CN116948009A - 瞬时表达方式制备重组牛fsh的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及瞬时表达方式制备重组牛FSH的方法。具体地说，本发明提供了牛FSH的核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位和β亚单位的天然牛FSH相同的蛋白序列，经过串联表达和融合表达设计及密码子优化，可显著提高其表达水平。本发明所述重组表达载体为pcDNA3.4，为瞬时表达使用载体。瞬时表达所用细胞株为CHOK1‑Hi，其最高密度可达到2*107个/ml。采用电转化的方式将带有目标基因的表达载体转入目标细胞株中，无血清培养重组高蛋白表达。纯化后的蛋白可用于同期发情、超数排卵、牛胚胎移植等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达牛FSH的核苷酸序列、重组表达载体、重组细胞株及重组牛FSH的制备方法。
背景技术
随着社会的发展和人们生活水平的提高，对牛肉和牛奶的需求更是与日俱增。传统人工授精繁育方式下，要提高牛整体遗传性能及生产表现，需数个世代的选种选配才能实现。随着胚胎工程技术的发展，一个世代即可得到更多生产性能优异的牛群体，进而实现全群的优化，从根本上提升生产性能。当前，一些颇具前瞻意识的牛养殖企业已开始运用胚胎工程加快牛遗传改良进展。
促卵泡激素(FSH，Follicle-stimulating hormone，促卵泡素)是由动物脑垂体前叶分泌的一种促性腺激素，属于糖蛋白类，它与促黄体激素(LH)等4种激素都由2个不同亚基组成，且这4种激素的α亚基都相同，但β亚基决定其特有的生物活性，牛FSH的β亚基由109个氨基酸组成，N端还有一个由20个氨基酸组成的信号肽。由于FSH可维持精子生成，刺激卵泡生长，因此可用于动物同期发情、超数排卵、治疗因促性腺激素分泌异常而引起的个体机能性不孕症，在畜牧业生产及经济动物繁育方面具有广泛用途。从动物脑垂体提纯获得的FSH量极其微少，影响了该激素的广泛应用。因此，用基因工程方法大量生产FSH，提高动物繁殖率，具有重要的实践意义和理论意义。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是目前动物细胞表达系统中最具代表性的细胞之一，也是用来表达外源目的蛋白最多也最成功的一类细胞。CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选细胞系之一，与其他表达系统相比，细胞具有如下优点：驯化后可悬浮培养，且表达水平较高，可以用于大规模生产；准确的转录后修饰功能，使其表达的糖基化蛋白在分子结构、理化性质及生物学功能方面更接近于天然蛋白分子；具有重组基因的高效扩增和表达能力；属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，有利于外源目的产物的分泌；产物胞外分泌，便于下游产物分离纯化。珠海恺瑞公司的CHOK1-Hi细胞是专门驯化用于瞬时表达的细胞系，其最高生长密度可达2*107个/ml，且存活率高达95％以上。
pcDNA3.4是目前最常用的哺乳动物表达载体之一，大约6kb左右，载体使用CMV强启动子调控外源基因的表达；载体拷贝数很高，表达量也很高；在大多数哺乳动物细胞中可以进行高水平的稳定和非复制的瞬时表达；Amp+原核筛选抗性，Neo+真核筛选抗性，可以利用G418筛选稳定细胞株。
本领域期待提供一种利用CHO细胞生产牛FSH并获得较高产量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛FSH的核苷酸序列(串联表达和融合表达及密码子优化设计)，pcDNA3.4重组表达载体、CHOK1-Hi细胞株及重组牛FSH的制备方法。
本发明以牛FSH核苷酸序列作为理论基础，通过串联表达和融合表达的设计，采用瞬时表达的方式，利用CHO细胞生产牛FSH，能够获得较高的产量。
更具体地，本发明提供以下各项：
1、一种牛FSH核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位和β亚单位的天然牛FSH相同的蛋白序列，α亚基的基因序列如SEQ ID No.1所示，β亚基的基因序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：atggattactacagaaaatatgcagctgtcattctgaccattttgtctctgtttctgcaaattctccattcctttcctgatggagagt ttacaatgcagggctgtcctgaatgcaagctaaaagaaaacaaatacttctccaagccagatgctgcaatctatcagtgcatggggtgctgcttctccagggca taccccactccagcgaggtctaagaagacaatgttggtccccaagaacatcacctcggaagctacatgctgtgtggccaaagcatttaccaaggccacagtg atgggaaatgtcagagtggagaaccacaccgagtgccactgcagcacttgttattatcacaaatcctaa。
SEQ ID No.2：atgaagtctgtccagttctgtttccttttctgttgctggagagcaatctgctgcagaagctgcgagctgaccaacatcaccatc acggtggagaaagaggaatgtggcttctgcataagcatcaacaccacgtggtgtgcaggctactgctacacccgggacttggtgtacagggacccagcaaggcccaatatccagaaaacgtgtaccttcaaggagctggtctacgagacggtgaaagtgcctggctgtgctcaccatgcagactccctgtacacgtacccagtagccactgaatgtcactgcagcaagtgcgacagcgacagcactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagggaaatcaaagaataa。
2、一种牛FSH的蛋白序列，其为串联表达方式，并带有自剪切2肽-P2A(其序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)。
3、一种牛FSH的蛋白序列，其为融合表达方式，并带有linker序列(其序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。
4、一种瞬时表达载体，其为pcDNA3.4表达载体，其特征在于，所用的启动子和终止子分别为：CMV和HSV TK poly(A)。
5、根据上述瞬时表达载体，其所用细胞株为CHOK1-Hi(其可借由商业途径例如由珠海恺瑞公司驯化所得，其可高密度培养的瞬时表达细胞株，其最高可支持的细胞密度为2*107个/ml)。
6、制备牛FSH的方法，包含以下步骤：
提供牛FSH核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；
将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成(其可借由商业途径合成)；
从插入重组质粒的甘油菌中提取质粒，使用电转仪(例如Thermo公司的)将提取的质粒转入CHOK1-Hi细胞株中；
对CHOK1-Hi细胞株进行大规模培养，获得包含牛促卵泡激素蛋白的培养上清，(该促卵泡激素可使用western blot验证)。
7、制备牛FSH的方法，包含以下步骤：
(1)获得pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α载体；
(2)质粒提取；
(3)pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α电转化入CHOK1-Hi细胞；
(4)CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的无血清培养重组高蛋白表达。
8、制备牛FSH的方法，其中步骤(1)获得pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α载体是照如下方式进行的：提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，合成得到包括pcDNA3.4、β亚基、P2A肽和α亚基的串联表达重组载体即重组质粒pcDNA3.4+β+P2A+α，以及包括pcDNA3.4、β亚基、Linker和α亚基的融合表达重组载体即重组质粒pcDNA3.4+β+L+α，以及得到插入该等重组质粒的甘油菌。
所述，α亚基的基因序列为如下SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1：atggattactacagaaaatatgcagctgtcattctgaccattttgtctctgtttctgcaaattctccattcctttcctgatggagagt ttacaatgcagggctgtcctgaatgcaagctaaaagaaaacaaatacttctccaagccagatgctgcaatctatcagtgcatggggtgctgcttctccagggca taccccactccagcgaggtctaagaagacaatgttggtccccaagaacatcacctcggaagctacatgctgtgtggccaaagcatttaccaaggccacagtg atgggaaatgtcagagtggagaaccacaccgagtgccactgcagcacttgttattatcacaaatcctaa。
所述，β亚基的基因序列为如下SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：atgaagtctgtccagttctgtttccttttctgttgctggagagcaatctgctgcagaagctgcgagctgaccaacatcaccatc acggtggagaaagaggaatgtggcttctgcataagcatcaacaccacgtggtgtgcaggctactgctacacccgggacttggtgtacagggacccagcaaggcccaatatccagaaaacgtgtaccttcaaggagctggtctacgagacggtgaaagtgcctggctgtgctcaccatgcagactccctgtacacgtacccagtagccactgaatgtcactgcagcaagtgcgacagcgacagcactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagggaaatcaaagaataa。
9、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(2)质粒提取使用无内毒素质粒大量提取试剂盒(例如采用Endo-Free Plasmid Maxi Kit试剂盒)进行质粒提取并测定浓度，具体是照如下方式进行的：
2.1)将插入了重组质粒的甘油菌培养所得(例如200ml)过夜培养菌液转移至(例如250ml的)离心杯中，离心(例如4000×g室温离心10min)，倒掉培养基(通过倒置于纸上以彻底流干培养基)；
2.2)加入10ml solution I/RnaseA，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体；
2.3)加10ml solution II，轻柔地来回颠倒(例如8-10次)获得澄清的裂解液；室温孵育(例如，2-3min，过程中偶尔混匀一次)；
2.4)加入(例如5ml)冰buffer N3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置(例如，2-3min，期间偶尔颠倒混匀，以使其充分反应)；
2.5)于4℃离心(例如4000×g离心10min)，将上清转移到注射器中，过滤至新的(例如50ml)离心管中，测定所得裂解液的体积；
2.6)加入0.1倍体积的ETR溶液，上下反复颠倒(例如10次)；
2.7)冰浴(例如10min)，期间将试管上下翻转多次(加入ETR溶液之后，裂解液应变浑浊，当放冰上后，变澄清)；
2.8)于42℃孵育裂解(例如5min)，应再次变浑浊；
2.9)于25℃离心(例如4000×g离心5min)，ETR溶液在管底形成蓝色层；
2.10)转移顶部水相(即清澈的裂解液)到一个新的(例如50ml)离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液；
2.11)插入一个结合柱(例如HiBind DNA Maxi结合柱)到一个(例如50ml)离心管中，加入(例如3ml)GPS buffer到结合柱中，室温放置(例如4min)，离心(例如，4000×g离心3min)，丢弃废液；
2.12)转移(步骤2.10)得到的)澄清裂解液(例如20ml)到步骤2.11)处理的结合柱中，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管；
2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到结合柱中；
2.14)向结合柱中加入(例如10ml)HBC buffer，离心(例如，4000×g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；
2.15)加入(例如15ml)DNA wash buffer，离心(例如，4000×g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；
2.16)加入(例如10ml)DNA wash buffer，离心(例如，4000×g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；
2.17)将空的结合柱离心(例如，4000×g离心10min)使色谱柱干燥；
2.18)将柱转移至一个新的(例如50ml的，无核酸酶的)离心管中；
2.19)加入1-3ml Endo-Free Elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，离心(例如，4000×g离心5min)得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。
10、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(3)pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α电转化入CHOK1-Hi细胞是使用电转化试剂盒(例如NeonTM Transfection System 10μLKit)按照如下操作处理的：
3.1)准备CHOK1-Hi细胞：将CHOK1-Hi细胞置于5％的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为6～10×106个/ml)，且存活率大于97％的细胞进行转化；
3.2)待细胞生长至密度为6～10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液(例如10ml)于离心管中(使其终密度为2×107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清；
3.3)加入(例如1ml)PBS溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；
3.4)使用电转化试剂盒中的R buffer重悬细胞；
3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+P2A+α质粒；9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+L+α质粒；
3.6)电转条件：1620V，10ms，3pulse；
3.7)在24孔板中加入1ml新鲜Hi-KDCHO培养液，进行培养，并在24h时添加300μg/ml的G418(Geneticin sulfate)，进行筛选；
3.8)逐步提高G418的筛选浓度，最终达到800μg/ml，得到CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞，其用于后续的无血清培养重组高蛋白表达。
11、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(4)CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的无血清培养重组高蛋白表达是按照如下操作处理的：
4.1)将经过抗生素筛选的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞分别置于5％的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，待细胞生长至密度为6-10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于新鲜Hi-KDCHO培养液中，使其密度达到6×106个/ml；
4.2)24小时后加入1.2％的CHO细胞蛋白表达增强剂Hi KDCHO-KE；同时添加一次营养补充添加剂Hi KDCHO-Feed(添加量为2％)，并将细胞转移至32℃摇床培养箱中进行低温表达，以取得高表达效果；
4.3)72小时后再添加一次Hi KDCHO-Feed(添加量为2％)，以提高产物的表达量；(例如，步骤4.2)和步骤4.3)中随Hi KDCHO-Feed添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.8mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液)；
4.4)待细胞生长至10×106个/ml时，每天额外添加1g/L的葡萄糖，待细胞生长至20×106个/ml时葡萄糖的添加量加倍；
4.5)待培养到第7天后，分别收获CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的表达了FSH蛋白的细胞表达上清；任选的，可以使用western blot法进一步验证这些表达上清中的FSH蛋白表达。
如本发明上下文所详述的，本发明方法能够成功地通过串联表达方式或者融合表达方式获得牛FSH蛋白，并且所得牛FSH蛋白呈现令人期待的效果。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1：串联表达重组片段的模式图，包括FSHβ基因表达盒和FSHα基因表达盒，其中包含一个P2A的切割肽，启动子为CMV，终止子为HSV TK poly(A)。
图2：融合表达重组片段的模式图，包括FSHβ基因表达盒和FSHα基因表达盒，其中包含一个linker，启动子为CMV，终止子为HSV TK poly(A)。
图3：瞬时表达细胞western blot结果图(1：FSH标准品-USA；2：pcDNA3.4+β+P2A+α串联表达上清；3：pcDNA3.4+β+L+α融合表达上清)。
图4：瞬时表达细胞免疫荧光检测效果图(a：串联表达正常光；b：串联表达荧光；c：融合表达正常光；d：融合表达荧光)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明以牛FSH核苷酸序列作为理论基础，对其进行密码子优化，设计了串联表达和融合表达的方式，借由商业途径(如未另外说明，本发明具体实例中，委托南京金斯瑞生物有限公司)合成，得到pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α甘油菌株，质粒抽提后测定浓度，pcDNA3.4+β+P2A+α通过电转化方式导入CHOK1-Hi细胞中，实现串联表达；pcDNA3.4+β+L+α通过电转化方式导入CHOK1-Hi细胞中，实现融合表达；应用细胞免疫荧光的检测方法，确定是否有阳性克隆产生；摇瓶发酵，western blot方法检测蛋白。
实施例1：获得pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α载体
在本实施例中首先提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成；其中，
串联表达重组载体包括pcDNA3.4、β亚基、P2A肽和α亚基，重组片段的组成如图1，获得的重组质粒命名为pcDNA3.4+β+P2A+α，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并寄送甘油菌。
融合表达重组载体包括pcDNA3.4、β亚基、Linker和α亚基，重组片段的组成如图2，获得的重组质粒命名为pcDNA3.4+β+L+α，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并寄送甘油菌。
如上所述，α亚基的基因序列和β亚基的基因序列分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示：
SEQ ID No.1：atggattactacagaaaatatgcagctgtcattctgaccattttgtctctgtttctgcaaattctccattcctttcctgatggagagt ttacaatgcagggctgtcctgaatgcaagctaaaagaaaacaaatacttctccaagccagatgctgcaatctatcagtgcatggggtgctgcttctccagggcataccccactccagcgaggtctaagaagacaatgttggtccccaagaacatcacctcggaagctacatgctgtgtggccaaagcatttaccaaggccacagtgatgggaaatgtcagagtggagaaccacaccgagtgccactgcagcacttgttattatcacaaatcctaa
SEQ ID No.2：atgaagtctgtccagttctgtttccttttctgttgctggagagcaatctgctgcagaagctgcgagctgaccaacatcaccatc acggtggagaaagaggaatgtggcttctgcataagcatcaacaccacgtggtgtgcaggctactgctacacccgggacttggtgtacagggacccagcaaggcccaatatccagaaaacgtgtaccttcaaggagctggtctacgagacggtgaaagtgcctggctgtgctcaccatgcagactccctgtacacgtacccagtagccactgaatgtcactgcagcaagtgcgacagcgacagcactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagggaaatcaaagaataa
据此可以确定牛促卵泡激素核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位(或称α亚基)和β亚单位(或称β亚基)的天然牛促卵泡激素相同的蛋白序列。
实施例2：质粒提取
本实施例采用Endo-Free Plasmid Maxi Kit试剂盒(Omega品牌，货号D6926-03，为一种无内毒素质粒大量提取试剂盒)提取，并测定浓度。处理步骤参考该试剂盒的说明书进行，具体为：
2.1)将实施例1之甘油菌培养所得200ml过夜培养菌液转移至一个250ml的离心杯中，4000×g室温离心10min，倒掉培养基(通过倒置于纸上以彻底流干培养基)。
2.2)加10ml的solution I/RnaseA，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体。
2.3)加10ml solution II，轻柔地来回颠倒8-10次获得澄清的裂解液；室温孵育2-3min，过程中偶尔混匀一次。
2.4)加入5ml冰buffer N3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置2-3min，期间偶尔颠倒混匀，以使其充分反应。
2.5)于4℃、4000×g离心10min，将上清转移到一个注射器中，将上清过滤至新的50ml离心管中，测定所得裂解液的体积。
2.6)加入0.1倍体积的ETR溶液，上下反复颠倒10次。
2.7)冰浴10min，期间将试管上下翻转多次(加入ETR溶液之后，裂解液应变浑浊，当放冰上后，变澄清)。
2.8)于42℃孵育裂解5min，应再次变浑浊。
2.9)于25℃、4000×g离心5min，ETR溶液应在管底形成蓝色层。
2.10)转移顶部水相(即清澈的裂解液)到一个新的50ml的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液。
2.11)插入一个HiBind DNA Maxi结合柱到一个50ml的离心管中(试剂盒提供的)，加入3ml GPS buffer到HiBind DNA Maxi结合柱中，室温放置4min，4000×g离心3min，丢弃废液。
2.12)转移20ml(2.10步骤得到的)澄清裂解液到HiBind DNA Maxi柱中，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到HiBind DNA Maxi柱中。
2.14)向HiBind DNA Maxi柱中加入10ml HBC buffer，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
2.15)加入15ml DNA wash buffer，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
2.16)加入10ml DNA wash buffer，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
2.17)将空HiBind DNA Maxi柱4000×g离心10min使色谱柱干燥。
2.18)将柱转移至一个新的50ml(无核酸酶的)离心管中。
2.19)加入1-3ml Endo-Free Elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，4000×g离心5min得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。
实施例3：pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α电转化入CHOK1-Hi细胞。
接续实施例2步骤2.19)进行本实施例。
3.1)准备CHOK1-Hi细胞：将CHOK1-Hi细胞置于5％的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为6～10×106个/ml)，且存活率大于97％的细胞进行转化。
3.2)待细胞生长至密度为6～10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液(10ml)于离心管中(使其终密度为2×107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清。
3.3)加入1ml PBS溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。
3.4)使用电转化试剂盒中的R buffer重悬细胞。
3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+P2A+α质粒；9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+L+α质粒。
3.6)电转条件：1620V，10ms，3pulse。
3.7)在24孔板中加入1ml新鲜Hi-KDCHO培养液，进行培养，并在24h时添加300μg/ml的G418(Geneticin sulfate)，进行筛选。
3.8)逐步提高G418的筛选浓度，最终达到800μg/ml，得到CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞，其用于后续的无血清培养重组高蛋白表达。
实施例4：CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞
的无血清培养重组高蛋白表达
4.1)将经过抗生素筛选的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞分别置于5％的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，待细胞生长至密度为6-10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于新鲜Hi-KDCHO培养液中，使其密度达到6×106个/ml。
4.2)24小时后加入1.2％(1.2ml/100ml)的CHO细胞蛋白表达增强剂Hi KDCHO-KE；同时添加一次营养补充添加剂Hi KDCHO-Feed(添加量为2％，2ml/100ml)，并将细胞转移至32℃摇床培养箱中进行低温表达，以取得高表达效果。
[本发明的一些试验中使用Hi-KDCHO-K(珠海恺瑞，货号K03205K)为CHO-K1-Hi细胞无血清高密度瞬时转染系统套装，该套装包含Hi-KDCHO、Hi KDCHO-TA、Hi KDCHO-KE、HiKDCHO-Feed，使用本系统便于高效完成重组蛋白CHO细胞超高密度瞬转表达的工作]
4.3)72小时后再添加一次Hi KDCHO-Feed(添加量为2％，2ml/100ml)，以提高产物的表达量；
4.4)待细胞生长至10×106个/ml时(一般为接种后的1至2天)，需每天额外添加1g/L的葡萄糖，待细胞生长至20×106个/ml时(一般为接种后的4至6天)，则葡萄糖的添加量可加倍；
4.5)待培养到第7天后，分别收获CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的表达了FSH蛋白的细胞表达上清，可以使用western blot法进一步验证这些表达上清中的FSH蛋白表达。
实施例5：CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞
表达的FSH蛋白western blot验证
使用western blot的常规操作进行，具体如下：
5.1)将实施例4步骤4.5)获得的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞表达上清分别与loading buffer(6×)按照5:1的比例配置，并置于沸水中煮10min，而后3000rpm离心1min，置于4℃冰箱中备用。
5.2)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶：按照配方加入适量的聚丙烯酰胺凝胶，10％SDS，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌(注：不要产生气泡)，将此液体缓缓地加入到模具中。在上面缓慢加入约1ml左右的无水乙醇，静置30min。
5.3)待下层胶凝固之后，轻轻倾斜制胶板，使无水乙醇流出，并采用滤纸吸干残余无水乙醇。
5.4)配置5％SDS-PAGE浓缩胶：按照配方加入适量的聚丙烯酰胺凝胶，10％ SDS，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌(注：不要产生气泡)，将此液体缓缓地加入到分离胶上并灌满，随后插入梳子(保证梳子齿末端没有气泡)。
5.5)等待30min，待凝胶聚合后小心拔出梳子，将制好的凝胶和玻璃板放入电泳槽内并组装好。
5.6)将电泳缓冲液加入内外槽中，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。
5.7)将5.1制备好的样品取20μl加入至凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。
5.8)接通电源进行电泳，观察marker，待marker显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离时停止电泳(一般情况下是等溴酚蓝标记的样本跑出凝胶，目标蛋白的分子量不同电泳停止的时间不同，视实验而定)。
5.9)准备好转膜缓冲液，将胶浸于转膜缓冲液10min左右。
5.10)根据胶的大小裁剪PVDF膜(使用前需要进行甲醇浸泡处理)和滤纸，放到转膜缓冲液中平衡10min左右。
5.11)装配转膜：在海绵上放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置胶，放置处理好的PVDF膜，放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置海绵，注意每层之间不能有气泡，用转膜仪中的支架夹住(胶位于负极)，装配成转膜“三明治”。
5.12)将转膜“三明治”放置到转膜槽中，加转膜缓冲液，将转移槽置于冰浴中；插上电极，根据蛋白分子量确认转膜的电压/电流和时间。
5.13)转膜结束后，切断电源，取出PVDF膜。
5.14)将膜置于5％脱脂牛乳的TBST溶液中，于室温处置1h。
5.15)用TBST洗3min，然后置于配置好的带有FSHβ(C-12)抗体(sc-374452，1:500，鼠源)的5％脱脂牛乳的TBST溶液中，4℃过夜。
5.16)用TBST洗3次，每次5min。
5.17)配置好带有goat anti-mouse HRP抗体(1:3000)的5％脱脂牛乳的TBST溶液中，室温2小时。
5.18)用TBST洗3次，每次5min。
5.19)配置化学发光液，将其直接加入膜表面，用保鲜膜覆盖(注：无气泡无褶皱)；胶片在暗盒中进行压片10s至几分钟时间不等(根据条带亮度确定时间)，取出后显影液浸泡后置于定影液中浸泡，最后清水冲洗，即可拍照(或者直接滴加发光液在显影仪器中直接显影和拍照)，如图3所示，其为瞬时表达细胞western blot结果的典型图，图中条带1为FSH标准品(USA)，条带2为pcDNA3.4+β+P2A+α串联表达上清，条带3为pcDNA3.4+β+L+α融合表达上清)，结果表明牛FSH蛋白在两种细胞中的优良表达。
本发明人另外还使用全自动化学发光成像分析系统(Tanon 5200，天能)进行WB曝光，使用系统配置软件读取目标条带的灰度值和面积，并计算各样品条带各斑点的总灰度，
以表达上清条带典型斑点总灰度除以FSH标准品条带典型斑点总灰度所得的商，作为该表达上清的目标蛋白相对量。经计算，实施例4步骤4.5)获得的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞表达上清之目标蛋白相对量为2.11±0.37(6次重复试验获得的表达上清之结果)、CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞表达上清之目标蛋白相对量为1.34±0.18(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验a)，与实施例1～实施例4步骤4.1)操作相同，通过2种方式获得细胞悬液；接着，参照实施例4步骤4.2)至步骤4.5)的操作，不同的仅是在步骤4.2)和步骤4.3)中随Hi KDCHO-Feed添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.8mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液；由此，在步骤4.5)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为5.47±0.73(6次重复试验获得的表达上清之结果)、CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1.47±0.27(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验b)，与实施例1～实施例4步骤4.1)操作相同，通过2种方式获得细胞悬液；接着，参照实施例4步骤4.2)至步骤4.5)的操作，不同的仅是在步骤4.2)和步骤4.3)中随Hi KDCHO-Feed添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.8mg/ml丙酮酸钙的灭菌水溶液；由此，在步骤4.5)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为1.92±0.48(6次重复试验获得的表达上清之结果)、CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1.41±0.43(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验c)，与实施例1～实施例4步骤4.1)操作相同，通过2种方式获得细胞悬液；接着，参照实施例4步骤4.2)至步骤4.5)的操作，不同的仅是在步骤4.2)和步骤4.3)中随Hi KDCHO-Feed添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含15mg/ml果糖的灭菌水溶液；由此，在步骤4.5)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为2.56±0.63(6次重复试验获得的表达上清之结果)、CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1.30±0.25(6次重复试验获得的表达上清之结果)。根据上文实施例1～4以及补充试验a至补充试验c的结果，表明在无血清培养过程中添加本发明上文所述增补液能够显著地增加CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量，但是对CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量无影响。
实施例6：细胞免疫荧光验证
6.1)吸取待检测的实施例4步骤4.5)获得的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞样品加入1.5ml的ep管中，细胞数量为1×106个以上，3000rpm离心5min。
6.2)弃上清，用1ml的PBS溶液清洗，3000rpm离心5min，弃上清。
6.3)加入4％多聚甲醛溶液，每管300μl，固定15min，3000rpm离心5min，弃上清。
6.4)加入0.25％曲拉通100溶液，静置15min，3000rpm离心5min，弃上清。
6.5)加入5％的BSA溶液，封闭30min，5000rpm离心5min，弃上清。
6.6)按照1:500比例配置his一抗，每个ep管加入100μl，4℃放置过夜。
6.7)用1ml的PBS清洗，5000rpm离心5min，弃上清；如此重复两次。
6.8)按照1:50的比例配置二抗(goat anti-mouse FITC)，每个ep管加入50μl，室温放置3h。
6.9)用1ml PBS清洗，5000rpm离心5min，弃上清；重复操作两次。
6.10)置荧光显微镜下观察，如图4所示。
上述细胞免疫荧光验证结果表明，两种表达方式均能够获得阳性克隆。
实施例7：FSH诱导KGN细胞产生孕酮并测定孕酮含量
FSH能够诱导KGN细胞产生孕酮，孕酮含量能够反映FSH细胞水平活性。本实施例使用人孕酮(PROG)ELISA检测试剂盒(品牌：岚派，货号：LP-H01679)，测定实施例4获得的2种牛FSH蛋白(培养液上清)诱导KGN细胞产生孕酮的量。
7.1)细胞培养：KGN细胞为单层贴壁生长细胞，生长用培养基为DMEM/F12培养基+10％胎牛血清，于37℃、5％CO2条件下培养3～4天，待细胞生长至对数生长期后；用胰酶消化，计数后保证在96孔细胞培养板(100μl)中的细胞数约为2×104个细胞/孔。
7.2)FSH样品准备：待细胞接种24h后，更换为1％FBS的DMEM/F12培养基，然后用含1％FBS的DMEM/F12培养基对FSH样品进行稀释，按照FSH蛋白培养液和DMEM/F12培养基的比例为1:1、1:2进行稀释(设置阴性对照孔：CHO细胞培养液和KGN细胞培养液按照实验稀释比例1:1、1:2稀释)，稀释好的样品加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个样品2个复孔；于37℃、5％CO2条件下分别培养48、72小时后取样检测。
7.3)FSH标准孔准备：待细胞接种24h后，更换为1％FBS的DMEM/F12培养基，然后用含1％FBS的DMEM/F12培养基对FSH标准品进行稀释，按照标准品(USA)和DMEM/F12培养基的比例为1:1、1:2进行稀释，稀释好的样品加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个样品2个复孔；于37℃、5％CO2条件下分别培养48、72小时后取样检测。
7.4)Elisa试剂盒检测孕酮含量：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
7.5)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
7.6)样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
7.7)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
7.8)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
7.9)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.10)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
7.11)绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。结果(n＝6的均值表示)：阳性对照组孕酮含量为1.193nmol/ml、串联表达所得FSH组孕酮含量为1.957nmol/ml、串融合表达所得FSH组孕酮含量为1.634nmol/ml。另外同法测定补充试验a所得两种细胞表达上清，显示串联表达所得FSH组孕酮含量为3.742nmol/ml、串融合表达所得FSH组孕酮含量为1.931nmol/ml。这些结果表明，本发明通过串联表达和融合表态两种方式制备得到的FSH均能够诱导KGN细胞产生孕酮。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.制备牛FSH的方法，包含以下步骤：
提供牛FSH核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；
将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成；
从插入重组质粒的甘油菌中提取质粒，使用电转仪将提取的质粒转入CHOK1-Hi细胞株中；
对CHOK1-Hi细胞株进行大规模培养，获得包含牛促卵泡激素蛋白的培养上清。
2.根据权利要求1的方法，包含以下步骤：
(1)获得pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α载体；
(2)质粒提取；
(3)pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α电转化入CHOK1-Hi细胞；
(4)CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的无血清培养重组高蛋白表达。
3.根据权利要求2的方法，其中步骤(1)获得pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α载体是照如下方式进行的：提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，合成得到包括pcDNA3.4、β亚基、P2A肽和α亚基的串联表达重组载体即重组质粒pcDNA3.4+β+P2A+α，以及包括pcDNA3.4、β亚基、Linker和α亚基的融合表达重组载体即重组质粒pcDNA3.4+β+L+α，以及得到插入该等重组质粒的甘油菌；其中，所述α亚基的基因序列为如下SEQ ID No. 1所示，所述β亚基的基因序列为如下SEQ ID No. 2所示。
4.根据权利要求2的方法，其中步骤(2)质粒提取使用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒提取并测定浓度，具体是照如下方式进行的：
2.1)将插入了重组质粒的甘油菌培养所得过夜培养菌液转移至离心杯中，离心，倒掉培养基；
2.2)加入10ml solution I/RnaseA，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体；
2.3)加10ml solution II，轻柔地来回颠倒获得澄清的裂解液；室温孵育；
2.4)加入(例如5ml)冰buffer N3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置；
2.5)于4℃离心，将上清转移到注射器中，过滤至新的离心管中，测定所得裂解液的体积；
2.6)加入0.1倍体积的ETR溶液，上下反复颠倒；
2.7)冰浴，期间将试管上下翻转多次；
2.8)于42℃孵育裂解，应再次变浑浊；
2.9)于25℃离心，ETR溶液在管底形成蓝色层；
2.10)转移顶部水相到一个新的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液；
2.11)插入一个结合柱(例如HiBind DNA Maxi结合柱)到一个离心管中，加入GPSbuffer到结合柱中，室温放置，离心，丢弃废液；
2.12)转移步骤2.10)得到的澄清裂解液到步骤2.11)处理的结合柱中，4000×g离心3min，弃滤液并重复使用收集管；
2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到结合柱中；
2.14)向结合柱中加入HBC buffer，离心，弃滤液并重复使用收集管；
2.15)加入DNA wash buffer，离心，弃滤液并重复使用收集管；
2.16)加入DNA wash buffer，离心，弃滤液并重复使用收集管；
2.17)将空的结合柱离心(例如，4000×g离心10min)使色谱柱干燥；
2.18)将柱转移至一个新的(无核酸酶的)离心管中；
2.19)加入1-3ml Endo-Free Elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，离心(例如，4000×g离心5min)得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。
5.根据权利要求2的方法，其中步骤(3)pcDNA3.4+β+P2A+α和pcDNA3.4+β+L+α电转化入CHOK1-Hi细胞是使用电转化试剂盒按照如下操作处理的：
3.1)准备CHOK1-Hi细胞：将CHOK1-Hi细胞置于5%的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为6~10×106个/ml)，且存活率大于97%的细胞进行转化；
3.2)待细胞生长至密度为6~10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中(使其终密度为2×107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清；
3.3)加入PBS溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；
3.4)使用电转化试剂盒中的R buffer重悬细胞；
3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+P2A+α质粒；9μl细胞(密度为2×107个/ml)，1μl的pcDNA3.4+β+L+α质粒；
3.6)电转条件：1620V，10ms，3 pulse；
3.7)在24孔板中加入1ml新鲜Hi-KDCHO培养液，进行培养，并在24h时添加300μg/ml的G418，进行筛选；
3.8)逐步提高G418的筛选浓度，最终达到800μg/ml，得到CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞，其用于后续的无血清培养重组高蛋白表达。
6.根据权利要求2的方法，其中步骤(4)CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的无血清培养重组高蛋白表达是按照如下操作处理的：
4.1)将经过抗生素筛选的CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞分别置于5%的CO2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，待细胞生长至密度为6-10×106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于新鲜Hi-KDCHO培养液中，使其密度达到6×106个/ml；
4.2)24小时后加入1.2%的CHO细胞蛋白表达增强剂Hi KDCHO-KE；同时添加一次营养补充添加剂Hi KDCHO-Feed(添加量为2%)，并将细胞转移至32℃摇床培养箱中进行低温表达，以取得高表达效果；
4.3)72小时后再添加一次Hi KDCHO-Feed(添加量为2%)，以提高产物的表达量；(例如，步骤4.2)和步骤4.3)中随Hi KDCHO-Feed添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.8mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液)；
4.4)待细胞生长至10×106个/ml时，每天额外添加1g/L的葡萄糖，待细胞生长至20×106个/ml时葡萄糖的添加量加倍；
4.5)待培养到第7天后，分别收获CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+P2A+α)细胞和CHOK1-Hi(pcDNA3.4+β+L+α)细胞的表达了FSH蛋白的细胞表达上清。
7.一种牛FSH核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位和β亚单位的天然牛FSH相同的蛋白序列，α亚基的基因序列如SEQ ID No. 1所示，β亚基的基因序列如SEQ ID No. 2所示。
8.一种牛FSH的蛋白序列，其为串联表达方式，并带有自剪切2肽-P2A。
9.一种牛FSH的蛋白序列，其为融合表达方式，并带有linker序列。
10.一种瞬时表达载体，其为pcDNA3.4表达载体，所用的启动子和终止子分别为：CMV和HSV TK poly(A)；其所用细胞株为CHOK1-Hi。
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