CN115236328B - 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用 - Google Patents

一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115236328B
CN115236328B CN202211154356.1A CN202211154356A CN115236328B CN 115236328 B CN115236328 B CN 115236328B CN 202211154356 A CN202211154356 A CN 202211154356A CN 115236328 B CN115236328 B CN 115236328B
Authority
CN
China
Prior art keywords
electrophoresis
dimensional electrophoresis
protein
adhesive tape
deamidation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211154356.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115236328A (zh
Inventor
彭健
沈绎伦
汤旸玚
彭宁
向源楚
李虎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiangya Hospital of Central South University
Original Assignee
Xiangya Hospital of Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiangya Hospital of Central South University filed Critical Xiangya Hospital of Central South University
Priority to CN202211154356.1A priority Critical patent/CN115236328B/zh
Publication of CN115236328A publication Critical patent/CN115236328A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115236328B publication Critical patent/CN115236328B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用，方法包括：S1、细胞培养与处理：将原代培养的人源细胞，加入6‑重氮‑5‑氧代‑L‑正亮氨酸处理或将慢病毒感染导入shRNA处理后得到的样品作为实验组，与对应的空白对照组，培养后收集细胞样品；S2、将细胞样品制成二维电泳样品；S3、二维电泳；S4、SDS‑PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳；S5、结果分析：根据实验组与对应空白对照组的细胞样品的同种蛋白迁移趋势分析，判断人源细胞蛋白质的脱酰胺化修饰程度。本方法具有操作简便和特异性强的优点，可缩短鉴定蛋白质脱酰胺化反应的实验周期，节约实验成本，能应用于人源肿瘤细胞相关蛋白质组学分析。

Description

一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种人体细胞蛋白理化性质改变的鉴定方法，具体涉及一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用，属于蛋白质组学分析技术领域。
背景技术
蛋白质脱酰胺化修饰（Protein Deamidation）是经典的蛋白质翻译后修饰之一，是指蛋白质通过自发或者酶促反应脱去其氨基酸侧链上的酰胺基团，继而转变为羧基的过程，如天门冬酰胺（Asn）转变为天冬氨酸（Asp），或谷氨酰胺（Gln）转变为谷氨酸（Glu），而酰胺化修饰能够在一定程度上影响蛋白质的功能，进而有可能对人体的多种疾病过程产生影响。尽管脱酰胺化修饰在半个多世纪以前已有报道，但是蛋白质脱酰胺化修饰在很大程度上被认为是蛋白质“老化”或功能衰退而产生的副作用。近期的研究表明蛋白质脱酰胺化修饰可以调节宿主的抗微生物免疫反应，例如源于细菌的效应因子通过对宿主天然免疫系统的关键信号分子脱酰胺化修饰，从而操纵天然免疫防御系统。另外，Bcl-XL和4EBP2蛋白的功能也受到脱酰胺化调控。过往研究还发现疱疹病毒的一个结构蛋白vGAT可以诱导宿主的模式受体RIG-I的脱酰胺化。这些结果表明脱酰胺化修饰能够在一定程度上影响蛋白质的功能，进而在机体的一系列生理、病理过程中起到相应的作用。对人源细胞中行使重要功能的蛋白质进行相关脱酰胺化研究，对于更好更全面地理解各种疾病的发生发展过程具备重要的意义。
目前，蛋白质脱酰胺化的检测主要采用液相色谱方法，如：公开号为CN107522768A的专利文献公开一种蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用，其方法中需要对蛋白质进行前处理，具体方法是将蛋白质通过与尿素接触实现变形处理，之后将变性后的蛋白质进一步于DTT接触进行二硫键破坏处理，之后将二硫键破坏处理后的蛋白质与胰酶接触实现消化处理获得变形酶解后的蛋白质。再将变形酶解后的蛋白质进行PIMT酶催化处理，最后进行RP-HPLC色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定待测蛋白质脱酰胺化程度。该专利公开的采用液相色谱进行蛋白质脱酰胺化的检测方法，其蛋白质前处理步骤繁多，操作繁琐、耗材较多、实验周期长。
因此，亟待一种操作简便、成本低且特异性强的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种基于二维电泳技术的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，该方法具有操作简便和特异性强的优点，可大大缩短鉴定蛋白质脱酰胺化反应的实验周期，同时大量节约实验成本。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
首先提供一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，具体包括如下步骤：
S1、细胞培养与处理：
将原代培养的人源细胞，常温条件下加入6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸处理后作为实验组，同时以加入同等体积的磷酸盐缓冲液的人源细胞作为空白对照组，37℃，5% CO2静置培养8-10h；
S2、制作二维电泳样品：
收集实验组与空白对照组的细胞样品，制备成二维电泳样品；
S3、二维电泳：将步骤S1得到的实验组与相应对照组的二维电泳样品附着在二维电泳胶条上，置于二维电泳槽中，进行二维电泳；
S4、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳：收集胶条后进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后利用考马斯亮蓝染色或者蛋白免疫印迹得到电泳结果；
S5、结果分析：根据实验组与空白对照组的细胞样品的同种蛋白迁移趋势分析，判断人源细胞蛋白质的脱酰胺化修饰程度。
在另一种方案中，步骤S1的细胞培养与处理的方法为：将原代培养的人源细胞，常温条件下将慢病毒感染导入shRNA处理后得到的样品作为实验组，同时以导入空白载体的人源细胞作为空白对照组，37℃，5%CO2静置培养8-10h。
步骤S1中人源细胞的原代培养具体包括：细胞复苏并铺板，在培养条件为37℃，5%CO2的恒温培养箱中，利用加入10% 胎牛血清的人源细胞培养基培养细胞，显微镜下观察，待细胞长至孔板每孔面积的65-75%，即可进行下一步。
步骤S1中的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的浓度为0.01mol/L；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L；以处理六孔板的一个孔板的人源细胞计，加入的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、磷酸盐缓冲液的体积均为1μL。一般一个六孔板的每一个孔，细胞个数范围1.9×105~2×105个。
进一步地，步骤S2中二维电泳样品的制备过程具体如下：
S201、润洗：收集步骤S1培养处理后的细胞，采用0.01mol/L PBS缓冲溶液反复润洗2-3次；优选地，以处理每孔样品计，其用量为3~5mL 。
S202、离心收集：对润洗后的细胞样品，加入0.01mol/L PBS缓冲溶液吹打均匀，之后将样品于3-5℃，3000-3500 rpm的转速离心4-6 min；去除PBS缓冲液后置于0-4℃环境下，具体可以是置于冰上或放置于4℃冷室中，以免细胞蛋白发生热变形，待用；优选地，每孔样品的吹打用量为90-110mL，更优选为100mL；
S203、配备裂解液：裂解液由尿素裂解液、1 mol/L 的DTT溶液以及pH为3-10的IPG缓冲液配制而成；混匀后、离心置于0-4℃环境下（置于冰上或放置于4℃冷室中），备用；
S204、加入步骤S203配制的裂解液，混匀，置于0-4℃环境下（置于冰上或放置于4℃冷室中），每5分钟震荡混匀一次，震荡2-4次（15分钟）；优选地，以六孔板的每个孔的细胞样品计，加入180-220μL，更优选为200μL；
S205、超声波震碎：将超声波破碎仪打开并将能量调至15%-20%，破碎频率为7s/次，以此参数进行两次超声波破碎，第一次超声之后于0-4℃环境中冷却（冷房中操作或者冰浴）15秒后进行第二次超声；
S206、离心：在冷冻离心机4℃，8000rpm条件下离心15min，取离心后的上清液，即为二维电泳样品。
进一步地，步骤S3的二维电泳的具体过程如下：
S301、上样：电泳槽中滴入步骤S2制得的二维电泳样品，从-20℃冰箱冷藏室中取出胶条，撕开胶条上的膜，正负极对好、膜面朝上、胶面朝下慢慢放入铺有RS的槽段，以避免产生气泡，来回轻轻拉动胶条，使胶条均匀覆盖样品；
以10cm的二维电泳胶条和电泳槽为例，一般滴入的二维电泳样品的量为100-150μL，优选为135μL。
S302、石蜡油覆盖：在二维电泳胶条表面加石蜡油1.5-2mL直至完全覆盖二维电泳胶条，给电泳槽上盖好电泳槽盖子；
S303、将上样的电泳槽按正确的电极方向摆放在二维电泳仪上（参考电泳仪的标识区域），盖好仪器盖子；
S304、将二维电泳仪调好参数，进行二维电泳。
S401、洗二维电泳胶条；
S402、制聚丙烯酰胺凝胶：首先根据需要配制分离胶和浓缩胶，然后往电泳槽的缝隙中加入分离胶，再加入浓缩胶，待注胶完成，立即按照实验需求将相应规格的电泳梳子插入电泳槽的狭槽上部；
S403、上样：待凝胶凝固完成后，拔掉梳子，形成梳孔，根据梳孔的大小剪去二维电泳胶条上多余的空白部分后放入梳孔中，赶走二维电泳胶条与SDS-PAGE胶之间的气泡，加入提前进行加热溶解的0.5%琼脂糖凝胶固定胶条；
S404、蛋白电泳：待琼脂糖凝固，加入0.01mol/L的 TGS 电泳缓冲液，二维电泳胶条正极位置加蛋白分子质量标记（蛋白marker），接电源进行恒压电泳（参数为100-120V，30min为宜），直至溴酚蓝迁移至凝胶底部时终止电泳；
优选地，电泳条件为：先调至15 mA/gel条件下恒流电泳25-35分钟，再调至30 mA/gel条件下恒流电泳直至溴酚蓝迁移至底部时终止电泳；
S405、转膜：电泳结束后，取出蛋白电泳后的凝胶，将硝酸碳纤维素膜（Nitrocellulose membrane,NC膜）在甲醇中浸泡激活10s后覆盖于凝胶上，采用恒流方式进行转膜，电压设置为 250mA，时间为 90min，同样在 4℃冰浴条件下进行；
S406、封闭：将电转后的硝酸碳纤维素膜（NC膜）取出，蛋白面朝上，在用1×TBST缓冲液稀释后的5%的脱脂牛奶中封闭1-1.5h；
S407、抗体孵育：弃去封闭液，在孵育盒子内加入一抗，4℃条件下孵育不少于8h；回收一抗，然后用 1×TBST缓冲液润洗NC膜15-20min，重复进行三次；加入二抗，室温条件下孵育不少于1h；回收二抗，然后用 1×TBST缓冲液洗NC膜 15-20min，重复进行三次，将NC膜放置于显影仪中，滴加ECL发光液，在显影仪下进行显影。
进一步地，步骤S401洗二维电泳胶条的步骤具体如下：
（1）配备DTT平衡缓冲液A和DTT平衡缓冲液B，先将步骤S3二维电泳后的胶条置于DTT平衡缓冲液A中，于室温环境的摇床上润洗10-20min；然后转移到DTT平衡缓冲液B中，于室温环境的摇床上润洗10-20min；
DTT平衡缓冲液A由SDS 胶条缓冲液母液和1mol/L的二硫苏糖醇配制而成；DTT平衡缓冲液B由SDS 胶条缓冲液母液加入碘乙酰胺粉末配制而成；
（2）接着将二维电泳胶条，采用0.01mol/L的TGS溶液，室温，洗8-12分钟。
本方法的分析检测原理：
二维电泳作为一种常用的分子生物学实验方法，被广泛应用于蛋白质组学分析当中。它首先会根据各类蛋白的等电点高低在电场中的不同位置形成多个聚焦的信号点，从而形成电泳的“第一相”，然后再通过常用的凝胶电泳（如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）手段将蛋白按照不同的相对分子质量再一次分开，从而形成电泳的“第二相”，由此细胞样本中的各类蛋白会根据等电点和相对分子质量的不同在两个方向上被拉开，从而便于我们进行包括蛋白质组学在内的各种分析。
二维电泳的基本原理是基于蛋白质的两个特定属性，即等电点和分子量。根据蛋白质的电荷（IEF方法）和分子量（SDS-PAGE）从两个方向来分离蛋白。第一维分离中，是按蛋白质的等电点的差异来分离蛋白的。蛋白质是两性分子，根据环境中不同 pH 值可分为带正电荷蛋白、带负电荷蛋白和不带电蛋白，环境 pH 值高于等电点，蛋白带负电荷，反之为带正电荷。当环境中的pH 值与等电点不相等时，蛋白质分子在电场作用下会发生偏移，带负电荷蛋白会向正极偏移，反之带正电荷蛋白会向负极偏移。当 pH 值与等电点相同时，此时的蛋白质不带任何电荷，因此也不会发生任何方向的偏移。根据这一原理，等电聚焦是由在凝胶中小分子载体形成的 pH 梯度所造成的。两性电解质载体是一类在等电点附近具有较高缓冲能力的可溶性小分子。当对两性电解质载体混合物之间施加电压时，pH 值最高的分子（带正电荷最多分子）移向阴极，pH 最低的分子（带负电荷最多的分子）向阳极移动，其余的分子根据 pH 值不同分散于电极的两端，形成一个有连续 pH 梯度蛋白分布；蛋白向与等电点相同的 PH 值方向移动，当到达等电点时，蛋白的电荷达到平衡，不再移动了，这样就根据不同蛋白质等电点不同进行了分离。蛋白质的带电性质取决于蛋白质的二级结构，蛋白质的二级结构是多样化的，导致同一蛋白质的不同二级结构出现不同的带电特性，从而在二维电泳胶上出现不同的蛋白分布。
按照上述原理，首先消除消除蛋白质电荷的影响，这就需要使用十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）对蛋白进行变性处理。通过二维电泳，我们并不能分辨出所有蛋白质亚基，十二烷基硫酸钠是一种强离子去污剂、变性剂和助溶剂，可以打破分子内和分子间的氢键和其他非共价键，能够让蛋白质分子变性，最终破坏蛋白质的二级结构和三级结构；同时，强还原剂巯基乙醇和二硫苏糖醇可以打开蛋白质中半胱氨酸之间的二硫键。凝胶和样品在还原剂和十二烷基硫酸钠的作用下，样品蛋白质可以被分解成多肽链。蛋白质与 SDS 反应后，侧链可发生解聚反应，进而可形成蛋白质-SDS 胶束，后者是带负电荷的而且其所带的负电荷大大超过了蛋白质本身所带电荷量，这就抵消了不同分子间所带电荷量的差异。因此，在跑第二维的 SDS-PAGE 胶时蛋白质在胶里的移动不受蛋白本身电荷的影响，而主要根据蛋白质本身分子量的大小来移动的。
本发明方法中，在蛋白质脱酰胺化反应发生之后，蛋白质会因此携带有更多的负电荷，因此，脱酰胺化修饰会导致蛋白质的等电点的改变，对于相同的蛋白质，由于等电点的改变，其在二维电泳的电场中势必引起位置的迁移，因此可以采用二维凝胶电泳的方法进行蛋白质的脱酰胺化分析。
细胞样本中不同的蛋白经过二维电泳会聚集成点，通过实验组与空白对照组的同种蛋白迁移趋势分析，即可知晓人体癌细胞是否可能发生脱酰胺化修饰（或修饰程度高低）。
本发明还提供上述任一所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法在人源肿瘤细胞相关蛋白质组学分析中的应用。具体地，人源肿瘤细胞包括：人源结肠癌细胞等。
本发明具有如下有益效果：
1、操作周期短、简便快捷：本发明从细胞原代培养到免疫印记实验取得结果，完成全部过程的时间在一周以内，且操作步骤简便。
2、特异性强：在本发明中，我们在进行二维电泳以后创造性地引入蛋白免疫印记这类实验手段，然后通过特异性抗体的孵育，可以针对特定蛋白分子（如：β-catenin蛋白、Deamidase蛋白）进行单独分析，拥有特异性强的优势。
3、节约成本：传统的质谱分析，需要进行的大量细胞培养、蛋白纯化、质谱分析，在该过程中操作繁琐、耗材较多、实验周期长，本技术发明的总体操作过程简单，可以大量节约实验耗材与实验费用支出。
4、灵活性强、可变用途广泛：本发明将细胞培养、二维电泳和蛋白免疫印记这三种生物学实验方法进行有机结合，可利用本发明方法，结合实际研究需要进行灵活运用。如更换不同的细胞株进行实验、观察不同种类蛋白的脱酰胺化情况、通过敲低某一类细胞因子来鉴定其是否对某一类蛋白具备脱酰胺化修饰的活性等。
综上所述，本发明是对现有肿瘤学和蛋白质组学研究领域的技术创新，能简化肿瘤相关蛋白研究的分析步骤，极大程度地节约实验成本。本发明技术的推广，能在肿瘤学研究中的人体癌细胞相关蛋白质组学分析方面产生一定影响。
附图说明
图1为本发明实施例1利用脱酰胺化抑制剂Don处理实验组后所得到的目的蛋白脱酰胺化二维电泳分析图，其中：（a）表示在实施例1的实验条件下目的蛋白利用脱酰胺化抑制剂Don处理的实验组（Don+）与空白对照组（Don-）的蛋白质脱酰胺化二维电泳分析对比图；（b）表示在实施例1的同等实验条件下β-actin蛋白的实验组（Don+）与空白对照组（Don-）的蛋白质脱酰胺化二维电泳分析对比图。
图2为本发明实施例2利用慢病毒导入实验组后所得到的目的蛋白脱酰胺化二维电泳分析图，其中：（a）表示在实施例2的实验条件下目的蛋白利用脱酰胺化抑制剂Don处理的实验组（Don+）与空白对照组（Don-）的蛋白质脱酰胺化二维电泳分析对比图；（b）表示在实施例2的同等实验条件下β-actin蛋白的实验组（Don+）与空白对照组（Don-）的蛋白质脱酰胺化二维电泳分析对比图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围不受下面公开的具体实施例的限制。
按照如下配方表配置各溶液（配方中的各试剂为市购）：
表1 各溶液配制配方表
Figure 564465DEST_PATH_IMAGE001
实施例1 （脱酰胺化抑制剂处理）
本实施例提供一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，具体包括如下步骤：
S1、细胞培养与处理：
（1）复苏人结直肠癌HCT116并原代培养：将人结直肠癌HCT116细胞复苏并铺板，在培养条件为37℃，5% CO2的恒温培养箱中利用加入10% 胎牛血清（FBS）的人源细胞培养基培养细胞，显微镜下观察，待细胞长至孔板每孔面积的70%，即得。
（2）将原代培养的六孔板的人结直肠癌HCT116，常温条件下加入1μL 0.01mol/L6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON)进入一个孔板的孔中处理后作为实验组，以处理六孔板的一个孔板的人源细胞计，一般一个六孔板的每一个孔，细胞个数范围1.9×105~2×105个，同时以加入1μL（同等体积）的磷酸盐缓冲液（1×PBS，0.01M浓度）的人源细胞作为空白对照组， 37℃，5%CO2静置培养8-10h；收集细胞样品。
S2、制作二维电泳样品：
（3）润洗：将收集的细胞样品，每孔细胞样品采用3~5mL的0.01mol/L PBS（1×）缓冲溶液反复润洗2-3次；
（4）离心收集：对润洗后的每孔细胞样品，加入100mL的0.01mol/L PBS缓冲溶液吹打均匀，之后将样品于4℃，3000-3500 rpm的转速离心5min；去除PBS缓冲液后置于冰上，以免细胞蛋白发生热变形，待用；一般一个六孔板的每一个孔，细胞个数范围1.9×105~2×105个。
（5）配备裂解液：
950μL的尿素裂解液（配方见表1）+50μL的已配好的1 mol/L 的DTT溶液（用0.01M乙酸钠溶液溶解，将pH调至5.2，搅拌至完全溶解，分装小份于-20℃保存备用）+5μL的IPG缓冲液（pH3-10）（商用）
将尿素裂解液与DTT溶液搅拌均匀后用双蒸水定容至5ml分装成200μL/每管（可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解），置于-20℃备用；使用时，解冻后加入5μL pH为3-10的IPG缓冲液，混匀，离心，置于冰上，待用；
（6）以六孔板的每个孔的细胞样品计，加入 200μL配制好的裂解液，混匀，置于冰上，每5分钟震荡混匀一次，震荡2-4次（15分钟）；
（7）超声波震碎：能量15%-20%，7秒/次，超声2次，第一次超声之后，置于冰上冷却15秒后接着第二次超声；
（8）离心：4℃，8000rpm条件下，离心15分钟，取离心后的上清液即为二维电泳样品。
S3、二维电泳：
（9）上样：电泳槽中滴入135μL（用量针对10cm的二维电泳胶条和电泳槽）二维电泳样品，从-20℃冰箱冷藏室中取出胶条，撕开胶条上的膜，胶条的pH值根据目的蛋白的等电点进行选择（注意确定胶条的 pH 值是否为自己目的蛋白所需要，如β-catenin蛋白的等电点PI=5.5，故可以选择pH 3-10），正负极对好、膜面朝上、胶面朝下慢慢放入铺有RS的槽段，以避免产生气泡，来回轻轻拉动胶条，使胶条均匀覆盖样品；
（10）加石蜡油：在二维电泳胶条表面加矿物油完全覆盖二维电泳胶条，给电泳槽上盖好盖子；
（11）将上好样的电泳槽按正负极方向正确摆放在Bio-Rad二维电泳仪上标识区域内盖好仪器盖子；
（12）将二维电泳仪调好参数，进行二维电泳。
S4、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
（13）洗二维电泳胶条：准备两个干净的15mL离心管，将二维电泳后的胶条放在其中一个离心管中，离心管中加入提前配制好的DTT平衡缓冲液A（配方见表1），摇床上洗15分钟，室温；
之后转移到另一离心管中，离心管中加入配制好的DTT平衡缓冲液 B（配方见表1），摇床上洗15分钟，室温。
（14）将二维电泳胶条转移到盒子里，用0.01M TGS溶液在室温条件下润洗10分钟；
（15）配制专门的聚丙烯酰胺凝胶：首先根据需要配制分离胶（下层胶）和浓缩胶（上层胶），配制方法见表2、表3；然后先往电泳槽的缝隙中加入分离胶（下层胶），再加入浓缩胶（上层胶），待注胶完成，立即按照实验需求将相应规格的电泳梳子插入电泳槽的狭槽上部；
表2 分离胶（下层胶）配方表
Figure 209221DEST_PATH_IMAGE002
表3 浓缩胶（上层胶）配方表
Figure 395482DEST_PATH_IMAGE003
（16）上样：待凝胶聚合完成后，拔掉梳子，形成梳孔（加样孔），根据梳孔的大小剪去电泳胶条上多余的空白部分，用镊子放入梳孔中，赶走二维电泳胶条与SDS-page胶之间的气泡，加入提前进行加热溶解的0.5%琼脂糖凝胶固定胶条；
（17）待琼脂糖凝固放入普通western blot（蛋白质印迹法）盒子里，加入0.01MTGS 缓冲液，二维电泳胶条正极加蛋白分子质量标记，接电源；
（18）调参数：恒流电泳，先调至15 mA/gel条件下恒流电泳30分钟，再调至30 mA/gel条件下恒流电泳直至溴酚蓝迁移至底部时终止电泳；
（19）转膜：电泳结束后，用镊子轻轻撬开聚丙烯酰胺凝胶两侧的玻璃板，然后轻柔取出蛋白电泳后的凝胶，将凝胶置于转膜夹子，然后把NC膜在甲醇（分析纯）中浸泡 10s后覆盖于凝胶上，然后采用恒流方式进行转膜，电压设置为 250mA，时间为 90min，同样在 4℃冰浴条件下进行；
（20）封闭：将电转后的 NC 膜小心取出，蛋白面朝上，在5%的脱脂牛奶（用1×TBST稀释）中封闭 1h ；
（21）孵育一抗：弃去封闭液，在孵育盒子内加入一抗，4℃条件下孵育不少于8h；
（22）洗膜：回收一抗，然后用 1×TBS 洗 NC膜15-20min，重复进行三次；
（23）孵育二抗，在室温条件下不少于1h；
（24）洗膜/显影：回收二抗，然后用 1×TBST 洗 NC 膜 15-20min，重复进行三次，将 NC 膜放置于显影仪中，滴加 ECL 发光液，进行显影。
S5、结果分析：
（25）根据实验组与对应空白对照组的细胞样品的同种蛋白迁移趋势分析，判断人源细胞蛋白质的脱酰胺化修饰程度。由于细胞样本中不同的蛋白经过二维电泳会聚集成点，通过实验组与空白对照组的同种蛋白迁移趋势分析，即可知晓人体癌细胞是否可能发生脱酰胺化修饰（或修饰程度高低）。
本实施例为了探究结直肠癌细胞系中的蛋白是否存在脱酰胺化修饰，实施例中利用二维凝胶电泳结合脱酰胺化抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-Diazo-5-oxo-L-norleucine，DON)的方法分析相关蛋白。在有脱酰胺化抑制剂DON存在的情况下，相关蛋白的等电点降低（与此同时DON不影响蛋白总量），因而相对于没有DON处理的对照组，会发生向负极迁移的趋势。提示蛋白在结直肠癌细胞系中可能存在脱酰胺化修饰现象。
本实施例的结果如图1（a）所示，在有脱酰胺化抑制剂DON存在的情况下，目标蛋白target protein的等电点降低（与此同时DON不影响target protein的总量），因而相对于没有DON处理的对照组，发生了向负极迁移的趋势。提示target protein在结直肠癌细胞株中可能存在脱酰胺化修饰现象。为了排除细胞全蛋白整体迁移的情况，客观反映实验条件下target protein的迁移情况。本实施例以β-actin蛋白作为参照，证明在实验条件下，其他蛋白不发生迁移的情况下，目的蛋白的迁移情况，如图1（b）所示，在实验条件下，β-actin蛋白没有发生迁移。
实施例2（慢病毒导入法）
本实施例提供另一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，本实施例与实施例1的不同在于，具体的细胞处理和培养方法不同，是将原代培养的六孔板的人肾上皮细胞 HEK-293T，常温条件下将慢病毒感染导入shRNA处理后得到的样品作为实验组，同时以导入空白载体的人源细胞作为空白对照组，37℃，5%CO2静置培养8-10h。具体如下：
（1）获取慢病毒液
首先，根据实验需求将少量人的肾上皮细胞 HEK-293T铺在25cm2的细胞培养flask 中，期间根据观察到的细胞生长情况进行培养、换液直至该细胞培养皿中的 HEK-293T 细胞长至孔板每孔面积的70%左右；
慢病毒相关质粒的转染体系如下：
表4 慢病毒相关质粒的转染体系
Figure 511730DEST_PATH_IMAGE004
按照表4所示的体系配比，利用商用聚乙烯亚胺转染试剂（PolyethylenimineTransfection Reagent，PEI）或者LipoMax将上述质粒转染到细胞中；转染后的 8h，更换新的完全DMEM培养基；在转染后24h，检查细胞生长状态，根据细胞的状况可以酌情添加适量的培养基（一般以 4-5mL 为宜）；在转染的72h后收上清（上清液即为慢病毒液，在收集过程中注意不要扰动贴壁的细胞），然后用 15mL 离心管装取，以 500rpm，3~5min 条件离心；用合适大小的离心管收集上清液，暂时存放在 4℃冰箱中，或者在-80℃冰箱当中进行保存，即为可以进行细胞感染实验的慢病毒液。
（2）慢病毒感染
将少量 HCT116 细胞分配到10cm2培养皿中，保证细胞贴壁后约占培养皿整体面积的 10~20%；用显微镜检查细胞的生长状态，待细胞生长至50%即可进行下一步（一般要求10 cm 培养皿中的细胞中加入10mL的RPMI-1640 培养基）；将慢病毒从冰箱中取出，放在常温下解冻至全部融化为液态；提前准备配置好的 10000×Polybrene，与上述所有实验材料全部置于生物安全柜中；在生物安全柜中操作，按照需要将 10000×Polybrene 加入培养有 HCT116细胞的培养皿中，轻微摇动培养皿使得 Polybrene 与培养基混匀，静置 30min；根据实验需求，按适当比例将病毒液加入到 HCT116 细胞中；将慢病毒感染后的细胞放回细胞培养箱中进行培养，因为前述试剂如Polybrene对细胞具有毒性，因此在病毒染后的8h需要对培养基进行彻底更换。
（3）慢病毒感染效果的检查：
a、本实验中所使用的shCAD带有 GFP，可以通过荧光倒置显微镜下观察到成功感染的HCT116细胞带有绿色荧光；b、通过WB实验（免疫印迹试验，westernblot，简称WB)），检测病毒感染后的细胞株和正常细胞株两者的CAD表达情况，由此可以判定shCAD 在CRC 细胞株HCT116中敲低CAD的效率。继续培养感染后的HCT116细胞，将其分为实验组和对照组进行铺板（6孔板），收集细胞样品。
后续实验步骤同前述（2-25）
本实施例的结果如图2（a）的电泳分析对比图所示：通过在HEK-293T细胞中的慢病毒包装，将shRNA导入结直肠癌细胞HCT116，在HCT116细胞中敲低了CAD（一种targetprotein（靶蛋白）的脱酰胺催化因子）的表达，并将细胞收样后进行二维电泳分析，发现敲低CAD表达后实验组target protein相对于对照组呈现向负极迁移的趋势，提示实验组的target protein带有更少的负电荷，target protein的脱酰胺化修饰水平有所下降。为了排除细胞全蛋白整体迁移的情况，客观反映实验条件下target protein的迁移情况。本实施例以β-actin蛋白作为参照，证明在实验条件下，其他蛋白不发生迁移的情况下，目的蛋白的迁移情况，如图2（b）所示，在实验条件下，β-actin蛋白没有发生迁移。
本发明方法通过在细胞培养时加入抑制剂脱酰胺化DON，或者通过慢病毒包装来试图降低目的蛋白的脱酰胺化水平，同时将二维电泳结合蛋白免疫印记实验观察目的蛋白是否发生脱酰胺化。通过以上实验组与空白对照组的同种蛋白迁移趋势分析，可知人体癌细胞是否可能发生脱酰胺化修饰（或修饰程度高低）。并且本发明提供的方法进行二维电泳以后创造性地引入蛋白免疫印记这类实验手段，然后通过特异性抗体的孵育，可以针对特定蛋白分子进行单独分析（如：β-catenin蛋白与Deamidase蛋白），拥有特异性强的优势。能简化肿瘤相关蛋白研究的分析步骤，极大程度地节约实验成本。本发明的推广，将在肿瘤学研究中的人体癌细胞相关蛋白质组学分析方面产生一定影响。
以上所述仅为本发明的部分较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、细胞培养与处理：
将原代培养的人源细胞，常温条件下加入6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸处理后作为实验组，同时以加入同等体积的磷酸盐缓冲液的人源细胞作为空白对照组， 37℃，5% CO2静置培养8-10h；
S2、制作二维电泳样品：
收集实验组与空白对照组的细胞样品，制备成二维电泳样品；
S3、二维电泳：将步骤S1得到的实验组与相应对照组的二维电泳样品附着在二维电泳胶条上，置于二维电泳槽中，进行二维电泳；
S4、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳：收集胶条后进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后利用蛋白免疫印迹得到电泳结果；步骤具体如下：
S401、洗二维电泳胶条；
S402、配制聚丙烯酰胺凝胶：首先根据需要配制分离胶和浓缩胶，然后往电泳槽的缝隙中加入分离胶，再加入浓缩胶，待注胶完成，立即按照实验需求将相应规格的电泳梳子插入电泳槽的狭槽上部；
S403、上样：待凝胶凝固完成后，拔掉梳子，形成梳孔，根据梳孔的大小剪去二维电泳胶条上多余的空白部分后放入梳孔中，赶走二维电泳胶条与SDS-PAGE胶之间的气泡，加入提前进行加热溶解的0.5%琼脂糖凝胶固定胶条；
S404、蛋白电泳：待琼脂糖凝固，加入0.01mol/L的 TGS 电泳缓冲液，二维电泳胶条正极位置加蛋白分子质量标记，接电源进行恒压电泳，参数为100-120V，30min，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部时终止电泳；
S405、转膜：电泳结束后，取出蛋白电泳后的凝胶，将硝酸碳纤维素膜在甲醇中浸泡激活10s后覆盖于凝胶上，采用恒流方式进行转膜，电压设置为 250mA，时间为 90min，同样在4℃冰浴条件下进行；
S406、封闭：将电转后的NC膜取出，蛋白面朝上，在用1×TBST缓冲液稀释后的5%的脱脂牛奶中封闭1-1.5h；
S407、抗体孵育：弃去封闭液，在孵育盒子内加入一抗，4℃条件下孵育不少于8h；回收一抗，然后用 1×TBST缓冲液润洗NC膜15-20min，重复进行三次；加入二抗，室温条件下孵育不少于1h；回收二抗，然后用 1×TBST缓冲液洗NC膜 15-20min，重复进行三次，将 NC膜放置于显影仪中，滴加ECL发光液，在显影仪下进行显影；
S5、结果分析：根据实验组与空白对照组的细胞样品的同种蛋白迁移趋势分析，判断人源细胞蛋白质的脱酰胺化修饰程度。
2.根据权利要求1所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，
步骤S1的细胞培养与处理的方法为：将原代培养的人源细胞，常温条件下将慢病毒感染导入shRNA处理后得到的样品作为实验组，同时以导入空白载体的人源细胞作为空白对照组，37℃，5% CO2静置培养8-10h。
3.根据权利要求1或2所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，
步骤S1中人源细胞的原代培养具体包括：细胞复苏并铺板，在培养条件为37℃，5% CO2的恒温培养箱中利用加入10% 胎牛血清的人源细胞培养基培养细胞，显微镜下观察，待细胞长至孔板每孔面积的65-75%，即可进行下一步。
4.根据权利要求3所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，
步骤S1中的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的浓度为0.01mol/L；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L；以处理六孔板的一个孔板的人源细胞计，加入的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、磷酸盐缓冲液的体积均为1μL。
5.根据权利要求1或2所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，步骤S2中二维电泳样品的制备过程具体如下：
S201、润洗：收集步骤S1培养处理后的细胞，采用0.01mol/L PBS缓冲溶液反复润洗2-3次；
S202、离心收集：对润洗后的细胞样品，加入0.01mol/L PBS缓冲溶液吹打均匀，之后将样品于3-5℃，3000-3500 rpm的转速离心4-6 min；将细胞样品吸取PBS缓冲液后置于0-4℃环境下，待用；
S203、配备裂解液：
裂解液由尿素裂解液、1 mol/L 的DTT溶液以及pH为3-10的IPG缓冲液配制而成；混匀后、离心后置于0-4℃环境下备用；
S204、加入步骤S203配制的裂解液，混匀，置于0-4℃环境下，每5min混匀一次，每次混匀过程中震荡2-4次；
S205、超声波震碎：将超声波破碎仪打开并将能量调至15%-20%，破碎频率为7s/次，以此参数进行两次超声波破碎，第一次超声之后于0-4℃环境中冷却15秒后进行第二次超声；
S206、离心：在冷冻离心机4℃，8000rpm条件下离心15min，取离心后的上清液，即为二维电泳样品。
6.根据权利要求5所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，步骤S3的二维电泳的具体过程如下：
S301、上样：电泳槽中滴入步骤S2制得的二维电泳样品，从-20℃冰箱冷藏室中取出胶条，撕开胶条上的膜，正负极对好、膜面朝上、胶面朝下慢慢放入槽段中，以避免产生气泡，来回轻轻拉动胶条，使胶条均匀覆盖蛋白样品；
S302、石蜡油覆盖：在二维电泳胶条表面加石蜡油1.5-2mL直至完全覆盖二维电泳胶条，给电泳槽上盖好电泳槽盖子；
S303、将上样的电泳槽按正确的电极方向摆放在二维电泳仪上，盖好仪器盖子；
S304、将二维电泳仪调好参数，进行二维电泳。
7.根据权利要求6所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，步骤S301中，胶条的pH值根据目的蛋白的等电点进行选择。
8.根据权利要求1或2所述的基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法，其特征在于，步骤S401洗二维电泳胶条的步骤具体如下：
（1）配备DTT平衡缓冲液A和DTT平衡缓冲液B，先将步骤S3二维电泳后的胶条置于DTT平衡缓冲液A中，于室温环境的摇床上润洗10-20min；然后转移到DTT平衡缓冲液B中，于室温环境的摇床上润洗10-20min；
DTT平衡缓冲液A由SDS 胶条缓冲液母液和1mol/L的二硫苏糖醇配制而成；DTT平衡缓冲液B由SDS 胶条缓冲液母液加入碘乙酰胺粉末配制而成；
（2）接着将二维电泳胶条，采用0.01mol/L的TGS溶液，室温，洗8-12分钟。
9.权利要求1-8任一所述基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法在人源肿瘤细胞相关蛋白质组学分析中的应用。
CN202211154356.1A 2022-09-22 2022-09-22 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用 Active CN115236328B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211154356.1A CN115236328B (zh) 2022-09-22 2022-09-22 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211154356.1A CN115236328B (zh) 2022-09-22 2022-09-22 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115236328A CN115236328A (zh) 2022-10-25
CN115236328B true CN115236328B (zh) 2023-02-03

Family

ID=83667348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211154356.1A Active CN115236328B (zh) 2022-09-22 2022-09-22 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115236328B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097897A (zh) * 2010-07-05 2013-05-08 韩思梗 表征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法
CN107522768A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 湖北生物医药产业技术研究院有限公司 蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用
CN110982866A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 莫纳(连云港)生物科技有限公司 用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251651B1 (en) * 1998-06-04 2001-06-26 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Protein-deamidating enzyme, gene encoding the same, production process therefor, and use thereof
CN104830822B (zh) * 2015-04-03 2017-02-22 广州优联康医药科技有限公司 一种重组人血管舒缓素

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097897A (zh) * 2010-07-05 2013-05-08 韩思梗 表征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法
CN107522768A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 湖北生物医药产业技术研究院有限公司 蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用
CN110982866A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 莫纳(连云港)生物科技有限公司 用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mass spectrometric peptide analysis of 2DE-separated mouse spinal cord and rat hippocampus;Stefan Mikkat et al.;《Electrophoresis》;20131231;第34卷;摘要、第2.1-2.2节 *
生物技术药物脱酰胺化检测方法概述;李恒等;《医药导报》;20190228;第38卷(第2期);第147-152页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115236328A (zh) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106868008A (zh) CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特异性gRNA
CN111363029B (zh) 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
Seow et al. Proteomic investigation of metabolic shift in mammalian cell culture
CN108387723B (zh) 一种lrp4抗体细胞包被微孔板制备方法
CN115236328B (zh) 一种基于二维电泳的人源细胞蛋白质脱酰胺化的检测方法及应用
CN117384295A (zh) 小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用
Benda et al. Regulation of specific functions of glial cells in somatic hybrids. I. Control of S100 protein
CN115896227A (zh) 一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法
CN114149980B (zh) 一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记系统PhastID
Talal et al. Functional and structural studies of membrane-bound and free ribosomes from rat spleen
CN109486883B (zh) 一种制备l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
CN108456696A (zh) 一种用于病毒包装的293t细胞株的构建方法
ZHANG et al. Preparation and application of novel thermo-sensitive matrix-based immobilized enzyme for fast and highly efficient proteome research
CN104478999A (zh) 一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白提取方法
CN116082512B (zh) 针对CDKN1A_p21CIP1蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN113063942B (zh) 一种检测摩氏摩根菌抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN117384294B (zh) 小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及应用
CN117904206A (zh) 一种hspb6基因敲除细胞系的构建方法及其应用
CN113740531B (zh) 一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用
CN114032216B (zh) 双皮质肾上腺素样激酶1的新用途
CN110951783B (zh) 一种通过干扰uch-l3表达抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
CN113774060A (zh) 基于CRISPR-Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用
CN116948009A (zh) 瞬时表达方式制备重组牛fsh的方法
CN112143755A (zh) 一种人甲状旁腺激素真核表达重组质粒载体及其构建方法
CN117587126A (zh) Psme3及其表达产物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant