CN105073779A - 促卵泡激素(fsh)/裂解结构域融合构建体与其制备和使用的方法 - Google Patents

促卵泡激素(fsh)/裂解结构域融合构建体与其制备和使用的方法 Download PDF

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赫克托·阿里拉
威廉·汉塞尔
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Abstract

本发明涉及融合构建体，使用融合构建体的方法和治疗不希望或异常细胞增殖或过度增殖紊乱，如肿瘤、癌症、瘤形成和恶性肿瘤的方法。

Description

促卵泡激素(FSH)/裂解结构域融合构建体与其制备和使用的方法
相关申请
本申请要求于2012年11月15日提交的申请序列号61/726,935的优先权，该申请全部内容通过引用明确地并入本文中。
技术领域
本发明涉及融合构建体，使用融合构建体的方法和治疗不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱(例如非转移性和转移性瘤形成、癌症、肿瘤和恶性肿瘤)的方法。
背景技术
当考虑癌症患者的五年生存率时：如果诊断有远处转移疾病，仅10-40％的患肺癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的患者生存，因此开发用于治疗原发性肿瘤和转移瘤的新的疗法的需要是显而易见的。
发明内容
本发明至少部分基于融合或缀合到结合部分的裂解结构域，在本文中称为融合构建体或缀合物。将细胞与裂解结构域接触被认为造成细胞膜的破裂，这导致细胞死亡。结合部分靶向细胞用于通过裂解结构域进行破坏，包括不希望的或异常的增殖细胞或过度增殖细胞，例如非转移性和转移性瘤形成、癌症、肿瘤和恶性肿瘤。一些非转移性和转移性赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞过度表达受体或配体。例如，许多非转移性和转移性瘤形成、癌症、肿瘤和恶性肿瘤表达激素(例如，促卵泡激素(FSH)、促黄体激素/绒毛膜促性腺激素(LH/CG)、或促黄体激素释放激素(LHRH等))、生长因子、细胞因子、抗体等的受体，其可以用作为融合构建体的结合部分。
融合构建体可以设计为靶向表达针对该结合部分的该结合位点的任何细胞或细胞群。如配体、抗体及其片段、生长因子、细胞因子之类结合部分可以连接到裂解结构域以提供靶向杀死表达或包含受体、抗原、抗体、配体之类细胞，从而减少或抑制细胞增殖或细胞生长。
融合构建不需要细胞分裂来杀死靶细胞。此外，融合构建体不太可能是免疫原性的，因为它们可以被制成尺寸相对较小。此外，融合构建体杀死多重抗药性细胞。
根据本发明，提供了融合构建体，融合构建体包括第一和第二结构域。在一个实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，第一结构域由12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基L-或D-氨基酸序列组成，所述L-或D-氨基酸序列包括肽序列，肽序列选自例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK，并且第二结构域包括靶向或结合部分或由靶向或结合部分组成。在另一个实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，并且第二结构域包括靶向或结合部分或由靶向或结合部分组成。在进一步的实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，所述第二结构域由与所述第一结构域不同的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如靶向或结合部分)组成。
根据本发明，还提供了分离和纯化的肽，其包括第一结构域或由第一结构域组成。在各种实施方案中，分离的或纯化的肽为KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF或KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA。在另外的实施方案中，分离的或纯化的肽为具有的一个或多个K残基被F或L残基中的任何一个替代，或一个或多个F残基被K、A或L残基中的任何一个替代，或一个或多个A残基被K、F或L残基中的任何一个替代的KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF或KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA。
融合构建体包括与受体、配体或抗原结合的结合部分。结合部分还包括配体、抗原或抗体。配体包括与受体结合的分子或由与受体结合的分子组成，如受体激动剂或拮抗剂。结合部分可以包括线性结构或环状结构或由线性结构或环状结构组成。
结合部分的具体非限制性实例包括一种或多种氨基酸(例如，肽、多肽、蛋白质)，核酸和碳水化合物。结合部分的具体非限制性的种类包括与受体结合的激素、激素类似物、激素和激素类似物的片段、激素和激素类似物的嵌合体或融合体、生长因子、细胞因子、抗体等。
激素的具体非限制性实例包括促卵泡激素(FSH)或其类似物、促性腺激素释放激素或其类似物、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β亚基、黑素细胞刺激素、雌二醇、二乙基己烯雌酚、乳铁蛋白、多巴胺、生长激素抑制素或其类似物、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、雄激素、黄体酮、促甲状腺激素(TSH)、胰岛素、儿茶酚胺、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧张素、抗利尿激素、降血钙素、缩胆囊素、蛙皮素、促肾上腺皮质激素释放激素、胃泌激素、胃饥饿素、胰高血糖素、生长激素释放激素及其类似物、抑制素、食欲素、KiSS肽(GPR54)、kisspeptin、催乳素、催乳素释放激素、生长激素、Her2/neu、叶酸、维生素H、铁蛋白、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、促甲状腺素释放激素、内皮素、肾素、促脂解素、褪黑激素等。生长因子的具体非限制性实例是表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1和2(IGF-1、IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α和β(TGFα、TGFβ)、血小板源生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血浆铜蓝蛋白等。细胞因子或配体的具体非限制性种类的是白介素(例如白细胞介素2、白介素17、CD154、Fas配体等)、肿瘤坏死因子(TNFs)、干扰素等。
促卵泡激素(FSH)的具体非限制性实例包括结合FSH受体的FSHβ链和FSHα链，和FSHβ链和FSHFSHα链的片段。FSH序列的非限制性具体实例，如FSHβ链或FSHα链，FSHβ链的片段和FSHFSHα链片段，是哺乳动物(例如，人)FSH序列。
因此，在具体的实施方案中，融合构建体包含结合FSH受体的促卵泡激素(FSH)或FSH片段，FSH类似物或FSH嵌合体以及裂解结构域，其中所述FSH片段或类似物或嵌合体缀合到裂解结构域。在各种实施方式中，融合构建体包括结合FSH受体和裂解结构域的FSH或FSH片段或FSH类似物，其包括肽序列或由肽序列组成，所述肽序列选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA，或所述肽序列选自具有的一个或多个K残基被F或L残基中的任何一个替代，一个或多个F残基被K、A或L残基中的任何一个替代，或一个或多个A残基被K、F或L残基中的任何一个替代的KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA。
FSH和FSH片段的非限制性的具体示例包括人FSHβ链序列的FSH序列或FSH片段，表示为：NH2-Asn-Ser-Cys-Glu-Leu-Thr-Asn-Ile-Thr-Ile-ala-Ile-Glu-Lys-Glu-Glu-Cys-Arg-Phe-Cys-Ile-Ser-Ile-Asn-Thr-Thr-Trp-Cys-ala-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe-Lys-Glu-Leu-Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Arg-Val-Pro-Gly-Cys-ala-His-His-ala-Asp-Ser-Leu-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-ala-Thr-Gln-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr-Cys-Ser-Phe-Gly-Glu-Met-Lys-Glu-OH。
FSH片段的具体非限制性的实例包括以下序列或由以下序列组成：FSHβ链氨基酸序列33-53；FSHβ链氨基酸序列81-95；FSHβ链氨基酸序列81-89；FSHβ链氨基酸序列90-95；或FSHβ链氨基酸序列33-53；FSHβ链氨基酸序列81-95；FSHβ链氨基酸序列81-89；或FSHβ链氨基酸序列90-95，其中至少一个半胱氨酸(C)被丙氨酸(A)替代。在具体的方面，FSH片段包括以下序列或由以下序列组成：CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT；QAHAGKADSDSTDAT；QCHCGKCDSDSTDCT；QAHAGKADS；QCHCGKCDS或DSTDCT，或者其中一个或多个半胱氨酸(C)残基被丙氨酸(A)残基替代的任何上述序列。
如本文所述，结合部分可以任选在细胞上表达。表达结合部分(例如，受体、配体、抗原、抗体)的细胞，或者可以根据本发明的方法被靶向的细胞包括过度增殖性细胞。表达受体、配体或抗原的细胞，或可以根据本发明的方法被靶向的细胞，还包括乳腺、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、睾丸、胰腺、皮肤、血液细胞、肾上腺、脑垂体、血管或脉管系统和子宫内膜细胞。在细胞上表达的结合部分的具体非限制性类别是激素的受体(FSH受体、LHRH受体、βCG受体等)，细胞因子，生长因子(例如EGF受体、Her2/neu、ROR1)，铁蛋白，转铁蛋白受体，细胞粘附分子等。在可用抗体或它们的片段靶向的在增殖细胞上表达的抗原的具体的非限制性实例是CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、免疫球蛋白类受体等。其它抗原包括，例如，前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌抗原125(CA-125)，以及结合于本文中公开的配体的其他受体分子。
第一和第二结构域可包括氨基酸或氨基酸序列或由氨基酸或氨基酸序列组成。在特定的方面，第一或第二结构域具有约1至10、10至20、15至20(即，15、16、17、18、19或20个氨基酸)、20至30、30至40、40至50、60至70、70至80、80至90、90至100或更多个氨基酸残基。裂解结构域通常为10至14、15至20(即，15、16、17、18、19或20个氨基酸)、10至20、20至30、30至40、或40至50，但可以任选较长(50个或更多)或较短(小于10)。
在一个具体的方面，第一结构域包括两亲性α-螺旋结构或由两亲性α-螺旋结构组成。在进一步具体的方面，第二结构域包括FSH氨基酸序列或由FSH氨基酸序列组成，FSH氨基酸序列阐述为结合FSH受体的CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT、QAHAGKADSDSTDAT、QCHCGKCDSDSTDCT、QAHAGKADS，QCHCGKCDS或DSTDCT；或CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT、QAHAGKADSDSTDAT、QCHCGKCDSDSTDCT、QAHAGKADS、QCHCGKCDS或DSTDCT中任何一个的片段；或CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT、QAHAGKADSDSTDAT、QCHCGKCDSDSTDCT、QAHAGKADS、QCHCGKCDS或DSTDCT中任何一个的片段；或CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT、QAHAGKADSDSTDAT、QCHCGKCDSDSTDCT、QAHAGKADS、QCHCGKCDS或DSTDCT中任何一个的片段。
第一和第二结构域可相对于彼此定位在NH2-末端或C-末端。因此，在一个实施方案中，第一(裂解肽)结构域相对于第二(结合部分或配体)结构域定位在NH2-末端，而在另一实施方案中，第二(结合部分或配体)结构域相对于第一(裂解肽)结构域定位在C-末端。
第一和第二结构域可包括一个或多个D-氨基酸和/或一个或多个L-氨基酸或由一个或多个D-氨基酸和/或一个或多个L-氨基酸组成。在特定的方面，例如，第一结构域在任何K、F或A残基具有D-氨基酸。
第一和第二结构域可进一步包括另外的结构域或由另外的结构域组成。因此，在各种方面，融合构建体包括第三、第四、第五、第六、第七结构域等，任何或所有这些结构域可以是相同的或彼此不同的。
第一和第二(以及任何另外的)结构域可通过共价键连接。例如，第一和第二结构域可通过肽或非肽连接子连接。在特定的方面，第一和第二结构域通过具有约1至25个氨基酸残基的肽(连接子)序列、或非肽(连接子)(诸如线性碳链)连接。在更具体的方面，第一和第二结构域通过肽(连接子)序列连接，所述肽(连接子)序列包括一个或多个A、S或G氨基酸残基或由一个或多个A、S或G氨基酸残基组成。在进一步具体的方面，第一和第二结构域通过肽(连接子)序列或非肽(连接子)线性碳链(Cn)连接，所述肽(连接子)序列包括下列序列或由下列序列组成：GSGGS、ASAAS、GS、AF、FK、VK、FFK、FA、GSGRSA、RVRRSV、SS、Cit-V(Cit＝瓜氨酸(H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H)；Val＝缬氨酸)、F-Cit(F＝苯基丙氨酸，Cit＝瓜氨酸)，所述非肽(连接子)线性碳链，Cn中，n是链中碳(C)的数量(如1-100)，所述链为诸如C、CC、CCC、CCCC、CCCCC、CCCCCC、CCCCCCC、CCCCCCCC，等等。
融合构建体包括分离的形式和纯化的形式或由分离的形式和纯化的形式组成。融合构建体还包括混合物或由混合物组成。这种制剂和混合物包括组合物，例如融合构建体和适于施用给受试者或与受试者体内接触的药学上可接受的载体或赋形剂的混合物，或融合构建体和抗细胞增殖或免疫刺激剂的混合物。
融合构建体包括单位剂量形式或由单位剂量形式组成。在一个实施方案中，融合构建体是治疗患有不希望的细胞增殖或细胞增殖紊乱的受试者的有效量的单位剂量。在另一个实施方案中，融合构建体是治疗患有瘤形成、肿瘤或癌症的受试者的有效量的单位剂量。在额外的实施方案中，融合构建体是降低受试者的生育能力的有效量的单位剂量。
融合构建体可包含在药盒中，任选地具有用于实施方法的用法说明。在一个实施方案中，药盒包括融合构建体和用法说明，用于减少或抑制细胞增殖的方法，用于减少或抑制过度增殖细胞增殖的方法，用于减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞或癌症细胞的增殖的方法，用于治疗患有过度增殖性紊乱的受试者的方法，用于治疗患有瘤形成、肿瘤或癌症的受试者的方法，或用于降低动物的生育能力的方法。
根据本发明，还提供了编码融合构建体的核酸。在一个实施方案中，核酸编码融合构建体，融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，第一结构域由12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基L-或D-氨基酸序列组成，所述L-或D-氨基酸序列包括选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列，第二结构域包括靶向或结合部分或由靶向或结合部分组成。在另一个实施方案中，核酸编码融合构建体，所述融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF，KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，第二结构域包括靶向或结合部分或由靶向或结合部分组成。在进一步的实施方案中，核酸编码融合构建体，所述融合构建体包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，所述第二结构域包括与所述第一结构域不同的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如靶向部分或结合部分)或由与所述第一结构域不同的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如靶向部分或结合部分)组成。
核酸可以包含在载体中，载体为例如当在细胞中表达时编码融合构建体的表达载体。宿主细胞可以用载体中的核酸转化，使得细胞表达由核酸编码的融合构建体。
融合构建体尤其适用于减少或抑制一种细胞的增殖(proliferationofacell)，减少或抑制细胞增殖，减少或抑制过度增殖细胞增殖，减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞的增殖和治疗不希望的或异常的细胞增殖，例如过度增殖细胞或过度增殖紊乱。过度增殖紊乱的非限制性实例包括良性增生，非转移性和转移性瘤形成、癌、肿瘤和恶性肿瘤(例如，固体或液体肿瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、癌(carcinoma)、肉瘤、黑色素瘤、神经的、网状内皮或造血系统的)。
根据本发明，进一步提供了减少或抑制一种细胞的增殖的方法；减少或抑制细胞增殖的方法；减少或抑制过度增殖细胞增殖的方法；和减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞增殖的方法。在各种实施方案中，方法包括使细胞与足够减少或抑制该细胞的增殖的量的融合构建体接触；使细胞与足够减少或抑制细胞增殖的量的融合构建体接触；使细胞与足够减少或抑制过度增殖细胞增殖的量的融合构建体接触；使细胞与足够减少或抑制赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的量的融合构建体接触。
根据本发明，还提供了选择性减少或抑制表达受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)或者抗原的细胞的增殖的方法；选择性减少或抑制表达受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)或者抗原的过度增殖细胞的增殖的方法；和选择性减少或抑制表达受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)或者抗原的赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的方法。在各种实施方案中，方法包括将细胞与足够减少或抑制细胞增殖的量的融合构建体接触，其中所述肽的结合部分与由所述细胞表达的受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)、配体或抗原结合；使细胞与足够减少或抑制过度增殖细胞的增殖的量的融合构建体接触，其中所述肽的结合部分与由过度增殖细胞表达的受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)、配体或抗原结合；以及使细胞与足够减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞的增殖的量的融合构建体接触，其中所述融合构建体的结合部分与由所述细胞表达的受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)、配体或抗原结合。
根据本发明方法的靶细胞包括表达受体(例如，比如与FSH、LHRH、βCG结合的激素受体等等)或者抗原的细胞，比如激素受体，例如性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体。根据本发明方法的靶细胞还包括表达与下述激素结合的受体的细胞：促卵泡激素(FSH)、促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、七鳃鳗(lamprey)III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β亚基、黑素细胞刺激素、雌二醇、二乙基己烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、黄体酮、雄激素、催乳激素、促乳素释放激素、抗利尿激素、血管紧张素、儿茶酚胺、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1、IGF-2)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、转铁蛋白、促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(PTH)、内皮素、蛙皮素、肾素、促脂解素、褪黑素激素、松弛素、促胰液素、生长激素、血管内皮生长因子(VEGF)、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如α5β3或α5β1整合素)、神经生长因子、转化生长因子α和β(TGF-α和β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌抗原125(CA-125)、白细胞介素17、CD154、可溶性白细胞介素-2(IL-2)受体、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-联蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨结合素、ILF3、叶酸或其衍生物、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、TNF-α、TNF-β(淋巴毒素，LT)、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、单糖、二糖、寡聚糖、唾液酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或乙酰神经氨酸。
此外，实施方法包括接触需要抑制、降低或防止细胞增殖、存活、分化、死亡或活性的受试者，例如过度增殖细胞或者不希望的增殖细胞。示例性的受试者包括患有或处于不希望的或者异常的细胞增殖风险的受试者；患有或处于良性增生或者非转移性或转移性瘤形成、癌症、恶性肿瘤风险的受试者(例如固体或液体肿瘤，骨髓瘤，淋巴瘤，白血病，癌症，肉瘤，黑色素瘤，神经、网状内皮和造血系统的瘤形成)。
根据本发明，另外提供治疗患有过度增殖紊乱的受试者的方法和治疗患有瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤(转移性、非转移性或良性)的受试者的方法。在多个实施方案中，方法包括向受试者施用足以治疗过度增殖紊乱的量的融合构建体；以及向受试者施用足以减少或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤增殖的量的融合构建体，以及向受试者施用足以降低或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的血管系统增殖的量的融合构建体。
方法包括治疗患有或处于患有转移风险的受试者。例如，向受试者内部的其它部位、局部或区域施用有效降低或抑制肿瘤、癌症或瘤形成的扩散或播散的量的融合构建体。在多个实施方案中，方法降低或抑制原发性肿瘤或癌症向一个或多个其它部位进行转移；在一个或多个其它部位、局部或区域转移的形成或建立，从而降低或抑制肿瘤或癌症的复发或者肿瘤或癌症的进展。在进一步的实施方案中，方法降低或抑制潜在地或已经发展成转移的肿瘤或癌细胞(例如播散的肿瘤细胞)的生长、增殖、移动或侵入；降低或抑制由原发性肿瘤或癌症到与原发性肿瘤或癌症所在不同的一个或多个其它部位、局部或区域引起的转移的形成或建立；在已经形成或建立转移之后，降低或抑制在与原发性肿瘤或癌症所在不同的一个或多个其它部位、局部或区域进行转移的生长或增殖；或者已经形成或建立转移之后降低或抑制其他转移的形成或建立。在又一个实施方案中，方法降低或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的复发或进展。
根据本发明，还进一步提供降低或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤向其他部位的转移，或者降低或抑制在原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤远端的其它部位形成或建立转移性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法。在多个实施方案中，方法包括向受试者施用足以减少或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤向其他部位转移，或者减少或抑制在原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤远端的其它部位形成或建立转移性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的量的融合构建体。
根据本发明的可治疗的瘤形成、肿瘤、癌症和恶性肿瘤包括实性细胞团，造血细胞或癌，肉瘤(例如淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤或纤维肉瘤)，淋巴瘤，白血病，腺瘤，腺癌，黑素瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间皮瘤，网状内皮、淋巴或造血系统瘤形成(例如骨髓瘤、淋巴瘤或白血病)、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。
根据本发明的可治疗的瘤形成、肿瘤、癌症和恶性肿瘤可存在于或影响肺(小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、甲状腺、头或颈、鼻咽、喉、鼻或窦、脑、脊柱、乳腺、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴、胃肠(口、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴、血液、肌肉、皮肤或干细胞的瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。
所述方法可以与其他治疗或疗法(例如手术切除、放射疗法、电离辐射或化学放射疗法、化学疗法、免疫疗法、局部或区域热(高热)疗法、或疫苗接种)一起实施。这些治疗或疗法可在施用融合构建体之前、基本上同时(单独或以混合物形式)或之后实施。在一个实施方案中，方法包括实施抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌或免疫增强的治疗或疗法。在进一步的实施方案中，方法包括施用烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷或核苷酸类似物、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物、博来霉素、放线菌素D、光辉霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、羟基脲、顺铂、卡铂、奥沙利铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉烷(例如紫杉醇或太平洋紫杉醇(paclitaxel))、长春碱、长春新碱、阿霉素或二溴甘露醇、拓扑异构酶抑制剂(伊立替康、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷)、吉西他滨、培美曲塞等等。细胞或免疫疗法包括淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞、NK细胞或B-细胞、抗体、细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、激素、细胞因子或趋化因子(实例是白细胞介素IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸细胞活化趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1或淋巴细胞趋化因子)。
适于与融合构建体一起施用的其它试剂为靶向药物或生物制剂，例如抗体或小分子。单克隆抗体的非限制性实例包括利妥昔单抗()、曲妥单抗()、贝伐单抗()、雷珠单抗()、西妥昔单抗()、阿仑单抗()、帕尼单抗()、帕妥珠单抗()、替伊莫单抗()、伊匹单抗()、托西莫单抗()等等，它们可与根据本发明的融合构建体一起使用。适于与融合构建体一起使用的其它靶向药物为伊马替尼()，吉非替尼()，硼替佐米(bortzomib，)，拉帕替尼()，舒尼替尼()，索拉非尼()，尼罗替尼()，扎妥木单抗，dalotuzumab，figitumumab，雷莫芦单抗，加利昔单抗，farletuzumab，ocrelizumab，奥法木单抗()，托西莫单抗，2F2(HuMax-CD20)，7D8，IgM2C6，IgG12C6，11B8，B1，2H7，LT20，1F5或AT80达利珠单抗()，抗LHRH受体抗体例如克隆A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03、GNRHR269等等。
本发明的方法包括为受试者提供益处。在具体的实施方案中，治疗方法导致赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性肿瘤细胞团块、细胞体积、大小或数量部分或完全破坏，刺激、诱导或增强赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性肿瘤细胞坏死、溶解或凋亡，减少瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的体积大小、细胞团块，抑制或预防瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积、团块、大小或细胞数量的进展或增加，或延长寿命；导致降低或减轻与瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤相关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率；导致降低或减轻疼痛、不适、恶心、虚弱或嗜睡；或者导致能量、食欲增加，改善活动或心理健康。
根据本发明，还另外提供降低动物生育能力的方法；治疗或减轻子宫内膜异位症、良性前列腺增生、子宫肌瘤或息肉的方法。在多个实施方案中，方法包括向动物(例如哺乳动物，比如人)施用足以降低生育能力的量的融合构建体；向动物(例如哺乳动物，比如人)施用足以治疗或减轻子宫内膜异位症的量的融合构建体；向动物(例如哺乳动物，比如人)施用足以治疗或减轻良性前列腺增生的量的融合构建体；以及向动物(例如哺乳动物，比如人)施用足以治疗或减轻子宫肌瘤或息肉的量的融合构建体。
根据所述方法可治疗的受试者包括哺乳动物。在具体的实施方案中，受试者是人。
附图说明
图1显示LHRH-Phor21杀死癌细胞的速度比Phor21-βCG-ala更快。人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S.luc，多个传代数)与Phor21-βCG-Ala或LHRH-Phor21一起孵育。
图2显示与Phor21-βCG-ala相比，裂解结构域中含有21(Phor21)、18(Phor18(338983)＝CLIP71)和15(Phor15)的βCG-ala融合构建体对MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性(微摩尔IC50)。
图3显示对βCG-ala和LHRH融合构建体的MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性(微摩尔IC50)。对MDA-MB-435S.luc细胞的毒性相比于Phor21-βCG-ala较大的融合构建体被列于附图的右侧。
图4显示LHRH融合构建体对MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性(微摩尔IC50)。融合构建体为323033＝Phor21-βCG-ala，337479＝LHRH-Phor21，337480＝Phor21-LHRH，338611＝D-ala-Phor21-LHRH，338612＝Phor18-ASAAS-LHRH，338613＝Phor18-LHRH，339385＝D-ala-Phor18-LHRH和339347＝Phor18-Lupron。
图5显示βCG-ala和LHRH融合构建体与Phor21-βCG-ala相比对人红血细胞的急性溶血活性(微摩尔HA50)，除了LHRH-Phor21、Phor21-LHRH和Phor18-Lupron(QHWSY(D-Leu)LRPNEt＝Lupron)之外，所有的融合构建体与Phor21-βCG-ala相比均具有显著降低的溶血活性。
图6显示细胞毒性和溶血活性的比较。箭头所示的肽与Phor21-βCG-ala相比对细胞的毒性较强。
图7是一个治疗方案的概述。
图8A-8J是治疗过程中以及研究终点3种βCG缀合物与未缀合的Phor21、未缀合的Phor18(338983)＝(CLIP71)以及(KKKFAFA)3缀合物(338984)相比较的肿瘤条件的总结。融合构建体代码，33＝Phor21β-CG-ala；76＝Phor18-βCG-ala；81＝D-ala-Phor21-βCG-ala；85＝D-ala-Phor18-LHRH；47＝Phor18-Lupron；13＝Phor18-LHRH；11＝D-ala-Phor21-LHRH；12＝Phor18-ASAAS-LHRH；71＝Phor15-βCG-ala；和74＝Phor15-C6-βCG-ala；随后是该研究中使用的构建体的量。
图9A-9H显示治疗组与盐水相比的肿瘤体积，基值A)Phor21-βCG-ala(33)；B)D-ala-Phor21-LHRH(11)；C)Phor18-Lupron(47)；D)Phor18-ASAAS-LHRH(12)；E)Phor18-LHRH(13)；F)(KKKFAFA)3-LHRH；G)D-ala-Phor18-LHRH(85)，在所指示的时间周期长达30天；以及H)，相比于基线。
图10A-10E显示在研究终点5种LHRH缀合物相比于Phor21-βCG-ala的肿瘤条件总结，A)肿瘤重量，B)肿瘤重量相比于基线的变化，C)活肿瘤细胞的总数，D)活肿瘤细胞总数相比于基线的变化，以及E)体重。338614＝(KKKFAFA)3LHRH，338612＝Phor18-ASAAS-LHRH，338613＝Phor18-LHRH和339385＝D-ala-Phor18-LHRH。
图11显示多重耐药卵巢癌细胞(OVCAR3)与浓度逐渐增加的Phor21-βCG-ala在指定量的阿霉素存在下一起孵育，通过组合，在最高阿霉素浓度下，细胞杀伤力增强200倍。
图12显示与含有LHRH、Phor21、βCG以及Phor21融合构建体的MDA-MB-435S.luc细胞相比，CHO(中国仓鼠卵巢)和TM4的细胞毒性。TM4细胞是LHRH受体阴性的，CHO细胞是CG受体阴性的，MDA-MB-435S.luc细胞同时表达LHRH和CG受体。
图13显示FSH裂解肽缀合物体内抑制人前列腺癌细胞生长。用生理盐水(载体对照)、FSH90-95(1mg/kg)、FSH90-95-Phor18(0.1mg/kg，1mg/kg)、FSH81-95(1mg/kg)、FSH81-95-Phor18(0.1mg/kg，1mg/kg)、FSH33-53(1mg/kg)、FSH33-53-Phor18(0.1mg/kg，1mg/kg)处理的经处理裸小鼠中的肿瘤体积变化。数据以肿瘤体积的平均值±S.E.表示(n＝8)。*P<0.05。
图14A-14C显示尸体解剖时的肿瘤体积。数据以平均值±S.E.表示(n＝8)。相比于载体处理组，FSH90-95-Phor18和FSH81-95Phor18以及FSH33- 53-Phor18处理的小鼠在尸体解剖时的肿瘤体积显著减少。*P<0.05。
图15A-15C显示尸体解剖时的肿瘤重量。数据以平均值±S.E.表示(n＝8)。相比于载体处理组，FSH90-95-Phor18和FSH81-95-Phor18处理的小鼠在尸体解剖时的肿瘤重量均显著减轻。*P<0.05。
图16显示体重。数据以平均值±S.E.表示(n＝8)。处理组之间在尸体解剖时的体重没有差异。
图17显示单独的1μMFSH81-89Phor18和FSH81-89aPhor18以及在FSH存在下的相对活性。FSH浓度为10μM时，活性损失是显著性的(P<0.05)。FSH81-89Phor18和FSH81-89aPhor18特异性靶向MES-SA-Dx5子宫肉瘤细胞上的FSH受体(n＝6)。
具体实施方式
本发明至少部分基于其中第一结构域裂解部分连接或融合至第二结构域结合部分上的融合构建体。在一个典型的构建中，融合构建体第一结构域包括对细胞有直接或间接毒性的裂解部分，其从而可降低细胞增殖或存活、或刺激、诱导、增加或增强细胞死亡、杀死或凋亡；并且融合构建体第二结构域包括靶向细胞的部分，该部分称为结合部分实体。
根据本发明，提供了融合构建体，其包括或由第一“裂解”结构域组成并且包括或由第二“靶向”或“结合”结构域组成。在一个实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域由12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基L-或D-氨基酸序列组成，所述残基L-或D-氨基酸序列括肽序列(选自氨基酸例如赖氨酸＝K、苯丙氨酸＝F和丙氨酸＝A)，例如KFAKFAKKFAKFAKK,KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK,KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK，所述第二结构域包括靶向部分或结合部分或由靶向部分或结合部分组成。在另一个实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，所述第二结构域包括靶向或结合部分或由靶向或结合部分组成。在进一步的实施方案中，融合构建体包括第一结构域和第二结构域或由第一结构域和第二结构域组成，所述第一结构域包括L-或D-氨基酸序列或由L-或D-氨基酸序列组成，L-或D-氨基酸序列选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK，所述第二结构域由与所述第一结构域不同的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如靶向或结合部分)组成。
如本文所使用的，术语“融合”或“嵌合”及其语法变体，在参考构建体使用时，意指该构建体包含衍生自、获得自或分离自、或基于或模仿于彼此不同并且通常不会一起存在于自然界的两种不同的分子实体的部分或区段。这就是说，例如，融合构建体的一部分包括裂解部分或由裂解部分组成并且构建体的第二部分包括靶向部分或由靶向部分例如具有结合能力的部分组成，靶向部分例如具有结合能力的部分，第一和第二结构域中每一个的结构均不同。融合构建体也可以被称为“缀合物”，其中所述缀合物包括第一结构域裂解部分和第二结构域靶向部分或结合部分或由第一结构域裂解部分和第二结构域靶向部分或结合部分组成。
融合构建体的第一结构域和或第二结构域包括以下物质或由以下物质组成，物质为：氨基酸序列(肽、多肽、蛋白质、外源凝集素)、核酸(DNA、RNA)和碳水化合物(糖类、唾液酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸等)。术语“氨基酸序列”、“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，指通过酰胺键共价连接的两个或更多个氨基酸、或“残基”或等价物。融合的氨基酸残基可以通过共价或非共价键进行连接。共价键的非限制性实例是酰胺键、非天然和非酰胺化学键，其中包括例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)。替代酰胺键的连接基团包括例如酮亚甲基(例如-C(＝O)-CH2-替代-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺、硫代酰胺或酯(参见例如Spatola(1983)，ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357,“PeptideandBackboneModifications,”MarcelDecker,NY)。
融合构建体或嵌合体的第一和第二结构域包括L-氨基酸序列、D-氨基酸序列以及L-氨基酸和D-氨基酸的混合物的氨基酸序列。第一和第二结构域的氨基酸序列可以是线性或环状结构，缀合至不同的部分(例如第三、第四、第五、第六、第七结构域等等)，形成分子内或分子间二硫键，并且还形成更高阶的具有相同或不同氨基酸序列的多聚体或寡聚体，或其它分子。
融合构建体的示例性长度为约5至15、20至25、25至50、50至100、100至150、150至200、或200至300或更多个氨基酸残基的长度。在具体的实施方案中，第一或第二结构域包括或由约1至10、10至20、15至20、20至30、30至40、40至50、60至70、70至80、80至90、90至100或更多个残基的氨基酸序列组成。在更具体的实施方案中，第一结构域由15、16、17、18、19、20、28或更多个残基的氨基酸序列组成。
融合构建体第一结构域单独或与第二结构域相组合，任选形成两亲性α-螺旋。两亲性α-螺旋在α-螺旋的一侧主要包含亲水性氨基酸，另一侧主要包含疏水性氨基酸。由于α螺旋中每3.6个残基正好转一圈，两亲性α-螺旋的氨基酸序列中的亲水性和疏水性残基每3至4个残基交替。预测PNNPNNP重复模式或基序以形成两亲性α-螺旋，其中P代表带正电的氨基酸残基而N代表中性氨基酸残基。PNNPNNP重复模式为裂解肽提供了对带负电荷的细胞膜的阳离子结合位点并且为膜相互作用/渗透提供疏水位点。因此，融合构建体包括第一结构域，其具有可形成两亲性α-螺旋的一个或更多个不间断的PNNPNNP重复模式或基序，或一个或更多个间断的PNNPNNP重复模式或基序。例如，15或18个残基的氨基酸序列例如KFAKFAKKFAKFAKK和KFAKFAKKFAKFAKKFAK包含不间断和间断的PNNPNNP重复基序。
融合构建体第二结构域，例如靶向或结合部分，包括或由以下物质组成：配体、抗体(或其抗原结合片段)、抗原、整合素、整合素受体(例如含“RGD”序列基序的蛋白质或肽，以及可存在于细胞外基质(ECM)中的成分，例如单糖、二糖或寡糖、唾液酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸)、生长因子、细胞因子、趋化因子，以及结合于受体、抗体、抗原、整合素、整合素受体(例如含“RGD”序列基序的蛋白质或肽，以及可存在于细胞外基质(ECM)中的成分，例如单糖、二糖或寡糖、唾液酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸)、生长因子受体、细胞因子受体和趋化因子受体上的靶向和结合部分。
“受体”通常存在于细胞上(例如膜受体)或细胞内。受体可与细胞膜表面相关或跨越细胞膜。例如，受体蛋白可具有跨越细胞膜的跨膜结构域，任选地具有细胞质或细胞外的部分，或具有细胞质和细胞外两部分。因此，受体包括含有细胞外、跨膜或细胞质部分的全长、完整的天然受体及其截短形式或片段(例如单独的或组合的受体的细胞外、跨膜或细胞质部分或子序列)。例如，可溶性受体通常缺少跨膜并且还可任选地缺少天然的细胞外或细胞质区域的所有区域或一部分(如果存在于天然受体上的话)。这种截短的受体形式和片段可保留至少部分与配体结合。
融合构建体的靶向和结合部分结构域包括结合于受体的任何实体或由结合于受体的任何实体组成，该实体称为受体配体，特异性的或者非特异性的。因此，靶向部分和结合部分的非限制性实例包括激素，激素类似物，与激素受体结合的激素或激素类似物的片段，生长因子，生长因子类似物，与受体结合的生长因子或生长因子类似物的片段，与激素或激素受体结合的激素受体或配体，以及与激素、激素类似物结合的靶向部分和结合部分，与激素结合的激素或激素类似物片段，与激素或激素受体、生长因子、生长因子类似物结合的激素受体或配体，与受体结合的生长因子或生长因子类似物的片段，与生长因子或生长因子受体结合的生长因子受体或配体等等。
可用作结合部分的示例性的激素包括促卵泡激素(FSH)、促性腺素释放激素I、促性腺激素释放激素II、七鳃鳗促黄体激素释放激素III、促黄体激素β链、促黄体激素(LH)、绒毛膜促性腺激素(CG)、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-或β-CG)、黑素细胞刺激素、雌二醇、二乙基己烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、黄体酮、雄激素及其衍生物。可用作结合部分的示例性的激素受体包括促性腺激素释放激素I受体、促性腺激素释放激素II受体、七鳃鳗III促黄体激素释放激素受体、促黄体激素受体、绒毛膜促性腺激素受体、黑素细胞刺激素受体、雌二醇受体、多巴胺受体、促生长素抑制素受体、促卵泡激素(FSH)受体、表皮生长因子(EGF)受体、生长激素(GH)受体、Her2-neu受体、糖皮质激素受体、雌激素受体、睾丸素受体、孕激素受体和雄激素受体。
示例性的生长因子包括表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)和Her2-neu。示例性的生长因子受体包括表皮生长因子(EGF)受体、生长激素(GH)受体和Her2-neu受体、IGF-1。
靶向部分或结合部分的具体非限制性实例包括FSH、LHRH和βCG；其FSH、LHRH和βCG功能(结合)片段；FSH、LHRH和βCG类似物；以及FSH、LHRH和βCG嵌合体。LHRH是完全的功能配体并且能够通过配体受体相互作用例如信号转导途径的活化引起药理作用。βCG-ala是可以与细胞膜结合而不会引起任何药理作用的hCG的片段。FSH受体靶向或结合部分的具体非限制性实例包括：Asn-Ser-Cys-Glu-Leu-Thr-Asn-Ile-Thr-Ile-Ala-Ile-Glu-Lys-Glu-Glu-Cys-Arg-Phe-Cys-Ile-Ser-Ile-Asn-Thr-Thr-Trp-Cys-Ala-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe-Lys-Glu-Leu-Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Arg-Val-Pro-Gly-Cys-Ala-His-His-Ala-Asp-Ser-Leu-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-Ala-Thr-Gln-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr-Cys-Ser-Phe-Gly-Glu-Met-Lys-Glu及其片段，例如FSHβ链氨基酸残基33-53；FSHβ链氨基酸残基81-95；FSHβ链氨基酸残基81-89；FSHβ链氨基酸残基90-95；或FSHβ链氨基酸残基33-53；FSHβ链氨基酸残基81-95；FSHβ链氨基酸残基81-89；或FSHβ链氨基酸残基90-95，其中至少一个半胱氨酸(C)残基被丙氨酸(A)残基替代。在更具体的实例中，FSH片段包括或由CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT；QAHAGKADSDSTDAT；QCHCGKCDSDSTDCT；QAHAGKADS；QCHCGKCDS或DSTDCT组成，或前述任意序列，其中一个或更多个半胱氨酸(C)残基被丙氨酸(A)残基，或者CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT；QAHAGKADSDSTDAT；QCHCGKCDSDSTDCT；QAHAGKADS；QCHCGKCDS或DSTDCT片段取代。与FSH受体结合的FSH片段及类似物的具体非限制性实例还包括：ser-gly-ser-asn-ala-thr-gly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-ser-gly-ser；andgly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-gly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-ser-gly-ser。与FSH受体结合的FSH嵌合体的具体实例在美国专利No.7,202,215；US2008/0234186；Weenen等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5204(1989)；Klein等人，Fertil.Steril.77:1248(2002)以及Pearl等人，Endocrinology151:388(2010)中进行了描述。
靶向和结合部分还包括在赘生性细胞、肿瘤细胞或癌症细胞中，以及与赘生性细胞、肿瘤细胞或癌症细胞相关的淋巴或血管中专属或优先表达的配体的抗原。这样的抗原可方便地称为“肿瘤相关抗原”或“TAA”，并且包括癌胚抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA-125(残余上皮性卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-链蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨结合素以及ILF3、IGF-1，仅举几例。可靶向的其它抗原是CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、免疫球蛋白样受体等等)。
靶向和结合部分另外包括转铁蛋白、叶酸及其衍生物(例如叶酸盐)以及肿瘤坏死因子(TNF)家族成员和TNF受体，例如TNF-α、TNF-β(淋巴毒素，LT)、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB。
其中第二结构域包括靶向或结合结构域或由靶向或结合结构域组成的融合构建体可与产生或表达第二结构域所结合的抗原、受体或配体、整合素、抗体或抗原或TAA的细胞相结合。细胞的非限制性实例包括过度增殖细胞和表现出异常的或不希望的过度增殖细胞。在具体的非限制性实例中，这样的细胞包括非转移性和转移性赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞以及播散的赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞以及休眠的赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞。其它非限制性实例包括血管细胞，例如作为瘤形成、癌症或肿瘤的血管的衬里的内皮细胞。相对于非靶向(例如正常)或非过度增殖细胞而言，以高水平表达抗原、受体、配体、整合素、TAA等等的细胞，对这样的细胞具有选择性。因此，靶向或结合部分可结合由靶细胞表达或产生的，但表达检测不到，或由正常或非过度增殖细胞以相对较低的水平产生或表达的抗原、受体、配体、整合素、TAA，所述靶细胞例如为过度增殖细胞(例如非转移性和转移性瘤形成、癌症、肿瘤和恶性肿瘤，以及播散的和休眠的赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞)，从而对细胞提供优选的靶向性。示例性非限制性的表达抗原、受体、配体、整合素或TAA的细胞和组织类型包括乳腺、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、睾丸、肾上腺、脑垂体、胰、肝、胃肠、皮肤、肌肉、子宫内膜和血管。
结合部分的其它实例包括抗体和抗体片段。“抗体”指任何单克隆或多克隆免疫球蛋白分子，例如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及其任何亚类。示例性的IgG亚类为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体包括通过细胞产生或在细胞上表达的那些抗体，细胞诸如B细胞。抗体片段或子序列指保留了对比全长抗体的至少部分抗原结合能力的全长抗体的一部分。示例性的抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL、VH、三特异性(Fab3)、双特异性(Fab2)、双抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三链抗体(三价)、四抗体(四价)、微抗体((scFv-CH3)2)、双特异性单链Fv(Bis-scFv)、IgGδCH2、scFv-Fc、(scFv)2-Fc或其它完整的免疫球蛋白的抗原结合片段。
融合构建体包括具有在氨基末端的第一结构域和在羧基末端的第二结构域的那些融合构建体。融合构建体还包括具有在羧基末端的第一结构域和在氨基末端的第二结构域的那些融合构建体。当存在另外的结构域(例如第三、第四、第五、第六、第七结构域等等)时，第一结构域相对于第二结构域而言位于NH2-末端，或者第二结构域相对于第一结构域而言位于NH2-末端。
本文所述的各种序列的子序列和氨基酸替代，例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA,KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK或结合部分也包括在内。在具体的实施方案中，第一或第二结构域的子序列具有至少5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35或更多个氨基酸残基。
因此，本发明包括修饰或改变，例如第一或第二结构域的替代、添加或缺失，或者第一和第二结构域两者均替代、添加或缺失。因此，包括肽序列的融合构建体，第一或第二结构域可引入任意数目的保守或非保守氨基酸替代，只要这样的替代不会破坏第一或第二结构域的活性(裂解或结合)即可。因此，例如，修饰的裂解部分(第一结构域)可保留未修饰的第一结构域的至少部分裂解活性，例如细胞杀死或凋亡，并且经修饰的结合部分或其模拟物可保留未修饰的结合部分的至少部分结合活性。
“保守替代”指一个氨基酸被生物、化学或结构相似的残基替代。生物相似意指替代是与生物活性相兼容，生物活性例如裂解活性。结构相似意指氨基酸包含长度相似的侧链，例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或者具有相似的大小，或者第一、第二或另外的结构域的结构被保留，如两亲性α螺旋。化学相似意指残基具有相同的电荷或两者都为亲水性的或疏水性的。具体的实例包括一个疏水性残基替代，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替代另一个，或者一个极性残基替代另一个，例如精氨酸替代赖氨酸、谷氨酸替代天冬氨酸、或谷氨酰胺替代天冬酰胺、丝氨酸替代苏氨酸等等。常规测定法可用于检测融合构建体变体是否具有活性，例如裂解活性或结合活性。
具体的实例包括肽第一或第二结构域的一个或更多个氨基酸(例如1-3、3-5、5-10、10-20或更多个)残基的替代或缺失。经修饰的融合构建体相比于参比序列可具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或更高的同一性(例如，第一结构域，比如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA或KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK，或者第二结构域，比如结合部分)。
在一个具体实施方案中，融合构建体包括肽第一结构域，所述肽第一结构域包括或由12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基L-或D-氨基酸序列组成，包括选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽，具有一个或更多个被F或L残基替代的K残基，一个或更多个被K、A或L残基替代的F残基，或者一个或更多个被K、F或L残基替代的A残基。在另一个具体实施方案中，融合构建体包括肽第一结构域，肽第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，具有一个或更多个被F或L残基替代的K残基，一个或更多个被K、A或L残基替代的F残基，或者一个或更多个被K、F或L残基替代的A残基。在进一步的具体实施方案中，融合构建体包含或由肽第一结构域以及由不同于第一结构域的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如结合部分)组成的肽第二结构域组成，所述肽第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，具有一个或更多个被F或L残基替代的K残基，一个或更多个被K、A或L残基替代的F残基，或者一个或更多个被K、F或L残基替代的A残基。
术语“同一性”和“同源性”及其语法变体意指两个或更多个参照实体是相同的。因此，当两个氨基酸序列相同时，它们具有相同的氨基酸序列。“同一性的面积、区域或结构域”意指两个或更多个参照实体的一部分是相同的。因此，当两个氨基酸序列在一个或更多个序列区域相同或同源时，它们在这些区域共享同一性。当用于指核酸序列时，术语“互补的”意指所参照区域是100％互补的，即表现出100％的无错配碱基配对。
由于结构和功能上相关的蛋白质之间序列保守的量的差异，保留功能或活性(例如裂解或结合)所需的序列同一性的量取决于蛋白质、该区域和该区域的功能或活性。例如，对于裂解的肽序列，可能存在多个PNNPNNP序列重复形式或基序，但不需存在一个或更多个间断或不间断的PNNPNNP序列重复模式或基序。
两个序列之间的同一性的程度可以利用本领域中已知的计算机程序和数学算法来确定。计算百分比序列同一性(同源性)的这些算法通常导致对比区域上序列缺口和错配。例如，BLAST(例如BLAST2.0)搜索算法(参见例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)，公众可通过NCBI获得)具有示例性的搜索参数，如下：错配-2；缺口开口5；缺口延伸2。对于多肽序列比对而言，BLASTP算法通常与计分矩阵组合使用，例如PAM100、PAM250、BLOSUM62或BLOSUM50。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比对程序也用于同一性程度的定量(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)；Pearson,MethodsMolBiol.132:185(2000)；以及Smith等人，J.Mol.Biol.147:195(1981))。还已开发出利用基于Delaunay的拓扑映射对蛋白质的结构相似性进行定量的程序(Bostick等人，BiochemBiophysResCommun.304:320(2003))。
个别残基和第一、第二以及另外的结构域可通过共价或非共价键进行连接。共价键的非限制性实例是酰胺键、非天然和非酰胺化学键，其包括例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺，N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。替代酰胺键的连接基团包括例如酮亚甲基(例如-C(＝O)-CH2-替代-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺、硫代酰胺或酯(参见例如Spatola(1983)ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357,“PeptideandBackboneModifications,”MarcelDecker,NY)。
第一和第二结构域可通过共价或非共价键彼此紧邻融合或连接。第一和第二结构域可通过干预区而被分离，例如位于第一和第二结构域之间的铰链、间隔子或连接子。连接子或间隔子的实例包括非肽连接子或间隔子，例如连续的碳原子(C)的链(例如CCCCC)。多碳链包括羧酸(例如二羧酸)，例如戊二酸、琥珀酸和己二酸。一个具体的非限制性实例是6-碳连接子，例如α-氨基己酸。
在另一个实施方案中，第一和第二结构域通过位于第一和第二结构域之间的氨基酸、或肽铰链、间隔子或连接子相连。肽铰链、间隔子或连接子序列可以是任意长度的，但范围通常为约1-10、10-20、20-30、30-40或40-50个氨基酸残基。在具体的实施方案中，位于第一和第二结构域之间的肽铰链、间隔子或连接子为1至25个L-或D-氨基酸残基，或1至6个L-或D-氨基酸残基。包括在位于第一和第二结构域之间的序列中的具体氨基酸残基包括一个或更多个A、S或G氨基酸残基。位于第一和第二结构域之间的肽的具体的非限制性实例包括序列，所述序列位于下列项内或阐述为：GSGGS、ASAAS，或者具体的连接序列的倍数(GSGGS)n或(ASAAS)n，其中n＝1-5、5-10、10-20等等。氨基酸和肽的衍生物可位于两个(或更多个)结构域之间。氨基酸衍生物的具体非限制性实例是赖氨酸衍生物。
含有或不含铰链、间隔子或连接子或第三、第四、第五、第六、第七结构域等的融合构建体可以完全由天然氨基酸或合成的、非天然的氨基酸或氨基酸类似物组成，或可包括衍生形式。在多个实施方案中，融合构建体中第一或第二结构域包括一个或更多个替代L-氨基酸的D-氨基酸，D-氨基酸和L-氨基酸的混合物，或者完全由D-氨基酸残基组成的序列。
融合构建体可包括非天然结构成分的任意组合，其通常来自三种结构基团：a)除天然酰胺键(“肽键”)连接之外的其它残基连接基团；b)替代天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或者c)诱导二级结构拟态的残基，即诱导或者稳定二级结构，例如，α螺旋构象。融合构建体包括环状结构，例如分子的氨基和羧基末端之间的端至端的酰胺键，或分子内或分子间二硫键。融合构建体可在体外或体内修饰，例如翻译后修饰，以包括例如糖或碳水化合物残基、磷酸基团、脂肪酸、脂质等等。
添加物的具体实例包括第三、第四、第五、第六或第七结构域。因此，具有第一和第二结构域的融合构建体包括一个或更多个共价连接到其上的其它结构域(第三、第四、第五、第六、第七结构域等等)，以赋予不同的或互补的功能或活动。示例性的其它结构域包括促进分离的结构域，其包括例如金属螯合肽，比如允许在固定金属上进行纯化的聚组氨酸束和组氨酸色氨酸模块、允许在固定免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域、以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp,SeattleWA)的结构域。任选包含的可切割序列，例如纯化结构域和融合构建体之间的Xa因子或肠激酶可用于促进纯化。例如，表达载体可包括融合构建体-编码与六个组氨酸残基相连的核酸序列，其后是硫氧还蛋白和肠激酶切割位点。该组氨酸残基有利于融合构建体的检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了由蛋白质的剩余部分纯化构建体的方法(参见例如Kroll,DNACell.Biol.12:441(1993))。
融合构建体的活性可受到多种因素的影响，因此，可通过考虑一个或更多个这些因素来设计或优化融合构建体。这些因素包括例如融合构建体的长度，其可影响对细胞的毒性。形成裂解肽结构域的α螺旋的细胞杀伤活性也可取决于螺旋的稳定性。铰链和间隔子可影响第一结构域和肽裂解结构域的螺旋结构的膜相互作用。例如，更短的融合构建体，例如任选包括间隔子或铰链的少于21个氨基酸的构建体，可表现出由于螺旋稳定性提高而增加的细胞毒性。具体而言，间隔子例如ASAAS和6氨基己酸倾向于增加更短的融合构建体的细胞毒性。裂解肽结构域的电荷，部分地由结构域中存在的特定的氨基酸残基来确定，也影响细胞杀伤效力。
相对裂解结构域(N-或C-末端)而言，结合部分的毒性也可影响融合构建体的细胞杀伤活性。例如，相比于该裂解结构域而言位于C-末端的结合部分的细胞杀伤活性比位于N-末端裂解结构域的细胞杀伤活性强。
融合构建体的体内半衰期可以通过构建具有一个或更多个非天然存在的氨基酸或其衍生物的融合构建肽结构域而延长。例如，具有D-氨基酸的融合构建体(例如所有残基中高达30％或以上是D-对映体)能抵抗血清蛋白水解，因此可在更长的时间内具有活性，从而增强体内效力。此外，构建具有一个或更多个非天然存在的氨基酸或其衍生物的融合构建肽结构域可降低溶血活性。含有D-对映体的这些融合构建体还能在溶液中更倾向于以单体形式存在-它们不会明显聚集。
根据本发明，提供相比于一个或多个Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala而言抗细胞增殖活性更强的融合构建体，已通过更低的IC50值确定，IC50值代表融合构建体实现细胞的细胞毒性所需要的量。根据本发明，还提供了相比于一个或多个Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala而言溶血活性更小的融合构建体，以IC50/HA50(溶血活性)比值表示。根据本发明，进一步提供以IC50/HA50(溶血活性)比值表示的溶血活性小于约0.02、0.01或0.005的融合构建体。用于检测细胞的细胞毒性和溶血活性的代表性试验条件在实施例1中进行阐述。
可利用本领域中已知的方法来制备和分离肽和模拟肽。可利用本领域已知的化学方法来全部或部分地合成肽(参见例如Caruthers(1980).NucleicAcidsRes.Symp.Ser.215；Horn(1980)；以及Banga,A.K.,Therapeutic PeptidesandProteins,Formulation,ProcessingandDeliverySystems(1995)TechnomicPublishingCo.,Lancaster,PA)。可利用各种固相技术进行肽合成(参见例如RobergeScience269:202(1995)；Merrifield,MethodsEnzymol.289:3(1997))，并且例如可利用ABI431A肽合成仪(PerkinElmer)按照制造商的说明实现自动合成。肽和模拟肽也可利用组合的方法来合成。可利用本领域中已知的多种程序和方法来合成引入模拟物的合成残基和多肽(参见例如OrganicSynthesesCollectiveVolumes,Gilman,etal.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NY)。修饰肽可通过化学修饰方法制得(参见例如Belousov,NucleicAcidsRes.25:3440(1997)；Frenkel,FreeRadic.Biol.Med.19:373(1995)以及Blommers,Biochemistry33:7886(1994))。
本发明进一步提供编码本发明的融合构建体的核酸和包含编码融合构建体的核酸的载体。在一个具体的实施方案中，核酸编码包括第一结构域和第二结构域的融合构建体，所述第一结构域由12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基氨基酸序列组成，残基氨基酸序列包括选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列，所述第二结构域包括靶向部分或结合部分或由靶向部分或结合部分组成。在另一个实施方案中，核酸编码包括第一结构域和第二结构域的融合构建体，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的氨基酸序列组成，所述第二结构域包括靶向部分或结合部分或由靶向部分或结合部分组成。在进一步的实施方案中，核酸编码包括第一结构域和第二结构域的融合构建体，所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的氨基酸序列组成，所述第二结构域由不同于所述第一结构域的1-25个氨基酸序列(例如靶向部分或结合部分)组成。
核酸，本文中也可以称为基因、多核苷酸、核苷酸序列、引物、寡核苷酸或探针，是指天然的或修饰的任何长度的含嘌呤和含嘧啶的聚合物、多聚核糖核苷酸或者多聚脱氧核糖核苷酸或者多聚核糖核苷酸-多聚脱氧核糖核苷酸混合物及其α-异头形式。所述两个或更多个含嘌呤和含嘧啶的聚合物通常通过磷酸酯键或其类似物相连。术语可以互换使用，以指所有形式的核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链、双链或三链的、线性或环状的。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义的。RNA核酸可以是剪接的或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反义的。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸类似物和衍生物。
由于遗传密码的简并性，核酸包括简并关于编码本发明融合构建体的序列的序列。因此，提供了编码融合构建体的简并核酸序列。
可利用任意各种已知的标准克隆和化学合成方法制备核酸，并且可通过位点定向诱变或本领域技术人员已知的其它重组技术有意改变核酸。多核苷酸的纯度可通过测序、凝胶电泳、UV光谱检测。
核酸可被插入到核酸构建体中，其中核酸的表达受到在本文中称为“表达盒”的“表达控制元件”的影响或通过其调节。术语“表达控制元件”是指调节或影响其所可操作连接的核酸序列的一个或更多个核酸序列元件。在适当的情况下，表达控制元件可在蛋白质编码基因的前面包括启动子、增强子、转录终止子、基因沉默子、起始密码子(例如ATG)等等。
可操作地连接至核酸序列上的表达控制元件控制核酸序列的转录，并且在适当的情况下控制翻译。术语“可操作地连接”是指毗邻，其中所参考的组件是允许它们以其预期方式发挥功能的关系。通常，表达控制元件与基因的5’或3’末端毗邻，但也可以是内含子。
表达控制元件包括组成型激活转录的元件，其是诱导型的(即需要外部信号激活)或是去阻遏型的(即需要信号关闭转录；当信号不再存在时，转录被激活或“去阻遏”)。本发明的表达盒还包括足以针对特定细胞类型或组织使基因表达可控制的控制元件(即组织特异性控制元件)。通常，这种元件位于编码序列的上游或下游(即5’和3’)。启动子通常位于编码序列的5’。通过重组DNA或合成技术制备的启动子可用于提供本发明的多核苷酸转录。“启动子”是指足以指导转录的最小序列元件。
必要时，核酸可被插入到质粒中，用于传代到宿主细胞中以及用于后续的遗传操作。质粒是可在宿主细胞中稳定地传代的核酸；质粒可任选地包含表达控制元件以驱动所述核酸的表达。载体在本文中使用时与质粒的意义相同并且也可包含用于在宿主细胞中表达的表达控制元件。质粒和载体通常至少包含用于细胞传代的复制起点和启动子。因此，例如，质粒和载体用于编码融合构建体的核酸的遗传操作、融合构建体或反义核酸的制备以及融合构建体在宿主细胞和生物体中的表达。
细菌体系启动子包括T7和诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)和四环素响应启动子。昆虫细胞体系启动子包括组成型启动子或诱导型启动子(例如蜕皮激素)。哺乳动物细胞组成型启动子包括SV40、RSV、牛乳头状瘤病毒(BPV)以及其它病毒启动子或者衍生自哺乳动物细胞基因组的诱导型启动子(例如金属硫蛋白IIA启动子、热休克启动子)或者来自哺乳动物病毒的诱导型启动子(例如腺病毒晚期启动子、诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复)。可替代地，逆转录病毒基因组可被遗传修饰而引入并指导融合构建体在适当的宿主细胞中的表达。
表达体系进一步包括被设计为体内使用的载体。具体的非限制性实例包括腺病毒载体(美国专利No.5,700,470和No.5,731,172)、腺相关载体(美国专利No.5,604,090)、单纯疱疹病毒载体(美国专利No.5,501,979)、逆转录病毒载体(美国专利No.5,624,820、5,693,508和5,674,703)、BPV载体(美国专利No.5,719,054)和CMV载体(美国专利No.5,561,063)。
酵母载体包括组成型启动子和诱导型启动子(参见例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,Ch.13，ed.GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,1988；Grant等人，Methodsin Enzymology,153:516(1987)版，Wu&Grossman；BitterMethodsin Enzymology,152:673(1987)版，Berger&Kimmel,Acad.Press,N.Y以及Strathern等人，TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces(1982)版，ColdSpringHarborPress,Vols.IandII)。组成型酵母启动子例如ADH或LEU2或者诱导型启动子例如GAL均可被使用(R.Rothstein，DNACloning, APracticalApproach,Vol.11,Ch.3,ed.D.M.Glover,IRLPress,Wash.,D.C.,1986)。促进外源性核酸序列整合到酵母染色体(例如通过同源重组)中的载体是本领域已知的。当所插入的多核苷酸对于大多数常用载体而言太大(例如大于约12Kb)时通常使用酵母人工染色体(YAC)。
表达载体还可包含对选择性压力赋予抗性的选择性标记或者可识别标记(例如β-半乳糖苷酶)，从而允许细胞含有待选择用于生长和扩增的载体。可替代地，选择性标记可位于第二载体上，第二载体与包含编码融合构建体的核酸的第一载体一起共转染到宿主细胞中。
选择体系包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等人，cell11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Szybalska等人，Natl.Acad.Sci.USA48:2026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Lowy等人，Cell22:817(1980))，可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择下述基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981))；gpt基因，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981))；新霉素基因，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1(1981))；嘌呤霉素和潮霉素基因，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30:147(1984))。其它选择性基因包括trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8047(1988))；以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO的抗性(McConlogue(1987),CurrentCommunicationsinMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratory)。
还提供了表达融合构建体的宿主细胞、用编码融合构建体的核酸转染的宿主细胞以及包含编码融合构建体的核酸的载体。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在多个方面中，所述真核细胞是酵母或哺乳动物(例如人、灵长类等等)细胞。
本文所用的“宿主细胞”是其中被导入核酸的细胞，该核酸可以传代、转录或编码所表达的融合构建体。该术语还包括宿主细胞的任意后代或亚克隆。宿主细胞包括表达融合构建体的细胞和不表达融合构建体的细胞。不表达融合构建体的宿主细胞被用于传代核酸或包含编码融合构建体的核酸的载体或反义核酸。
宿主细胞包括但不限于例如细菌和酵母之类微生物；以及植物、昆虫和哺乳动物的细胞。例如重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸的表达载体转染的细菌；重组酵母表达载体转染的酵母；重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染的植物细胞体系或者重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转染的植物细胞体系；重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞体系；以及重组病毒表达载体(例如逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒)感染的动物细胞体系，或者通过基因工程设计为瞬时或稳定传代或表达的转染的动物细胞体系。
融合构建体、编码融合构建体的核酸、载体、和表达融合构建体的宿主细胞或经编码融合构建体的核酸和反义核酸转染的宿主细胞包括分离的形式和纯化的形式。当用作本发明组合物的修饰剂时，术语“分离的”意指组合物是通过手工制得的或者基本上完全或至少部分地从天然存在的体内环境分离出的。通常，分离的组合物基本上不含一种或更多种实际上通常与例如一种或更多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜相关的材料。术语“分离的”并不排除组合物的可替代的物理形式，例如多聚体/低聚体、变体、修饰或衍生的形式、或者由手工制得的宿主细胞中表达的形式。术语“分离的”也不排除其中在其中存在组合且组合中任意一种均是手工制得的形式(例如药物制剂和组合组合物)。
当不含一些、相当数量、大多数或所有的通常实质上相关的材料时，“分离的”组合物也可以是“纯化的”。因此，分离的融合构建体也基本上是纯的，不包含存在于成千上万的其它序列之中的多肽或多核苷酸，例如比如蛋白质文库的蛋白质或者基因组或cDNA文库中的核酸。“纯化的”组合物可以与一种或更多种其它分子相组合。
根据本发明，提供了融合构建体和组合组成物的混合物。在一个实施方案中，混合物包含一种或更多种融合构建体和药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，混合物包含一种或更多种融合构建体和抗细胞增殖、抗肿瘤、抗癌或抗肿瘤形成的治疗或药剂。在进一步的实施方案中，混合物包含一种或更多种融合构建体和一种免疫增强剂。还提供了组合物，例如在药学上可接受的载体或赋形剂中的一种或更多种融合构建体与一种或更多种抗细胞增殖、抗肿瘤、抗癌或抗肿瘤形成的治疗或药剂以及一种免疫增强的治疗或药剂。
本发明的融合构建体(例如包含含有第一裂解结构域和第二结合部分结构域的氨基酸序列的多肽)可用于靶向细胞使其裂解、细胞死亡或凋亡。能选择性地靶向这样的细胞。例如，可利用融合构建体靶向表达受体、配体、抗原或抗体的细胞，因此所述细胞与表达较少的受体、配体、抗原或抗体的细胞相比较而言优先被杀死。
根据本发明，提供了降低或抑制一种细胞增殖的方法以及降低或抑制细胞增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使细胞与足以降低或抑制该细胞的增殖的量的融合构建体接触。在另一个实施方案中，方法包括使细胞与足以降低或抑制细胞增殖的量的融合构建体接触。
还提供了降低或抑制过度增殖细胞的增殖的方法，以及降低或抑制正过度增殖细胞的增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使过度增殖细胞或正过度增殖细胞与足以降低或抑制增殖的量的融合构建体接触。
进一步提供了降低或抑制非转移性或转移性赘生性细胞、癌、肿瘤和恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使赘生性细胞、癌症、肿瘤或恶性细胞与足以降低或抑制该细胞增殖的量的融合构建体接触。
更进一步提供了降低或抑制静止的或未分化的非转移性或转移性赘生性细胞、癌症、肿瘤和恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使静止的或未分化的赘生性细胞、癌症、肿瘤或恶性细胞与足以降低或抑制静止的或未分化的细胞的增殖的量的融合构建体接触。
另外提供了选择性降低或抑制表达受体、配体、抗体或抗原的细胞(例如过度增殖细胞)的增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使细胞足以降低或抑制该细胞(例如过度增殖细胞)的增殖的量的融合构建体接触，其中所述肽的结合部分与由细胞表达的受体、配体、抗体或抗原相结合。
另外，还提供了选择性降低或抑制表达受体，配体，抗体或抗原的赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方案中，方法包括使细胞与足以降低或抑制所述赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的量的融合构建体接触，其中所述融合构建体的结合部分与由细胞表达的受体、配体、抗体或抗原相结合。
术语“接触”意指两个或更多个实体(例如融合构建体和细胞)之间直接或间接结合或相互作用。本文所用的接触包括在溶液中、在固相、在体外、离体、在细胞内和在体内。在体内接触可指动词施用或名词施用。
非选择性或选择性降低或抑制增殖的靶细胞包括表达融合构建体的结合部分与之相结合的任意分子的细胞。示例性的细胞包括表达下述物质的细胞：受体(例如激素受体、生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体)，配体(例如激素、生长因子、细胞因子、趋化因子)，或抗体或抗原，或整合素或整合素受体(含“RGD”序列基序的肽)，或存在于细胞外基质(ECM)中的成分，例如单糖、二糖或寡糖、唾液酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸、含“RGD”序列基序的肽等等。
靶细胞包括表达性激素或性腺类固醇激素或者性激素受体或性腺类固醇激素受体的细胞。靶细胞还包括表达与下述激素结合的受体的细胞：促卵泡激素(FSH)、促性腺素释放激素I、促性腺激素释放激素II、七鳃鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、黑素细胞刺激素、雌二醇、二乙基己烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、黄体酮、雄激素、表皮生长因子(EGF)、Her2/neu、维生素H、叶酸或其衍生物(例如叶酸盐)、转铁蛋白、促甲状腺激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如α5β3或α5β1整合素)、神经生长因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、免疫球蛋白样受体、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素、血浆铜蓝蛋白或HIV-tat。
靶细胞还包括表达与性激素或性腺类固醇激素或者性激素受体或性腺类固醇激素受体结合的受体的细胞。此外，靶细胞包括表达与下述激素结合的受体的细胞：促卵泡激素(FSH)、促性腺素释放激素I、促性腺激素释放激素II、七鳃鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β亚基、黑素细胞刺激素、雌二醇、二乙基己烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、糖皮质激素、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、黄体酮、雄激素、表皮生长因子(EGF)、Her2/neu、维生素H、叶酸或其衍生物(例如叶酸盐)、转铁蛋白、促甲状腺激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如α5β3或α5β1整合素)、神经生长因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、免疫球蛋白样受体、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白或HIV-tat或其类似物(例如米非司酮、flutaminde、醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、组氨瑞林、曲普瑞林(synateltriptorelin)、布舍瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、安替肽、替维瑞克或地加瑞克(Fe200486))。
非选择性或选择性降低或抑制增殖的靶细胞还包括表达“肿瘤相关抗原”的细胞，例如癌胚抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA125(残余上皮性卵巢癌)、可溶性白细胞介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-链蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨结合素和ILF3。此外，非选择性或选择性降低或抑制增殖的靶细胞还包括表达转铁蛋白、叶酸及其衍生物(例如叶酸盐)以及肿瘤坏死因子(TNF)家族成员或者例如TNF-α、TNF-β(淋巴毒素，LT)、TRAIL、Fas、LIGHT以及41BB及其受体的细胞。
本发明的融合构建体和方法还适用于治疗不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖紊乱。因此，根据本发明，提供了治疗不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖紊乱的方法。在一个实施方案中，方法包括向受试者(需要治疗的)施用足以治疗不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱的量的融合构建体。
术语“过度增殖紊乱”是指任何不希望的或异常的细胞存活(例如不能经历程序性细胞死亡或细胞凋亡)、生长或增殖。这些疾病包括良性增生，非转移性和转移性瘤形成、癌症、肿瘤和恶性肿瘤。不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖紊乱可影响受试者的任何细胞、组织、器官。不希望的或异常的细胞增殖和过度增殖紊乱可存在于受试者的局部、区域或全身。过度增殖紊乱可由多个组织和器官引起，包括但不限于乳腺、肺(例如小细胞或非小细胞)、甲状腺、头和颈、脑、鼻咽、喉、鼻或窦、淋巴、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴、胃肠(口、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、阴道子宫颈、子宫内膜、输卵管、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴、血液、肌肉、皮肤和干细胞，其可能或可能不会转移到其它次级部位、区域或位置。
本发明的融合构建体和方法也适用于任何细胞、器官或组织来源的转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成，以及任何细胞、器官或组织来源的转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的血管。这样的疾病可几乎影响任何细胞或组织类型，例如癌，肉瘤，黑色素瘤，神经、网状内皮或造血系统的肿瘤形成性疾病(例如骨髓瘤、淋巴瘤或白血病)。
本文所用的术语“瘤形成”和“肿瘤”是指其生长、增殖或存活大于相应的正常细胞的生长、增殖或存活的细胞或细胞群，例如细胞增殖或分化疾病。肿瘤是已经形成明显的块或生长的瘤形成。“癌症”或“恶性肿瘤”是指可侵入相邻空间、组织或器官的瘤形成或肿瘤。“转移”是指瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤已经从其原发部位播散或扩散到受试者的一个或更多个次级部位、局部或区域，其中所述部位、局部或区域与原发性肿瘤或癌症的部位、局部或区域不同。
赘生性细胞、肿瘤、癌症和恶性细胞(转移性或非转移性)包括静止的或残余的赘生性细胞、肿瘤、癌症和恶性细胞。这些细胞通常由不分裂(G0-G1停止)的残余肿瘤细胞组成。这些细胞能持续存在于原发部位或者与微小的残余疾病一样播散赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞。这些静止的赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞保持无症状状态，但是，一旦这些静止细胞增殖，则可发展为严重症状和死亡。本发明的方法可用于降低或抑制静止的赘生性细胞、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖，从而可抑制或降低肿瘤或癌症的复发或者肿瘤或癌症的转移或进展。
根据本发明，提供了治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的受试者的方法。在一个实施方案中，方法包括向受试者(需要治疗的)施用足以治疗(例如降低或抑制增殖)转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的量的融合构建体。
转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成可以是任何阶段的肿瘤，例如早期或晚期，比如I、II、III、IV或V期。转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成可以是之前已经进行治疗的或者稳定(非进展)的或者缓解的。
就转移而言，本发明的方法可用于降低或抑制原发性肿瘤或癌症转移到其它部位或者在原发性肿瘤或癌症远端的其它部位形成或建立转移性肿瘤或癌症，从而抑制或减少肿瘤或癌症复发或肿瘤或癌症的进展。因此，除此之外，本发明的方法包括1)降低或抑制可能或发展成转移的肿瘤或癌细胞(例如播散的肿瘤细胞，DTC)的生长、增殖、迁移或侵入；2)降低或抑制形成或建立起因于原发性肿瘤或癌症至不同于原发性肿瘤或癌症的一个或更多个其它部位、局部或区域的转移；3)降低或抑制转移已经形成或已经建立之后转移至不同于原发性肿瘤或癌症的一个或更多个其它部位、局部或区域进行生长或增殖；以及4)降低或抑制已经形成或建立转移之后形成或建立其它的转移。
转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的细胞可聚集在“实体”细胞块中或分散或扩散。“实体”肿瘤是指癌症、瘤形成或转移通常聚集在一起并形成肿块。具体的非限制性实例包括内脏肿瘤，例如黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、子宫癌和卵巢癌、睾丸癌(包括精原细胞瘤)、胃癌或结肠癌、肝癌、肾上腺癌、肾癌和膀胱癌、肺癌、头颈癌和脑瘤/癌。
癌是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。示例性的癌包括从子宫、子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠、胰腺、睾丸、肾上腺、肾脏、食道、胃、肝脏和卵巢形成的那些癌症。该术语还包括癌肉瘤，例如包括由癌和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。腺癌包括腺组织的癌症，或者其中肿瘤形成腺样结构的癌症。
肉瘤指起因于间充质细胞的恶性肿瘤。示例性的肉瘤包括例如淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤。
神经瘤形成包括神经胶质瘤、恶性胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。
“液体肿瘤”是指本质上分散的或弥漫性的由于它们通常不形成固体块的瘤形成。具体的实例包括网状内皮组织或造血系统的瘤形成，例如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病的非限制性实例包括急性和慢性成淋巴细胞瘤、成髓细胞瘤和多发性骨髓瘤。通常，这样的疾病起因于分化不良的急性白血病，例如成红细胞白血病和急性巨核细胞白血病。具体的骨髓疾病包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括B系ALL和T系ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症(WM)。具体的恶性淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、何杰金氏病和里德-斯特恩伯格疾病(Reed-Sternbergdisease)。
本文所公开的不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱可发生于子宫、乳腺、阴道、子宫颈和输卵管。当子宫细胞长到子宫外和其它区域例如卵巢、膀胱或肠道时发生子宫内膜异位。肌瘤和息肉可影响子宫、乳腺、阴道、子宫颈和输卵管。
因此，根据本发明，提供了治疗子宫内膜异位症和子宫肌瘤或息肉的方法。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用足以治疗子宫内膜异位症的量的融合构建体。在另一个实施方案中，方法包括向受试者施用足以治疗纤维瘤或息肉的量的融合构建体。
靶细胞包括参与生殖或生育或者生殖或生育所需的细胞。因此，根据本发明，提供了降低动物生育能力的方法。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用足以降低生育能力或降低怀孕可能性或降低雄性哺乳动物精子产生的量的融合构建体。
如本文还公开，不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱可发生于前列腺。因此，根据本发明，提供了治疗良性前列腺增生或转移性前列腺瘤形成的方法。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用足以治疗良性前列腺增生或转移性前列腺瘤形成的量的融合构建体。
具有抗细胞增殖活性或效果的任何组合物、治疗、协议、疗法或方案均可与融合构建体相组合或以组合的形式用在本发明的方法中。因此，本发明的融合构建体和方法包括抗增殖、抗肿瘤、抗癌、抗肿瘤形成和抗转移的治疗、协议和疗法，其包括抑制、降低、阻碍、减慢、减轻或预防过度增殖紊乱的任何其它组合物、治疗、协议或治疗方案，例如在体外或体内的肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的生长、进展、转移、增殖或存活或恶化。抗增殖(例如肿瘤)疗法的具体非限制性实例包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法(电离或化学)、局部热(高热)疗法、手术切除和免疫接种。融合构建体可在施用抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌、抗转移或免疫增强治疗或疗法之前、基本上同时或之后施用。融合构建体可以与抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌、抗转移或免疫增强的治疗或疗法、转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成一起以组合组合物的形式施用。
抗增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌和抗转移的组合物、疗法、协议或治疗包括：预防、破坏、中断、抑制或延缓细胞周期进展或细胞增殖；刺激或增强细胞凋亡或细胞死亡；抑制核酸或蛋白质合成或代谢；抑制细胞分裂，或减少、降低或抑制细胞存活，或必需的细胞存活因子、生长因子或信号通路(胞外或胞内)的制备或利用。具有抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌和抗转移活性的化学试剂种类的非限制性实例包括烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷和核苷酸类似物。具有抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌和抗转移活性的药物的具体实例包括环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，强的松龙，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，氮芥，白消安，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)，AZT，5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物，例如地西他滨(5-氮杂-2’-脱氧胞苷)、阿糖胞苷(cytarabine)、1-β-D-阿糖呋喃-5-氮杂胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷、博来霉素、放线菌素D、光辉霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、羟基脲、顺铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉烷(例如紫杉醇或太平洋紫杉醇)、长春花碱、长春新碱、阿霉素和二溴甘露醇等等。
可与融合构建体和方法一起施用的其它试剂是本领域已知的并且可以使用。例如，可施用生物制品比如抗体、细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子和趋化因子。单克隆抗体的非限制性实例包括利妥昔单抗()、曲妥单抗()、贝伐单抗()、雷珠单抗()、西妥昔单抗()、阿仑单抗()、帕尼单抗()、帕妥珠单抗()、替伊莫单抗()、伊匹单抗()、托西莫单抗()等等，它们可特别与其中本发明的融合构建体一起使用。适于与融合构建体一起使用的其它靶向药物为伊马替尼()，吉非替尼()，硼替佐米(bortzomib，)，拉帕替尼()，舒尼替尼()，索拉非尼()，尼罗替尼()，扎妥木单抗，dalotuzumab，figitumumab，雷莫芦单抗(ramucirumab)，galiximab，farletuzumab，ocrelizumab，奥法木单抗(ofatumumab，)，托西莫单抗(tositumumab)，2F2(HuMax-CD20)，7D8，IgM2C6，IgG12C6，11B8，B1，2H7，LT20，1F5或AT80达利珠单抗()，抗LHRH受体抗体。细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子和趋化因子的非限制性实例包括IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、趋化因子、趋化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1和淋巴细胞趋化因子。
其它非限制性实例包括免疫增强治疗和疗法，其包括基于细胞的疗法。具体地，免疫增强治疗和疗法包括施用淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞和B细胞。
提供了治疗转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或肿瘤形成的方法、治疗由于患有或处于患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成风险而需要治疗的受试者的方法以及增强效能或改善抗增殖、抗肿瘤、抗癌、抗肿瘤形成或抗恶性肿瘤的治疗方法。在各个实施方案中，方法包括向患有或处于转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成风险的受试者施用足以治疗转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的量的融合构建体；向受试者施用足以治疗受试者的量的融合构建体；以及向正在经历或已经经历转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成治疗的受试者施用足以增强抗增殖、抗肿瘤、抗癌、抗肿瘤形成或抗恶性肿瘤的治疗效能的量的融合构建体。
本发明的方法可以在存在不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱、疾病或病症开始(例如一种或更多种症状)的证据之前(即预防)、同时或之后实施。在不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱的症状发生之前、同时或之后立即施用融合构建体可能会降低受试者的不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱、疾病或病症的一种或更多种症状的发生、频率、严重程度、进展或持续时间。此外，在不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱、疾病或病症发生之前、同时或之后立即施用融合构建体可能会抑制、降低或预防受试者的过度增殖细胞(例如转移)扩散或播散到其它部位、区域、组织或器官，或者在受试者的其它部位、区域、组织或器官建立过度增殖细胞(例如转移)。
本发明的融合构建体和方法(例如治疗方法)可为受试者提供可检测的或可测量的治疗益处或改善。治疗益处或改善是对受试者的任何可测量的或可检测的、客观的或主观的、短暂的、临时或长期的益处，或者对受试者的组织、器官、细胞或细胞群中任何程度的病症、紊乱或疾病、不良症状、后果或根本原因的改善。治疗益处和改善包括但不限于减少或降低一种或更多种与紊乱、疾病或病症相关的症状或并发症，紊乱、疾病或病症的根本原因或间接影响的发生、频率、严重程度、进展或持续时间。因此，本发明的融合构建体和方法包括为受试者提供治疗益处或改善。
在其中治疗益处或改善是所希望的结果的本发明方法中，本发明的融合构建体可以足够的或有效的量施用给需要的受试者。“足够的量”或“有效的量”是指这样的量：以单剂量或多剂量、单独或与一种或更多种其它组合物(治疗剂，例如化疗药或免疫刺激药物)组合，治疗、协议或治疗方案的药剂为受试者提供任何持续时间(长期或短期)的可检测的响应、任何可测量或可检测程度的期望结果或益处或任何持续时间(例如，数小时、数天、数月、数年或治愈)。治疗(例如提供治疗益处或改善)的剂量或“足够的量”或“有效的量”通常是以可测量的程度有效改善紊乱、疾病或病症，或者紊乱、疾病或病症的一种、更多种或所有的不良症状、后果或并发症，但是，降低或抑制紊乱、疾病或病症或症状的进展或恶化被认为是一个令人满意的结果。
术语“改善”是指在受试者病症的可检测的客观或主观改善。可检测的改善包括由紊乱、疾病或病症引起或与其相关的发生、频率、严重程度、进展或持续时间主观或客观的减少，紊乱、疾病或病症的根本原因或结果的改善，或紊乱、疾病或病症的逆转。
因此，治疗可以导致抑制、减轻或预防紊乱、疾病或病症、或与其相关的症状或后果或根本原因；抑制、减轻或预防紊乱、疾病、病症、症状或后果或根本原因的进展或恶化；或紊乱、疾病、病症或症状的一种或更多种其它症状进一步恶化或发生。因此，成功的治疗结果导致“治疗效果”或“益处”，或者抑制、减轻或预防受试者中病症、紊乱、疾病或症状的一个或更多个症状或根本原因或后果的发生、频率、严重程度、进展或持续时间。因此，影响病症、紊乱、疾病或症状的一种或更多种根本原因的治疗方法被认为是有益的。稳定或抑制紊乱或病症的进展或恶化也是一个成功的治疗结果。
因此，治疗益处或改善不需要与病症、紊乱或疾病相关的任何一种、大多数或所有的症状、并发症、后果或根本原因完全消失。因此，当受试者在短时间或长期(数小时、数天、数周、数月等等)时间内病症逐渐改善，或者发生、频率、严重程度、进展或持续时间部分减轻，或者抑制或逆转一个或更多个相关的不良症状或并发症或后果或根本原因、恶化或进展(例如稳定病症、紊乱或疾病的一种或更多种症状或并发症)或者紊乱或疾病的一种或更多种生理、生物化学或细胞的表现或特征时，实现令人满意的终点。
在具体实施方案中，治疗方法导致转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的细胞团块、体积、大小或细胞数量部分或完全破坏；导致刺激、诱导或增强转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的细胞坏死、裂解或凋亡；导致转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的体积、大小、细胞团块减小；导致抑制或预防转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的体积、团块、大小或细胞数量的进展或增加；导致抑制或降低过度增殖细胞(例如转移)的扩散或播散至受试者的其它(次级)部位、区域、组织或器官中；在受试者的其它(次级)部位、区域、组织或器官中建立过度增殖细胞(例如转移)；或者导致延长受试者的寿命。在另外的具体实施方案中，治疗方法导致减轻或减少与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成相关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率。
足够量或有效量可以但不需要以单次施用提供，并且可以但不需要单独或与另一种组合物(例如化疗药或免疫增强剂或刺激剂)、治疗、协议或治疗方案组合施用。例如，所述量可以根据受试者以及所治疗的紊乱、疾病或病症的状态或者治疗的副作用按比例增加。此外，如果单剂量或多剂量在没有第二组合物(例如化疗药或免疫刺激剂)、治疗、协议或治疗方案的情形下，足够量或有效量不需要足够或有效，因为为了认为对指定的受试者有效或足够，可包括高于并超出这些剂量的其它剂量、量或持续时间，或者其它的组合物(例如化疗药或免疫刺激剂)、治疗、协议或治疗方案。认为足够的量还包括导致另一种治疗、治疗方案或协议的使用减少的量。
足够量或有效量不需要对各个和每个治疗受试者有效，预防或治疗也不需要对给定组或群中大多数治疗受试者有效。因为治疗或治疗方法是典型的，所以一些受试者将对给定的治疗、治疗方案或协议表现出更大或更小的响应。足够量或有效量是指对特定的受试者足以或有效，而不是对一组或普通人群。这样的量将部分取决于所治疗的病症，例如不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)的类型或阶段、所希望的治疗效果以及个体受试者(例如受试者的生物利用度、性别、年龄等等)。
不希望的或异常的细胞增殖例如过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)的治疗益处或改善的具体非限制性实例包括细胞大小、团块或体积的减小，抑制细胞大小、团块或体积的增加，减缓或抑制恶化或进展，刺激细胞坏死、裂解或凋亡，降低或抑制瘤形成或肿瘤恶变或转移，降低死亡率以及延长受试者寿命。因此，抑制或延迟细胞大小、团块、体积的增加或转移(稳定化)可延长寿命(降低死亡率)，尽管仅数天、数周或数月，即使转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成不能完全消失。可减轻或减少的与过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)相关的不良症状和并发症包括例如疼痛、恶心、不适、食欲不振、嗜睡和虚弱。因此，减少不希望的或异常的细胞增殖例如过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)的症状的发生、频率、严重程度、进展或持续时间，例如改善主观感觉(例如能量、食欲增加，减轻恶心，改善活动或心理健康等等)，是治疗益处或改善的所有实例。
例如，足够量或有效量的融合构建体被认为是施用时具有治疗效果，使得治疗不希望的或异常的细胞增殖例如过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)所需的化疗药物、放射或免疫疗法减少。
术语“受试者”是指动物，通常为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家养动物(狗和猫)、家畜(马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。受试者包括动物疾病模型，例如不希望的或异常的细胞增殖例如过度增殖紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)的动物模型，用于融合构建体的体内分析。
适于治疗的受试者包括患有或处于患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成细胞的风险的那些受试者，经历以及正在经历或已经经历抗增殖(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)治疗的那些受试者，包括其中肿瘤正在缓解的受试者。“处于风险”的受试者通常具有与不希望的或异常的细胞增殖、增生(例如肿瘤)形成相关的风险因素。
处于风险或候选受试者的具体实例包括含有表达融合构建体可结合的受体、配体、抗原或抗体的细胞的那些受试者，特别是被靶向而坏死、裂解、杀死或破坏的细胞相比于非靶细胞而言表达更多数目或量的受体、配体、抗原或抗体。这样的细胞可以选择性或优先被靶向而坏死、裂解或杀死。
处于风险的受试者还包括已经历手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或免疫接种的那些受试者和其候选者。因此，本发明适用于治疗处于转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成或者与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成相关的并发症的风险的受试者，例如，稳定或缓解一段时间之后，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成再次出现或再次生长。
风险因素包括性别、生活方式(饮食、吸烟)、职业(医疗和临床人员、农业和畜牧业工作者)、环境因素(致癌物暴露)、家族史(自身免疫性疾病、糖尿病等等)、遗传易感性等等。例如，处于形成黑素瘤风险的受试者包括过量阳光暴露(紫外线照射)、白皙的皮肤、大量的痣(发育不良痣)、患者表型、家族史或先前黑色素瘤病史。因此，处于形成癌症的风险可通过生活方式、职业、环境因素、家族史和遗传筛选肿瘤相关基因、基因缺失或基因突变来鉴定。例如，处于形成乳腺癌风险的受试者缺乏Brca1基因。处于形成结肠癌风险的患者患有早期或高频息肉形成，或者缺失或突变的肿瘤抑制基因，例如比如腺瘤样结肠息肉病(APC)。
受试者还包括排除其它治疗的那些受试者。例如，某些受试者可能不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的好的候选者。因此，根据本发明治疗的候选受试者包括不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的候选者的那些受试者。
融合构建体可以配制成单位剂量或单位剂量形式。在具体实施方案中，融合构建体的量可有效治疗患有不希望的或异常的细胞增殖或过度增殖紊乱的受试者。在其它具体实施方案中，融合构建体的量可有效治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的受试者。在进一步的具体实施方案中，融合构建体的量可有效降低受试者的生育能力。示例性的单位剂量范围为约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或者2500-5000、5000-25000、5000-50000ng；约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或者2500-5000、5000-25000、5000-50000μg和25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000mg。
本发明的组合物和方法可以在体外、离体或在体内接触或提供。组合物可以单个或多个剂量施用以提供期望的效果，例如，以有效或足够的量。示例性的剂量范围为约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25000、5000-50000pg/kg；约50-500、500-5000、5000-25000或25000-50,000ng/kg；以及约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25000、5000-50000μg/kg，或约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25000mg/kg，连续数天，或交替数天或间断。单剂量或多剂量可连续数天、交替数天或间断地施用。
可以通过全身、区域或局部施用通过任何途径施用组合物和实施方法，例如，融合构建体可以全身、区域或局部，静脉内、经口(例如摄入或吸入)、肌内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、透皮(局部)、肠胃外例如经粘膜或经直肠施用。本发明的组合物和方法包括可通过(微)胶囊递送系统或包装成植入物施用的药物制剂。
本发明还提供其中融合构建体包含在药物组合物中的融合构建体和方法。药物组合物是指“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”载体、稀释剂或赋形剂。本文所使用的术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”当指载体、稀释剂或赋形剂时包括溶剂(水性或非水性)、去污剂、溶液、乳剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收促进或延迟剂，与药物施用以及该制剂的其它成分相兼容。这样的制剂可以包含在片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬的或软的)、微珠、乳剂、粉末剂、颗粒剂、晶体、混悬剂、糖浆或酏剂中。
药物组合物可配制成与具体的施用途径相兼容。用于肠胃外、皮内或皮下施用的组合物可包含无菌稀释剂，例如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂。制剂可包含一种或更多种防止微生物生长的防腐剂(例如抗菌剂，比如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及张力调节剂，比如氯化钠或右旋糖)。
用于注射的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或临时制备成无菌可注射溶液或分散体的分散剂和无菌粉末。对于静脉内施用而言，合适的载体包括生理盐水、带抑菌剂的水、CremophorELTM(BASF，帕西帕尼，新泽西)或磷酸盐缓冲液(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)及其合适的混合物。例如，通过使用涂层比如卵磷脂或使用表面活性剂可维持流动性。抗菌剂和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
其它的药物制剂和递送系统是本领域已知的并且适用于本发明的方法(参见例如Remington’sPharmaceuticalSciences(1990)18thed.,MackPublishingCo.,Easton,PA；TheMerckIndex(1996)12thed.,MerckPublishingGroup,Whitehouse,NJ；PharmaceuticalPrinciplesofSolidDosageForms,TechnonicPublishingCo.,Inc.,Lancaster,Pa.,(1993)；以及Poznansky等人，DrugDeliverySystems,R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.(1980),pp.253-315)。
本发明提供包含包装进合适的包装材料中的本发明的融合构建体、组合组合物及其药物制剂的药盒。药盒任选地包括标签或包装说明书，包括组份描述或其中组份的体外、体内或离体使用说明。示例性的说明书包括用于降低或抑制细胞增殖，降低或抑制不希望的或异常的细胞例如过度增殖细胞的增殖，降低或抑制转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生性细胞的增殖，治疗患有过度增殖紊乱的受试者，治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成的受试者，或降低动物的生育能力。
药盒可包含这样的组份的集合，例如单独的两种或更多种融合构建体或与另一种治疗上有用的组合物(例如抗增殖或免疫增强药物)相组合。
术语“包装材料”是指容纳药盒组份的物理结构。该包装材料可保持组份无菌，并且可由通常用于这种目的材料(例如纸、瓦楞纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、瓶、管等等)制成。
本发明的药盒可包括标签或插入物。标签或插入物包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独的或固定至组份上、药盒或包装材料(例如箱)上，或附着于包含药盒组份的安瓿、管子或瓶上。标签或插入物还可包括计算机可读介质，例如磁盘(例如软盘、硬盘、ZIP盘)，光盘例如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3，磁带或电存储介质例如RAM和ROM或这些这样的磁/光存储介质的杂合体、FLASH介质或记忆类型卡。
标签或插入物可包括识别其中一种或更多种组份，剂量，活性成分的临床药理学包括作用机制、药代动力学和药效学的信息。标签或插入物可包括用于识别制造厂商、批号、制造商地址和日期的信息。
标签或插入物可包括药盒组份可用于的病症、紊乱、疾病或症状的信息。标签或插入物可包括临床医生或受试者在方法、治疗协议或治疗方案中使用一种或更多种药盒组份的说明。说明书可包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所阐述的任何方法、治疗协议或治疗方案的说明。示例性的说明包括用于治疗不希望的或异常的细胞增殖、过度增殖细胞和紊乱(例如转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或瘤形成)的说明。因此，本发明的药盒还可包括用于实施本文所述的本发明的任何方法包括治疗方法的标签或说明。
标签或插入物可包括有关可提供例如预防或治疗益处的组份的任何益处的信息。标签或插入物可包括有关潜在的不良副作用的信息，例如将不适合使用特定组合物的情形警告受试者或临床医生。当受试者已经、将要或目前正在服用一种或更多种与组合物不相兼容的其它药物，或者受试者已经、将要或目前正在经历与组合物不相兼容的另一种治疗协议或治疗方案时，也可产生不良副作用，因此，说明可包括有关这些不兼容的信息。
本发明的药盒还可包含其他组份。药盒的各组份可装在单独的容器内，并且所有各容器可在单个包装内。本发明的药盒可以设计为冷储存。本发明的药盒还可进一步设计为包含表达本发明的融合构建体的宿主细胞，或包含编码融合构建体的核酸。药盒中的细胞可以保持在适当的储存条件下，直到细胞准备被使用。例如，包含一种或更多种细胞的药盒可包含合适的细胞储存介质，使得细胞可被解冻并生长。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域中普通技术人员通常理解的相同。但是类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实施或测试本发明，合适的方法和材料如本文所述。
本文所引用的所有申请、出版物、专利和其它参考文献、GenBank引文以及ATCC引文均通过引用整体并入本文。在冲突的情形下，将以本说明书包括定义为准。
本文所使用的单数形式“一”、“和”以及“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种融合构建体”或“一个裂解结构域”包括多种(个)这样的融合构建体或裂解结构域等等。
如本文所用，所有数值或数值范围包括这样范围内的整数或者范围内的值或整数的分数，除非上下文另有明确说明。因此，例如，参考90-100％的范围，其包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等等以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等等，并依此类推。
本文中公开的本发明通常使用肯定的语言来描述许多实施方案。本发明还具体地包括其中具体的主题例如物质或材料、方法步骤和条件、协议、程序、测定或分析被全部或部分排除的实施方案。因此，尽管本发明通常不在本文中表达，就本发明不包括本发明未表达的方面而言，都依旧在本文公开。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应当理解的是，可以在不背离本发明的精神和范围的情形下进行各种修改。因此，下述实施例旨在举例说明而不是限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
最初的研究包括体外筛选28种裂解结构域肽，所述裂解结构域肽含有在裂解肽部分和配体之间的不同的铰链序列；含有30％的D氨基酸(D-对映体)；其裂解肽部分的长度为18和15个氨基酸，并包含铰链序列或它们的D-对映体。研究了引入α-氨基己酸作为21、18和15个氨基酸Phor21类似物的间隔子。选择用于研究的配位体包括βCG-ala，其是来自绒毛膜促性腺激素的β链的结合部分的15个氨基酸片段；和LHRH，其是代表全功能配体的十肽。
实施例2
本实施例描述使用人乳腺癌细胞系筛查细胞毒性(IC50)和溶血活性。
研究了十八种βCG-ala和八种LHRH缀合的融合构建体并与Phor21-βCG-ala和未缀合的Phor21和Phor18(338913)＝CLIP71肽进行比较。过表达绒毛膜促性腺激素(CG)和促黄体激素释放激素(LHRH)受体的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435S.luc以传代数248-252用于筛查。从通过脂质转染法用质粒PRC/CMV-luc稳定转染从美国模式菌种收集中心(AmericanTypeCellCultureCollection)获得的MDA-MB-435S细胞系来构建MDA-MB-435S.luc细胞系，质粒PRC/CMV-luc包含北美产萤火虫(Photinuspyralis)荧光素酶基因和抗体抵抗基因。使用G418选择稳定转染的细胞系，并针对LH和LHRH受体表达对具有最高的荧光素酶基因的表达的克隆进行测试。
MDA-MB-435S.luc细胞在Leibovitz的L15培养基，10％胎牛血清，0.01mg/ml牛胰岛素，100IU/ml青霉素，100microg/ml链霉素中生长。使细胞在紧密封闭的烧瓶中培养。用96孔板以每孔10,000个细胞孵育。细胞典型地接种到96孔板中，孵育48小时后更换培养基。在递增浓度的0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10和100微摩尔剂量的裂解肽-结合结构域缀合物进行每个测试。每种裂解肽-结合结构域缀合物以冻干形式提供并被新鲜地溶解在盐水中，加入到细胞中。孵育的时间通常为24小时，使用甲瓒转化测定(MTT测定)进行细胞活性测试。含有盐水或0.1％triton的对照组分别作为0和100％细胞死亡的参考。
使用GraphPadPrizm4TM软件(GraphPadPrizm，Inc)处理和分析数据。通过双尾学生T-检验确定统计分析意义。进行各研究以达到N为至少8。
确定了增加融合构建体的长度的影响(Javadpour等人，JMedChem39:3107(1996)；Javadpour和Barkeley,Biochemistry36:9540(1997)；Leuschner和Hansel,CurrentPharmaceuticalDesign,10:2299(2004)；以及Leuschner和Hansel,BiolReprod73:255(2005))。在C末端与βCG-ala缀合的裂解肽表现出随构建物的长度增加而增强的毒性。具有各种长度的肽的IC50为：对于14个氨基酸(Phor14)为5.74μM，对于15个氨基酸(Phor15)为1.92μM，对于18个氨基酸(Phor18＝CLIP71)为1.09μM，对于21个氨基酸(Phor21)为2.31μM以及对于28个氨基酸(Phor28)为1.36μM(见表3)。
确定了结合部分的位置(N-末端或C-末端)的影响。简言之，研究了Phor21-βCG-ala(C-末端)，βCG-ala-Phor21(N-末端)，LHRH-Phor21(N-末端)和Phor21-LHRH(C-末端)融合构建体。肽的IC50为：对于Phor21-βCG-ala为2.3μM，对于βCG-ala-Phor21为4.7μM，对于LHRH-Phor21为2.65μM，以及对于Phor21-LHRH为1.71μM。该数据表明，βCG-ala和LHRH结合部分被定位在C-末端比如果结合部分被定位在N-末端表现出更强的毒性。
LHRH受体存在于许多人类癌症中(见表1)。将LHRH作为结合部分的活性与βCG-ala作为结合部分的活性进行比较。
孵育2或24小时，在体外人MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞中比较LHRH-Phor21和Phor21-βCG-ala的毒性。数据表明，LHRH-Phor21比Phor21-βCG-ala更快杀死细胞，LHRH-Phor21在2小时内引发细胞死亡(图1)。
表1：人癌症中的LH和LHRH受体
癌症类型 LH受体 LHRH-受体
乳腺癌 72％ 52％
前列腺癌 100％ 86％
卵巢癌 40％ 80％
子宫内膜癌 17％ 80％
胰腺癌 未检出 68％
肺癌 是 未检出
黑素瘤癌 68％ 是
脑癌 未检出 是
结肠癌 未检出 是
口腔癌 未检出 是
在裂解结构域和结合部分之间引入铰链、间隔子或连接序列导致肽比Phor21-βCG-ala在杀死细胞方面有更大的效力。(图2，表2)。而在Phor21-βCG-ala融合构建体中引入铰链序列或间隔子并未显著改变细胞杀伤活性，对于βCG-缀合物，ASAAS作为铰链序列的效果显著增强具有15个氨基酸的裂解肽的毒性；在βCG和LHRH缀合的肽Phor18-LHRH和Phor18-ASAAS-LHRH的情况下，这种ASAAS作为铰链序列的增强毒性的效果是不存在的，它们在体外同样有效(表2，图4)。当铰链序列被替换为6碳间隔子，α-氨基己酸时，观察到了类似的效果(表2)。丙氨酸被替换为在第二铰链序列(GSGGS)中的甘氨酸导致显著较低的活性，这表明甘氨酸会有螺旋去稳定作用。(图2，表2)。
表2：βCG-ala缀合的肽的肽长度的影响
LHRH-缀合的肽
为了确定D-氨基酸替代的作用，融合构建体Phor21-βCG-ala合成为D对映体(以下简称为D-ala-Phor21-βCG-ala)。该融合构建体体外显示出对MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞的可比较的毒性(Phor21-βCG-ala2.31μM，D-ala-Phor21-βCG-ala2.15μM(表3)；D-ala-Phor18-βCG-ala比Phor21-βCG-ala(IC501.6μM)的效力高1.4倍，LHRH对应物(counterpart)比D-对映体显著更有效力(Phor21-LHRH(IC50为1.31μM)相比于D-ala-Phor21-LHRH(IC50为0.75μM)、D-Phor18-LHRH(IC50为1.42μM)和Phor18-Lupron(IC50为1.95μM))。
在表3和图3总结了βCG-ala和LHRH-缀合的裂解肽在MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞中的IC50值。简略地说，具有的IC50比Phor21-βCG-ala(2.31±0.16)显著低的肽为：Phor28-βCG-ala(1.36±0.09μM；p<0.0001)、Phor15-ASAAS-βCG-ala(1.48±0.24μM；p<0.005)、Phor15-C6-βCG-ala(1.31±0.17μM；p<0.004)(C6＝6氨基己酸)、Phor18-βCG-ala(1.09±0.17μM；p<0.0001)、Phor21-LHRH(1.31±0.1μM；p<0.0001)、D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.1μM；p<0.0001)、Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.12μM；p<0.0001)、Phor18-LHRH(0.87±0.11μM；p<0.0001)、(KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21μM；p<0.0004)、和D-ala-Phor18-LHRH(1.42±0.08μM；p<0.004)。
相比于βCG-ala融合构建体，LHRH融合构建体总体上较有效力(较强毒性和较快速作用，图1)。简言之，与Phor21-βCG-ala(p<0.003)相比较，Phor21-LHRH、D-ala-Phor21-LHRH、Phor18-ASAAS-LHRH、Phor18-LHRH和肽对照338614((KKKFAFA)3＝无活性的肽)对人乳腺癌细胞的毒性均显著较强。除了LHRH-Phor21以外，所有的LHRH融合构建体大致同样有效，当所述结合部分相对于裂解部分被定位在C末端时，LHRH-Phor21具有显著较低的效力。相比于Phor21-LHRH，D-ala-Phor18-LHRH同样有效；Phor18-Lupron的毒性较低，但与Phor21-βCG-ala是相似的。(图4，表3；Lupron是QHWSY(D-Leu)LRPNEt)。
与Phor21-LHRH(1.34±0.1μM)相比，具有显著降低IC50-值的融合构建体为：D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.12μM；p<0.002)，Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.11μM；p<0.0001)，Phor18-LHRH(0.87±0.12μM；p<0.004)，和(KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21μM；p<0.04)。当相同的融合构建体在βCG-ala和LHRH结合部分之间相比较时，在所有的情况下，LHRH融合构建体比其βCG-ala对应物有显著更强的毒性。
表3：溶细胞肽与肽缀合物-MDA-MB-435S.luc细胞中的IC50和HA50性能的总结
与Phor21-βCG-ala(323033)相比显著***p＜0.0005，**p＜0.005，*p＜0.05
研究了包括Phor18-Lupron和D-ala-Phor18-LHRH的21种融合构建体的急性溶血活性。结果总结在图5和图6，以及表3中。
使用连续稀释的暴露于0.5％的人RBC的肽在96孔板中确定溶血活性。对照是盐水(无RBC死亡)或0.1％的TritonX100(100％RBC裂解)。肽浓度的范围为0至100μM。孵育进行2小时。
为了确定各种融合构建体相比于顺铂对不同的人肿瘤细胞系的IC50，融合构建体的IC50被评估如表3所示。结果显示如下：
相比于顺铂在人癌症细胞系中的IC50[μm]值
乳腺癌细胞系：MDA-MB-435S.luc，MDA-MB-231
卵巢癌细胞系：OVCAR-3，SKOV-3
前列腺癌细胞系：LNCaP
子宫内膜癌细胞系：AN3-CA
数据总体表明，除了Phor21-LHRH、LHRH-Phor21和Phor18-Lupron以外，研究的融合构建体具有非常低的溶血活性。在类似条件下，下面的融合构建体不显示任何溶血活性(见图5)：Phor15-氨基己酸-β-CG-ala(337474)，D-ala-Phor21β-CG-ala(337481)>150000μM，Phor21，未缀合的Phor18＝CLIP71，(KKKFAFA)3-βCG-ala，Phor21(338982)，Phor18＝CLIP71(338983)，D-ala-Phor18-LHRH(339385)和(KKKFAFA)3-LHRH(338984)。D-氨基酸对映体没有可测量的溶血活性。
具有溶血活性<50μM的融合构建体为：Phor21-LHRH(25μM)，LHRH-Phor21(33μM)和Phor18-Lupron(21μM)。
具有溶血活性>100μM的融合构建体为：Phor18-β-CG-ala(337476)和Phor18-LHRH(338613)。
具有溶血活性介于50-100μM之间的融合构建体为：(KKKFAFA)3-LHRH(95μM)，Phor21-βCG-ala和Phor21-ASAAS-βCG-ala，具有相似的HA50为70μM。
具有溶血活性介于400-1300μM之间的融合构建体为：Phor14-βCG-ala(337464)，Phor18-GSGGS-β-CG-ala(337467)，Phor18-ASAAS-β-CG-ala(337470)，Phor15-ASAAS-β-CG-ala(337471)，D-ala-Phor21-LHRH(338611)和Phor18-ASAAS-LHRH(338612)。
临床意义标准是细胞毒性(IC50)和溶血活性(HA50)的比率，或IC50/HA50(图6，表3)。用最大浓度为10μM的融合构建体进行体内研究，所述融合构建体是低于针对大多数融合构建体测量的HA50值的几个因子。
具有D-ala-Phor21、Phor18-ASAAS、D-ala-Phor18和Phor18的LHRH缀合物具有非常低的IC50/HA50比率，为0.001-0.006(相比于Phor21-βCG-ala，为0.03)。对MDA-MB-435S.luc细胞的毒性相比于Phor21-βCG-ala显著更高：D-ala-Phor21-LHRH比Phor21-βCG-ala毒性高3倍，Phor18-LHRH和Phor18-ASAAS-LHRH的效力比Phor21-βCG-ala高2倍，D-ala-Phor18-LHRH的效力比Phor21-βCG-ala高1.5倍(图6)。
总之，通过增加的毒性和较低的溶血活性(IC50/HA50比)的标准进行评价的融合构建体为：Phor18-βCG-ala、Phor18-ASAAS-βCG-ala、Phor15-ASAAS-βCG-ala、Phor15-C6-βCG-ala、D-ala-Phor21-LHRH、Phor18-LHRH、Phor18-ASAAS-LHRH和D-ala-Phor18-LHRH。
实施例3
本实施例描述了用各种类型和剂量的βCG融合构建体和LHRH融合构建体在乳腺癌的小鼠异种移植模型中进行的体内研究。
用MDA-MB-435S.luc/基质胶高浓度悬浮液(1×106个细胞)皮下注射雌性裸(Nu/Nu)小鼠。治疗时间表在图7中所示。简言之，治疗开始于肿瘤细胞注射后第13天，并在第19天以及第25天继续。治疗是：盐水对照，Phor21(5mg/kg)，Phor18(5mg/kg)，(KKKFAFA)3肽-βCG-ala(5mg/kg)，Phor21-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，Phor18-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，D-ala-Phor21-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，基线每组8-12只小鼠，14组。每周注射的剂量分别为5、1和0.01mg/kg体重，以单次团注法注射。
所有组的小鼠对注射物耐受良好。在337476的各注射中在5mg/kg的剂量情况下只有一只小鼠死亡。死亡是急性事件。在其他治疗组中的所有小鼠存活。注射后10分钟以后没有小鼠由于注射导致死亡。
溶细胞肽注射液对原发肿瘤的效果示于图8。简言之，图8A-8C示出了针对每个单个肽的研究过程中的肿瘤体积。图8D-8G示出尸检时的肿瘤特征：肿瘤体积(D)、肿瘤重量(E)、活肿瘤细胞(F)、肿瘤状态(G)。
治疗效力被计算为在治疗开始时的测量值相比于在研究结束时的测量值之间的差异(图8H-8I)。图8J示出了尸检时的小鼠的体重。当针对萤光素酶活性测量肿瘤时，测量细胞在研究结束时在肿瘤中的活性。
相比于0.01mg/kg的基线(除323033以外)和(KKKFAFA)3-βCG-ala，Phor21和未缀合Phor18＝CLIP71对照，在用含有作为配体(II，A)的βCG的肽治疗的所有动物中肿瘤体积显著减少，p<0.05。相比于盐水对照，在所有治疗组中肿瘤体积显著减小，除(KKKFAFA)3-βCG-ala、Phor21和Phor18以外，它们对减少异种移植物的体积无效。
当与用盐水或(KKKFAFA)3肽治疗的动物相比时，在用βCG缀合肽的所有治疗组中肿瘤重量也显著减轻(p<0.001)。肿瘤细胞活性(如通过荧光素酶活性测定)与肿瘤重量和肿瘤体积中观测到的变化具有良好的相关性。
对于323033和337476，测量为与基线值相比降低的肿瘤重量或活肿瘤细胞的治疗效力，显示出浓度依赖性治疗响应。在0.01、1和5mg/kg的剂量下337481表现出持续减少的肿瘤负荷和活肿瘤细胞。相比于5mg/kg，在1mg/kg的剂量下323033是最有效的(我们已经在以前的实验已经观察到这一点)，但是只有在施加最低剂量的情况下才与盐水对照组显著不同。在使肿瘤负荷和活肿瘤细胞(p<0.004)减小低于基线值中，以5和0.01mg/kg的融合构建体337476和337481比323033(p<0.0001)显著更有效。融合构建体337481没有显示出浓度依赖性，并且在所有测试的构建体中是最有效的。
在构建融合体337476和337481治疗的小鼠中发现了囊性肿瘤，其发生达到80-90％，但在1mg/kg的323033治疗组中仅达到30％。(在该异种移植模型中没有观察到囊肿形成。囊肿由液体填充的被膜组成)。尽管目前尚不清楚，但据推测，当在快速生长的肿瘤中细胞被迅速杀死时囊性肿瘤发生。囊肿存在于用Phor21治疗的前列腺肿瘤异种移植物中。
治疗组的血生化和血常规结果透露，在任何情况下，治疗不影响肝、肾、心脏功能。血小板计数、WBC和RBC计数在正常范围内，表明该治疗特异性杀死肿瘤细胞，在给定的浓度下没有造成贫血，也没有影响任何其它可观察的重要身体功能。该融合构建体耐受良好，没有长期副作用。
基于前面的体内肿瘤的疗效数据，在与基线值相比的肿瘤重量减轻方面(p<0.004)和活肿瘤细胞的破坏(p<0.0001)方面，Phor18-βCG-ala(337476)和D-ala-Phor21-βCG-ala(337481)比参考Phor21-βCG-ala(323033)有显著较强的效力。两种融合构建体未引起体内溶血并在所用的最高剂量(5mg/kg)未表现出持久性的副作用。多次注射Phor18-βCG-ala的肿瘤效力较大是可能的，即使在最低剂量下也是如此。
对于LHRH融合构建体，使用了针对乳腺癌的小鼠异种移植模型。简言之，用MDA-MB-435S.luc/基质胶悬浮液(1×106个细胞)皮下注射5周龄远交品系的雌性裸小鼠(CharlesRiver)。治疗开始于肿瘤细胞注射后第21天，并在第26天和第29天继续。注射的融合构建体的每周剂量为2、0.2和0.02mg/kg体重，作为单次团注法注射。肿瘤细胞注射后34天所有小鼠被尸检-肿瘤重量的基线值是在治疗开始时通过牺牲8只小鼠获得的。原发性肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾被收集并在福尔马林中制备用于组织学评估。在尸检时记录肿瘤的重量，在-80℃下冷冻肿瘤的一部分用于荧光素酶分析测定。
治疗组包括盐水对照，Phor21-βCG-ala-323033(0.02、0.2和2mg/kg)、D-ala-Phor21-LHRH-338611(0.02、0.2和2mg/kg)，(KKKFAFA)3-LHRH-338614(5mg/kg)、Phor18-LHRH-338613(0.02、0.2和2mg/kg)、Phor18-ASAAS-LHRH-338612(0.02、0.2和2mg/kg)、D-ala-Phor18-LHRH-339385(0.02、0.2和2mg/kg)、和Phor18-Lupron-339347(0.02、0.2和2mg/kg)，基线每组12只小鼠。
所有组对注射物耐受良好。在用以2mg/kg的剂量的Phor18-ASAAS-LHRH第二和第三次注射期间仅两只小鼠死亡(这些小鼠均来自同一笼)。死亡是急性事件。在其他治疗组中的所有小鼠存活。注射后10分钟以后没有小鼠由于注射导致死亡。
图9总结了融合构建体注射物对原发肿瘤的影响，作为在针对每个单独的构建体的研究过程中的体积测量。在所有组中，治疗过程中肿瘤体积减小，除了用(KKKFAFA)3-LHRH缀合物治疗的小鼠或盐水对照中的小鼠以外，其中观察到指数形式的肿瘤生长。对于所有的融合构建体，将治疗后30天记录的肿瘤体积与基线相比显示减少(p<0.01)，在用Phor18-ASAAS-LHRH和Phor18-LHRH的治疗组中记录的肿瘤体积最小。
在图10中总结肿瘤的尸检特征：(A)肿瘤重量，(B)肿瘤重量相比于基线的变化，(C)活肿瘤细胞总数，(D)活肿瘤细胞总数相比于基线的变化，和(E)在基线的体重和尸检时的体重。当针对萤光素酶活性测量肿瘤时，测量研究结束时肿瘤细胞的活性。治疗效力被计算为在治疗开始时的测量值相比于在研究结束时的测量值之间的差异(图10B和10D)。
在所有治疗组中的所有动物中，当LHRH缀合物与盐水对照和(KKKFAFA)3-LHRH缀合肽相比较时，活肿瘤细胞的肿瘤重量和总数显著减少，即使0.02mg/kg的最低剂量也是如此(p<0.0001)。在用2mg/kg的含有LHRH的肽以及用0.02、0.2和2mg/kg的D-ala-Phor18-LHRH(A)治疗的所有动物中，肿瘤总重量相比于基线显著降低(p<0.05)。
下面的浓度导致类似于基线的肿瘤重量：Phor21-βCG-ala(323033)以0.02mg/kg(p<0.07)和0.2mg/kg(p<0.06)；Phor18-Lupron以0.2和0.02mg/kg剂量，Phor18-LHRH以0.2mg/kg，和D-ala-Phor21-LHRH以0.2mg/kg。当与以0.02mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala进行比较时，以0.02mg/kg的剂量的Phor18-ASAAS-LHRH和D-alaPhor18-LHRH的总肿瘤重量具有优势(p<0.05)。
活肿瘤细胞的数量被确定并作为活肿瘤细胞总数绘制在图10C中和作为活肿瘤细胞相比于基线的变化绘制在图10D中。细胞活性(如通过荧光素酶活性测量的)与在肿瘤重量和肿瘤体积中的观察到的变化相关联，除了Phor18-ASAAS-LHRH和Phor18-LHRH以外，其中观察到活肿瘤细胞减少。用D-ala-Phor18-LHRH(339385)和Phor18-ASAAS-LHRH(338612)治疗明显优于以2mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala(p<0.04)。
关于肿瘤重量和活肿瘤细胞方面，对于除了D-ala-Phor21-LHRH以外的所有的融合构建体，治疗效力测量为肿瘤重量或活肿瘤细胞相比于基线值的降低，其显示出浓度依赖性治疗响应。以0.02、2和2mg/kg剂量的D-ala-Phor18-LHRH显示肿瘤重量和活肿瘤细胞一致地减少。在减少活肿瘤细胞的数量和肿瘤重量方面，在这个实验中最有效的融合构建体为Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)，剂量为2mg/kg。Phor18-ASAAS-LHRH和D-ala-Phor18-LHRH相比于2和0.02mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala较优越(p<0.05)。Phor18-Lupron在减少肿瘤重量和活肿瘤细胞的效果方面是最差的。
治疗组的血生化和血常规结果表明，在任何情况下，治疗不影响肝、肾、心脏功能。血小板计数、WBC和RBC计数在正常范围内，表明该治疗特异性杀死肿瘤细胞，在给定的浓度下没有造成贫血，也没有影响任何其它可观察的重要身体功能。与盐水对照相比，在注射Phor18-Lupron、Phor18-LHRH和D-ala-Phor21-LHRH的小鼠中观察到钾水平升高1.5倍。该融合构建体耐受性良好，没有长期副作用。
基于上述的体内肿瘤效力数据，在肿瘤重量减轻(p<0.05)和活肿瘤细胞的破坏(p<0.04)方面，Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)相比于参考Phor21-βCG-ala显著更有效。与Phor21-βCG-ala同样有效的是D-ala-Phor21-LHRH和Phor18-LHRH。两种融合构建体未引起体内溶血或其他副作用。多次注射Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)的功效会更大是可能的，即使在最低剂量下也会如此。
实施例4
该实施例描述了体外和体内的受体表达和特异性研究。
在治疗之前和之后的LH受体表达密度均被分析以确定治疗是否导致受体表达的下调。免疫细胞化学与Western印迹分析和RIA比较，用于定量。使用IHC用腔室载玻片以及Westernblot分析在MDA-MB-435S.luc细胞、CHO和TM4细胞中进行LH和LHRH受体测定。针对对裂解肽CG和裂解肽LHRH的敏感性，将测试相同传代数的每种细胞系。
在MDA-MB-435S.luc(LHRH受体和CG受体两者)、TM4(无LHRH受体)和CHO(无CG受体)的细胞中分析LH受体融合构建体的特异性。IC50数据显示TM4细胞对LHRH-Phor21(10.9μM)显著降低的敏感性，而相比于MDA-MD-435S.luc细胞(2.3μM)CHO细胞显示出对Phor21-βCG-ala(24.6μM)低的敏感性(图12)。
测量与融合构建体治疗相关的体内受体表达。在融合构建体治疗的开始和结束测量体内受体表达。
实施例5
本实施例描述用融合构建体和化疗剂联合治疗。
将Phor21-βCG-ala和阿霉素与卵巢癌细胞系(OVCAR-3细胞，多重耐药)孵育48小时进行初步研究。细胞活性测定为甲瓒还原。在与Phor21-βCG-ala同时孵育中，随着阿霉素治疗增加IC50减小。在0、0.5、2和10μg/ml浓度的阿霉素下，所述减小是从10μM至0.9减少到0.3至0.05μM。(图11)。用Phor21-βCG-ala治疗增强对阿霉素的反应。该数据表明，当用阿霉素共孵育细胞时Phor21-βCG-ala是更有效的(13倍)。
用阿霉素或顺铂预处理肿瘤细胞，接着在存在和不存在LH或LHRH的情况下用LH或LHRH融合构建体治疗，将显示构建体的细胞毒性是否会变化。
在异种移植肿瘤模型(MDA-MB-435S)中测试联合治疗的体内功效。用融合构建体和化疗药物的组合治疗小鼠，并与适当的对照进行比较。根据药物的标准时间表治疗小鼠，并且用融合构建体每周治疗一次，连续3周。
融合缀合物具有高的安全界限考虑参数，如溶血活性，与抗肿瘤有效剂量(0.02或0.01mg/kg)相比的最大耐受剂量(MTD)(高达16-25mg/kg)。Phor21-βCG-ala的安全界限是16，而Phor18-βCG-ala和Phor18-LHRH的值可以高达800。相比之下，Phor18-Lupron的安全界限只有8。
表6下面是根据各种标准的缀合物的总结
等级代码：
分配的点：123
在体外活性1倍2倍3倍
HA50<5050-100>100
IC50/HA50<0.03<0.006<0.004
体内效力
相比于33等于更好
MTD相比于33等于更好
1)33的IC50为2.31μM，数值表示为33的IC50/IC50肽。
2)溶血活性表示为HA50[μM]。
3)体内性能是指相比于肽33的相同参数，在肿瘤重量减少和活肿瘤细胞减少与基线值比较的显著性。
4)注射剂量导致66.6％存活(急性和注射后8-14天)。
肽代码：
33＝Phor21βCG-ala
76＝Phor18-βCG-ala
81＝DalaPhor21-βCG-ala
85＝DalaPhor18-LHRH
47＝Phor18-Lupron
13＝Phor18-LHRH
11＝DalaPhor21-LHRH
12＝Phor18-ASAAS-LHRH
71＝Phor15-βCG-ala
74＝Phor15-C6-βCG-ala
实施例6
该实施例描述了在多种肿瘤细胞系中肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))的体外动力学研究。
标准化疗药物通过DNA嵌入、或微管相互作用相互影响或是信号转导途径的抑制剂。因此，它们的作用机理确定破坏靶细胞需要的时间范围。据报道，阿霉素体外破坏人乳腺癌细胞(如MDA-MB-435S)的动力学为快至4小时，而其他护理治疗标准可能需要更长的时间。破坏癌细胞的作用的最常见的机制是细胞凋亡。作为可逆过程，并且由于多重耐药(MDR)的发生，Pgp泵将药物分子输入MDR癌细胞中的作用，护理治疗标准可能是无效的。
与化疗药物相反，直接膜作用可以在几分钟内破坏癌细胞。膜活性化合物(如阳离子裂解肽)包括Phor18-LHRH(338613)(KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG)。
为了确定细胞毒性的动力学，在表达LHRH靶受体的各种细胞系中在不同的水平下用Phor18-LHRH(338613)与非靶向裂解肽部分Phor18＝CLIP71(338983)比较进行详细的时间过程研究。与其外膜具有高磷脂酸含量的癌细胞系相比，非癌性细胞系的膜是中性的并耐受溶细胞肽。
研究的乳腺癌细胞系是MDA-MB-435S(雌激素受体α阴性)、MCF-7和T47D(雌激素受体α阳性)，卵巢癌细胞系(OVCAR-3和SKOV-3)，前列腺癌(LNCaP)，非恶性乳腺上皮细胞系MCF-10A和小鼠成纤维细胞系NIH：3T3。还评估了LHRH受体靶向在Phor18-LHRH(338613)的效力中起的作用。
以10,000个细胞/孔的密度将细胞接种到96孔板中。通过加入在0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10、50和100μM的浓度的Phor18-LHRH(338613)(APC338613，批号#P080401)或Phor18＝CLIP71(APC338983，批号#W08033C1)48小时之后开始治疗。对照包含USP盐水或0.1％的TritonX-100TM分别作为0和100％细胞死亡的参考。2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、24小时和48小时后通过除去培养基终止孵育。细胞活性通过甲瓒转化测定(MTT测定，(CellTiter96AqueousOne，Promega#G3582)进行评估。在室温下使用BioRadBenchmarkPlus微孔板分光光度计在490/630nm双波长下测定甲瓒转化)。
数据被计算为吸收的分数，以含TritonX-100TM的孔代表100％的细胞死亡，含盐水的孔代表0％细胞死亡。根据用于使用0和100％的约束值的具有可变斜率的S形剂量响应的程序，用美国加利福尼亚圣地亚哥GraphPadSoftware用于Windows的GraphPadPrism版5.01确定细胞毒性为IC50。比较和分析两个96孔板的每个单独的组中的4孔。通过双尾学生T-检验确定统计分析意义。
在MDA-MB435S细胞(p250)中，孵育1小时后Phor18-LHRH(338613)显示出其最大功效，而CLIP71孵育造成随着孵育时间增加，IC50值为100、109、171、145、148、86、54.5、55.1(24小时)和3[μM](48小时)(p<0.005)。相比于未缀合的裂解肽CLIP71(>100μM)，Phor18-LHRH(338613)是快速作用剂(1.2μM0.5小时，在1小时后0.6μM)。
在MCF-7细胞(p152)中，Phor18-LHRH(338613)孵育1小时后显示出其最大功效，而CLIP71孵育造成随着孵育时间增加，IC50值为92、95、50和22[μM](p<0.005)。相比于未缀合的CLIP71，Phor18-LHRH(338613)是快速作用剂(3.4-1.8μM)。
在OVCAR-3细胞(p47)中，Phor18-LHRH(338613)在孵育1小后显示其最大的功效，而未缀合的Phor18＝CLIP71(33)孵育造成随着孵育时间增加，IC50值为337、126、85.5、52.5、22.9和23.1[μM](p<0.005)。Phor18-LHRH(338613)是快速作用剂，随着孵育时间增加，IC50值为6.7、5.6、5.3、1.6、1.5、0.5和0.5[μM](p<0.005)。快速动力学数据表明，Phor18-LHRH(338613)和Phor18通过不同的作用机制杀死细胞，并增强了药物的效力。
在SKOV-3细胞(p40)中，Phor18-LHRH(338613)孵育24小时后显示出其最大功效(11.5μM)，而Phor18孵育造成随着孵育时间增加，IC50值为86、96、53和50[μM](p<0.005)。Phor18-LHRH(338613)不是SKOV-3细胞的合适靶标，因为这些细胞不呈递功能LHRH受体。
用Phor18-LHRH(338613)治疗的呈递功能LHRH受体的所有细胞系，如乳腺癌细胞(MDA-MB-435和MCF-7)和OVCAR-3，证明在孵育0.5-1小时内最大效果(IC50以μM)。与此相反，对于Phor18的最大效果，需要孵育24小时。呈递功能LHRH受体的细胞系(如T47D、LNCaP)得到类似结果。在24小时的孵育后在不呈递功能LHRH受体的细胞系(SKOV-3和HEK1A)中，Phor18-LHRH(338613)和Phor18显示相似的毒性，IC50值分别为10.3，11.8μM。非癌变细胞系3T3对Phor18-LHRH(338613)和Phor18高度耐性，对于Phor18，IC50值>40μM，对于Phor18-LHRH(338613)，IC50值>10μM。
这些结果表明，LHRH靶向性增强Phor18的效力，非癌性细胞系耐受溶细胞阳离子肽的破坏。在少于1小时内Phor18-LHRH(338613)通过受体靶向机制显示在破坏癌细胞中的显著效能。Phor18-LHRH(338613)在几分钟之内就有效并拥有超过标准化疗的优势，依赖于细胞内摄取和干扰代谢途径和增殖机制用于疗效。此外，Phor18-LHRH(338613)能够作用于多重耐药癌细胞。
实施例7
该实施例包括指示肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))体外对乳腺癌细胞的作用的可能机制的数据。
为了证明在体外作用的可能机制，在过表达LHRH受体的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435中进行荧光显微镜研究。简言之，将人乳腺癌细胞(MDA-MB-435，传代#252)接种到培养皿中。在添加EP100之前引入下列标记物：DRAQ5TM(AlexisCorporation)-蓝色-被用于核染色，和施加RedCMXRos(M7512)(MolecularProbes,Inc.OR)用于使完整线粒体可视。细胞膜用小麦胚芽AlexaFluor绿色缀合物(MolecularProbes,Inc.OR)染色。
根据生产商的建议，将细胞首先用Mitotracker染料装载。以10μM的终浓度加入重溶解于盐水的Phor18-LHRH(338613)，并孵育5-10分钟。具有盐水的培养皿只作为对照。除去上清液并准备剩余的细胞进行荧光显微镜成像。
暴露于Phor18-LHRH(338613)之后，呈递功能LHRH受体的MDA-MB-435乳腺癌细胞的体外荧光显微镜评估显示，暴露于Phor18-LHRH(338613)(10μM)5分钟后质膜崩解。这些观察结果表明Phor18-LHRH(338613)破坏了质膜，导致在数分钟之内细胞死亡。
用2μMPhor18-LHRH(338613)FITC孵育30分钟的培养物中的SKOV-3(p41)和MDA-MB-435S(p250)细胞的荧光显微镜评估显示，在SKOV-3细胞中不存在细胞内摄取，没有发生膜出泡，和线粒体染料被保留。与此相反，在MDA-MB-435S细胞中，Phor18-LHRH(338613)FITC的细胞内摄取在30分钟内是可见的，并且大量的膜起泡导致外膜的囊泡形成，以及线粒体染料褪色。这些观察结果表明在数分钟内细胞死亡。
在数分钟之内，Phor18-LHRH(338613)破坏呈递功能LHRH受体的细胞。Phor18-LHRH(338613)通过瓦解外质膜来破坏肿瘤细胞导致坏死。作用机制强烈表明Phor18-LHRH(338613)与呈递功能靶标的细胞的质膜快速相互作用。对LHRH受体是阴性的细胞不是靶标并保持完整。
这些数据显示Phor18-LHRH(338613)作为抗癌药物的高特异性和有效性。Phor18-LHRH(338613)在几分钟之内有效，并拥有超过标准化疗的主要优势，需要细胞内摄取和干扰代谢途径和增殖机制用于疗效。此外，Phor18-LHRH(338613)能够作用于多重耐药的癌细胞。
实施例8
本实施例包括表明肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))在异种移植模型中有效对抗癌症的研究。
在带有下列异种移植物的裸鼠中进行了体内效力研究，作为单一疗法或与标准护理治疗组合疗法：人乳腺癌异种移植物：MDA-MB-435S.luc(皮下)，MCF-7(雌激素受体α阳性)，人卵巢癌异种移植物：OVCAR-3，(皮下)，人前列腺癌异种移植物：PC-3(雄激素受体阴性)。使溶解在盐水中的Phor18-LHRH(338613)(0.02、0.2和2mg/kg)作为单次团注注射物进入侧尾静脉，每周注射一次或两次，持续3周。
Phor18-LHRH(338613)组合疗法是在乳腺癌MCF-7异种移植癌症模型中进行的。
将小鼠在最后一次注射之后一周处死，收集血液用于生化检查，记录肿瘤重量和体重。一部分肿瘤被固定在PBS缓冲的10％福尔马林中用于组织学评估。表7总结了各种体内异种移植物的研究。
表7：异种移植研究
为了在单剂量方案中确定减少MDA-MB-435S异种移植物的重量所需的最小有效剂量，用MDA-MB-435S(传代#249)/基质胶悬浮液(2.4×106细胞/小鼠)注射(皮下)到5周龄远交品系雌性裸小鼠(CharlesRiver)肩胛间区域[Leuschner2006]。Phor18-LHRH(338613)(ID：338613批号#P080401)(0.00002、0.0002、0.002、0.02、0.2和1mg/kg)和未缀合的Phor18＝CLIP71(APC338983，批号#W08033C1)以及LHRH(0.2/0.122mg/kg，([D-Trp6]-LHRH；SigmaL9761，批号#037K1103)在给药前溶于USP盐水。剂量经侧尾静脉以单次静脉内团注给予，每周一次连续3周。
每组由16只小鼠组成，每周一次连续3周注射小鼠。在治疗开始的时间一组16只小鼠被处死，用作为基线。盐水注射作为对照。整个研究期间，每周两次记录肿瘤体积。
肿瘤细胞注射后第16天在肿瘤被建立时开始治疗，并在23天和30天继续。肿瘤细胞注射后第37天对所有剩余小鼠进行尸检。
治疗反应是通过在尸检时的肿瘤重量和肿瘤重量的变化与盐水对照和非靶向的Phor18治疗相比较来确定的。收集原发肿瘤，称重，并用10％的PBS缓冲的福尔马林进行福尔马林固定以制备用于组织学评估。在GraphPadPrizm4中进行数据集统计评估，通过威尔克森符号等级检定计算统计意义。
在盐水对照和用CLIP71加LHRH治疗的小鼠中肿瘤体积和肿瘤的重量增加。相比于盐水对照，在用0.0002mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的小鼠中肿瘤体积和肿瘤重量显著减少。相比于基线，用低至0.002mg/kg剂量的Phor18-LHRH(338613)的治疗显著减少了肿瘤体积和肿瘤重量(p<0.0002)。
对来自用来自治疗的小鼠的苏木精/曙红染色的MDA-MB-435S异种移植的小鼠的肿瘤切片的组织学评估显示在盐水对照中和用Phor18/LHRH治疗的小鼠中有活肿瘤细胞。相比之下，在来自用低至0.0002mg/kg的剂量的Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠的肿瘤中显著坏死是明显的。非靶向阳离子裂解肽Phor18没有降低肿瘤重量或破坏肿瘤组织。
低至0.002mg/kg的Phor18-LHRH(338613)在减少MDA-MB-435S异种移植物的肿瘤重量中非常有效，导致治疗的肿瘤组织坏死。用溶细胞肽的非靶向治疗是无效的。
为了在多次剂量方案中确定减少MDA-MB-435S异种移植物的重量所需的最小有效剂量，如上先前描述的，用MDA-MB-435S(传代#253)/基质胶悬浮液(2.4×106细胞/小鼠)注射(皮下)到8周龄远交品系裸雌性小鼠(CharlesRiver)肩胛间区域。Phor18-LHRH(338613)(ID：338613批号#P080401)(0.002和0.2mg/kg)在给药前溶于USP盐水。在肿瘤细胞接种后第15、16、17、20、21、22、23、27、28、29、30、33、34、35、36、37、38、40、41、42天，剂量经侧尾静脉以单次静脉内团注给予。盐水注射作为对照组。
每个处理组由16只小鼠组成。在整个研究期间，每周两次记录肿瘤体积。在肿瘤细胞注射后第45天进行最终尸检。由于在大多数小鼠中尾静脉闭塞，重新开始注射。在研究终点测定体重、肿瘤重量，并将肿瘤固定在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中。
用Phor18-LHRH(338613)使用多次静脉注射的治疗导致在两种剂量水平肿瘤消退。在两个治疗组中观察到无肿瘤小鼠，在接受0.002mg/kg的组中为6/23和在0.2mg/kg为1/20。剩余的团块通常由基质胶组成。在0.2mg/kg组中有一只小鼠没有响应治疗。
在尾部没有观察到坏死，不存在尾巴发红。在整个研究期间体重没有受到治疗的影响。
在治疗的小鼠中生存率是100％。相比之下，在盐水对照中的8只小鼠在肿瘤细胞注射后第30天(研究终点之前)被处死，因为肿瘤体积超过2500mm3。
多次注射方案中H&E染色的来自用0.002和0.2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠的肿瘤的组织学检查显示在治疗的小鼠中肿瘤细胞的根除。相比之下，盐水对照小鼠中存在活肿瘤细胞。
Phor18-LHRH(338613)破坏肿瘤并显著减少肿瘤重量并延长治疗的小鼠的寿命。所述治疗对体重或器官检查未有任何明显的影响。
实施例9
本实施例包括在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌异种移植模型中肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))的功效研究的描述。
本文描述的体外研究证明了Phor18-LHRH(338613)是快速作用剂，在接触的几分钟内杀死癌细胞。为了确定在靶向治疗的初始阶段Phor18-LHRH(338613)对乳腺癌异种移植物的疗效，单次注射Phor18-LHRH(338613)后，研究了在乳腺癌异种移植模型中通过Phor18-LHRH(338613)破坏细胞的动力学。
简言之，如在实施例10中所描述的，用MDA-MB-435S(传代#249)/基质胶悬浮液(2.4×106细胞/小鼠)注射(皮下)到5周龄远交品系的雌裸性小鼠(CharlesRiver)肩胛间区域。Phor18-LHRH(338613)(ID：338613批号#P080401)(0.2，和2mg/kg)在给药前溶于USP盐水。剂量经侧尾静脉以单次静脉内团注给予。
在用Phor18-LHRH(338613)或盐水治疗后1、2小时和16小时处死小鼠。在研究终点测定体重、肿瘤重量，并将肿瘤固定在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中。
对H&E染色的肿瘤切片的组织学评估显示在用盐水治疗的小鼠中具有多重有丝分裂象的活肿瘤细胞。用Phor18-LHRH(338613)以0.2和2mg/kg两种剂量的治疗显示，在注射后如1小时那么迅速，来自MDA-MB-435S异种移植物的肿瘤被破坏。
早在给药后1小时Phor18-LHRH(338613)就破坏肿瘤，这表明快速作用机制通过坏死导致细胞死亡。这些数据证实，Phor18-LHRH(338613)通过其膜接触到呈递LHRH受体的肿瘤细胞进行作用。
为了确定Phor18-LHRH(338613)对类似于人疾病的卵巢癌异种移植物的效力，进行了单剂量和多剂量研究。在研究中使用呈递功能LHRH受体的OVCAR-3人卵巢癌细胞系的异种移植物模型。OVCAR-3代表缓慢生长的异种移植模型并分泌肿瘤标志物(癌抗原125，或CA125)。它的分泌物可作为治疗反应并且是药物活性的量度。
该异种移植物研究的目的是在卵巢癌模型中测试Phor18-LHRH(338613)，以确定在多重抗药性的缓慢生长的肿瘤模型中单次每周注射Phor18-LHRH(338613)是否在体内有效。简言之，用NIH：OVCAR-3细胞/基质胶悬浮液(4.6×106细胞/鼠)皮下注射5周龄近交系雌性裸小鼠(Harlan-SpragueDawley)。治疗开始于肿瘤细胞注射后第33天肿瘤建立的时候，并在第41和47天继续。3次每周注射的剂量为0.02、0.2和2mg/kg体重，在第33、41和47天，每周一次，为期三周，经由侧尾静脉以单次静脉团注给药。在第52天进行尸检。数据表示为平均值SEM。箭头指示剂量。
治疗组包括盐水对照(N＝10)，Phor18-LHRH(338613)(338613，V09108X1)(0.02(N＝10)，0.2(N＝10)和2mg/kg(N＝9)，)，以及未缀合的Phor18＝CLIP71(APC338983，批号#V04004X1)(2mg/kg(N＝10))，顺铂/CP在盐水中(Calbiochem，目录232120，D0005495，)(10mg/kg，3qd(N＝10)，)，基线(N＝9)。
一组9只带有肿瘤的小鼠在第33天被处死，并作为基线组。肿瘤细胞注射后第51-52天对所有小鼠进行尸检。在研究期间每周两次记录肿瘤体积和体重，以及进行小鼠的整体兽医检查。
原发性肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾被收集，在福尔马林中固定并制备用于组织学评估。在尸检时测量肿瘤重量，肿瘤的一部分在-80℃下被冷冻用于LH/CG和LHRH受体分析测定。
使用用于定量测定卵巢癌抗原CA125的酶联免疫分析(AssaykitGenway,Biotech,Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚，根据制造商目录#40-052-115009，#BC-1013)在尸检时从每个个体小鼠处收集的血清中测定CA125，其作为药物活性的生物标记物。
从福尔马林固定的肿瘤中评估LHRH受体水平。使用在功能上连接到互动显微镜(interactivemicroscope)(AxioImager)的VentanaImageAnalysisSystem(VIAS)附加计算机辅助图像分析系统进行定量免疫过氧化物酶图像分析。用定量Her2/neu受体的包括形态和比色分析的程序进行定量分析。受体状态的结果被报告为细胞的百分比，根据以下标准显示LHRH受体的阳性染色：0无免疫活性，1+：1-25％阳性，2+：26-50％阳性，3+：51-75％阳性细胞。
所有的小鼠组对注射物耐受良好。只有一只小鼠在以2mg/kg的剂量注射Phor18-LHRH(338613)的第一次注射时死亡。死亡是急性事件，是程序操作上的并且不与治疗相关。在其他的治疗组中所有的小鼠存活。注射后10分钟以后没有小鼠由于注射导致死亡。
在用Phor18-LHRH(338613)治疗过程中肿瘤体积减小。与此相反，对于用Phor18、顺铂治疗的小鼠或盐水对照中的小鼠，观察到肿瘤生长。以低至0.2mg/kg体重的浓度的Phor18-LHRH(338613)相比于基线在肿瘤细胞注射后第42天记录的肿瘤体积显示减小(p<0.001)。
测定了在尸检时肿瘤的特性(与基线相比中等肿瘤重量和中等肿瘤重量变化)。相对于盐水对照和未缀合的Phor18＝CLIP71，在以2和0.2mg/kg的剂量的Phor18-LHRH(338613)的组中获得肿瘤重量减轻(p<0.05)。在0.2和2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)的组中发现无肿瘤小鼠。治疗反应测量为与治疗开始相比肿瘤消退，在用Phor18-LHRH(338613)以0.2mg/kg治疗的小鼠中治疗反应最大(p<0.03与基线)。顺铂和未缀合的Phor18＝CLIP71对减轻肿瘤重量无效。
盐水控制、CLIP71和顺铂治疗的小鼠表现出稳定的肿瘤生长。CA125的血清水平对应于肿瘤重量(r2＝0.66)。相对于盐水对照，CA125分泌在Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠中减少，并在用Phor18-LHRH(338613)以0.2和2mg/kg处理的小鼠中最高(p<0.0002)。
从在用0.02mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗后的携带OVCAR-3异种移植物的小鼠中切除的肿瘤的大小相对于盐水对照组减少并且肿瘤坏死。治疗的肿瘤显示LHRH受体水平降低1-2得分点。在用0.02mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的组中用苏木精/曙红染色的肿瘤切片表现显著性坏死。用顺铂或CLIP71治疗的携带异种移植物的小鼠的肿瘤体积、LHRH受体水平没有降低，并在组织学评估后表现出存活的肿瘤细胞。
用Phor18-LHRH(338613)治疗引起肿瘤消退，在血浆中CA125的肿瘤标志物减少，LHRH受体水平降低和卵巢移植物模型坏死。因此，Phor18-LHRH(338613)有效地破坏多重耐药性卵巢癌异种移植物。
为了确定Phor18-LHRH(338613)对前列腺癌异种移植物的疗效，研究了Phor18-LHRH(338613)在快速侵略性增长的异种移植模型中的体内影响。未治疗的PC-3异种移植物造成小鼠中体重显著损失。
简言之，用PC-3细胞/基质胶悬浮液(1×106细胞/鼠)皮下注射6周龄远交品系的裸雄性小鼠(CharlesRiver)。在肿瘤细胞注射后第15天肿瘤建立时，开始治疗，并在第22和29天继续。3次每周注射的剂量为2、0.2和0.02mg/kg体重，以经由侧尾静脉单次静脉团注给予。治疗组包括盐水对照组(N＝12)，Phor18-LHRH(338613)(APC338613批号#V09108X1)(0.002(N＝12)，0.02(N＝12)，0.2(N＝12)和2mg/kg(N＝12)，)，未缀合的Phor18＝CLIP71(338983，批号#V04004X1)(5mg/kg(N＝12)，基线(N＝12)。
一组12只带有肿瘤的小鼠在第15天被处死，并作为基线组。肿瘤细胞注射后第35和36天对所有小鼠进行尸检。在研究期间每周两次记录肿瘤体积和体重，以及进行小鼠的整体兽医检查。
原发性肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾被收集，在福尔马林中固定并制备用于组织学评估。在尸检时测量肿瘤重量，肿瘤的一部分在-80℃下被冷冻用于LH/CG和LHRH受体分析测定。
所有组对注射物耐受良好的，治疗组中的所有小鼠存活。没有小鼠由于注射导致死亡。
在用Phor18-LHRH(338613)以0.002、0.02、0.2和2mg/kg的剂量的治疗过程中，肿瘤体积减小。对于用Phor18治疗的小鼠或在盐水对照组中的小鼠，观察到肿瘤生长。相比于盐水对照组和CLIP71，低至0.002mg/kg体重浓度的Phor18-LHRH(338613)在肿瘤细胞注射之后第22天记录的肿瘤体积显示减小(p<0.001)。肿瘤重量相对于盐水对照组和CLIP-71治理组均显著降低(在所有Phor18-LHRH(338613)治疗组中0.001)。
已知在裸鼠中PC-3异种移植物会导致重量损失。在Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠中，相比于盐水对照组和Phor18注射组，用0.002、0.02,、0.2和2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)治疗的组中肿瘤体积减小。在尸检的平均肿瘤重量相对于盐水对照组和Phor18显著减轻(p<0.001)。对照组中的小鼠是恶病质并且比治疗的小鼠遭受超过10克的重量损失。
Phor18-LHRH(338613)有效阻止在PC-3异种移植物中的肿瘤生长并防止由于肿瘤负荷造成的严重体重下降。未缀合的Phor18-LHRH(338613)是无效的。
总之，上述研究表明肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))在体内有效地破坏乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌异种移植物。Phor18-LHRH(338613)在治疗的小鼠中引起肿瘤坏死，早在注射后1个小时坏死是明显的。Phor18-LHRH(338613)是有效的。Phor18-LHRH(338613)造成LHRH受体水平在治疗后减少，与靶细胞破坏是一致的。
实施例10
本实施例包括β链FSH片段/裂解肽融合构建/缀合物的描述。
内衬在供应前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、睾丸癌和卵巢癌的血管的内皮细胞都表达促卵泡激素(FSH)受体(Radu等人，NEnglJMed,363:1621(2010))。FSH受体暴露于管腔内皮表面，在那里它们可以结合循环的配体。FSH序列和裂解肽(Phor18)的缀合物可以靶向并破坏内衬在肿瘤血管的内皮细胞，从而破坏它的血液供应，导致肿瘤消退。
对于体内筛选，使用由人促卵泡激素的β链的片段组成的三种裂解肽缀合物。序列选自结合FSH受体的片段：hFSH-β-33-53，hFSH-β-81-95和hFSH-β-90-95(Santa-ColomaTA等人，JBiolChem265:5037(1990)；GrassoP等人Endocrinology128:2745(1991)；和AgrisPF，JProteinChem11:495(1992))。
β链的FSH片段的氨基酸序列如下：
hFSH-β-33-53：CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT；
hFSH-β-81-95：QCHCGKCDSDSTDCT；和
hFSH-β-90-95：DSTDCT。
使用标准固相化学方法用Fmoc[Nα-(9-芴甲氧羰基)]将这些肽序列缀合至裂解肽结构域(被称为Phor18，其在C-末端具有序列KFAKFAKKFAKFAKKFAK)，并通过标准反相高压液相色谱(HPLC)纯化。含硫醇的氨基酸存在于肽中，所述裂解混合物被修饰，以包括95％的三氟乙酸、2.5％的水、2.5％的乙二硫醇和1％的三异丙基硅烷。合成的肽缀合物的纯度为>95％。
实施例11
本实施例描述用三种类型和剂量的β-FSH-Phor18-融合构建体(hFSH-β-33-53；hFSH-β-81-95和hFSH-β-90-95)在人前列腺癌(PC-3)的小鼠异种移植模型的体内研究。
用PC-3/基质胶悬浮液(1×106个细胞)皮下注射雄性裸小鼠。在肿瘤细胞注射后第21天，小鼠分成每组8只小鼠的治疗组。第1天开始治疗并在第5、第8、第12、第15和第19天继续。冻干的肽和肽缀合物溶解在盐水中。治疗为：盐水对照，hFSH-β-90-95(1mg/kg)，hFSH-β-81-95(1mg/kg)，hFSH-β-33-53(1mg/kg)，Phor18hFSH-β-90-95(0.1、1和2mg/kg)，Phor18hFSH-β-81-95(0.1、1和2mg/kg)，和Phor18hFSH-β-33-53(0.1、1和2mg/kg)。每周两次注射的剂量以单次团注被给予。
所有组小鼠对注射物耐受良好。治疗组中所有小鼠存活。
肽缀合物注射物和未缀合的hFSH-β序列对原发肿瘤的效果示于图13。在所有对照组和注射未缀合的FSH片段的组中观察到肿瘤体积的时间相关性的增大。当与载体和未缀合的配体肽治疗组相比时，在用Phor18hFSH-β-90-95(P＝0.027)、Phor18hFSH-β-81-95(P＝0.029)和Phor18hFSH-β-33-53(P＝0.134)治疗的小鼠中肿瘤体积维持在显著较低水平。
如按照肿瘤体积来测量，Phor18hFSH-β-90-95、Phor18hFSH-β-81-95和Phor18hFSH-β-33-53的给药抑制前列腺癌细胞的生长(图14)。在Phor18hFSH-β-90-95和Phor18hFSH-β-81-95治疗组中在尸检时肿瘤重量减轻(p<0.05)。以1mg/kg体重的剂量的Phor18hFSH-β-33-53减小肿瘤体积但没有显著性(图15)。Phor18hFSH-β-90-95的最小有效剂量为1mg/kg体重，而Phor18hFSH-β-81-95的最小有效剂量为0.1mg/kg。(图15)。未缀合的hFSH-β-90-95、hFSH-β-81-95或hFSH-β-33-53没有影响的肿瘤体积或肿瘤重量。
任何的这些治疗没有影响体重(图16)。
在血常规(completebloodcounts)或血生化的结果没有差异，表明肝和肾功能检查在对照组和治疗的动物之间没有变化。
使用FSHR抗体323的肿瘤免疫组化分析(NicolaeGhinea，Inserm，法国)显示，在供应对照组小鼠的肿瘤的许多血管中发现FSH受体阳性的内皮细胞，但在用任何FSH-β-片段Phor18缀合物处理的小鼠的肿瘤中存在很少FSH受体阳性的内皮细胞。在这些测试的缀合物中，Phor18hFSH-β-81-95在破坏携带FSH受体的内皮细胞和抑制在裸鼠中的PC-3异种移植物的肿瘤生长方面是最有效的。
实施例12
本实施例描述了在表达癌细胞系的FSH受体上的FSH靶向Phor18缀合物的活性。
除了其他以外，已经在正常前列腺、良性前列腺发育不全(BPH)、前列腺癌(Dirnhofer等人，Prostae35:212(1998)；Ben-Josef等人，J.Urol.161:970(1999)；MarianietalJ.Urol.175:2072(2006)；Mariani等人，J.Urol.175:2072(2006))和卵巢癌(Li等人，Mol.CellEndocrinol.267:26(2007)；Mertens-WalkeretalCancerLett.324:152(2012))中，检测到FSH受体。
FSH-β片段和裂解肽(Phor18)的缀合物被进一步修饰以去除半胱氨酸，并测试以靶向和破坏体外的前列腺癌和子宫肉瘤细胞系。
体外研究包括由人促卵泡激素的β链的片段组成的三个裂解肽缀合物的筛选。序列从hFSH-β-81-95序列修饰(Santa-ColomaT等人，JBiolChem265:5037(1990))。
hFSH-β-81-95(QCHCGKCDSDSTDCT)的氨基酸序列中的四个半胱氨酸被丙氨酸替代，用以有利于合成，在溶液中肽缀合物的均匀性，在非还原条件下通过二硫化物基团形成用单体代替多聚物。
截断hFSH-β链成81-89氨基酸序列使Phor18缀合物的电荷从7+(Phor18-hFSH-β81-95a)增加至9+(Phor18-hFSH-β81-89和Phor18-hFSH-β81-89a)。各缀合物保留了裂解肽缀合物和用于与FSH受体结合所必须的配体结构域中的氨基酸的原始螺旋长度(1-20)。
β链的FSH片段的氨基酸序列如下：
hFSH-β81-95a:QAHAGKADSDSTDAT；
hFSH-β81-89:QCHCGKCDS；和
hFSH-β81-89a:QAHAGKADS。
使用标准固相化学方法用Fmoc[Nα-(9-芴甲氧羰基)]将这些肽序列缀合至裂解肽结构域(Phor18，其具有在C-末端的序列KFAKFAKKFAKFAKKFAK)，通过标准反相高压液相色谱(HPLC)纯化。
实施例13
本实施例描述了三种FSH-β-Phor18缀合物对3种前列腺和一种子宫肉瘤细胞系的体外活性测试。
人前列腺癌细胞系(PC-3(p35)、LNCaP(p22)和DU145(p64))和人子宫肉瘤细胞系MES-SA-Dx5(p58)(多重耐药克隆)在ATCC推荐的培养基，10％胎牛血清、0.01mg/ml牛胰岛素、100IU/ml青霉素、100microg/ml链霉素中生长。细胞典型地接种(每孔2000个细胞)到96孔板，孵育48小时后更换培养基。在增加浓度的0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10和25微摩尔剂量的裂解肽-结合结构域缀合物(N＝6)进行每个测定。将以冻干形式提供的每个裂解肽-结合FSH缀合物溶解在盐水中，并加入到细胞中。在37℃下孵育时间为2小时和24小时。2小时后使用发光分析(PromegaCytotoxGloG607A，批号29753501)测定膜的完整性，发光分析确定从破裂细胞释放的死细胞蛋白酶。24小时后利用发光分析((Promega,CellTiterGlo，G755B，批号31511202)评估细胞活性。含有盐水或0.1％triton的对照分别作为0和100％细胞死亡的参考。
使用用于Windows的GraphPadPrism版本5.00(GraphPadSoftware，加利福尼亚州圣地亚哥)处理并分析数据。通过双尾学生T-检验确定统计分析意义。进行每个研究以达到N为至少6。
对于每种细胞系、时间点和测试的化合物，体外活性表示为IC50值，使用希尔方程(GraphPadPrizm软件)进行计算。
FSH受体水平通过流式细胞仪检测。相对染色水平通过比较背景和信号水平获得。PC-3前列腺癌细胞(p35)针对FSH受体为阴性，MES-SA-Dx5(p58)具有最高染色值9，DU145为5.6和LNCaP细胞具有染色水平3.3。较高的染色水平与对具有在低微摩尔范围的IC50值的FSHPhor18缀合物中的每个有较高的敏感度相关联，(Phor-18-hFSH-β-81-95a的相关系数为r2＝0.9250，Phor-18-hFSH-β-81-89的相关系数为r2＝0.8685，Phor-18-hFSH-β-81-89a的相关系数为r2＝0.9335)。
对于表达FSH受体(Phor-18-hFSH-β81-95a；Phor-18-hFSH-β81-89；Phor-18-hFSH-β81-89a)的前列腺癌细胞系，测量为IC50值的体外活性在中到低微摩尔范围内：LNCaP细胞系在2小时后具有的IC50值为14.6±1.8、7.4±0.6和7.9±0.4μM，24小时后具有的IC50值为10.5±0.5(p<0.0001)、3.9±0.4(p<0.0004，与Phor-18-hFSH-β81-89a对比)和6.3±0.1μM；DU145细胞在2小时后表现出敏感性且具有的IC50值为14.8±0.8、9.7±0.7和11.3±0.3μM，24小时后表现出增加的敏感性且具有的IC50值为10.1±0.3(p<0.0001)，2.7±0.5(p<0.0002，与Phor-18-hFSH-β81-89a对比)和6.2±0.3μM。在具有最高水平的FSH受体的子宫肉瘤细胞系(MES-SA-Dx5)中测出最高的敏感性：2小时后IC50值为2.5±0.6、1.1±0.3和2.0±0.4μM，和24小时后IC50值为2.7±0.3(p<0.0001)、0.47±0.04(p<0.016，与phor-18-hFSH-β81-89a对比)和0.76±0.05μM(表8)。
对于前列腺癌细胞系DU145和LNCaP以及子宫肉瘤细胞系MES-SA-Dx5，Phor-18-hFSH-β81-89和Phor-18-hFSH-β81-89a(p<0.0001；p<0.0001和p<0.0001)相比于Phor-18-hFSH-β81-95a，增加的电荷增强FSH受体阳性细胞系的毒性。在LNCaP、DU145和MES-SA-Dx5的细胞系中，Phor-18-hFSH-β81-89比Phor-18-hFSH-β81-89a活性更强(p<0.0004，p<0.0002和p<0.016)。在DU145、LNCaP和MES-SA-Dx5的细胞系中早在2小时就观察到膜破裂。
这些数据表明，截短的缀合物特异性杀死FSH受体阳性癌细胞。相比于半胱氨酸对应物，丙氨酸替代导致较低的效力，但在低微摩尔范围表现出足够的活性。
表8:FSH-Phor18缀合物的体外活性
实施例14
本实施例显示了细胞杀伤对两种截短的FSH-Phor18缀合物(Phor-18-hFSH-β81-89和Phor-18-hFSH-β81-89a)的FSH受体的特异性。在FSH受体阳性子宫肉瘤细胞系(MES-SA-Dx5)中随增加的FSH的浓度以恒定的剂量测试两种FSH-Phor18缀合物。
来自MES-SA-Dx5(p59)细胞的细胞培养物从指数增长的培养物通过使用2,000细胞/孔将无酶细胞释放在96孔不透明板中来制备。使细胞培养物附着48小时。以0、1、10、25和50μM的剂量加入增加浓度的溶于盐水的FSH(SigmaF4021，人垂体，090M1336)。冻干形式的Phor-18-hFSH-β81-89和Phor-18-hFSH-β81-89a新鲜地溶解在盐水中，并以1μM的最终浓度加入到多孔板中。使用发光测定试剂盒(CellTiterGloG755，Promega，批号31699601)测定在37℃下孵育6小时的细胞活性。包含USP盐水或0.1％的TritonX-100TM的对照分别作为0和100％细胞死亡的参考。使用美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPadSoftware用于Windows的GraphPadPrism版本5.00(www.graphpad.com)处理并分析数据。通过双尾学生T-检验确定统计分析意义。进行每个研究以达到N为至少6。
体外活性相对于盐水对照水平表示为100％。
单独的1μM的Phor18-FSH-81-89和Phor18-FSH-81-89a和在FSH的存在下的相对活性显示出活性的损失，在10μM的浓度下损失显著(p<0.05)。Phor18-FSH-81-89和Phor18-FSH-81-89a特异性靶向在MES-SA-Dx5子宫肉瘤细胞上的FSH受体。
Phor18-FSH-81-89和Phor18-FSH-81-89a特异性靶向在MES-SA-Dx5子宫肉瘤细胞上的FSH受体，具有相似的体外活性。在10μM的FSH的存在下显著抑制活性，在25μM的FSH的存在下完全失效。这些数据表明，Phor18-FSH-81-89和Phor18-FSH-81-89a两者都通过结合FSH受体特异性靶向表达FSH受体的细胞(图17)。
实施例15
本实施例描述了三种FSH-β-Phor18缀合物与未缀合的Phor18相比对两种卵巢癌细胞系、一种胰腺癌症细胞系和一种乳腺癌细胞系的体外活性。
人卵巢癌细胞系OVCAR-3(p41)、SKOV-3(p35)和人子宫肉瘤细胞系MES-SA-Dx5(p61)(多重耐药克隆)，人胰腺癌细胞系Panc-1(传代数18)，和人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(传代数47)在ATCC推荐的培养基，10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100微克/毫升链霉素中生长。细胞典型地接种(每孔2000个细胞)到96孔板中，孵育48小时后更换培养基。以增加的浓度0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10和25微摩尔剂量的裂解肽-结合结构域缀合物和未缀合的Phor18(N＝6)进行每个测定。每个以冻干形式提供的Phor-18-hFSH-β81-89缀合物被溶解在盐水中，并加入到细胞中。在37℃下孵育持续时间为4小时。4小时后使用发光测试(Promega，CellTiterGlo，G755B，批号#00000031421)评估细胞活性。含有盐水或0.1％triton的对照分别作为0和100％细胞死亡的参考。
使用美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPadSoftware的用于Windows的GraphPadPrism版5.00，(www.graphpad.com)处理并分析数据。通过双尾学生T-检验确定统计分析意义。进行每个研究以达到N为至少6。
对于每种细胞系、时间点和测试的化合物，体外活性表示为IC50值，使用希尔方程(GraphPadPrizm软件)进行计算。
对于卵巢癌细胞系OVCAR-3、PANC-1和人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，测量为IC50值的体外活性在中到低微摩尔范围内，在MES-SA-Dx5细胞中，Phor-18-hFSH-β81-89具有最高活性，随后是Phor-18-hFSH-β81-89a。相比于Phor18-hFSH-81-89a，Phor18-hFSH-81-89是显著更有效力(p<0.003)。对于Phor-18-hFSH-β81-95a一致地发现最低活性(p<0.0001)。
在4种不同的细胞系中，相比于Phor-18-hFSH-β81-95A，Phor-18-hFSH-β81-89和Phor-18-hFSH-β81-89a在4小时后体外活性显著更高(表9)。Phor-18-hFSH-β81-89的活性比未缀合的Phor18的活性高3至93倍。
这些数据表明，Phor-18-hFSH-β81-89缀合物特异性杀死FSH受体阳性癌细胞。相比于半胱氨酸对应物(Phor-18-hFSH-β81-89)，丙氨酸的替代(Phor-18-hFSH-β81-89a)导致较低的效力，但相比于Phor-18-hFSH-β81-95a，表现出较优的活性。
表9：FSH-Phor18缀合物相比于未缀合的Phor18的体外活性
显著性水平：*相比于Phor-18-hFSH-β81-95a，#相比于Phor-18-hFSH-β81-89a

Claims (79)

1.一种融合构建体，其包含结合FSH受体的促卵泡激素(FSH)片段和裂解结构域，其中所述FSH片段缀合至所述裂解结构域，并且其中所述裂解结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的肽序列组成，或由选自具有的一个或多个K残基被F或L残基中的任何一个替代的，一个或多个F残基被K、A或L残基中的任何一个替代的，或一个或多个A残基被K、F或L残基中的任何一个替代的KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的肽序列组成。
2.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段是FSHβ链的片段。
3.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段是哺乳动物FSH序列的片段。
4.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段是人FSH序列的片段。
5.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段是如下所示的人FSHβ链序列的片段：Asn-Ser-Cys-Glu-Leu-Thr-Asn-Ile-Thr-Ile-ala-Ile-Glu-Lys-Glu-Glu-Cys-Arg-Phe-Cys-Ile-Ser-Ile-Asn-Thr-Thr-Trp-Cys-ala-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe-Lys-Glu-Leu-Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Arg-Val-Pro-Gly-Cys-ala-His-His-ala-Asp-Ser-Leu-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-ala-Thr-Gln-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr-Cys-Ser-Phe-Gly-Glu-Met-Lys-Glu。
6.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段包括下列片段或者由下列片段组成：FSHβ链氨基酸残基33-53；FSHβ链氨基酸残基81-95；FSHβ链氨基酸残基81-89；FSHβ链氨基酸残基90-95；或FSHβ链氨基酸残基33-53；FSHβ链氨基酸残基81-95；FSHβ链氨基酸残基81-89；或FSHβ链氨基酸残基90-95，其中至少一个C残基被A残基替代。
7.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段包括下列序列或者由下列序列组成：CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT；QAHAGKADSDSTDAT；QCHCGKCDSDSTDCT；QAHAGKADS；QCHCGKCDS或DSTDCT，或者其中至少一个C残基被A残基替代的任何前述的序列。
8.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段包括氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是FSHβ链的约1至10、10至20、15至20、20至30、30至40、40至50、60至70、70至80、80至90、90至100或更多个氨基酸的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述的FSH片段具有线性结构或环状结构。
10.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH受体在细胞上表达。
11.如权利要求10所述的融合构建体，其中所述细胞是过度增殖性细胞。
12.如权利要求10所述的融合构建体，其中所述细胞是乳腺、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、睾丸、肾上腺、脑垂体或子宫内膜细胞。
13.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域或FSH片段由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸：L-氨基酸，D-氨基酸或L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。
14.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是约1至10、10至20、15至20、20至30、30至40、40至50、60至70、70至80、80至90、90至100或更多个氨基酸的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域由约15、16、17、18、19或20个氨基酸的氨基酸序列组成或包含约15、16、17、18、19或20个氨基酸的氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域相对于所述FSH片段定位在NH2-末端。
17.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段相对于所述裂解结构域定位在NH2-末端。
18.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域或所述FSH片段具有一个或多个D-氨基酸。
19.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域在任何K、F或A残基上具有D-氨基酸。
20.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域形成两亲性α-螺旋。
21.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述裂解结构域形成不间断的或中断的PNNPNNP重复基序，其中P是一正电的氨基酸，N是中性氨基酸。
22.如权利要求1所述的融合构建体，其进一步包括第二、第三、第四、第五、第六或第七裂解结构域。
23.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过共价键连接。
24.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过肽连接子连接。
25.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过具有1至25个氨基酸残基的肽连接子序列连接。
26.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过包含一个或多个A、S或G氨基酸残基的肽连接子序列连接。
27.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过肽序列连接，所述肽序列包括以下序列或由以下序列组成：GSGGS或ASAAS。
28.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域通过非肽连接子连接。
29.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述FSH片段和所述裂解结构域是通过直链碳链连接。
30.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体是被分离的或纯化的。
31.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体包含混合物。
32.一种组合物，其包含权利要求1所述的融合构建体。
33.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的融合构建体。
34.一种单位剂量，其包含治疗患有不希望的细胞增殖或细胞增殖性病症的受试者的有效量的根据权利要求1所述的融合构建体。
35.一种单位剂量，其包含治疗患有瘤形成、肿瘤或癌症的受试者的有效量的根据权利要求1所述的融合构建体。
36.一种单位剂量，其包含降低受试者的生育力的有效量的根据权利要求1的融合构建体。
37.一种药盒，其包括根据权利要求1所述的融合构建体和用法说明，用于减少或抑制细胞的增殖，减少或抑制过度增殖细胞的增殖，减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞或癌症细胞的增殖，治疗患有细胞增殖紊乱的受试者，治疗患有瘤形成、肿瘤或癌症的受试者，或降低动物的生育力。
38.一种组合物，其包括根据权利要求1所述的融合构建体和抗细胞增殖剂或免疫刺激剂。
39.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的融合构建体。
40.一种载体，其包含根据权利要求39所述的核酸分子。
41.一种宿主细胞，其用根据权利要求40所述的载体转化。
42.一种细胞，其表达根据权利要求1所述的融合构建体。
43.一种减少或抑制表达FSH受体的细胞的增殖的方法，其包括将所述细胞与足够减少或抑制所述细胞的增殖的量的根据权利要求1所述的融合构建体接触。
44.一种减少或抑制表达FSH受体的过度增殖细胞的增殖的方法，其包括将所述细胞与足够减少或抑制过度增殖细胞的增殖的量的根据权利要求1所述的融合构建体接触。
45.一种减少或抑制赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞增殖的方法，其包括将所述细胞与足够减少或抑制所述赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞的增殖的量的根据权利要求1所述的融合构建体接触。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性细胞表达FSH受体，或赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性肿瘤的脉管表达FSH受体。
47.一种治疗患有细胞增殖紊乱的受试者的方法，其包括给所述受试者施用足以治疗所述细胞增殖紊乱的量的根据权利要求1所述的融合构建体。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞增殖紊乱包括表达FSH受体的细胞。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞增殖紊乱包括瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤或它们的新生血管。
50.一种减少或抑制瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤转移至其它部位，或在原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的远端的其他部位形成或建立转移性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，其包括向受试者施用足以减少或抑制所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤转移至其它部位，或在所述原发性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的远端的其他部位形成或建立转移性瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的量的根据权利要求1所述的融合构建体。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括表达FSH受体的细胞，或其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的脉管系统包括表达FSH受体的细胞。
52.如权利要求49或50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤是转移性、非转移性或良性。
53.如权利要求49或50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包含固体细胞物质。
54.如权利要求49或50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括造血细胞。
55.如权利要求49或50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括癌，肉瘤，淋巴瘤，白血病，腺瘤，腺癌，黑素瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，间皮瘤，网状内皮、淋巴或造血系统瘤形成、肿瘤，癌症或恶性肿瘤。
56.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述肉瘤包括淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤或纤维肉瘤。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述造血系统瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
58.如权利要求49或50所述的方法，其中所述瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括肺、甲状腺、头或颈、鼻咽、喉、鼻或窦、脑、脊柱、乳腺、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴、胃肠(口、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴、血液、肌肉、皮肤的瘤形成、肿瘤、癌症。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述肺瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
60.如权利要求49或50所述的方法，其中所述肺瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤包括干细胞瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤。
61.如权利要求49或50所述的方法，其中所述方法抑制或降低所述肺瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的发展或复发。
62.如权利要求49或50所述的方法，其进一步包括施用抗细胞增殖，抗瘤形成、抗肿瘤、抗癌症或免疫增强的治疗或疗法。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括手术切除、放射疗法、电离或化学放射疗法、化学疗法、免疫疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括施用烷化剂，抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷或核苷酸类似物。
65.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括施用环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮杂胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物、博来霉素、放线菌素D、光辉霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、羟基脲、顺铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉烷、长春碱、长春新碱、阿霉素或二溴甘露醇。
66.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括施用淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞或B-细胞。
67.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括施用抗体、激素、细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子或趋化因子。
68.如权利要求62所述的方法，其中所述治疗或疗法包括施用IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸细胞活化趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1或淋巴细胞趋化因子，利妥昔单抗曲妥单抗贝伐单抗雷珠单抗西妥昔单抗阿仑单抗帕尼单抗帕妥珠单抗替伊莫单抗伊匹单抗托西莫单抗等等，它们尤其可与根据本发明的融合构建体一起使用。适于与所述融合构建体一起使用的其它靶向药物为伊马替尼吉非替尼硼替佐米拉帕替尼舒尼替尼索拉非尼尼罗替尼扎妥木单抗，dalotuzumab，figitumumab，雷莫芦单抗，加利昔单抗，farletuzumab，ocrelizumab，奥法木单抗托西莫单抗，2F2(HuMax-CD20)，7D8，IgM2C6，IgG12C6，11B8，B1，2H7，LT20，1F5或AT80达利珠单抗或抗LHRH受体抗体。
69.如权利要求62所述的方法，其中所述融合构建体在施用所述抗细胞增殖、抗肿瘤形成、抗肿瘤、抗癌或免疫增强治疗或疗法之前、基本上同时或之后施用。
70.如权利要求49或50所述的方法，其中所述受试者已经经历手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或免疫接种。
71.如权利要求49或50所述的方法，其中所述受试者是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或免疫接种的候选者。
72.如权利要求49或50所述的方法，其中所述受试者不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或免疫接种的候选者。
73.如权利要求49或50所述的方法，其中所述治疗导致赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性肿瘤细胞团块、细胞体积、大小或数量部分或完全破坏，刺激、诱导或增强赘生性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞或恶性肿瘤细胞坏死、溶解或凋亡，减少瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的体积大小、细胞团块，抑制或预防瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积、团块、大小或细胞数量的进展或增加，或延长寿命。
74.如权利要求49或50所述的方法，其中所述治疗导致降低或减轻与瘤形成、肿瘤、癌症或恶性肿瘤相关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率。
75.如权利要求49或50所述的方法，其中所述治疗导致降低或减轻疼痛、不适、恶心、虚弱或嗜睡。
76.如权利要求49或50所述的方法，其中所述治疗导致能量、食欲增加，改善活动或心理健康。
77.一种降低动物的生育能力的方法，其包括施予所述动物足以降低生育能力的量的根据权利要求1所述的融合构建体。
78.如权利要求49或50或77所述的方法，其中所述受试者或动物是哺乳动物。
79.如权利要求49或50或77所述的方法，其中所述受试者或动物是人。
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