研究，其中，对折叠过程的表征结果作为每个蛋白质的个性指纹为蛋白质的功能和进化关系提供依据，并可作为辅助规范对现有的以结构、拓扑结构、同源性和进化关系为基础的分类方法进行补充。 

本发明的第十四个应用是动态表征蛋白质在折叠时与核苷酸、多糖和脂类形成复合物的过程及所伴随的活性和功能的变化情况，由此发现对复合物动态形成起作用的化学和生物物质，其中，对标的蛋白质和其复合物的折叠过程先分别进行表征，然后在标的蛋白质折叠过程中按一定的时间间隔定时取样，为了形成复合体与复合成份混合并对其过程予以表征，最后，在不同的化学和生物因子条件下，分别在提供和不提供蛋白质核酸复合物底物情况下，对复合物形成的动态过程重复进行表征、对比和评估。在制作中间体片段质量识别模板时相应记入核酸、醣类和脂质的附加质量。为了对这类蛋白质的非共价结合部分进行定性和定量测定，需在实验样品经酶解片段化后和质谱测量之前，先进行色谱分离并用光谱测定方法确定这些片段的水合动力学尺寸和质量。 

本发明的第十五个应用是诊断和预报由于蛋白质错误折叠而引起的疾病。其中，对疾病相关的蛋白质折叠过程的变化进行表征后，以折叠过程指纹图谱的形式进行展现。最后把这些变化定义为诊断或预报某些疾病的标准。 

本发明的第十六个应用是动态并行表征相同蛋白质或者不同蛋白质在其折叠过程中相互之间发生聚集的过程，包括折叠中的蛋白质和已复性天然蛋白质之间的聚集，研究揭示蛋白质聚集的机理，寻找发现化学和生物学的聚集抑制剂，其中，比较和评估待测蛋白质折叠过程与加入其它蛋白质和/或化学生物抑制剂在不同分子环境中的折叠过程。 

本发明的第十七个应用是动态表征在折叠中不同蛋白质之间或者折叠中蛋白质与天然蛋白质之间发生的分子相互作用的过程，研究检验特殊蛋白质折叠过程中的构象行为和催化性能，寻找发现具有治疗功能的靶蛋白，合理化药物设计，优化生物技术生产工艺，其中，表征、比较和评估蛋白质在优化分子环境条件下分别免受和经受其它蛋白质影响的折叠过程。 

本发明的第十八个应用是动态表征抗原抗体结合反应和抗原抗体复合体的分解过程，来优化和合理化抗体工程，其中，表征、比较和评估新设计的抗体和抗原各自的折叠过程，及其在优化的分子生理生化环境下免受和/或经受其它化学和生物化学影响因子情况下同步折叠相互结合的过程，检验评价新设计抗体的选择性、特异性、亲和性、折叠效率、热稳定性、药理动力学和生物技术生产产率以及抗原的抗原性。 

本发明的第十九个应用就是，这种方法用于对体外蛋白质早期生物合成和可能的翻译中修饰的初生折叠过程进行表征，研究检验蛋白质生物合成早期的起始折叠过程，寻找发现对蛋白质初生折叠过程有影响的化学和/或生物物质，其中，在一个生物和物理化学影响因子优化的无细胞生物合成体系，通过调节有或无同位素标记的必需氨基酸的供给进行体外模拟生物合成，收集分批合成的不同长度的被称为小型中间体的蛋白质片段，用色谱方法进行特异性分离，接着运用本发明方法对其折叠过程进行表 征和对比。在这里，对小型中间体的形成时间根据它们在整个氨基酸序列中的长度比例进行重新定义。 

本发明的另一个应用是通过构建以蛋白质折叠表征及其应用结果为基础的数据库，作为服务中心来持续扩展新的应用领域，例如，以表征折叠过程结果为基础的新型修饰、分子重新设计、药性蛋白质的分子融合，新构建蛋白质的折叠过程指纹图谱的预测。 

本发明的一个突出优点就是，其实施方式可根据不同的目的通过技术方法的组合得以延伸扩展。 

本发明方法的产物，其特征是以各种形式和方法修饰的蛋白质折叠中间体及对这些中间体，在不同的分子环境下和各种物理化学和生物化学因子的影响下的应用，所获得的并在数据库得以系统收集的有关所有被表征的蛋白质折叠过程的结果证据，可用以筛选对蛋白质折叠过程产生作用的药物，完善和优化生物技术药物生产工艺方法，优选标的药物蛋白的复性和保存条件，提高蛋白质分子修饰的效率，更新分子设计，合理化蛋白质融合，提高蛋白质类药物的结构功能、活性及药代药理特性。 

本发明方法涉及应用新材料，它们是经过完全变性去折叠然后在复性折叠过程中于不同时间间隔多样化修饰，以各种类型中间体形式存在的蛋白质，其特征是，具有不同水合动力学分子大小和相对稳定的结构形状和至少各自拥有的4个独立特征，用以采用多种实施方式对蛋白质的折叠过程在各种分子环境和不同物化生化条件下进行表征，说明蛋白质折叠、错误折叠、聚集、相互作用和自发组装、聚合、老化、衰变及其新生生物合成的机理，提高蛋白质活性和功能，优化药物蛋白质的生物技术生产，发展纳米蛋白质材料，扩展蛋白质分类学，寻找发现对蛋白质折叠和降解有影响作用的新兴生物和化学药物，以及蛋白质分子病的治疗药物及方法。 

实施本发明方法的手段工具 

用以实施本发明的工具包括本发明的系列检测实验试剂盒，本发明专用仪器设备和特定软件。本发明的实施既可以一步一步地人工完成，也可以通过部分和/或完全自动化及小型化的设备来完成，这些设备是根据本发明的构思和设计特定开发和制作的。 

系列检测实验试剂盒 

本发明系列检测实验试剂盒主要由需用的化学物质、材料、本发明组件及使用说明书组成。它们是对蛋白质折叠表征实验条件和每个操作步骤开发、优化和标准化的产物，适用于所有种类和类型蛋白质的折叠过程的系统性表征操作。它们可根据操作步骤、操作方式、实施形式和对本发明的应用种类，分别如下分类为各种即时备用的检验实验试剂盒： 

–用于制备完整去折叠具有最大水合动力学分子大小的蛋白质样品的检验实验试剂盒， 

–用于对固定化蛋白质在其折叠期间使用不同侧链试剂进行动态修饰的检验实验试剂盒， 

–用于对蛋白质在其折叠期间使用一种和/或多种荧光标记物进行动态修饰的检验实验试剂盒； 

–用于对蛋白质在其折叠期间使用同位素或电子自旋标记的侧链试剂进行动态修饰的检验实验试剂盒， 

–用于对蛋白质在其折叠期间使用生物素标记的侧链试剂进行动态修饰的检验实验试剂盒； 

–用于对含有二硫键的蛋白质在其折叠期间分别使用不同侧链的试剂进行动态修饰，并由此制作该蛋白质折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对不含二硫键的蛋白质在其折叠期间分别使用不同类型的侧链试剂，包括零长度、双端同源功 能交联剂、双端异源功能交联剂和光敏标记修饰试剂进行单项、多项和/或分子内交联动态修饰，并由此制作该蛋白质折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对球状亲水性蛋白质在其折叠期间使用不同的侧链试剂进行动态修饰，并由此制作该蛋白质折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对强疏水性蛋白质及膜蛋白质在其折叠期间使用不同的侧链试剂进行动态修饰，并由此制作该蛋白质折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对强酸或强碱性蛋白质在其折叠期间使用不同的侧链试剂进行动态修饰，并由此制作该蛋白质折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对从相互独立的多结构域蛋白质分离出的各蛋白质结构域在其折叠期间使用不同的侧链试剂进行动态修饰，并由此制作其折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对相互依赖且复合组装的多结构域蛋白质在其折叠期间使用不同的侧链试剂进行动态修饰，并由此制作其折叠指纹图谱的检验实验试剂盒， 

–用于对蛋白质在其折叠期间有它的作用底物或它可能作用的底物存在下，选择不同的物化和生化条件为研究、检验和审核其活性和功能变化情况进行动态表征的检验实验试剂盒， 

–用于对更新设计的或生物技术修饰的或/和融合的蛋白质的折叠过程进行动态表征，并在对原始蛋白质折叠过程表征的基础上检验其活性和功能变化的检验实验试剂盒， 

–用于对用无细胞方法在选择性的物化和生化分子环境下，体外模拟生物合成和可能出现的翻译中或翻译后修饰的蛋白质的折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以优化生物技术生产体外翻译后修饰蛋白质药物的条件， 

–用于对用生物或无细胞方法在选择性的物化和生化分子条件下，体外模拟体内翻译后修饰的蛋白质折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以开发生物技术生产体外翻译后修饰蛋白质药物的工艺方法， 

–用于对在选择性的生物或/和化学物质影响下蛋白质折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以检测和验证对蛋白质折叠起作用的潜在药物， 

–用于对有所选择的折叠酶或分子伴侣参与的蛋白质折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以检测和验证折叠酶或分子伴侣对蛋白质折叠所起的辅助作用， 

–用于对有所选择的折叠酶或分子伴侣和其潜在生物和化学抑制剂参与的蛋白质折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以检测和验证潜在生物或化学抑制剂对蛋白质折叠所起的抑制效果， 

–用于对多肽或小分子蛋白质在其有额外生物和/或化学影响因子参与的情况下的折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以研究检验它们可控的自组装和聚合过程， 

–用于在有潜在的生物和/或化学折叠稳定剂参与下，对异常病蛋白质的折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以测试和证实这些潜在稳定剂作为分子伴侣对病原蛋白质的药理作用， 

–用于对朊病毒蛋白质的折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以对其折叠过程有影响的生物和/或化学物质一起做平行实验，通过对去稳定条件的调控，研究检测其发病机理及证实可能的预 防和治疗的途径与方法， 

–用于对蛋白质在其折叠期间老化衰变的过程进行动态表征的检验实验试剂盒，用以分别通过输入光化学和/或热能、自由基作用、氧化压力和变化的分子环境，研究、检验由于异构化、脱氨基作用和消旋作用而引起的蛋白质老化及由于自由基反应、氧化作用和环境影响而引起的蛋白质衰变， 

–用于通过对蛋白质折叠过程进行动态表征获得关于蛋白质分类（分类学）和蛋白质进化方面信息的检验实验试剂盒，其中实验在优化的分子环境下及在依据蛋白质的种类、类型和大小不同而标准化的物理化学和生物化学条件下进行， 

–用于对蛋白质在其形成核蛋白、糖蛋白和脂蛋白复合物的折叠过程进行表征的检验实验试剂盒，其中实验在不同的化学和生物因子影响下及按需提供可能的作用底物条件下进行，用以研究、检测蛋白质与核酸、糖类及脂类形成复合物的过程及伴随的活性和功能的变化，以及加入化学和生化物质对复合物形成反应的影响， 

–用于在优化和标准的物理化学和生物化学条件下对病源蛋白质的折叠过程进行表征，并由此制作折叠指纹图谱作为疾病诊断和预报的标准检验实验试剂盒， 

–用于对蛋白质在其形成聚集体时的折叠过程进行动态表征的检验实验试剂盒，其中实验分别在没有和有其他蛋白质存在的情况下，在不同分子环境及按需加入蛋白质聚集的化学和生物抑制剂（包括可能的抑制剂）的条件下进行，用以确证、检验相同或不同蛋白质在折叠过程中折叠蛋白质之间或折叠蛋白质与天然蛋白质之间的聚集机理， 

–用于对不同蛋白质在彼此之间开始相互作用时的折叠过程进行表征的检验实验试剂盒，其中实验在合适的分子环境下分别在加入和不加入可能的作用底物或因子情况下进行，用以研究、检验和核证折叠蛋白质之间或/和折叠蛋白质与天然蛋白质之间在折叠期间的作用特征和伴随的构象变化，催化特性以及靶标药物的治疗性效果， 

–用于对蛋白质在其形成抗原抗体复合体的折叠过程和抗原抗体复合物的降解过程进行动态表征的检验实验试剂盒，其中实验在分批加入化学和生物影响因子的条件下进行，用以研究、检验和验证抗体在选择性、特异性、亲和性、折叠效率、热动力学稳定性、药理动力学及生物技术产率上的变化，还有抗原的抗原性变化， 

–用于对蛋白质在其体外生物合成和产生可能的翻译中修饰时的折叠过程进行表征的检验实验试剂盒，其中实验使用无细胞培养方法，在优化的生物和物化影响因子存在的条件下，调节有或没有同位素标记的必需氨基酸来进行，用以研究、检验和核证新生蛋白质的起始折叠过程以及对其有作用的化学和/或生物物质； 

–用于制备天然聚丙烯酰胺凝胶及电泳分离在蛋白质折叠过程中被动态修饰形成的中间体的检验实验试剂盒， 

–用于直接使用配置的即时备用聚丙烯酰胺凝胶，对在蛋白质折叠过程进行动态修饰产生的中间体进行电泳分离的检验实验试剂盒， 

–用于使用串并联的一次性微型柱和/或微型柱模块的多维高效液相色谱，对蛋白质折叠修饰中间体进行分离的检验实验试剂盒， 

–用于使用单个的并串联的微型电泳色谱柱对蛋白质折叠修饰中间体进行分离的检验实验试剂盒， 

–用于使用一次性微型柱和/或微型柱模块对蛋白质折叠期间修饰了的中间体进行缓冲液交换的检验实验试剂盒， 

–用于使用一次性的微型超滤柱和/或微型超滤柱模块对蛋白质折叠期间修饰和分离的中间体进行浓缩的检验实验试剂盒， 

–用于使用配置的多功能微孔试验板和电泳样品分离工具，对电泳分离的中间体泳带样品进行手工处理和微波辅助的凝胶内酶解的检验实验试剂盒， 

–用于对分离的折叠中间体使用多功能微孔试验板，对中间体进行多重凝胶内蛋白质酶解和额外的化学分解的检验实验试剂盒， 

–用于在配置的多功能微孔试验板中对分离的折叠中间体进行微波辅助的溶液内酶解的检验实验试剂盒。 

每种上述检验实验试剂盒都包含至少一种下列的以不同形式出现的化学物质、材料或本发明的组份： 

–不同的缓冲液、变性剂、还原剂，可以氧化蛋白质可变组分和组成的再氧化剂，具有或没有同位素、电子自旋探针和荧光标记的侧链特异性试剂，生物素标记试剂，用以分子间交联标记的试剂，凝胶电泳所用试剂，对折叠过程起作用的生物因子折叠酶和分子伴侣，折叠酶和分子伴侣可能的抑制剂，蛋白质折叠和降解的生化辅助剂和抑制剂，蛋白质折叠过程的稳定剂，为体外蛋白质合成和翻译后修饰而适用的特异性细胞提取成分等等； 

–不同的试剂瓶、试管、反应容器、多功能微型试验板、凝胶泳带样品收集器、专用配液制作梯度胶所用的特定注射器，预制的即时使用的凝胶，液相色谱和电色谱中所用的一次性微型柱和微型柱模块，一次性的微型超滤柱和一次性微型超滤柱模块，蛋白质固定所用的载体基质和相应的辅助软件等等。 

检验实验试剂盒并不局限于上述所举的例子，因为新的检验实验试剂盒可以根据实施本发明方法的需要，通过与现有的检验实验试剂盒的组合互补或共享功能组件进一步制作生产。 

特殊的实验设备 

本发明用于实施完成蛋白质折叠过程表征需要使用的实验仪器包括： 

–本发明用于蛋白质折叠中间体动态再氧化及同步修饰的微波辅助断流淬火仪器； 

–本发明用于对蛋白质折叠中间体进行修饰的与断流淬灭技术样品装置相联的微型微波仪； 

–本发明用于电泳分离蛋白质折叠修饰中间体的专用电泳仪； 

–本发明用于蛋白质折叠修饰中间体电泳色谱分离仪器； 

–本发明用于对电泳分离染色后的蛋白质折叠修饰中间体进行凝胶图形记录和定量的数码凝胶扫描仪； 

–本发明用于对分离和荧光标记的泳带进行图形记录和定量，尤其用于对具有相似水合动力学分子大小的不同蛋白质折叠中间体进行数码识别的微型数码荧光扫描仪； 

–本发明用于凝胶内酶解样品制备的凝胶样品收集器； 

–本发明用于凝胶内和溶液内酶解的微波降解仪； 

–本发明用于分离蛋白质折叠中间体的微型串联凝胶色谱柱的自动化模块； 

–本发明改进的用于在复合功能微孔试验板里确定和区别蛋白质折叠中间体水合动力学分子大小的DLS和SLS测量仪(动态和静态光散射)。 

实施本发明自动仪器的构思和设计 

本发明的实施可以在一个根据本发明的构思和设计制作的仪器里自动完成。该仪器由6个功能单元组成，每个单元分别用图10中1-6号表示。下面对各部分功能进行详细的介绍。 

1号功能单元的作用是分离完全去折叠化的蛋白质。其功能载体有泵、阀门、色谱柱或场流分离器和系列的可以重复使用或/和一次性使用的不同容器，这些容器提供不同的变性剂和去折叠溶液配剂。反应容器也可以和自动调温器相联。在变性剂作用下已经适当溶解的蛋白质，首先在泵的作用下经过第二个阀门进入一个容器，然后切换到第一个阀门，选择变性溶液，使其流入同一容器，通过超声或震荡完成混合过程。根据所设定的条件变性了的蛋白质具有不同的结构和大小，它们通过泵进入色谱柱或场流分离器进行分离，其水合动力学分子大小和其分布通过波谱学动态光散射进行测定分析，其结果数据储存在数据库中。在不同设定的条件下，用不同的变性剂重复这一系列过程。然后，确定出得到完整去折叠蛋白质组份的最佳反应条件，这种条件下的蛋白质具有相对稳定的最大水合动力学分子大小。最后重复由计算机检测识别的最佳实验方案，所获得的具有最大水合动力学分子大小的蛋白质组份，通过动态光散射法检测后通过泵导入到2号功能单元。 

2号功能单元用于蛋白质动态修饰的优化。本单元的功能载体和1号单元的装置相似，但是使用更小的实验体积。小型一次性的容器模块可在此连接用于提供不同的修饰剂。从1号单元流出的洗脱液从折叠路径建立阶段的时间尺度出发，经过从几秒到几分钟的不同时间间隔，先后与输入的不同修饰剂分别导入到各个小反应瓶中进行修饰反应。这些修饰样品然后依次进行液相色谱分离。通过对洗脱液的波谱学测定，得到每种修饰方法下中间体的水合动力学分子大小的分布模式，由此可确定出最佳修饰剂的作用方法，这种优选的方法可以产生相对稳定且可用色谱法分离的中间体，被用来为3号功能单元的动态断流淬灭修饰提供样品。 

3号功能单元专门用于蛋白质的动态断流淬灭修饰。该单元功能载体包括断流淬灭、微波、样品收集模块和阀门等。从1号功能单元流出的最适洗脱样品直接进入断流淬灭模块4个注射器中的一个。重折叠缓冲液或再氧化溶液，2号功能单元所确定的最佳修饰溶液，和稳定液分别加入到其它的注射器。蛋白质重折叠过程从第一个混合容器里启动。在第二个混合容器中，通过定时混合修饰剂溶液对蛋白质样品进行动态修饰，其中混合器和延迟管可用专用微波单元器对其进行处理，以便加快反应速率。在混合器中前后分批成功修饰同时在延迟管捕获的中间体既可以直接导入第三个混合器进一步稳定其结构，也可以直接通入样品自动收集模块的小容器中以便直接导入4号功能单元进行进一步的分离。 

4号功能单元用于高效液相色谱分离动态修饰的折叠中间体。该单元功能载体有一次性微型柱模块、一次性超滤模块、微孔试验板、泵和阀门等。储存在4号功能单元微容器中的修饰样品可按第一种操作形式，依次通入微型柱用高效液相色谱法分离中间体，其分离洗脱液进入一次性超滤模块进行浓缩，然后进行动态光散射法DLS检测，随后把他们经导管在线引入5号功能单元。第二种操作形式是，修饰样品先依次连续地导入一次性模块的微型柱，然后在泵的驱动下，同时进行中间体分离，其中间 体洗脱液由一次性微型柱模块浓缩后，不经过动态光散射在线检测而直接收集在微孔试验板里，用于后续的离线操作。 

5号功能单元设计用于酶解中间体和对酶解片段的质谱分析。所用前后连接的功能部件有与微波单元相连接的在线和离线蛋白质自动降解机械装置、电喷雾离子源质谱ESI-MS、基质辅助激光解吸电离质谱MALDI-MS、微孔试验定板、与动态光散射仪相连的检测器等。按第一种操作形式从4号功能单元流出的洗脱液，首先用在线自动消化装置进行蛋白质的酶解。接着所有流脱液中间体片段在线通入电喷雾离子源质谱ESI-MS中，从而获得中间体片段数目和质量的数据信息。4号功能单元中按第二种操作形式收集在微型试验板的分离中间体，通过连接的动态光散射仪DLS和紫外线仪进行检测、辨别和定量，随后在离线水解装置中进行酶解。所有酶解的中间体片段的数据通过对微孔试验板中所选择的洗脱液进行离线基质辅助激光解吸电离质谱MALDI-MS测量而获得。这两个自动化水解装置应分别和一个微波单元器耦合。 

6号功能单元将完成三项任务，即设置应用程序、过程控制、数据分析和结果的图形展示。功能部件包括控制和连接组件、电脑系统和自动化操作软件、分析和结果展示等。在设置选定应用程序时，构建、查验一个工艺操作方案，该方案以可变流程图的形式形象化展示并且可以自动化运行。其运行过程也是形象化展示，通过检测控制，记录归档。从动态光散射DLS、紫外和质谱测量所得到的数据将得以自动化记录和解析。这里所有的中间体根据前面所述的4个特征进行鉴定，并且根据其折叠路径从属关系进行分类。根据这些原理，蛋白质折叠过程的表征及其多维形象化展示可以在特定软件下自动完成。 

这种设计的一个优点是，1至5号功能单元可以分别单独的和6号功能单元组合成为5个之间可相互耦合的自动仪，用以实施完成本发明的特定步骤，这使自动仪的进一步微型化成为可能。 

专用软件 

用于完成本发明过程各步骤的特定程序软件包括： 

-特定的蛋白质分类程序，这种分类是根据蛋白质分子量的大小、蛋白质的类型、二硫键的指标、亲水和疏水特性、蛋白质的单结构域或多结构域特征及其理化性质和以此为基础的蛋白质分离方法、缓冲溶液系统和物理化学及生物化学条件等； 

-以蛋白质一级结构和三维结构为基础，用于特异侧链修饰剂筛选的程序； 

-用于操控与断流淬灭流仪耦合的小型微波装置的程序，用以中间体的快速修饰； 

-用于操控与数码凝胶扫描仪、微荧光扫描仪和凝胶样品收集器相偶联的特定改良凝胶电泳装置的程序； 

-用于操控用一次性集合模块的串联微型凝胶柱和微型超滤柱色谱分离修饰中间体的程序； 

-用于中间体的鉴别、分类，以及根据光谱测定的数据，把中间体水合动力学分子大小和数量作为中间体折叠过程的函数而进行二维图形坐标显示的程序； 

-根据本发明定义的，以对蛋白质折叠的前2个阶段或所有的4个阶段进行测定的数据为基础，用于制作蛋白质折叠指纹图谱和对其进行多种图形化展示的程序； 

-用于操控与凝胶样品收集器和一次性集合模块的串联微型凝胶柱和微型超滤柱相偶联的，用于中间体凝胶内和溶液内酶解的微波降解仪器的程序， 

-以蛋白质一级和三级结构及修饰了的中间体酶解片段为基础制作理论片段识别模板的程序，以及以此程序为基础的与光谱学测量所得数据进行对比评估的软件； 

-以体外翻译后修饰及酶解中间体片段为基础制作理论片段识别模板的程序，以及以此程序为基础的与光谱学测量所得数据进行对比评估的软件； 

-以在化学和/或生物影响因子存在的条件下，体外模拟蛋白质折叠中间体修饰和酶解为基础制作的理论片段识别模板的程序，以及以此程序为基础的与光谱学测量所得数据进行对比评估的软件， 

-用于酶解中间体理论片段识别模板的制作、鉴别和评估的程序，这些中间体涉及到单项、多项和分子内交联修饰，修饰所用的所有已知的和未知的但具有相同效果的特异性侧链试剂，包括零长度、同源或异源双功能试剂，有或没有同位素标记、荧光和电子自旋探针标记的试剂，用光亲和标记和生物素标记的试剂。 

-用于对已鉴定的中间体归组分类的程序； 

-用于已经分组的中间体的折叠路径归属确定的程序； 

-用于将表征的蛋白质折叠过程在多维坐标体系中用各种图形表示的程序； 

-用于将表征的蛋白质折叠过程进行多维动画展示的程序； 

-用于将表征的蛋白质折叠过程和伴随的体外翻译后修饰过程进行多维动画展示的程序； 

-以同源蛋白质折叠过程的表征和基于内外网络服务器的结构单元的从头预测为基础用于模拟和预测蛋白质折叠过程的程序； 

-用于蛋白质折叠表征自动仪器的程序。 

这些程序可以根据自己的应用目的，每个作为独立的产品而单独使用，也可以与以上提到的试剂盒和实验设备进行各种各样的结合而使用。 

实施本发明的实验举例 

现在将通过下列实例说明本发明。这些实例用来说明本发明的某些常选实施方式和内容特点，不应被解释为本发明的保护范围受其限制。 

本发明的实施举例涉及到表征蛋白质Parvulustat（Z-2685）的折叠过程。蛋白质Parvulustat（Z-2685）是通过链霉菌Streptomyces lividans TK24异源表达的α-淀粉酶抑制剂,一个源自链霉菌Streptomyces parvulus FH-1641的活性小蛋白质。由于Parvulustat的药效基团结构明确、与酶的不可逆结合和较低的解离常数2.8×10^-11M/L，因而成为有效的α-淀粉酶抑制剂，它可以减少肠道对葡萄糖的吸收，因此是一种潜在的治疗Ⅱ型糖尿病的药物。这种抑制剂的三维结构已经通过核磁共振检测被确定(Rehm et al,2009;Pdb2KER）。表征该α-淀粉酶抑制蛋白质的折叠过程对其生产与探索其药代动力学性能是非常重要的。 

实例1 

蛋白质Parvulustat结构和理化性质的分析 

蛋白质Parvulustat(以下简称:蛋白质-PL)（图1-A）由78个氨基酸组成，其分子量为8282.09Da。其氨基酸顺序为：ATGSPVAECVEYFQSWRYTDVHNGCADAVSVTVEYTHGQWAPCRVIEPGGWATFAG YGTDGNYVTGLHTCDPATPSGV。蛋白质-PL有4个半胱氨酸、5个脯氨酸、2个精氨酸、3个色氨酸、5个酪氨酸、2个苯丙氨酸、3个β折叠、6个β转角及2个分别由Cys9—Cys25和Cys43—Cys70之间二硫键连接而成的环状结构（图1-C）。它有8个带负电的残基，2个带正电的残基，来自于4个天冬氨酸、4个谷氨酸和2个精氨酸。其α-淀粉酶的抑制活性中心即药效中心Trp¹⁶-Arg¹⁷-Tyr¹⁸位于第一个环结构的β折叠上的β转角。蛋白质-PL的等电点是4.3，在pH为7.0时，带有5.9个净负电 荷。亲水残基和疏水残基之间的比例为1:3。分子表面是极性亲水的(图1-B)。蛋白质-PL是一个小且紧密的蛋白质，在7M的盐酸胍溶液中将完全变性，并且之后可以在不损失活性的情况下复性至自然状态(图2-A)。 

根据电脑辅助分析得出的结论，蛋白质-PL在重新折叠的过程中由于天然的和非天然的二硫键形成，理论上可以有8种中间产物（图2-B），由此建立了中间体酶解片段质量识别模板(图-4B)。同时决定，中间产物的分离，水合动力学分子大小的差异分析和确定其大小顺序可以使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时进行，蛋白质-PL折叠时对其半胱氨酸残基上巯基的修饰使用电中性的侧链特异性的试剂碘乙酰胺，对电泳分离得到的折叠中间体通过凝胶内胰蛋白酶解来片段化（图4-A）。蛋白质-PL的折叠过程将以此继续表征。 

实例2 

分离具有最大水合动力学分子大小的变性去折叠蛋白质样品 

蛋白质-PL被完全变性、还原，除去还原剂。然后以液相色谱分离，由此得到的最佳去折叠的蛋白质-PL组分具有最大的水合动力学分子大小，而且其二硫键完全水解成自由的巯基，以备接下来的再氧化和动态修饰使用。 

蛋白质-PL在变性缓冲液的作用下变性和还原。变性缓冲液包含常用的6M GdmCl(盐酸胍)、0.2M Tris三异丙基乙磺酰、1mM EDTA乙二胺四乙酸，pH为8.7。还原缓冲液由还原剂0.2M DTE二硫赤糖醇（1,4-Dithioerythrit）、6MGdmCl、0.2M Tris、1mM EDTA，pH为8.7。由于在其分子表面高度极化，蛋白质-PL容易在溶液中凝聚。因此，在6M GdmCl溶液中变性时，蛋白质-PL最高浓度不能超过2.4毫克/毫升，以使蛋白质-PL完全变性，并防止分子间二硫键的形成。在1.5ml微量离心管中加入5mg蛋白质-PL，用1.25ml变性缓冲液处理2min，离心15min，37℃超声处理，然后转移至含有1.25ml还原缓冲液的4ml试管中，混合之后超声5min，室温放置1h，完成变性和二硫键还原。此时溶液中蛋白质-PL的浓度为2mg/ml。 

蛋白质-PL在变性和还原之后，必须彻底与还原剂DTE分离。蛋白质-PL溶液中DTE的存在会严重影响接下来的实验分析。还原剂DTE的除去使用两个串联的凝胶过滤柱。两个PD-10柱的第一次平衡用20ml pH2的分离缓冲液处理。然后将2.5ml还原的蛋白质-PL溶液转移到第一个柱中。沉降之后，加入2.5ml分离缓冲液，同时洗脱得到的蛋白质-PL溶液直接进入第二个PD-10柱。最终在第二个柱中加入2.5ml分离缓冲液，得到的蛋白质-PL溶液被收集至5个1.5ml的试管中，每个0.5ml，接着测定还原的蛋白质-PL的浓度和被还原的半胱氨酸巯基(-SH)的数量。 

还原的蛋白质-PL的浓度用来控制溶液中蛋白质-PL原料的量，计算分子中自由巯基的数量。此时选择测量280nm处的紫外吸光值来确定蛋白质-PL的浓度。这种方法利用蛋白质-PL上的3个色氨酸、5个酪氨酸和两个二硫键对光的吸收。浓度为1mg/ml的蛋白质-PL的A₂₈₀值为2.92，远远高于大多数蛋白质所得到的值从0.5到1.5。为了保持蛋白质-PL浓度对吸收值的线性关系，测得的A₂₈₀不能超过1。缓冲液中待测的蛋白质-PL的浓度通常通过稀释保持在20～500μg/ml这一范围内。在测量过程中，第一次蛋白质-PL样品稀释十倍。在5个除去DTE的蛋白质-PL溶液中分别取0.1ml至5个1.5ml的含有0.9ml pH7.5的磷酸缓冲液的试管中。混合均匀后，使用紫外分光光谱测量5个样品的A₂₈₀值。吸收因子ε₂₈₀可以通过以下第一个方程(Pace et al.,1995)求得。蛋白质-PL的浓度通过下面第二个方程直接计算，不用校准。 

ε₂₈₀=(Trp)(5500)+(Tyr)(1490)+(disulfide bonds)    (125) 

=(3)(5500)+(5)(1490)+(2)(125)=24200(M^-1cm^-1) 

C(mg/ml)=10A₂₈₀/ε₂₈₀·d=A₂₈₀×82860mgM^-1cm^-1/24200M^-1cm^-1=3.42×A₂₈₀

对于成功表征蛋白质折叠过程，待测蛋白质的完全变性和二硫键的还原，形成完全自由的巯基是非常重要的。确定上述5个样品蛋白质分子含有自由巯基的个数，为下一步实验提供完全还原且具有最大水合动力学分子大小的蛋白质样品，用以重新氧化、修饰和捕捉中间体。测定自由巯基的数量运用Ellmans反应，它包括2mg/ml5，5-二硫代双（2－硝基苯甲酸DTNB）Ellmans试剂，2mg/ml5，5-二硫代双（2－硝基苯甲酸DTNB），0.1mM EDTA和0.1M pH7.5的磷酸缓冲液。分别从5份样品中各取0.1ml还原蛋白质-PL溶液转移至五个1.5ml的含有0.8ml pH7.5的磷酸缓冲液的试管中均匀混合。然后在这5个试管中，分别加入0.1ml Ellmans试剂。在分光光度计中测量5份样品在波长为412nm处的吸光值。其中Ellmans试剂(DTNB)通过与还原性蛋白质-PL的SH-SS交换反应产生等量的亮黄色TNB^2-产物，它在412nm处摩尔吸光系数为13600M^-1cm^-1。颜色的亮度与蛋白质-PL分子中游离巯基的量成比例。因此，样品溶液中游离巯基的量通过测定溶液中蛋白质-PL和TNB2-浓度确定，在含量上可以通过下式计算（Riddles et al.1983）。结果证明，最初的0.5ml洗脱液的蛋白质-PL浓度是1.2mg/ml，含有四个完全还原的巯基基团，因此具有最大水合动力学分子大小（图2-C）。接下来的实验使用这种样品。 

游离巯基数-SH=TNB^-2浓度/蛋白质-PL浓度 

=(A_TNB ^-2 _(412nm)/13600M^-1cm^-1)/(A_{蛋白质-PL(280nm)}/24200M^-1cm^-1) 

实例3 

还原蛋白质-PL的再氧化与动态修饰 

含有4个完全还原巯基的蛋白质-PL的折叠动态修饰是与其再氧化反应同步进行的。折叠过程再氧化反应可使蛋白质-PL游离的半胱氨酸巯基间形成天然的或非天然的二硫键。二硫键的形成不是自发进行的，尽管其所处的空间位置非常接近。它由其专一的氧化还原电位决定，也就是在巯基附近的给电子体和受体达到的有效浓度。二硫键的形成，必须有合适的电子受体。有大量熟悉的氧化剂可以达到这一要求。在这里，使用在再氧化实验中有效且常用的一种氧化剂谷胱甘肽以其还原态(GSH)和氧化态(GSSG)(Creighton&Goldenberg,1984)，实验时将其还原态（GSH）与氧化态(GSSG)按10:1混合。 

再氧化是通过将含有0.1M Tris/乙酸，10mM EDTA，pH8的再氧化缓冲液、含有10mM GSH和1mMGSSG的再氧化溶液和首先流出的还原的蛋白质-PL混合。首先将0.15ml再氧化溶液与1.16ml再氧化缓冲液于4ml试管中混合，再加入0.19ml最初的洗脱液，稍加震荡开始反应。溶液中蛋白质-PL的浓度是0.18mg/ml。这个1.5ml的再氧化混合物提供了研究动态修饰的15个100μl的样品，用以捕获的蛋白质-PL的中间产物。再氧化反应只有当所有对接下来修饰捕获中间体的实验准备结束后才可启动。 

动态修饰开始于在不同的时间间隔下，依次取出的折叠再氧化反应样品与常见的特异侧链修饰剂碘乙酰胺的混合。碘乙酰胺与所有在折叠和再氧化过程尚未形成二硫键的巯基产生不可逆的共价反应，封闭半胱氨酸残基使其酰胺中性化。首先在14支1.5ml的试管中，用移液器分别加入20μl含有0.6M的碘乙酰胺、0.25M pH7.5缓冲液的修饰剂，然后，如上所述在1.5ml溶液中开始启动再氧化反应，在 计划时间间隔1,3,6,9,15,30,45,60,90,120,150,180,210和240min分别依次取出100μl折叠再氧化混合物样品移入含有20μl修饰剂的试管中混合，室温培养5min后，液氮处理，冰冻保存，一共14次（图-3A）。这些样品中的蛋白质-PL浓度是大约.12μg/100μl.其修饰的程度和类型取决于被修饰氨基酸残基的接近难易性，由此产生各种各样结构相对稳定分别拥有各自的个性特征的折叠中间体，以备电泳分离和进一步的鉴定。 

实例4 

中间体的分离和量化以及以其水合动力学分子大小作为其形成时间函数的二维展示修饰中间体的分离和伴随的对其水合动力学分子大小的展示，使用本发明改进的不连续天然聚丙烯酰胺凝胶电泳在Hoefer Scientific SE600设备中进行。在非变性凝胶电泳中，蛋白质的迁移由其静电荷和构象决定。因此这种改进的电泳法非常适合用来分离和展示在蛋白质折叠过程中被修饰的中间产物，这些中间产物有几乎相同的分子量但是不同的水合动力学分子大小。凝胶需要在使用前一天准备，冰箱中保存。大的凝胶（16cmx18cmx0.1cm）有16个样品孔。每一个样品孔最多放120μl样品，其中包含12–15μg蛋白质。 

由于常常发生边缘效应，第一个和最后一个样品孔不加入样品。在第二个和第三个样品孔中分别加入100μl天然蛋白质-PL样品和100μl完全还原且与20μl样品缓冲液混合、经碘乙酰胺修饰的蛋白质-PL样品。从上述14个样品中取11个分别以时间间隔为1,3,6,9,15,30,45,60,120,180和240min的经酰胺基甲基化重新折叠和再氧化已修饰的蛋白质-PL样品，在SpeedVac中浓缩至100μl。之后在11个样品中分别加入20μl样品缓冲液。混合均匀后，分别在11个样品孔中加入上述样品100μl。电泳凝胶（20%A，3.25%T）与制冷槽耦合，在浓缩胶阶段的电压是120V，持续2小时，分离胶阶段是180V，持续4h，在4°C(图3-B)冷室中进行不连续的电泳缓冲液的替换。 

在凝胶电泳完成与考马斯染色和脱色后，在指定时间间隔内折叠修饰的中间产物以一系列凝胶泳带的形式，对应4阶段多重折叠路径模型以二维分离图像呈现出来（图3-B）。 

在这个电泳图像中（图3-B）可得知，所有在折叠过程形成的分子内中间产物出现在10个凝胶带中，显现出它们具有不同的水合动力学分子大小；中间产物的类型、个数和数量在折叠的过程中发生改变；在折叠第一阶段以超速自发形成的折叠途径种子结构显示在第一条凝胶带中；在15-30分钟的折叠第二阶段显现不同折叠路径并由此形成一个折叠的指纹图谱；折叠在其第三阶段沿经第二阶段形成的折叠路径，历时超过2小时；分子内的进一步重排至最后天然结构的完全形成需要4小时。 

可以看到，完全变性、还原并在再氧化过程开始之后用碘乙酰胺修饰的蛋白质-PL，由于4个半胱氨酸残基体积增大引发的分子膨胀使其具有最大水合动力学分子大小，因此在电泳中迁移地最慢，其中天然的蛋白质-PL和复性的蛋白质-PL由于拥有相同的紧密结构在凝胶中的迁移速率也相同。还可以看到，在不同时间样品泳道等高的泳带显示了相同的中间产物，其中凝胶泳带10中的中间产物的水合动力学分子大小甚至小于凝胶泳带9中的天然蛋白质-PL。凝胶图像被扫描，以备进一步对凝胶泳带中的中间产物进行鉴定。 

实例5 

折叠中间体的凝胶内酶解片段化 

对凝胶泳带含有的折叠中间体使用胰蛋白酶进行凝胶内酶解片段化。胰蛋白酶（23.23kDa）是一种蛋 白质分析中最常用的丝氨酸蛋白酶，多用于多肽谱的制作与分析。胰蛋白酶特异催化断裂精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）C末端的肽键。蛋白质-PL只有两个精氨酸没有赖氨酸，第一个精氨酸位于抑制活性中心Trp16-Arg17-Thr18内，另一个Arg44位于二硫键Cys43-Cys70旁。修饰的中间体在胰蛋白酶的作用下断裂成3个片段，另外还有2个由片段间二硫键的形成而产生的大片段，其中每个中间体含有的5种片段的质量得以准确确定（图4-A）。 

胰蛋白酶消化使用sigma公司的酶产品（胰蛋白酶蛋白质组学级别，产品编号T6567），其中操作方法由本发明改进。位于60分钟泳道的10个凝胶泳带被仔细切割分离取出，在微波和水域超声的条件下用胰蛋白酶消化处理。最终所有消化得到的混合物分别转移至离心管中，在旋转真空干燥器中浓缩至20微升作为基质辅助激光解吸附质谱MALDI-MS的样品。这些20μl的样品包含了凝胶带上0.3-1.5μg蛋白质-PL碎片，完全满足质谱MALDI-MS的测量要求。 

理论上，蛋白质-PL有八个由天然和非天然二硫键的形成而产生的折叠中间体（图2-B），他们每一个分别可有5个分子质量明确的片段，由此出发，可以借助计算机用表格的形式制作一个包括各个中间体和其5个分子片段的片段质量识别模板（图4-B），用以和质谱测定的实际数据相比较。 

实例6 

折叠中间体片段的质谱检测 

所有来自凝胶泳带的中间体的酶解片段的质量大小用MALDI-MS质谱仪进行测量（图5）。凝胶泳带1至7里的中间体水合动力学分子大小相对比较大，容易水解。断裂片段之间的连接键由于缺乏稳定二级结构的支持相对比较脆弱，容易在MALDI-MS质谱测量时打开。这导致所有这些中间体在MALDI-MS质谱中只显示3个单独的片段。在凝胶泳带8中的一个中间产物第二个片段的缺失说明了分子内二硫键重排的存在，即非天然的二硫键Cys25-Cys43和Cys25-Cys70进一步重排得到天然的二硫键Cys43-Cys70。凝胶泳带8和9中的中间体的混合物含有3个以上的片段，这个情况被通过凝胶泳带的电泳洗脱和接下来的微型柱层析分离所证实。 

所有经胰蛋白酶消化质谱测定的分子片段的质量被填写入一个表格里，其中10个凝胶泳带对应其逐渐减小的水合动力学分子大小，凝胶泳带从1到10按照从上到下填入第一纵格，其片段数据从左到右作为各己的片段质量模式填入相应的横格（图6）。基于不同修饰产生的中间体拥有其自己的片段质量模式，将其与理论片段质量识别模板进行比较、标记和区别，然后将其结果在相邻确定中间产物的框格里用短语注释。 

实例7 

确定中间体的折叠路径归属特性 

折叠路径的归属特性是一个折叠中间体的重要特征，也是本发明之所以与人们熟知的传统方法的一个不同之处。一个中间体的折叠途径的特性不能单独确定，但可以根据对其归类的组群属性定义。 

在上述表格中得知，根据各自的片段质量模式从10个凝胶泳带中被区分出共计12个稳定的中间产物。它们是来自凝泳胶带2、4、6、7不含二硫键结构的还原性中间体的4种异构体，分别标记为CCCC-1,-2,-3和-4；来自凝胶泳带3、5、8、9、10的有非天然二硫键结构Cys25-Cys43的5种非天然结构中间体，分别标记为C25-C43-1,-2,-3,-4和-5；凝胶泳带8中仅有1个非天然中间体含有非天然二硫键结构Cys25-Cys70，标记为C25-C70；分别来自凝胶带8和10的2个天然中间产物Cys9-Cys25和 Cys43-Cys70，分别标记为C9-C25和C43-C70。在凝胶泳带1中完全修饰的蛋白质-PL在这里尚不被认为是中间产物。 

所有发现的中间产物可以根据其标记注释的共性分类成4组（图6）。标记为CCCC-1,-2,-3-4的4种没有二硫键的中间体属于第一组。标记为C25-C43-1,-2和-3的3个非天然的中间产物属于第二组。第二类也包括其他非天然的中间体C25-C70，C25-C70是中间体C25-C43-4分子间重排的产物。中间体C25-C43-4和5以及天然中间体C9-C25构成了第三组。最重要的天然中间体C43-C70代表了第四组。对所有的12个中间体根据其各自归组后的组员身份和其水合动力学分子大小逐渐减小的特征定义其归属的折叠路径，由此从归类的4个中间体小组确定出4种折叠路径。由此所有的12个中间体的折叠路径归属性得以区别确定。 

实例8 

中间体的定义和分类 

通过确定他们的水合动力学分子大小力尺寸、在折叠过程形成的时间点和已明确的折叠路径特征对12个中间体进行定义。这12个被分类至4个类别组和4个折叠路径的中间体，根据其在折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇等中的作用进一步被分类。 

12个中间体的相对水合动力学分子大小的定义根据10个凝胶带中不同的高度。它们截止折叠开始后60分钟内的关键形成时间已给出。其归属的折叠路径在上一个章节已予说明。由此所有的12种中间体可以在尚没有对其进行量化的情况下通过其在表格(图6）里表述的3种特征来定义。从凝胶图像(图7)可知，归属于第四组的中间体C43-C70在折叠开始后3分钟开始形成，因此属于最快速折叠路径。标签为C.C.C.C1,-2,-3，-4的第一组中间体，在重新折叠后6分钟形成，因此属于快速折叠路径。标签为C25-C43-1,-2,-3-4的第二组中间体，在重新折叠后15分钟出现，属于慢速折叠路径。标签为C9-C25的第三组中间体，在开始折叠后30分钟出现并持续了3小时，因此属于最慢速折叠途径。折叠过程所发生的折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇都体现在呈熔球状态的凝胶泳带8中。 

实验进一步发现，最快速折叠路径只含有天然二硫键Cys43-Cys70的中间体并且不发生分子内的二硫键重排，由标签为C.C.C.C-1,-2,-3-4的一组中间体组成的快速折叠路径含有还原性的不含有二硫键的天然异构体，慢速折叠路径含有非天然二硫键Cys25-Cys43的中间体和其异构体，并伴随有分子内二硫键由Cys25-Cys43到Cys25-Cys70的重排，分子内二硫键的重排发生在其水合动力学分子大小类似凝胶泳带8显示的熔球状态。 

实例9 

蛋白质-PL折叠过程的表征和在二维和三维坐标体系中的展示 

蛋白质-PL折叠过程的表征首先通过对所有12种中间体沿着4个折叠路径在二维坐标系的平行成像展示来进行，其中代表12个中间体的水合动力学分子大小的凝胶泳带，分别对应其最初形成的时间点直至60分钟，在坐标系中给予标注（图8）。在这里，根据体积大小和路径归属被分为3类的中间体，依据其水合动力学分子大小和折叠路径的归属，以系列逐渐变小且色彩灰度各异的象征性小图形在坐标系里给予标注，逻辑显现的折叠路径分别用线条和深浅不一的灰度表示。在这个坐标系中，y轴用中间体能量状态/凝胶泳带位置标记，x轴标记折叠的时间顺序，其中中间体能量状态与其水合动 力学分子大小呈正比关系，而水合动力学分子大小则对应不同的凝胶泳带。 

从这个二维展示可清楚看出，在蛋白质-PL折叠过程中形成的12种中间体被分成3种类型，即不含二硫键的还原性蛋白质-PL的4种同分异构中间体、有天然二硫键的2种中间体和有非天然二硫键的6种异构中间体。这些中间体沿着四种折叠路径以不同的速度并行向天然蛋白质-PL折叠。折叠途径-1由首先形成天然二硫键(Cys43-Cys70)的中间体组成，主导整个折叠过程。非天然二硫键Cys25-Cys43导致错误折叠，它经分子间二硫键重排由Cys25-Cys43经Cys25-Cys70转变到天然中间体Cys43-Cys70，还经过Cys25-Cys43的异构中间体转变到含有二硫键Cys9-Cys25的天然中间体，这一过程需要几个小时，折叠的过程由此减慢延长。所有这些分子间二硫键重排发生在紧凑的分子体积如在凝胶泳带8显示的熔球状态的结构大小。折叠路径2和3在天然二硫键Cys43-Cys70处相交重叠，跨越折叠路径1达到天然结构终点。折叠途径4从折叠途径3分支出来，导致二硫键的重排。含有天然二硫键Cys9-Cys25的中间体是最后一个折叠形成的天然中间体，通过分子间二硫键的重排导致其拥有比天然蛋白质-PL还小的水合动力学分子大小，是能量状态比天然蛋白质-PL还低的中间体。蛋白质-PL折叠过程由此完全得以表征。 

被表征的折叠过程同样以三维形式在多维坐标体系里展示出来（图9），其中分别把与凝胶泳道和水合动力学分子大小呈对应关系的能量状态定义为y坐标轴，中间体形成的时间点定义为x轴，与折叠路径或者通道的归属特性相对应的折叠路径定义为z坐标，蛋白质-PL的折叠途径和它们直到60分钟的简化折叠运行过程由此得以显示。 

实例10 

本发明的产物 

作为本发明产物的一个实例就蛋白质-PL而言起码包括12种经动态修饰、分离、依据4个特征鉴定的折叠中间体和由此获得的结果，即证明蛋白质-PL中Cys-25参与非天然二硫键Cys25-Cys43的形成，是导致形成2个缓慢折叠路径的中间体错误折叠的原因，这些错误折叠阻碍了蛋白质-PL中β-折叠结构药效活性基团在其第一个环结构中的构建，减缓了整个折叠过程的速度，并且由于这种异常效应激活细胞内启动对错误折叠中间体的降解，导致了天然蛋白质-PL生物合成生产的很大损失。 

实例11 

本发明的产物的应用 

以上所述本发明的产物以蛋白质-PL作为实例而言，可用来改善其药代动力学性能，对其进行特异性分子修饰、更新分子设计和蛋白质分子融合并以此提高其生物技术生产的产率，例如由非天然二硫键Cys25-Cys43导致的错误折叠而产生的负效应，通过将其胱氨酸Cys-25修饰转换成为丙氨酸和苏氨酸后被消除。 

图表 

下列图表用来解释这项发明 

图1显示用NMR核磁共振法测定的蛋白质-PL分子三维结构，和其前面与后面亲水且极性的分子表面以及由2个二硫键导致的2个环结构。 

图2分别显示了表征蛋白质-PL折叠任务的二维坐标体系示意图，8个基于理论可能在折叠过程中由天然和非天然二硫键的形成产生的中间体，用以折叠修饰所选择的侧链修饰剂碘乙酰胺，获取具有最大水合动力学分子大小变性蛋白质-PL样品的方案图示。 

图3显示在蛋白质-PL折叠过程中对其实施的定时动态修饰和其结果在电泳凝胶上的二维展示，其中通过天然聚丙烯酰胺凝胶分离的具有不同水合动力学分子大小的中间体对应不同凝胶泳带为y轴，不同时间间隔内的折叠时间为x轴。这里还展示了本发明定义的4个折叠阶段和折叠指纹图谱。 

图4显示了8种理论上可能在折叠过程由天然和非天然二硫键的形成产生的中间体的胰蛋白酶酶解模式，及由此产生的表格形式填有每个片段分子质量的片段质量识别模板。 

图5显示了用质谱法对来自10个凝胶泳带的所有中间体的蛋白质酶解片段进行检测的结果。 

图6在表格里给出了来自10个凝胶泳带通过对其检测的片段质量与理论片段质量识别模板的比较,从而区分、标记并分为4组归类到4种折叠路径的12个中间体。 

图7展示了相应电泳凝胶二维图像的对蛋白质-PL折叠过程的表征解说。 

图8展示了对蛋白质-PL的折叠过程直至60分钟的表征结果在二维坐标系中的形象化描述。 

图9形象化显示了蛋白质-PL在三维坐标系中的折叠路径和它们直到60分钟的简化折叠运行过程。 

图10所示是本发明自动仪的构思和设计用以实施本发明的自动化。 

图11所示是本发明同样适用于多维能量景观理论的多重折叠路径模型，它是在实验的基础上用4类折叠途径和5种功能区域的形式总结性的对蛋白质折叠过程表征新知识的图像表述。 

Claims (29)

1.表征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法，其特征在于，对所有在折叠过程中以不同时间间隔通过化学修饰捕捉到的具有不同构象的蛋白质折叠中间体可以至少根据其各自拥有的4个特性，即其水合动力学分子大小、其形成时间点、其归属的折叠路径以及其形成的量的多少来进行鉴别和数字化描绘，被表征的蛋白质折叠过程可由4个阶段组成。该方法适用于对所有蛋白质折叠途径的特征描述，包括以下步骤：

1）基于对蛋白质一级结构、二级结构和有可能的多维结构特征以及蛋白质的生物和理化性质分析，制作相应的理论片段质量识别模板，确定进一步的操作方法和实施方式；

2）通过蛋白质变性、还原、必要时去除还原剂、色谱分离和波谱检测，制备完全变性去折叠具有最大水合动力学分子大小的蛋白质样品；

3）对折叠过程中和可能同时被氧化的蛋白质的动态修饰，其中，所有在不同时间间隔产生的折叠中间体被按序取出，根据它们被修饰氨基酸残基的特性，使用相应的侧链修饰试剂，不同程度的进行修饰，使之形成各自相对稳定的结构和各自独有的特性，即水合动力学分子大小、形成时间点、归属的折叠路径以及量化值；

4）分离和量化中间体并展示他们的水合动力学分子大小和必要时它们的量化值对应于它们形成时间的函数关系，其中，所有在折叠过程中被修饰的中间体可用电泳法或用与波谱检测偶合（首选使用动态光散射）的色谱法进行分离、量化、数字化储存、以备后用，同时多维展示它们水合动力学分子大小与形成时间的函数关系，形成蛋白质折叠过程的指纹图谱；

5）中间体的片段化，其中，为了鉴别区分中间体，对在不同时间间隔形成、被修饰、分离和其水合动力学分子大小已得以区分的折叠中间体进行酶解片段化，首选使用胰蛋白酶，必要时可用其它内切酶、外肽酶以及化学方法；

6）中间体片段的检测，其中，使用各类质谱对所有单个片段的分子量以及由二硫键和/或交联剂结合的中间体大片段的分子量，进行精确测量，数据储存入库并分类制成折叠中间体片段质量识别检测表；

7）中间体折叠路径归属性的确定，其中，通过对用质谱法整理的片段数量和质量与理论片段质量识别模板参照比较可以确定每个中间体发生修饰的类型、数量和位置作为各自的特征，并鉴于这些个性特征将中间体按照它们的共同之处划类归组，赋予其组分归属性，归属性相同的中间体给定一个特定的折叠路径，也即可由一个中间体的组归属性确定其折叠路径的归属，对此可进一步用蛋白质进化理论和蛋白质折叠动力学理论来补充和完善。

8）中间体的鉴定和分类，其中，每一个中间体都可以至少用它们被测定的水动力学尺寸大小、形成时间、数量、折叠路径来标记和区分鉴定。根据它们的特征的一致性，所有被鉴定的中间体可以被分为若干小组，并以此划归不同折叠途径。被归类于某个折叠途径的中间体还可以满足三个标准，即它们具有相同的修饰类型，它们的水合动力学分子大小逐渐减小，它们沿着折叠路径形成的时序明确；

9）折叠过程的表征，其中，通过在多维坐标系里并行标记所有被鉴定的在不同折叠路径上的中间体可以直接确定天然折叠的主导路径，最快和最慢折叠的路径，导致错误折叠的路径，所有折叠路径的折叠动力学，二硫键形成和/或交联形成的次序，折叠结节的形成，分子重排和折叠路径的分支、延伸、交叉、穿越和交汇以及与此相关的中间体等等，蛋白质的折叠过程由此得以表征；

10）蛋白质折叠过程的图形和可视化展示，其中，已表征的蛋白质折叠过程可以通过定义坐标借助计算机图形学的方法在多维坐标系中以多种形式包括动画可视化展示，还可通过重新组合和转换融合所定义的坐标扩展可视化展示的多样性。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤3）至少使用一种下列的实施方式，

-对含有二硫键蛋白质的动态修饰，

-对不含二硫键蛋白质的动态修饰

-对多结构域蛋白质的动态修饰

-对体外模拟共翻译和翻译后的动态修饰

-对体外模拟蛋白质折叠的动态修饰

-对蛋白质生物合成的体外动态修饰

和至少一种下列的操作方法，

-单项修饰，其中，选择性地只针对一种氨基酸的残基使用一种特异性侧链反应试剂在最佳反应条件下进行的修饰化学反应；

-多项修饰，其中，选择性地对一种或多于一种氨基酸的残基使用一种或多于一种侧链反应试剂在不同的反应条件下进行的修饰化学反应，反应可以单独进行也可分别进行后混合；

-分子内交联修饰，其中，选择性地使用双端功能侧链反应试剂在不同的反应条件下以不同的实施方式进行的双重修饰化学反应；

和至少满足一种下列的反应动力学，

-修饰反应速率的时间尺度范围从纳秒、微秒到毫秒，包括氢键的形成、二级结构单元的形成、肽链的疏水折拢；

-修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到分钟，涉及到快速折叠阶段和形成折叠路径早期中间体的阶段；

-修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到数分钟，适用于研究以秒至数小时或数日的速率折叠的蛋白质，大多涉及到缓慢折叠阶段，其间，继续产生归属不同折叠路径的中间体，出现相对稳定的溶球态紧密结构，所有中间体持续折叠，直到重新折叠到他的原始天然结构状态，并达到最低能量状态。

和至少使用一种下列化学试剂药品，

-蛋白质的变性剂，

-蛋白质二硫键的还原剂，

-蛋白质的氧化剂，包括与它们相配的组合物及变量组份，主要用以修饰含有二硫键的蛋白质，

-含有或不含有同位素标记的有效特异性侧链基团修饰试剂，

-含有荧光和电子自旋标记报告基团的修饰剂和其它标记修饰试剂，

-用以分子内标记的零长度直接交联剂、双端同源功能交联剂、双端异源功能交联剂、光敏标记修饰试剂，

-生物素标记试剂，

-试剂和/或酶用来蛋白质共翻译或翻译后的修饰，

-各类细胞提取物，

-折叠酶和/或者伴侣蛋白，

-折叠酶和/或伴侣蛋白的备选抑制剂，

-影响蛋白质折叠和降解的化学和生物性备选活性物质，

-影响蛋白质体外共翻译修饰的化学和生物性备选活性物质，

-影响蛋白质体外翻译后修饰的化学和生物性备选活性物质，

-影响蛋白质体外生物合成的化学和生物性备选活性物质，

-蛋白质折叠的辅助及稳定剂。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤4）可以手工进行也可以根据本发明的构思和设计自动化和微型化进行，并采用至少一种下列操作形式，

-优先使用针对球形亲水蛋白质的聚丙烯凝胶电泳，使用至少一种下列的改进措施，

-连接一个可以在电泳过程中控制电泳缓冲液浓度、组成、pH值的输送系统，它可以通过在缓冲液储缸的阴极端连接一个充满所需缓冲液并有渗透性元件的容器装置来实现，也可以通过在缓冲液的阴极端配装一个用细管与外面盛有所需缓冲液容器相连接的溶液分配器来实现。这可使所需的缓冲液根据需要的速度连续或不连续的且按需定量的输入电泳系统；

-通过在电泳过程中对缓冲溶液的输入调节来动态控制和优化折叠中间体的分离分辨率和清晰度。由此可行的对缓冲液的浓度、组成、pH值的动态调整和设定提高了蛋白质折叠中间体之间的电荷、极性以及离子流的差异。在这里提高的分离分辨力不再仅仅基于蛋白质分子本身的电荷分布和构型形式，还取决于那些由此新引入的辨别因子，即动态改变的折叠中间体的表面电荷和极性分布，以及它们与额外离子流不同的相互作用；

-应用脉冲驱动电泳技术，通过短时间提高电压、短时间改变缓冲液组份的极性和/或者浓度、短时间的调换电泳电极，结合使用高度疏水的反离子以便聚焦单条泳带和扩增含有折叠中间体泳带之间的距离；

-使用不同成分和性状的凝胶，比如：对于较大的蛋白，可以采用孔梯度凝胶来分离。

-电泳设备或者和一个有效的冷却恒温器相连，或者将其和由制冷元件和液体循环冷却槽构成的装置组装在一起，以便凝胶及时得以散热，减少折叠中间体由于热效应引起的在凝胶泳带之间的扩散

-和光谱分析仪器，如动态和静态散射仪，耦合连接的液相色谱、微型电泳层析柱、微型化的场流分离（FFF），用以分离区别它们的水合动力学分子大小。这些仪器适合于分离区分所有蛋白质中间体的水合动力学分子大小，特别是针对一些不适于电泳分离的蛋白质，包括强酸性、强碱性、疏水性的蛋白质，还有膜蛋白和非常大的蛋白质，其操作形式如下所列。

-单级柱液相色谱，即按照需求与波谱仪器耦合连接的用不同的分离介质填装的微型凝胶色谱柱或者微型场流分离器，用以直接确定每个分离组份里折叠中间体的水合动力学分子大小的顺序；

-多级柱液相色谱，即按照需求对与光谱测量方法联用的微型分离柱进行串联和/或并联的组合，微型分离柱包括凝胶色谱柱、羟磷灰石柱、疏水柱、离子交换柱、反相色谱柱、亲和色谱柱，还有微型场流分离器等，专用于分离一些水合动力学分子大小非常接近和折叠路径的归属尚未确定的折叠中间体；

-波谱学区分与量化，即对分离后分别置于系列小容器或微孔试验板内的折叠中间体的水合动力学分子大小进行波谱学鉴别，首选使用动态和静态光散射设备，也使用荧光、紫外/可见光、圆二色法、核磁共振、傅立叶变换红外、电子自旋共振等技术；

-折叠中间物的特异区分，即对单个分离样品中的折叠中间物，它们要么具有不同的水合动力学分子大小，要么具有近似的水合动力学分子大小但可能属于不同的折叠途径，可以使用本发明改进的动态和静态光散射装置，它们的区分能力可以通过以下至少一种方法得以提高：

-通过延长检测时间来提高分辨率，

-通过程控升温的熔点温度（Tm）区分，

-通过对样品用内置的真空蒸发或通风浓缩装置单元进行的浓度改变，

-通过使用微型自动滴定器或手动移加所需缓冲液组分来改变pH值及缓冲溶液体系，

-通过测定并分析样品的固有黏度和界达电势，进一步对中间体进行结构性区分，

-通过提供或去除能量，如以辐射、加热、冷却、超声波、微波、电场、磁场等的形式，来改变样品的生物流变学性质，

-通过使用一些特别开发的测评和排比软件来对折叠中间物进行进一步的区分

-通过毛细管电泳与波谱仪特别是与动态和静态光散射仪的联用，分离和在线自动区分中间体水和动力学分子大小。

4.根据权利要求1至3，其特征是，蛋白折叠过程可通过确定所有或者关键中间体的三维分子结构引入折叠中间体的第五个特征参数在多维坐标系中进行各种多样的可视化展示。

5.根据权利要求1至4的方法应用，其特征是，用于研究、检测和评定蛋白质在折叠过程中其活性和功能针对其底物的变化，用以提高或优化这种蛋白质生物技术生产的产率。

6.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于蛋白质工程，即研究、检测和评定蛋白质的折叠过程及其活性和功能经受诸如分子设计、修饰、改造和融合后发生的变化。

7.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于动态表征和量化及比较和评估体外模拟生物合成和可能出现的共翻译和翻译后的修饰过程，用以优化如体外翻译后修饰蛋白质药物的生物技术生产条件和筛选对共翻译和翻译后修饰过程有辅助或抑制效果的化学和生物药剂，

8.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于结合蛋白质固定化和蛋白质芯片技术动态表征蛋白质在其体外模拟已知体内翻译后修饰时的折叠过程，用以发展其蛋白质药物生物技术生产的工艺方法。

9.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于寻找影响蛋白质折叠过程的生物或化学药剂，即表征、描述、评定备选生物和/或化学抑制剂和/或辅助物质对蛋白质折叠过程的影响。

10.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于研究折叠酶或分子伴侣对蛋白质折叠的影响，其中，这种影响通过对比在含有和不含有折叠酶或分子伴侣的反应条件下的表征结果给予定义。

11.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，寻找抑制折叠酶或分子伴侣的生物和化学活性物质以及影响蛋白质降解的药物，其中，以分别含有折叠酶和分子伴侣及蛋白质降解的蛋白质折叠过程表征为对照，通过平行的含有和不含有折叠酶、分子伴侣备选抑制剂及蛋白质降解影响剂的表征试验，比较、评估、确定备选抑制剂对折叠酶和分子伴侣的抑制药效以及备选药物对蛋白质降解的促进或阻断功能。

12.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于研究多肽或蛋白质在折叠过程中可控的自组装和聚合作用，开发和制作纳米蛋白质材料，其中，对蛋白质自组装和聚合作用的初始过程进行平行的在不同的生理和生化条件下及各种生物和化学影响因子作用下的表征和评价。

13.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于寻找治疗蛋白质分子结构异常病的药物分子伴侣，这些药物分子伴侣可以与折叠中的蛋白质分子特异性结合，结合后可以加快折叠过程稳定蛋白质分子结构，或者可以覆盖错误折叠蛋白质分子的疏水性区域增加蛋白质的溶解度从而阻止未折叠蛋白质分子的聚集，其中，作为备选药物分子伴侣的生物和/或化学性折叠辅助稳定剂的药效将通过对病源蛋白质进行的并行对比折叠表征来确定。

14.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，一方面可用于对正常朊病毒蛋白质（PrionProtein cellular，PrP^C）转变到致病朊病毒蛋白质（Scrapie prion protein，PrP^Sc)的过程进行折叠表征，包括随后的聚合过程；另一方面可用于表征研究从致病朊病毒转变为正常朊病毒的逆过程，包括为阐明发病机理而对聚集物进行的降解过程表征，由此寻找新的治疗手段和可能的预防方法，其中，运用对其折叠过程有影响的生物和/或化学物质，通过调节实验条件例如温度、pH和离子强度等，对朊病毒蛋白质的的折叠过程进行并行表征对比实验。

15.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用以研究、检测、解释蛋白质分子由于异构化、脱氨基作用和外消旋作用而导致的老化和由于自由基作用、氧化压力和环境的影响而引起的衰老的过程，开发针对蛋白质分子的生物及化学抗老抗衰药剂，其中，在标的蛋白质的折叠期间，通过光化学和热能催化加速其异构化、脱氨基和外消旋反应，或通过自由基反应及氧化压力和环境的影响引发其导致老化和衰变的修饰反应，并对这由此变化的折叠过程进行折叠表征，并将实验结果与没有这些特征化影响因子时的折叠过程进行对比。

16.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用于蛋白质的分类（分类学范畴）和对蛋白质的进化在其分子折叠水平上的研究，其中，对折叠过程的表征结果作为每个蛋白质的个性指纹为蛋白质的功能和进化关系提供依据，并可作为辅助规范对现有的以结构、拓扑结构、同源性和进化关系为基础的分类方法进行补充。

17.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用以动态表征蛋白质在折叠时与核苷酸、多糖和脂类形成复合物的过程和所伴随的活性和功能的变化情况，由此发现对复合物动态形成起作用的化学和生物物质，其中，对标的蛋白质和它的复合物的折叠过程先分别进行表征，然后在标的蛋白质折叠过程中按一定的时间间隔定时取样为形成复合体与复合成份混合并对其过程给予表征，最后，在不同的化学和生物因子条件下，分别在提供和不提供蛋白质核酸复合物底物情况下对复合物形成的动态过程重复进行表征、对比和评估。

18.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，用来对蛋白质错误折叠所导致的疾病的诊断和预测，其中，表征病源蛋白质折叠过程的变化作为一种诊断和预测某种蛋白质分子疾病的标准。

19.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，动态并行表征相同蛋白质或者不同蛋白质在它们折叠过程中相互之间发生聚集的过程，包括折叠中的蛋白质和已复性天然蛋白质之间的聚集，研究蛋白质聚集的机理，探索化学和生物学的聚集抑制剂，其中，比较和评估待测蛋白质折叠过程与加入其它蛋白质和/或化学生物抑制剂在不同分子环境中的折叠过程。

20.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，动态表征在折叠中不同蛋白质之间或者折叠中蛋白质与天然蛋白质之间发生的分子相互作用的过程，研究特殊蛋白质折叠过程中的构象行为和催化性能，发现具有治疗功能的靶蛋白，合理化药物设计，优化生物技术生产工艺，其中，表征、比较、评估蛋白质在优化分子环境条件下分别免受和经受其它蛋白质影响的折叠过程。

21.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，动态表征抗原抗体结合反应和抗原抗体复合体的分解过程，来优化和合理化抗体工程，其中，表征、比较、评估新设计的抗体和抗原各自的折叠过程和其在优化的分子生理生化环境下免受和/或经受其它化学和生物化学影响因子情况下同步折叠相互结合的过程，检验评价新设计抗体的选择性、特异性、亲和性、折叠效率、热稳定性、药理动力学和生物技术生产产率以及抗原的抗原性。

22.根据权利要求1至4所述的应用，其特征是，这种方法用于对体外蛋白质早期生物合成和可能的翻译中修饰的初生折叠过程进行表征，研究蛋白质生物合成早期的起始折叠过程，寻找对蛋白质初生折叠过程有影响的化学和/或生物物质，其中，在一个生物和物理化学因子优化的无细胞生物合成体系通过调节有或无同位素标记的必需氨基酸的供给进行体外模拟生物合成，收集分批合成的不同长度的被称为小型中间体的蛋白质片段，用色谱方法进行特异性分离，接着运用本发明方法对他们的折叠过程进行表征和对比。

23.实施根据权利要求1至4所述方法或5至22所述应用的装置，其特征是，用以手动或自动化实施本方法或其应用的各类手段和工具，即各类本发明专用蛋白质折叠表征实验盒、仪器设备和软件、和按本发明构思设计的自动化设备。

24.根据权利要求1至4所述的方法产物或5至22所述的应用产物，其特征在于，它们都是标的蛋白质的各类修饰中间体。

25.根据权利要求24所述的产物的应用，其特征如下，

-筛选、发现和发展作用于蛋白质折叠和蛋白质降解的新型化学和生化药物，

-改善和优化标的药物的生物技术生产、复性和保存，

-蛋白质的高效修饰、设计更新、合理融和优化生产，提高他们的结构功能、活性和药代动力学特性。

26.根据权利要求1至4所述方法产物的应用或者权利要求5至22所述方法应用产物的应用，其产物是经过完全变性去折叠然后在复性折叠过程中被多样化修饰以各种类型中间体形式存在的蛋白质，其特征是，具有不同水合动力学分子大小和相对稳定的结构形状和至少各自拥有的4个独立特征，用以采用多种实施方式对蛋白质的折叠过程在各种分子环境和不同物化生化条件下进行表征，说明蛋白质折叠、错误折叠、聚集、相互作用和自发组装、聚合、老化、衰变、和其新生生物合成的机理，合理化和改善抗体工程和蛋白质工程的实施操作，提高蛋白质活性和功能，优化药物蛋白质的生物技术生产，发展纳米蛋白质材料，扩展蛋白质分类学，寻找发现对蛋白质折叠和降解有影响作用的新兴生物和化学药物以及蛋白质分子病的治疗方法。

27.实施根据权利要求1至4所述方法或5至22所述应用的多重折叠路径模型，其特征在于，基于实验的用4类折叠途径和5种功能区域总结的同样适用于多维能量景观系统的对蛋白质折叠过程表征新知识的图像表述，用以更好的设计、验证和优化本发明的实施步骤。

28.构建的数据库，包含根据权利要求1至4的方法的实施或者根据权利要求5至22的方法应用的实施，或者根据权利要求27的多重折叠路径模型的应用实施得到的对蛋白质折叠过程表征结果的说明。

29.根据权利要求28所述对所建数据库的应用，其特征在于，建立以各类蛋白质折叠表征结果的数据信息为基础的数据库和数据库服务中心。

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