CN109957580A - 一种表达人促卵泡生长激素（fsh）的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法。本发明将人促卵泡生长激素目的基因克隆到腺病毒载体，包装得到的重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞可以高效表达得到具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白。本发明提供了一种利用重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞制备重组人促卵泡生长激素的方法，该方法利用动物泌乳功能的乳腺上皮细胞制备了可分泌到细胞外且具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白，为动物乳腺上皮细胞用于制备重组人促卵泡生长激素蛋白可提供了可靠的方法，对将来利用转基因羊、牛等大动物乳腺生产重组人促卵泡搜生长激素提供可靠的技术依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药与基因工程技术领域，特别是涉及一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法。
背景技术
人促卵泡生长激素(FSH)是由下丘脑控制的垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的糖蛋白类促性腺激素，它是一种由FSHα亚基与FSHβ亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白。其中FSHα亚基基因编码了92个氨基酸，包含10个半胱氨酸，形成5个二硫键；FSHβ亚基基因编码了111个氨基酸，其中包含12个半胱氨酸，形成6个二硫键。人促卵泡生长激素在女性体内的主要功能是促进子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等，临床上主要用于辅助生殖方面超数排卵等功能。
目前市场对于人促卵泡生长激素产品的需求巨大，市面上主要有两种人促卵泡生长激素产品，一种是尿源的人促卵泡生长激素，另外一种是国外进口的基因工程重组人促卵泡生长激素(rhFSH)蛋白，其中在国内市场的临床应用上进口重组人促卵泡生长激素占据主要市场。尿源FSH蛋白药物如瑞士Serono公司的Tertinex/metrodin，以及我国丽珠集团的丽申宝。进口的重组促卵泡生长激素目前主要是利用基因工程技术和细胞培养工艺来制备重组促卵泡激素生物制品，如瑞士Serono公司的Gonal-F以及荷兰Organon公司的Puregon等进口的重组hFSH都是这类产品。
重组人促卵泡生长激素相比尿源提取人促卵泡生长激素有纯度高、生物活性高、来源均一的特点，并且它不含有促黄体激素及其他杂蛋白的污染，但是国外进口的重组人促卵泡生长激素主要是细胞表达的基因工程产品，受制于细胞表达量低的因素，生产成本较高，因此进口重组人促卵泡生长激素价格较为昂贵。
要突破国外进口重组人促卵泡生长激素药物的价格壁垒，开发出国内生产的重组人促卵泡生长激素，需要充分利用现逐渐成熟的技术来实现。目前利用动物乳腺制备重组蛋白药物是重组蛋白药物制备热门的研究领域之一，动物乳腺制备重组蛋白药物具备产量高、价格低的优势。但是目前还未见大动物乳腺制备重组人促卵泡生长激素相关研究报导，主要原因还是制备转基因大动物来制备重组人促卵泡生长激素药物是需要复杂的技术程序操作，在大动物上获得转基因动物的成功率较低，成本很高，因此在制备转基因大动物用于乳腺表达重组重组人促卵泡生长激素蛋白国内外未见相关报道。
发明内容
为了克服目前重组人促卵泡生长激素的生产上的技术体系缺陷，本发明旨在提供一种利用腺病毒载体在动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长素的方法，通过体外动物泌乳功能细胞生产重组人促卵泡生长激素。本发明的优势在于选用腺病毒进行人促卵泡生长素基因动物乳腺上皮细胞的表达，可以高效表达目的蛋白重组人促卵泡生长激素，由于腺病毒载体不会整合到宿主细胞的染色体基因中，因此避免了宿主细胞基因突变等危险因素，更加安全可靠，同时利用体外动物乳腺上皮细胞进行人促卵泡生长素基因的表达，在细胞层面为动物乳腺制备其他重组蛋白提供前期的技术依据，探索了动物乳腺细胞制备重组人促卵泡生长激素蛋白药物的可能性与有效性。
本发明方案由如下步骤组成：
(1)重组人促卵泡生长激素腺病毒载体的构建
以pAdTrack-CMV为腺病毒穿梭载体，将人促卵泡生长激素基因克隆到pAdTrack-CMV 载体构建了pAdTrack-CMV-FSH腺病毒穿梭载体，穿梭载体pAdTrack-CMV-FSH与骨架载体 pAdEasy-1通过转化到大肠杆菌体内重组后获得了重组腺病毒表达载体pAdEasy-FSH。
(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增
将重组腺病毒载体pAdEasy-FSH转染到人胚胎肾细胞中，10-14d后得到第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，收集第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，通过感染HEK-293A后继续扩增得到滴度更高的腺病毒，收集得到第三代重组人促卵泡生长激素腺病毒，测定第三代重组人促卵泡生长激素病毒的滴度。
(3)重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞
将重组人促卵泡生长激素腺病毒加入到培养了24-30h的动物乳腺上皮细胞中，24h-48h 后收集动物乳腺上皮细胞蛋白。
(4)重组人促卵泡生长激素的鉴定及纯化
收集动物乳腺上皮细胞蛋白，通过Western blotting鉴定目的蛋白的表达，利用亲合层析方法纯化动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素。
(5)重组人促卵泡生长激素活性检测
将动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素进行体外活性检测，验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中所用腺病毒穿梭载体为pAdTrack-CMV、腺病毒骨架载体为pAdEasy-1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中人促卵泡搜生长激素目的基因由FSHα及 FSHβ两个亚基基因基因组成。其中步骤(1)中其中FSHβ目的基因后携带6个组氨酸标签基因，用于后期在动物乳腺上皮细胞表达的目的蛋白的纯化。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中用于腺病毒穿梭载体和骨架载体重组的菌株为BJ5183大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的用于包装腺病毒的细胞为人胚胎肾细胞 (HEK-293A)细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的转染用的脂质体可以为Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000阳离子脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞，动物乳腺上皮细胞感染复数为180-260。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中动物乳腺上皮细胞为羊乳腺上皮细胞或者牛乳腺上皮细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中Western blotting鉴定重组人促卵泡搜生长激素中电泳过程中蛋白上样缓冲液为非还原上样缓冲液，蛋白样品不进行煮沸处理。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中用于测定重组人促卵泡生长激素体外生物活性的方法为人促卵泡生长激素刺激含人促卵泡生长激素受体蛋白的人胚胎肾细胞细胞产生 cAMP(环磷酸腺苷)，从而可以利ELISA试剂盒来测定含人促卵泡生长激素受体蛋白的 HEK-293A细胞产生环磷酸腺苷的浓度，来验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素体外生物活性。
本发明有益效果在于：
(1)选用腺病毒进行人促卵泡搜生长激素基因在动物乳腺上皮细胞的表达，可以高效表达人促卵泡搜生长激素目的蛋白，相比在CHO(仓鼠卵巢细胞)细胞系等表达重组人促卵泡生长激素更加经济高效。同时腺病毒载体不会整合到宿主细胞的染色体基因中，因此避免了宿主细胞基因突变等危险因素，更加安全可靠。
(2)利用动物乳腺上皮细胞进行人促卵泡生长激素基因的表达，在细胞层面进行前期的探索为牛羊等大动物乳腺制备其他重组蛋白提供前期的研究方法借鉴，为大动物乳腺制备 FSH蛋白药物的可能性与有效性提供可靠依据。
(3)本发明以腺病毒作为载体，将人促卵泡生长激素目的基因连接到腺病毒载体构建重组人促卵泡生长激素腺病毒表达载体，包装得到的重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞后高效表达人促卵泡生长激素目的基因，获得了具备生物活性的重组人促卵泡生长激素目的蛋白。
(4)本发明方法表达的重组人促卵泡生长激素通过体外生物活性检测后，对于具备和商品化的重组人卵泡生长激素一样的体外生物活性，其中本方法制备的重组人促卵泡生长激素和空白对照组刺激HEK-293A细胞产生cAMP的浓度大小分别平均为165.63mM、33.72mM，具备显著差异。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的pAdTrack-CMV-FSH穿梭载体酶切电泳图谱
图中：泳道M为D15000 DNA marker，片段大小依次为：15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp；
泳道1为未酶切pAdTrack-CMV-FSH腺病毒穿梭载体电泳图；
泳道2为经过双酶切pAdTrack-CMV-FSH穿梭载体，目的基因片段大小为795bp，所用内切酶为BglII和HindIII限制性内切酶。
图2为本发明一种实施方式的pAdEasy-FSH重组腺病毒载体目的基因PCR鉴定电泳图谱
图中：泳道M为D2000 DNA marker，片段大小依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp、100bp；
泳道1为PCR扩增pAdEasy-FSH模板中促卵泡搜生长激素目的基因，其大小为795bp。
图3为本发明一种实施方式的动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素蛋白的Western blotting免疫印迹图
图中：A为感染重组人促卵泡生长激素基因腺病毒的动物乳腺上皮细胞细胞蛋白样品的免疫印迹结果，B为未感染重组人促卵泡生长激素基因腺病毒的动物乳腺上皮细胞蛋白样品的免疫印迹结果，其中使用的抗体为Abcam公司的FSH兔多克隆抗体(ab8746)。
图4为本发明一种实施方式的镍柱纯化动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素蛋白SDS Page电泳图
图中：泳道M为蛋白质Marker，从上往下条带大小依次为94kD、66.2kD、45kD、33kD、26kD、20kD、14.4kD；
泳道1为未纯化羊乳腺上皮细胞培养上清蛋白；
泳道2为经过镍柱纯化得到羊乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素目的蛋白，其大小为40kD；
泳道3为纯化得到牛羊乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素目的蛋白，其大小为 40kD。
图5为本发明一种实施方式的ELISA检测重组人促卵泡生长激素蛋白刺激稳定表达人促卵泡生长激素受体的HEK-293A细胞产生cAMP浓度柱状图
图中：柱状图中从左往右分别为羊乳腺上皮细胞、牛乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素、阳性对照药物Gonal-F和只添加培养基的空白对照组刺激HEK-293A细胞产生cAMP 的浓度大小。
本发明中所涉及的HEK-293A细胞购自The Global Bioresource Center(ATCC)，菌种 BJ5183大肠杆菌购自Addgene公司，腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV、腺病毒骨架载体pAdEasy-1购自Addgene公司。
具体实施方式
以下通过实施案例形式的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施案例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。
实施例1
羊乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素
(1)重组人促卵泡生长激素腺病毒载体的构建
在GenBank中检索得到人促卵泡生长激素的基因序列为中人FSHα(GenBenkaccession NO.：NP_000726.1)及FSHβ(GenBenk accession NO.：NP_000501.1)亚基基因序列，且在 FSHβ基因下游增加6个组氨酸标签的基因序列便于后期纯化目的蛋白，目的基因由金斯瑞生物科技有限公司化学法合成，设计的酶切位点为BglII和HindIII，并连接到pAdTrack-CMV 载体中构建pAdTrack-CMV-FSH穿梭载体，酶切及测序验证其正确性。用PmeI酶将 pAdTrack-CMV-FSH穿梭载体线性化，切胶回收载体，将其转化到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183感受态，在含卡那霉素的LB平板上过夜生长。挑取平板上较小的菌落，扩大培养后，提取质粒，并用PacI酶切验证目的基因是否与骨架载体重组得到腺病毒载体pAdEasy-FSH，同时测序验证重组腺病毒载体的正确性。
(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增与滴度测定
将HEK 293A细胞复苏后传代培养，待细胞到较好状态的时候，将细胞传代到25cm2的细胞培养瓶中，确保24h后细胞汇合度为50％左右，将已经测序正确的线性化腺病毒表达载体pAdEasy-FSH和脂质体Lipofectamine 2000按照1:3(3μg质粒：9μL脂质体)的比例转染HEK 293A，转染4-6h后更换新鲜培养基。转染3天后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达，每2-3天添加少量新鲜培养基。到10-14天后，细胞几乎全部可以观察到荧光，并且细胞呈葡萄球状且大量漂起，此时可收集第一代病毒。用第一代病毒感染HEK-293A细胞，扩增后收集第二代病毒，如此反复，收集得到第三代腺病毒，用LaSRT法测定第三代腺病毒病毒滴度，准备用于感染羊乳腺上皮细胞细胞。
(3)重组人促卵泡生长激素腺病毒感染羊乳腺上皮细胞细胞
感染前确定腺病毒感染的最佳MOI值，将实验室冻存的羊乳腺上皮细胞细胞复苏，在 DMEM/F12培养基(含10％FBS)、37℃和5％CO2下经过传代培养后，让细胞达到最好的状态，将羊乳腺上皮细胞细胞按1×105个接种于6孔板中，培养24h-30h后，分别用感染复数为60、100、140、180、220、260的重组腺病毒感染乳腺上皮细胞，每个组设置三个重复， 2h后换新鲜的培养液，培养24-48h后观察GFP荧光情况和细胞病变状况，选择转染效率高且病变作用小的作为最佳感染复数，用最佳感染复数感染羊乳腺上皮细胞细胞24-48h后，收集活细胞蛋白，准备用Western blotting鉴定rhFSH蛋白表达情况。
(4)Western blotting鉴定重组促卵泡生长激素在羊乳腺上皮细胞的表达
用第三代腺病毒感染羊乳腺上皮细胞细胞后，收集活细胞蛋白。制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，蛋白样品上样量为15μL，上样缓冲液为非还原上样缓冲液，电泳过程中浓缩胶用 80V电压，分离胶用100V电压，待溴酚蓝距离凝胶底部约1cm处时停止电泳。将蛋白从凝胶转膜到PVDF膜上，4℃低温下用5％的脱脂奶粉过夜封闭。封闭结束后，将PVDF膜至于 TBST缓冲液配置的抗FSH多克隆抗体中，在4℃条件下过夜孵育。孵育完一抗后用TBST洗膜4次，每次10min。将洗好的PVDF膜用羊抗兔HRP酶标二抗在4℃下孵育4h，然后用 TBST洗膜缓冲液洗膜4次，每次10min。用ECL化学发光液显色后在化学发光成像仪中曝光，观察目的蛋白的表达情况。
(5)重组促卵泡生长激素目的蛋白的纯化
由于羊乳腺上皮细胞细胞表达的蛋白含组氨酸标签，用镍柱纯化目的蛋白后用于进一步的生物活性检测。将含金属Ni的琼脂糖填料混匀后装入层析柱，静置10min后凝胶与溶液分层，缓慢排出柱中乙醇。装好柱子后向柱子中加入5倍体积的去离子水将残余乙醇冲洗干净，接着用10倍柱体积的上样缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl)平衡镍柱。平衡后准备上样，将细胞培养上清液及细胞裂解液作为样品上样，上样前需高速离心去除细胞碎片等杂质，以10倍柱体积每小时的流速过柱。样品过柱完成后，用洗杂缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.5M NaCl)冲洗柱子，洗去部分杂蛋白。根据上样蛋白量的多少用适量洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM咪唑，0.5M NaCl)将柱子上目的蛋白洗脱下来，并对洗脱的蛋白样品进行SDS Page鉴定。
(6)重组人促卵泡生长激素的体外生物学活性验证
复苏含FSHR受体的HEK-293A细胞，该细胞为稳定表达人卵泡刺激素受体(FSHR)基因的稳定细胞株。待细胞生长状态良好后，将HEK-293A细胞按照2×104个细胞/孔的密度种到96孔细胞培养板中，每个孔加入0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。细胞培养24h后，弃去孔中旧培养基，其中纯化的rhFSH蛋白作为试验组、Gonal-F作为阳性对照组，分别用培养基稀释后加入到细胞中，空白组细胞只加等体积的完全培养基培养，每个组设三个复孔。细胞在培养箱培养1h后，弃去细胞上清液，裂解细胞后用cAMP试剂盒检测不同组中细胞cAMP的含量。
本发明通过羊乳腺上皮细胞制备的rHFSH蛋白大小为40kD大小，经体外试验检测，与商品化的重组人促卵泡生长激素Gonal-F一样具备体外生物活性。
实施例2
牛乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素
试验所用牛乳腺上皮细胞购买自ATCC，并由本实验室培养及保存。在步骤(3)中，实施例2使用的细胞为牛乳腺上皮细胞，实施例1使用的细胞为羊乳腺上皮细胞，除了该点不同之处外，实施例2具体的实施步骤同实施例1步骤(1)(2)(3)(4)(5)(6)。牛乳腺上皮细胞表达的rhFSH蛋白大小与羊乳腺上皮细胞表达的rhFSH大小一致，为40kD大小，且经过体外活性验证，其与商品化的重组人促卵泡生长激素Gonal-F同样具备体外生物活性。
Claims (7)
1.一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法，其特征在于，该方法是利用腺病毒载体在动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素，包括以下步骤：
(1)构建重组人促卵泡生长激素腺病毒载体
以pAdTrack-CMV为腺病毒穿梭载体，将人促卵泡生长激素基因克隆到pAdTrack-CMV载体构建pAdTrack-CMV-FSH腺病毒穿梭载体，腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-FSH与骨架载体pAdEasy-1通过转化到大肠杆菌体内重组后获得了重组腺病毒载体pAdEasy-FSH；
(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增
将重组腺病毒载体pAdEasy-FSH转染到人胚胎肾细胞中，10-14d后得到第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，收集第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，通过感染人胚胎肾细胞后继续扩增得到滴度更高的腺病毒，收集得到第三代重组人促卵泡生长激素腺病毒，测定第三代重组人促卵泡生长激素病毒的滴度；
(3)重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞
将重组人促卵泡生长激素腺病毒加入到培养了24-30h的动物乳腺上皮细胞中，24h-48h后收集动物乳腺上皮细胞蛋白；
(4)重组人促卵泡生长激素的鉴定及纯化
收集动物乳腺上皮细胞蛋白，通过蛋白质免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白的表达，利用亲合层析方法纯化动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素；
(5)重组人促卵泡生长激素活性检测
将动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素进行体外活性检测，验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性。
2.根据权利1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的人促卵泡生长激素基因是由由FSHα及FSHβ两个亚基基因组成；所述FSHβ目的基因后携带6个组氨酸标签基因，用于后期在动物乳腺上皮细胞表达的目的蛋白的纯化。
3.根据权利要求1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于：步骤(4)中所述Western blotting鉴定目的蛋白的表达，电泳过程中蛋白上样缓冲液为非还原上样缓冲液，蛋白样品不进行煮沸处理。
4.根据权利要求1所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于，步骤(5)中所述验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性的方法为人促卵泡生长激素刺激含人促卵泡生长激素受体蛋白的HEK-293A细胞产生环磷酸腺苷(cAMP)，从而可以利ELISA试剂盒来测定含人促卵泡生长激素受体蛋白的HEK-293A细胞产生的环磷酸腺苷的浓度。
5.根据权利1-4任一所述的一种表达人促卵泡生长激素的方法，其特征在于：步骤(3)中通过腺病毒载体表达的重组人促卵泡生长激素的目标宿主细胞为羊乳腺上皮细胞或者牛乳腺上皮细胞。
6.如权利要求1-4任一所述表达人促卵泡生长激素的方法生产的重组人促卵泡生长激素。
7.如权利要求6中所述的重组人促卵泡生长激素的应用。
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