MX2014000698A - Compuesto de hormona luteinizante (lh) de accion prolongada. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o compuesto de LH el cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo de un agonista de LH administrado de la misma manera que el compuesto LH. La presente invención se relaciona con métodos para estimulación controlada del ovario la cual se puede utilizar junto con tecnologías de reproducción asistida tales como fertilización in vitro, inyección intracitoplasmática de esperma, inseminación intrauterina y maduración in vitro. En otros aspectos, la invención se relaciona con métodos para inducir foliculogénesis y métodos para proporcionar soporte lúteo para el cuerpo lúteo.

Description

COMPUESTO DE HORMONA LUTEINIZANTE (LH) DE ACCION PROLONGADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable y con métodos de preparación y utilización de estos compuestos de LH. Estos compuestos de LH tienen un perfil de acción prolongada y son útiles en procedimientos de tecnología de reproducción asistida, tales como para promover la fertilidad o el tratamiento de infertilidad y para uso en hombres hipogonadales hipogonadotrópicos y en niños con criptorquidismo . La LH modificada presenta un perfil de acción prolongado y son útiles en combinación con hormona estimulante de los folículos (FSH, por sus siglas en inglés) para inducir desarrollo folicular en mujeres anovulatorias o para inducir estimulación controlada de ovario en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto mamífero del género femenino. Además, la presente invención se relaciona con métodos de estimulación controlada de los ovarios lo cual se puede utilizar junto con tecnologías de reproducción asistida tal como fertilización in vitro (IVF, por sus siglas en inglés) , la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI, por sus siglas en inglés), la inseminación Ref. 245635 intrauterina (IUI, por sus siglas en inglés), la maduración in vitro (IVM, por sus siglas en inglés) y la inducción de ovulación. En otros aspectos, la invención se relaciona con métodos para inducir foliculogénesis y métodos para proporcionar soporte lúteo y gestacional al cuerpo lúteo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los procedimientos de tecnología de reproducción asistida (ART, por sus siglas en inglés) habitualmente requieren el tratamiento con gonadotropinas exógenas para estimular el crecimiento y maduración de los folículos del ovario. Cuando se utilizan gonadotropinas para tratar a mujeres anovulatorias , el objetivo es duplicar el ciclo menstrual normal cuando un folículo dominante único madura antes de inducción de ovulación. En contraste, para mujeres que experimentan fertilización in vitro (IVF) , la estimulación controlada de los ovarios (COS, por sus siglas en inglés) se utiliza para estimular el crecimiento y maduración de varios folículos del ovario, lo que proporciona ovocitos múltiples los cuales después se recuperan para uso en los procedimientos de IVF.

En contraste con ART, COS que asegura el desarrollo de folículos múltiples es esencial para obtener la mejor probabilidad posible para que la paciente se embarace. Para obtener crecimiento múltiple de folículos los niveles circulantes de FSH necesitan suprimir el nivel umbral fisiológico que activa el crecimiento de folículos sensibles por un período más prolongado que el período natural de tres a cuatro días. Esto se obtiene por la administración de FSH exógeno o por manipulación de la hipófisis para secretar cantidades aumentadas de FSH y se realiza COS en la manera correcta lo cual puede resultar en la recolección de un exceso de ovocitos maduros para fertilización in vitro (IVF, por sus siglas en inglés) .

Además de estimular el crecimiento folicular, una función importante de FSH es estimular el desarrollo de receptores de LH de células granulosas . Los receptores de LH se expresan de modo constitutivo en las células de la teca que rodean de manera inmediata al folículo y asegura la producción - entre otras sustancias - de andrógenos (es decir, androstenodiona y testosterona) para la conversión en estrégenos en la capa de células granulosas, pero los receptores de LH también tienen funciones importantes en la capa de células granulosas del folículo. Actualmente no se conoce con precisión en que momento los receptores de LH en el desarrollo folicular se expresan sobre las células de granulosa .

En el ciclo menstrual normal, el receptor de LH es activado únicamente por la actividad de LH liberada desde la hipófisis, pero la hCG, la cual esencialmente es una proteína asociada al embarazo, también puede unirse y estimular el receptor de LH. La hCG tiene una vida media más prolongada que LH y la actividad in vivo acumulada de hCG (a partir de dosis iguales de LH hCG en una ampolleta) habitualmente se considera que es 6 a 8 veces mayor que la de LH (Stockman PGW et al. Fértil Steril 1993; 60: 175, Giudece E et al . J Clin Res 2001;4 :27) .

Algunas preparaciones para COS únicamente contienen FSH mientras que otras contienen una combinación de FSH y actividad similar a LH (es decir, ya sea LH o hCG solos o en una mezcla de LH y hCG) . Por ejemplo, Menopur contiene FSH derivada de orina y actividad similar a LH. En estas preparaciones, aproximadamente 95 por ciento de la bioactividad similar a LH mediada por receptor in vivo se deriva de hCG debido a su vida media más prolongada (Van der Hooven H et al. RBM Online 2003; 7:547) . La LH recombinante también está disponible en una forma pura que se agrega para COS (es decir, Luveris, Merck-Serono, Darmstadt, Alemania) . No obstante, la hCG para COS está disponible únicamente en presencia de un producto que contenga FSH y no se comercializa en dosis pequeñas para ser utilizada en relación con COS.

El beneficio clínico de utilizar actividad de LH en relación con COS se ha discutido profundamente durante la década pasada. Aunque muchos meta- análisis han sugerido que la adición de la actividad similar a LH, lo cual en esencia se proporciona por medio de hCG muestran una tasa aumentada de bebé tomada en casa, en comparación con FSH sola pura, este problema aún no ha sido aclarado (Al-Inany HG et al., Reprod Biomed Online. 2008; 16: 81-88, Westergaard LW, Cochrane Datábase Syst Rev 2003 ; 1 :CD003973. , Al-Inany HG et al., Gynecol Endocrinol . 2009;25:372-8). Para complicar el tema, existen diferencias entre el perfil de la isoforma FSH de la FSH utilizada con mayor frecuencia que contiene hCG (es decir, Menopur (hMG altamente purificada que contiene FSH derivada de orina, LH y hCG) ) y la FSH pura (es decir, FSH recombinante , Puregon o Gonal F) . No obstante, no hay duda de que los niveles de LH se pueden reducir por debajo de un límite umbral en el cual la adición de actividad similar a LH puede ser útil y también existe un límite de umbral superior por encima del cual se vuelven evidentes los efectos negativos en el resultado del tratamiento. De este modo, la actividad similar a LH idealmente debe permanecer en un intervalo terapéuticamente estrecho.

LH y CG son muy parecidas. En comparación con LH, CG tiene una extensión glucosilada en la parte C-terminal que se ha demostrado que es importante para prolongar la vida media de CG. La LH y hCG humanas son idénticas en su secuencia en más de 80%. Aunque ambas, LH y hCG se unen y activan el receptor de LH, ambas hormonas existen como una familia de iso-hormonas que difieren en su composición de oligosacáridos . Cada una de las diferentes isoformas afecta el receptor de una manera específica y puede inducir respuestas celulares variables (Burgon PG et al., Endocrinology, 1996 ; 137 : 4827 ; Stanton PG et al., Mol Cell Endocrinol . 1996; 125:133-141.), como también se ha demostrado para las diferentes isoformas de FSH (Barrios-de-Tomasi J, et al. Mol. Cell Endocrinol. 2002; 186:189-98, Yding Andersen C & Ezcurra D, Reproductive Biology Insights 2011:4, 1-10) . De esta manera, los efectos más subyacentes y de ajuste fino de LH y hCG pueden diferir en realidad. Investigaciones recientes presentadas en la conferencia ESHRE en Estocolmo (julio del 2011) muestran que LH actúa mucho más rápido que hCG pero es menos eficiente en general a nivel de receptor (L. Casarini et al., ESHRE Estocolmo 2011-P312, Universita degli Studi di Modena, Italia) . La hCG es una proteína asociada a embarazo la cual es secretada después de la implantación del embrión comenzando aproximadamente 8 días después de la ovulación. La hCG es capaz de estimular el cuerpo lúteo para que permanezca activo y continúe su secreción de progesterona y otras sustancias necesarias para que se establezca el embarazo. Pese al hecho de que los niveles de LH en el momento del ciclo menstrual están presentes en cantidades apreciables, este nivel es insuficiente para estimular el cuerpo lúteo adicionalmente y a menos que la mujer quede embarazada, el cuerpo lúteo regresará, se producirá una hemorragia menstrual y se iniciará un ciclo menstrual nuevo. Aunque esta diferencia entre LH y hCG ha intrigado a la ciencia durante cierto tiempo, ahora se han demostrado que existen cambios en el receptor de LH (LH-R, por sus siglas en inglés) durante la fase lútea. El receptor funcional de longitud completa mantiene su expresión cuando está presente hCG mientras que LH es incapaz de llevar a cabo esto (Dickinson RE et al., Endocrinology 150:2873-2881, 2009). Esto demuestra diferencias en el efecto de LH y hCG durante la fase lútea y esto puede sugerir que LH y hCG también en la fase folicular del ciclo menstrual ejercen efectos diferentes al nivel de receptor .

Ahora se reconoce bien que la expresión de LH-R en células granulosas humanas es suficiente para activar el desarrollo folicular desde un diámetro de aproximadamente 10-12 milímetros y hasta la ovulación con la presencia de FSH únicamente en cantidades permisivas pequeñas en relación con COS (Blockheel et al., 2009; Filicori et al., 1999). Por lo que esta situación recuerda a condiciones del ciclo menstrual natural en el cual los niveles de FSH se atenúan durante la segunda mitad de la fase folicular, mientras que los niveles de LH permanecen esencialmente constantes y se ha demostrado que LH tiene un efecto estimulante muy fuerte sobre la producción de estradiol en células de granulosa de folículos preovulatorios antes de la descarga de gonadotropinas en la mitad del ciclo. La capacidad para proporcionar un ambiente más natural para la maduración final de los folículos probablemente es proporcionar ovocitos que tengan una capacidad incluso mejor para sostener la fertilización, la embriogénesis e implantación y que subsecuentemente resulten en un mejor resultado reproductivo.

Uno de los efectos secundarios más graves de COS es la presentación del síndrome de hiperestimulación de los ovarios (OHSS, por sus siglas en inglés) , la cual es una condición que potencialmente pone en peligro la vida. Investigaciones recientes han demostrado que ahora es posible eliminar casi por completo OHSS mediante el uso de un activador agonista para maduración folicular final (Humaidan P, Kol S, Papanikolaou E; Copenhagen GnRH Agonist Triggering orkshop Group. GnRH agonist for triggering of final oocyte maturation : time for a change of practice? Hum Reprod Update. 2011;17:510-24. PMID : 21450755) sin deteriorar el resultado reproductivo. En combinación con un antagonista de GnRH que regula por disminución la función de la hipófisis, un bolo de un agonista de GnRH es capaz de desplazar al antagonista y provocar una descarga de liberación de gonadotropina la cual después se utiliza como una señal para inducción de ovulación. No obstante, subsecuente a la descarga el agonista provoca regulación por disminución de la hipófisis lo que elimina las señales estimuladoras al ovario. El retiro de estos estímulos también reduce el riesgo de OHSS. No obstante, esta regulación por disminución también tiene un impacto negativo profundo sobre la función del cuerpo lúteo y el resultado reproductivo es inaceptablemente bajo. Así, con el fin de mantener cierta función del cuerpo lúteo se ha intentado exitosamente agregar un bolo de hCG (1500 UI) en el momento de recuperación del ovocito y posteriormente en la fase lútea. De manera alternativa, las inyecciones diarias de LH pueden recuperar la fase lútea y proporcionar un buen resultado reproductivo (A novel method of luteal supplementation with recombinant luteinizing hormone when a gonadotropin-releasing hormone agonist is used instead of human chorionic gonadotropin for ovulation triggering: a randomized prospective proof of concept study. Papanikolaou EG, Verpoest W. Fatemi H, Tarlatzis B. Devroey P, Toumaye H. Fértil Steril, 2011 Mar 1 ; 95 (3) : 1174-7. Epub 2010 Oct 27. PMID: 2097997) .

Pese a los avances recientes en ART, la estimulación de los ovarios a través de gonadotropinas exógenas no es exitosa de manera uniforme debido, en parte, a variación en las respuestas individuales al tratamiento con gonadotropinas. Esta variabilidad complica el manejo del paciente y puede resultar en nacimientos múltiples y complicaciones que potencialmente pongan en peligro la vida. 1 Las gonadotropinas forman una familia de hormonas glucoproteinícas relacionadas estructuralmente . Los miembros comunes incluyen gonadotropina coriónica (CG) , hormona estimulante del folículo (FSH; folitropina) , hormona luteinizante (LH; lutropina) ; y hormona estimulante de la tiroides (TSH; tirotropina) . FSH, LH y TSH están presentes en la mayor parte de las especies vertebradas y se sintetizan y secretan por la hipófisis. Hasta ahora CG se ha encontrado solo en primates, incluyendo humanos y en caballos y se sintetiza por tejido de placenta. FSH y LH son hormonas hipofisiarias esenciales para la maduración folicular y luteinización en las mujeres y para maduración de los testículos y espermatogenésis en el hombre.

Las gonadotropinas se secretan por la hipófisis bajo el control de la hormona liberadora de gonadotropina hipotalámica (GnRH) . La hormona estimulante de los folículos (FSH, por sus siglas en inglés) y la hormona luteinizante (LH, son hormonas hipofisiarias esenciales para maduración folicular (desarrollo folicular) y luteinización. Se requiere FSH para reclutamiento folicular (es decir, el crecimiento temprano de folículos del ovario) al inicio del ciclo menstrual espontáneo y también soporta el desarrollo folicular en etapa media y tardía.

En años recientes preparaciones muy puras de gonadotropinas se han vuelto disponibles mediante el uso de tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Boime et al., Seminars in Reproductive Endocrinology 10, 45-50, 1992: "Expression of recombinant human FSH, LH and CG in mammalian cells"). Las gonadotropinas recombinantes son de calidad constante, es decir, tienen propiedades bioquímicas y biológicas reproducibles . Se han preparado clones genómicos y de ADNc para todas las subunidades y se ha resuelto su estructura primaria. Además, se han transfectado células de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) , con genes de subunidad de gonadotropina humana y se ha demostrado que estas células son capaces de secretar dímeros intactos (por ejemplo, Keene et al (1989), J. Biol, Chem. , 264, 4769-4775; Van Wezenbeek et al (1990), in From clone to Clinic (eds Crommelin D. J. A. and Schellekens H.), 245-251). Se ha demostrado que las características bioquímicas y biológicas de, por ejemplo, FSH recombinante son casi idénticas a las de FSH natural (Mannaerts et al (1991) , Endocrinology, 129, 2623-2630) . Además, se consiguen embarazos después de superovulación controlada de los ovarios utilizando FSH recombinante (Germond et al (1992), Lancet, 339, 1170; Devroey et al (1992), Lancet, 339, 1170-1171).

La gonadotropina también se puede aislar de fuentes naturales, por ejemplo, de orina humana o la gonadotropina se puede preparar de una manera (bio) sintética, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante.

Las gonadotrofinas se utilizan ampliamente en la práctica clínica para tratar a mujeres con anovulación WHO grupo II y WHO grupo I (World Health Organisation Technical Report 514, (1973)). De manera convencional, el desarrollo folicular es inducido por administración de hMG (gonadotrofina menopáusica humana) o u-hFSH (hormona estimulante de folículos humana urinaria) en una dosis de 75-150 Ul/día. Esta dosis se incrementa después de algunos días (habitualmente cinco) por etapas de 75 UI . Es raro exceder 450 Ul/día. Cuando existe por lo menos un folículo que tiene una media de diámetro de por lo menos 18 mm y no mayor de dos folículos que tengan una media de diámetro de por lo menos 16 mm, se administra una dosis alta (por ejemplo, de 5000 UI) de hCG (gonadotrofina coriónica humana) para inducir ovulación. Este "protocolo convencional" se ha utilizado exitosamente durante más de 20 años. No obstante, presenta ciertos riesgos, principalmente en pacientes con ovarios poliquísticos o síndrome de ovario poliquístico (PCOS) .

Estos riesgos incluyen la presentación de OHSS y una incidencia relativamente alta de embarazos múltiples (Schenker et al, Fértil, Steril. 35: 105-123 (1981)). Aunque la mayor parte de embarazos múltiples son gemelos, la inducción de ovulación contribuye a un tercio de los nacimientos múltiples de rango alto en el Reino Unido (Levene et al, Br. J Obstet, Gynacol . 99:607-613 (1992)).

Un monitoreo cuidadoso durante el tratamiento por ultrasonido (US, por sus siglas en inglés) y determinación de estradiol sérico (E2) ha reducido estos riesgos pero no ha sido capaz de evitarlos en todos los pacientes. Estos problemas se relacionan directamente con la dificultar de obtener el crecimiento de un folículo dominante único que genera el desarrollo multifolicular no fisiológico.

Se administra FSH terapéuticamente para inducir desarrollo folicular en mujeres anovulatorias y en mujeres que experimentan COS. En métodos estimuladores ovulatorios traducionales , se administra FSH a través del tratamiento hasta poco antes de que se recuperen los ovocitos. Esta estimulación continua por FSH provoca el desarrollo folicular múltiple y puede, en combinación con un bolo exógeno de hCG, inducir ovulación que genera una condición potencialmente mortal, OHSS . Ahora se ha calculado que COS es mortal en pacientes que de otra manera son sanos en aproximadamente 3 por 100,000 ciclos de estimulación. Una disminución de la dosificación de FSH puede reducir el riesgo de OHSS pero dosificaciones bajas de FSH proporcionan un número inadecuado de folículos y por lo tanto disminuyen las probabilidades de éxito en la reproducción asistida.

La LH funciona durante todas las etapas de un ciclo menstrual normal. La LH estimula las células de la teca del folículo para producir el sustrato de andrógeno el cual se convierte en estrógeno por el sistema aromatasa en las células de granulosa. Durante las etapas tardías de maduración del folículo, aproximadamente 5 a 7 días antes de la ovulación, los folículos de ovario grandes comienzan a expresar receptores de LH en células de granulosa, los cuales vuelven a estos folículos sensibles a LH para maduración y desarrollo continuos. Hillier et al., Mol. Cell Endocrinol . 100:51 (1994), Campbell et al. J. Reprod. Fértil. 117:244 (1999) . Posteriormente, una descarga a mitad del ciclo de LH activa la etapa final de maduración folicular y la ovulación en un ciclo menstrual normal. La ovulación sigue la descarga de LH en la parte media del ciclo en las siguientes 24 a 48 horas. Finalmente, la segunda parte del ciclo menstrual, la fase lútea, LH estimula la producción de estrógeno y progesterona en el cuerpo lúteo del ovario de manera que prepara el útero para implantación y embarazo.

El protocolo de estimulación de ovario, la hCG puede servir como una fuente de actividad de LH debido a que hCG y LH actúan a través del mismo receptor. Filicori et al. Human Reprod. 17:2009 (2002a); Martin et al., Fértil. Steril. 76: 0-49 (2002) . En relación a LH, hCG tiene una vida media más prolongada y por lo tanto es más potente in vivo que LH, aunque la literatura tiende a tratar a hCG y LH como intercambiables. En realidad, la literatura científica generalmente no menciona determinación de la fuente de actividad de LH en preparaciones de gonadotropinas derivadas de modo natural .

La literatura describe la utilización de actividad de LH o dosis bajas de hCG en combinación con FSH durante la estimulación ovulatoria, pero se carece de una guía respecto a las cantidades eficaces y la sincronización de suplementación de la actividad de LH. Por ejemplo, el extracto de Martin et al., Fértil. Steril. 76: 0-49 (2002) describe administrar 2.5 pg de hCG recombinante diariamente (manteniendo niveles de hCG séricos de 1-3 mUI/ml) durante la estimulación ovulatoria. Gordon et al., describen administrar 75 UI de FSH con 0, 1, 25 y 75 UI de actividad de LH. Human Reprod. 12 (Suppl. 1):52 (1997a); ibid. : 53 (1997b).

Los estudios publicados describen administrar actividad de LH, por medio de estimulación, en relaciones de FSH respecto a LH de 150:0, 150:37.5, 150:75 y 150:150. Filicori et al. (2002a). Además, la literatura documenta suplementar la estimulación de FSH con 50 UI de hCG/día (Filicori et al., J. Clin. Endocrinol . & Metabol . 84: 2659 (1999) ) y los protocolos en los cuales se administran 150 UI de FSH durante 7 días, seguido por tratamiento con relaciones de FSH respecto a hCG de 150:0, 50:50, 25:100 y 0:200 (ibid. 87:_1156 (2002c) y documento de E.U.A. 20080108571).

Durante los últimos 10 días se ha diseñado un protocolo nuevo (el "protocolo de dosis baja crónica") y se ha probado con el fin de reducir adicionalmente la incidencia de las complicaciones del tratamiento con gonadotrofina (Seibel et al, Int. J Fértil., 29:338-339 (1984); Buval et al., Fértil. Steril., 52:553-559 (1989); Hamilton-Fairley et al, Human Reprod. 6: 1095-1099 (1991); Sagle et al, Fértil Steril., 55:56-60 (1991); Shoham et al. Fértil Steril., 55:1051-1056 (1991); Meldrum, Fértil Steril., 55: 1039-1040 (1991) ) . Este protocolo comienza con una dosis baja de FSH o hMG (75 Ul/día) y sin ajuste de dosis antes de siete o preferiblemente 14 días de tratamiento. Si se requiere un ajuste de dosis, este se realiza por etapas en aumento de únicamente 37.5 UI . Además, cada incremento subsecuente puede no solo efectuarse después de siete días de tratamiento a una dosis dada. El concepto de este protocolo de dosis baja crónico es encontrar la cantidad umbral de FSH necesaria para promover unifoliculogénesis . Se han publicado hasta ahora resultados alentadores que muestran que esta solución reduce la media de números de folículos preovulatorios , el promedio de nivel de E2 preovulatorio y el tamaño del ovario en la fase lútea media.

No obstante, pese al uso del protocolo de dosis baja crónica, algunos ciclos de tratamiento aún deben ser cancelados debido a una respuesta excesiva (por ejemplo, en donde existen más de 3 folículos con una media de diámetro de 16 ram o mayor) . Además, en una tasa de embarazo múltiple, aunque mejorada claramente en comparación con el protocolo convencional, aún es más alta que en ciclos de concepción espontánea, es decir, 5-10% en ovulación inducida, en oposición a 1.5% en ciclos espontáneos. Esto se debe al hecho de que el desarrollo de un folículo preovulatorio único se obtiene en únicamente aproximadamente dos tercios a tres cuartos de los ciclos inducidos y los folículos que tienen una media de diámetro de 15 mm o menos habitualmente no se consideran cuando se determina el número de folículos preovulatorios en el día de administración de hCG (Buvat et al, Fértil Steril., 52: 553-559 (1989); Hamilton-Fairley et al, Human Reprod. 6: 1095-1099 (1991)). No obstante, no está claro si los folículos con una media de diámetro de 14 a 15 mm, o incluso menores, en el día de administración de hCG ovularán y llevarán a una liberación del ovocito fertilizable sano. De este modo, sería deseable tener mejoras en el tratamiento de desarrollo folicular inducido por FSH en el cual se reduzcan las tasas de embarazo múltiple y la cancelación de ciclo.

El crecimiento de folículo antral es inducido por FSH. Continuamente durante la vida y hasta la menopausia, algunos folículos entran a una fase de crecimiento la cual es interrumpida por regresión y atresia antes de alcanzar la etapa de madurez completa del estado preovulatorio (Hillier, Hum. eprod., 9: 181-191 (1994)). Durante la fase de crecimiento la mayor parte de los folículos deben ser rescatados de atresia, con la condición de que se expongan a una concentración suficiente de FSH. El nivel de FSH necesario par evitar atresia y promover crecimiento adicional de los folículos se denomina el nivel "umbral de FSH" (Brown, Aus. NZJ Obstet. Gynecol . , 18:47-55 (1987). El nivel umbral de FSH varía con el tiempo y, en un punto de tiempo dado, los folículos los cuales actualmente se encuentran en una fase de crecimiento tienen niveles umbral FSH diferentes. Este es el razonamiento sobre el cual se basa el protocolo de "dosis baja crónica". Un incremento progresivo y precautorio en la dosis de FSH se utiliza para encontrar el nivel umbral de un número mínimo de folículos y, con esperanza, alcanzar la mono-ovulación.

Se sabe que LH también contribuye al fenómeno de dominancia de folículo y mono-ovulación. En realidad aunque parte de LH es esencial para la síntesis de E2 durante el desarrollo folicular, existen pruebas de que una exposición excesiva a LH activará la atresia folicular y suprimirá la proliferación de células granulosas. Los folículos en desarrollo por lo tanto parecen tener requerimientos finitos para estimulación por LH, después de lo cual cesa el desarrollo folicular normal. Este es el concepto de "cota superior de LH" (Hillier, Hum. Reprod., 9: 191-191 (1994)).

Se considera que, en un punto de tiempo dado, los folículos los cuales actualmente están en la fase de crecimiento presentarán niveles de cota superior de LH diferentes. Se sugiere que los folículos más maduros son más resistentes a la acción atrética de LH en comparación con los folículos menos maduros .

Se han reportado dos casos de anovulación WHO grupo I tratados por ya sea FSH únicamente o hMG utilizando un protocolo de establecimiento (Glasier et al, Journal of £ndocrinology, 119 A-159 (1988)). El ciclo "únicamente con FSH" tiene un número mucho más grande de folículos maduros que el ciclo hMG, posiblemente soportando un papel de LH en la atresia de folículos secundarios. Posteriormente se publicaron dos estudios comparativos. En un primer estudio cruzado en 10 mujeres hipogonadales hipogodanotróficas , se registró una diferencia notable en términos de niveles preovulatorios de E2 , pero no se reportó la cuenta folicular (Couzinet et al.,. J. Clin. Endocrinol . Metab. 66 552-556 (1988)). Un segundo estudio cruzado en 9 mujeres hipogonadales hipogonadotróficas reportó una media en el número de folículos que tienen una media de diámetro de más de 16 mm en el día de administración de hCG de 2.0 (0.7 en ciclos tratados con hMG y 1.2 en ciclos tratados con FSH (Shoham et al, FertiL Steril., 55: 1051-1056 (1991)). No se encuentra información disponible respecto al número de folículos más pequeños.

Más recientemente se ha publicado los resultados de administración de 150 UI de hFSH (FSH humana) y 75 UI de r-LH (LH humana recombinante) a un paciente único con concentraciones inmensurablemente bajas en suero de FSH, LH y E2 (Hall et al, The Lancet, 344 (8918) : 334-335 (1994)). La administración de r-hLH y r-hFSH provocó que los niveles de E2 aumentaran y el número total de folículos de 10 mm o mayor en diámetro se redujeran, en comparación con la administración de únicamente hFSH. No obstante, el número de folículos grandes permanece suficientemente alto para sugerir una tasa de embarazo múltiple inaceptablemente alta.

Una investigación adicional comparó el efecto de administrar r-hLH (a una dosis de 300 Ul/día o 750 Ul/día) y r-hFSH a mujeres ovulatorias normales después de tratamiento con FSH para estimulación de desarrollo folicular múltiple antes de implantación intrauterina (Sullivan et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84, 228-232, 1999) ) . Los resultados indican que los niveles en suero de E2 se incrementaron en mujeres quienes recibieron LH, aunque no se realizó mediciones del número y tamaño de los folículos y se produjo un embarazo múltiple en el grupo que recibió 750 Ul/día de LH.

La literatura documenta otras composiciones que contienen actividad tanto de FSH como de LH, así como el uso de FSH en combinación con la actividad de LH. Por ejemplo, la solicitud PCT O 00/67778 publicada el 16 de noviembre del 2000 se relaciona con el uso de LH o una cantidad equivalente de hCG en combinación con FSH para inducir desarrollo folicular en mujeres anovulatorias . De manera más particular, la solicitud "778 describe administrar LH o "un análogo biológicamente activo del mismo" en dosis de 100 a 1500 UI por día (página 4, líneas 26 a 29) y en relaciones de FSH : LH que varía de 1:1.5 a 1:20 (id., líneas 16 a 18).

La patente de E.U.A. 5,929,028 se relaciona con formulaciones líquidas que contienen una o más gonadotropinas naturales o recombinantes que incluyen FSH, LH y hCG. La patente '028 describe composiciones suministradas de modo natural de gonadotropina menopáusica humana (hMG) , las cuales tienen actividades de FSH y LH en una relación de aproximadamente 1 : 1 pero no menciona la relación de la actividad de FSH respecto a LH además de la relación de 1:1 de preparaciones comerciales de hMG.

Adicionalmente, existen formulaciones comerciales que contienen tanto FSH como LH. Las preparaciones derivadas humanas están disponibles conteniendo 75 UI de FSH con 75 UI de actividad LH (Pergonal, Humegon, Menogon, Repronex, and Menopur) y 75 UI de FSH con 25 ó 35 UI de actividad de LH (Normegon and Pergogreen) .

No obstante, es una creencia convencional que niveles "excesivo" de LH, aunque sin una definición exacta, resultan en un atresia folicular, supresión de proliferación de células granulosas y luteinización prematura. Véase, de manera general, Filicori, Fértil. Steril. 79: 253 (2003). Aunque investigaciones recientes sugieren otra cosa, persiste la noción en el ámbito de que los niveles de actividad de LH deben estar dentro de cierto intervalo y que niveles inferiores o por encima de la "cota superior de LH" deterioran el desarrollo normal del folículo. Shoham, Fértil. Steril. 70; 1170 (2002).

Resumiendo, existen pruebas publicadas de que suplementación de FSH con actividad de LH durante la inducción de ovulación reduce la duración de tratamiento y la cantidad de gonadotropina utilizada para obtener el desarrollo adecuado del folículo. Filicori et al. (1999), (2002b) . Por otra parte, persiste la creencia de que los niveles de actividad LH "altos" tienen un impacto negativo en el desarrollo del folículo.

Pese a los numerosos avances de los protocolos de COS aún existe la necesidad de mejoramiento adicional y eliminación de la presentación de OHSS, para mejorar las tasas de implantación subsecuentes y mejorar la conveniencia para mujeres que experimentan tratamiento reproductivo asistido así como seguridad.

La creencia que ha guiado el paradigma convencional de estimulación de ovario, el cual involucra la administración de FSH durante la estimulación controlada del ovario. Se considera innecesaria la actividad de LH exógena e incluso perjudicial durante las etapas temprana a media del desarrollo folicular. En consecuencia, los medios tradicionales de estimulación del ovario implican el tratamiento únicamente con FSH, típicamente a 75-300 Ul/día. En este protocolo tradicional, la actividad de LH se administra para inducir ovulación únicamente después de que el folículo alcanza cierta etapa de desarrollo. Solo recientemente se ha administrado actividad de LH durante el tratamiento y la cantidad óptima y sincronización de actividad de LH que es eficaz en este contexto aún se encuentra en discusión.

Con el fin de que los niños desarrollen fertilidad normal, ambos testículos necesitan estar localizados fuera del cuerpo a una temperatura menor que el escroto. Si uno o ambos testículos permanecen a una temperatura corporal por periodos de tiempo prolongado se puede perjudicar la fertilidad y la capacidad de producir células espermáticas funcionales en la vida adulta puede deteriorarse. Con el fin de reducir el impacto negativo en la fertilidad por un testículo que no ha descendido bien, habitualmente se mueve físicamente el escroto a través de una operación o por tratamiento con hormonas por hCG que provocan que uno o varios testículos se muevan hacia el escroto. La hCG estimula la producción de hormonas esteroides testiculares al estimular las células de Leydig para producir andrógenos . No se conoce con precisión el mecanismo exacto de acción de los niveles aumentados de andrógenos para provocar que uno o varios de los testículos se muevan hacia el escroto.

La frecuencia de por lo menos un testículo que no ha descendido entre los niños es de aproximadamente 3% de niños lactantes a término y 30% en prematuros. No obstante, durante el primer año de vida la mayor de los testículos dentro del cuerpo llegan al escroto por si mismos (la mayor parte dentro de tres meses) lo que vuelven la incidencia real de criptorquidismo de aproximadamente 1% en total. El efecto de hCG está bien documentado pero, debido a diferencias en la edad del paciente, protocolos de tratamiento y posible inclusión de testículos retráctiles, se han reportado resultados muy divergentes y no se conoce la eficacia verdadera . Se han reportado numerosos protocolos de dosificación diferentes que varían de 3-15 dosis suministradas dos veces a la semana (10 inyecciones durante 5 semanas es común) . Uno de los procedimientos más comunes prescribe 250 Ul/dosis en lactantes jóvenes, 500 Ul/dosis en niño de 6 años o más jóvenes y 1000 Ul/dosis en individuos más grandes de 6 años de edad.

Los hombres con hipogonadismo hipogonadotrópico presentan incapacidad para llevar a cabo liberación hipofisiaria de las gonadotropinas LH y FSH. Diversos defectos genéticos pueden provocar un defecto en el hipotálamo que resulta en una deficiencia en la liberación de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) lo que a su vez provoca que la hipófisis reduzca la liberación de FSH y LH. Una de estas condiciones es lo que se denomina el síndrome de Kallman que afecta aproximadamente 1:10.000 hombres y 1:50.000 mujeres. Además de afectar la fertilidad, el problema de salud principal tanto para hombres como para mujeres es osteoporosis .

Cuando los niveles de LH son bajos, la producción andrógena en el hombre se reduce y con frecuencia son infértiles y muestran características masculinas reducidas. El tratamiento se enfoca en restaurar las hormonas deficientes. A los hombres se les administra hCG o testosterona . Están disponibles numerosas preparaciones de testosterona diferentes: la utilizada más ampliamente requiere únicamente administración con intervalos mensuales. No obstante, para inducir producción de esperma y fertilidad en estos hombres, se requiere una administración conjunta de hCG, debido a que testosterona administrada exógenamente alcanza los testículos por circulación rara vez alcanza niveles intratesticulares suficientes para provocar producción de esperma. Aparentemente es más eficaz utilizar hCG para estimular la producción de andrógeno testicular suficientemente para inducir la producción de esperma, frecuentemente en combinación con administración de FSH. Dado que la producción de esperma desde la etapa espermatogónica al espermatozoa completamente maduro requiere 60 a 70 días, con frecuencia es un proceso prolongado con inyecciones múltiples de hCG para inicio de la producción de esperma.

SUMARIO DE LA INVENCION Los presentes inventores se han dado cuenta de que una CG o LH de mamífero modificada, por ejemplo CG humana o LH humana, que tiene propiedades agonistas y activa el receptor de LH en un mamífero y proporciona una composición corporal biológica o concentración de la CG o LH de mamífero, por ejemplo la CG humana o LH humana, a) suficiente para inducir a un folículo antral de aproximadamente 5 a 6 mm, por ejemplo desde 10 mm de diámetro hasta 30 mm de diámetro en el cual un ovocito madurante puede finalizar la maduración para estar listo para reanudación de la meiosis, b) suficiente para inducir la producción de andrógeno en un adolescente joven, aproximadamente 1 año después del nacimiento de una descendencia masculina o en la pubertad de sujetos femeninos y masculinos, c) suficiente para soportar la producción de esteroides en hipogonadismo hipogonadotrófico para sujetos femeninos y masculinos, d) suficiente para sostener progesterona en la fase peri-, en la fase ovulatoria y en la fase post-ovulatoria del sujeto mamífero con el objeto de reglar el endometrio y el útero para permitir la implantación de un blastocisto de mamífero, e) suficiente para sostener una progesterona en una fase peri. en la fase ovulatoria y en la fase post-ovulatoria de un sujeto mamífero con el objetivo de preparar el endometrio y el útero para implantación, f) suficiente para inducir la producción de andrógeno en hipogonadismo hipogonadotrópico en hombres con el objetivo de provocar producción de esperma y aumento en la producción de andrógeno, g) suficiente para inducir la producción de andrógeno en niños por criptorquidismo con el objetivo de provocar reubicación de los testículos hacia el escroto, h) suficiente para inducir la producción de progesterona en mujeres con embarazos recurrentes con el objetivo de reducir el riesgo de pérdida del embarazo.

Es importante para mejorar la presente plataforma de los A T (excepto para el inciso b) .

En consecuencia, en un aspecto amplio la presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) biológicamente activo de duración prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o compuesto de LH el cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo del agonista de LH administrado de la misma manera que el compuesto de LH.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o compuesto de LH el cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo de gonadotropina coriónica (CG) endógena.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo, de acción prolongada que comprende una CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, transferrina y un CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 8 a 22 y un polímero.

El agonista de LH puede ser de origen de mamífero y se puede seleccionar de una CG de mamífero tal como CG humana, una CG equina, tal como CG de caballo; o una LH de mamífero tal como una LH humana, LH de vaca, LH de cerdo, LH de caballo, LH de borrego, LH de perro, LH de gato y LH de chivo. El agonista de LH también puede ser un análogo del agonista de LH de mamífero y típicamente el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente del agonista de LH, tal como gonadotropina coriónica u hormona luteinizante , por ejemplo por lo menos 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad o por lo menos 99% de identidad.

El agonista de LH también puede ser de origen no mamífero y se puede seleccionar de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y proteínas.

El agonista de LH está unido a otra molécula, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable y este es un compuesto modificado que en la presente se denomina como un compuesto LH. El agonista de LH se puede unir a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras como se describe en la literatura de la técnica anterior, tal como, sin limitación, acoplamiento químico a través de un enlazante difuncional, tecnológicamente por genes mediante acoplamiento de la parte N-terminal o C-terminal del agonista de LH tal como hCG o hLH, a la molécula farmacéuticamente aceptable tal como albúmina. En particular, la parte N-terminal de albúmina, por ejemplo albúmina humana, se puede acoplar a la parte C-terminal de la cadena alfa de hCG o hLH o a la parte C terminal de la cadena beta de hCG o hLH o la parte C-terminal de albúmina, por ejemplo albúmina humana, se puede acoplar a la parte N terminal de la cadena alfa de hCG o hLH o a la parte N terminal de la cadena beta de hCG o hLH. Una secuencia enlazante se puede insertar entre la albúmina y la cadena hCG o hLH. Las eos cadenas en hCG y/o hLH, es decir, las cadenas alfa y beta, se pueden acoplar uniéndose a través de un péptido enlazante y de esta manera se produce una secuencia polipeptídica la cual a su vez se puede unir, por ejemplo a través de enlace químico o enlace genético a la molécula farmacéuticamente aceptable.

El agonista de LH se puede unir a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante estable o un enlazante más lábil. Se conocen en el ámbito varios enlazantes que incluyen moléculas de PEG bifuncionales (véase, por ejemplo, Paige et al. Pharmaceutical Research, vol . 12, no. 12, 1995), enlazantes hidrolizables (Shechter et al Bioconjugate Chem. 2005, 16, 913-920 and International Journal of Peptide Research and Therapeutics , Vol. 13, Nos. 1-2, Junio del 2007 y WO2009095479) , PDPH y EMCH, véase, por ejemplo en el documento WO 2010092135. En el caso especial en donde la conjugación química (enlace de dos o más moléculas) del agonista de LH tal como hCG a la molécula farmacéuticamente aceptable reducen fuertemente la actividad funcional de LH puede ser preferible utilizar un enlazante más lábil que pueda liberar el agonista de LH funcional.

El agonista de LH puede estar glucosilado en cuyo caso la unión a la molécula farmacéuticamente aceptable puede ser a través de una porción de azúcar, o en la porción de azúcar se puede insertar y utilizar para crear un enlace entre el agonista de LH y la molécula farmacéuticamente aceptable .

El agonista de LH se puede unir a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables o una o más moléculas farmacéuticamente aceptables se pueden unir a uno o más agonistas de LH, típicamente, el agonista de LH se une a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una hCG se une a una albúmina, por ejemplo albúmina humana o albúmina modificada.

Una ventaja adicional del compuesto de LH de la presente invención es que la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una concentración en suero del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para soportar la formación de mantenimiento del cuerpo lúteo/cuerpos lúteos (CL) . Esta ventaja se obtiene cuando se suministra una inyección del compuesto de LH durante la fase folicular del ciclo menstrual en relación con el tratamiento con hormona estimulante de folículos (FSH) , preferiblemente 5-10 días después del inicio del tratamiento con FSH.

Una ventaja adicional del compuesto LH de la presente invención es que la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una concentración del agonista de LH o compuesto de LH para estimular liberación suficiente de progesterona desde CL. Esta ventaja se obtiene después de una inyección del compuesto de LH durante la fase folicular del ciclo menstrual en relación con el tratamiento con FSH, preferiblemente 5 a 10 días después del inicio del tratamiento con FSH o en relación con la inducción de ovulación o en relación con la transferencia de embrión o en algún momento en las fases lútea o gestacional.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el compuesto de LH y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede comprender uno o más compuestos de LH.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un compuesto de LH de la presente invención, para uso en el tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero, tal como tratamiento por tecnologías de reproducción asistida, por ejemplo tratamiento por IVF o ICSI o un descenso incompleto de los testículos o para el uso de o aumento de la producción de esteroides en hipogonadismo hipogonadotrópico . Típicamente, el compuesto de LH es para uso en promover fertilidad de un sujeto mamífero.

La presente invención también se relaciona con un método de tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo el compuesto de LH de la presente invención.

Además, la presente invención se relaciona con un método para promover fertilidad de un sujeto mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo el compuesto de LH de la presente invención.

Además, los presentes inventores se han dado cuenta de que LH modificado de acción prolongado que comprende LH de mamífero o un análogo de la misma unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, por ejemplo LH humana unida, por ejemplo, fusionada a albúmina o fusionada a un fragmento de Fe de un anticuerpo de mamífero o una variante de un fragmento de Fe de un anticuerpo de mamífero o conjugado a un grupo de acilación o PEG, que tiene acción agonista y activa al receptor LH en un mamífero y que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas, típicamente de 4 a 28 horas, tal como 6 a 8 horas en un mamífero. La LH modificada proporcionada en la fase folicular o como soporte de la fase lútea se considera que mejora la seguridad, el resultado del tratamiento y la conveniencia del paciente. Esta LH de mamífero modificada de acción prolongada de la presente invención con la vida media in vivo especificada es particularmente útil en combinación con FSH.

En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de la presente invención y una FSH o molécula que tiene actividad de FSH. La composición farmacéutica puede ser una composición que comprende tanto LH modificada como la FSH de la molécula que tiene actividad de FSH o puede ser un kit de partes que comprende la LH modificada y la FSH o la molécula que tiene actividad de FSH en composiciones separadas, en donde las composiciones se pueden administrar de manera simultánea, secuencial o por separado.

La presente invención también se relaciona con una LH modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, de la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero, para uso en combinación con una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH para uso simultáneo, secuencial o separado para inducir desarrollo folicular tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , un tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o para inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero.

La presente invención también se relaciona con un método para inducir desarrollo folicular tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , un tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una LH modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero, de manera simultánea, secuencial o separada en combinación con una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con la administración de un compuesto de LH durante las primeras 12 semanas de gestación en mujeres con pérdida de embarazo recurrente con el fin de mejorar el resultado de progesterona por la CL y mejorar la tasa de partos de niños.

En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una LH modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero, típicamente de 4 a 28 horas, tal como 6 a 8 horas. Como se establece en lo anterior la LH modificada es particularmente útil en combinación con el tratamiento con FSH.

La LH de mamífero se puede seleccionar de una LH de mamífero tal como LH de primate (por ejemplo de simio o LH de mono) , LH humana y LH de caballo. La LH también puede ser un análogo de LH de mamífero y típicamente el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de la LH tal como por lo menos 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad o por lo menos 99% de identidad.

La LH de mamífero está unida a otra molécula, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable y está LH modificada que en la presente se denomina como una LH modificada. La LH de mamífero puede estar unida a una molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras como se describe en la literatura de la técnica anterior tal como, sin limitación, acoplamiento químico a través de un enlazante bifuncional, tecnológicamente por genes mediante acoplamiento de la parte N-terminal o C-terminal de la LH tal como hLH, a una molécula farmacéuticamente aceptable tal como albúmina. En particular, la parte N-terminal de albúmina, por ejemplo albúmina humana, se puede acoplar a la parte N terminal de la cadena alfa de hLH o a la parte C-terminal de la cadena beta de hLH. Las dos cadenas en hLH, es decir, las cadenas alfa y beta se pueden acoplar juntas a través de un péptido enlazante, y de esta manera se produce una secuencia de polipéptido que a su vez puede estar unida, por ejemplo a través de enlace químico o enlace genético a la molécula farmacéuticamente aceptable.

La LH de mamífero se puede unir a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante estable o un enlazante más lábil. Se conocen en el ámbito diversos enlazantes, que incluyen moléculas de PEG bifuncionales (véase, por ejemplo, Paige et al. Pharmaceutical Research, vol . 12, no. 12, 1995) , enlazantes hidrolizables (Shechter et al Bioconjugate Chem. 2005, 16, 913-920 and International Journal of Peptide Research and Therapeutics , Vol. 13, Nos. 1-2, Junio del 2007 y O2009095479) , PDPH y EMCH, véase, por ejemplo en el documento WO 2010092135. En el caso especial en donde la conjugación química (enlace de dos o más moléculas) de la LH de mamífero tal como hLH a la molécula farmacéuticamente aceptable reducen fuertemente la actividad funcional de LH puede ser preferible utilizar un enlazante más lábil que pueda liberar la LH de mamífero.

La LH de mamífero puede ser glucosilada, en cuyo caso la unión a la molécula farmacéuticamente aceptable puede ser a través de la porción azúcar o la porción azúcar se puede insertar o utilizar para crear un enlace entre el agonista de LH y la molécula farmacéuticamente aceptable.

La LH de mamífero se puede enlazar a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables o una molécula farmacéuticamente aceptable se puede enlazar a una o más LH de mamífero, típicamente, la LH de mamífero se une a una a cinco, tal como una o dos moléculas farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, una hLH se une a una albúmina, por ejemplo albúmina humana o albúmina modificada.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de la presente invención y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender una o más LH modificadas.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para tratamiento reproductivo asistido en un humano del género femenino, el método comprende: a. iniciar la estimulación por administración de FSH en el día del ciclo 1 a 3 de un ciclo menstrual, b. administrar un antagonista de GnRH desde el día 4 a 7 de la estimulación hasta activación de ovulación, c. proporcionar un agonista de LH a la mujer al administrar por lo menos una dosificación de un agonista de LH en el período desde el día 1 a 9 de la estimulación, la dosificación es suficiente para estimular el desarrollo del folículo hasta activación de ovulación, d. suspender la administración de FSH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de 12 a 14 mm, e. inducir la ovulación con por lo menos una dosificación de un agonista de GnRH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 15 mm.

Los protocolos de estimulación de la presente invención buscan mejorar los métodos conocidos para suspender la administración de FSH cuando se han reclutado un número adecuado de folículos y al cambiar en este punto a administración de hCG (o LH) con el fin de asegurar la maduración de los folículos más grandes, mientras que los folículos más inmaduros no se desarrollan más. Se conoce en el ámbito que un número grande de folículos inmaduros en la ovulación aumentan el riesgo de OHSS .

El riesgo de OHSS se reduce aún más al inducir ovulación mediante el uso de un disparo de activador de agonista de GnRH y de esta manera se elimina la necesidad de administrar una dosificación alta de hCG para inducir ovulación.

En modalidades preferidas de la invención, la hCG administrada durante la estimulación folicular es una hCG de acción prolongada o LH de acción prolongada. El uso de hCG o LH de acción prolongada tiene varias ventajas. Evidentemente existe un cumplimiento aumentado por parte del paciente conforme se reduce el número de inyecciones. También se espera que esto pueda reducir el riesgo de OHSS aún más, dado que no hay riesgo de acumulación de hCG o LH cuando la proteína se administra solo una vez o dos veces durante la fase folicular.

También es concebible que hCG o LH de acción prolongada se puede administrar como una dosis única durante uno de los primeros días del protocolo de estimulación. Cuando se realiza una inyección en bolo de un fármaco, tal como una proteína recombinante , existe casi siempre una descarga inicial en el nivel de suero después de los cual el nivel de suero disminuye a un nivel menor el cual disminuye de manera estable de acuerdo con la vida media en suero del fármaco. Durante los días iniciales del protocolo de estimulación el receptor para hCG o LH aún no está activo sobre las células granulosas mientras que se expresa constitutivamente en las células circundantes de la teca. La actividad de LH proporcionada en esta etapa de desarrollo folicular es probable que incremente la salida de andrógeno por las células de la teca. Estos andrógenos probablemente afecten las células granulosas para incrementar su expresión de receptor de FSH y de esta manera las vuelve más sensibles a FSH administrada de manera exógena y de esta manera mejoran la salud folicular (Eilso Nielsen M, Rasmussen IA, Kristensen SG, Christensen ST, ollgárd K, reford Andersen E. Byskov AG, Yding Andersen C: Expression of Androgen-receptor mRNA in granulosa cells from human small antral follicles and the corresponding follicular fluid concentrations of androgens are positively correlated to granulosa cell FSH receptor mRNA expression. Mol. Hum. Reprod. 2011 ; 17_63-70 , PMID : 20843821). Esto significa que la descarga que resulte de una inyección en bolo de hCG puede mejorar la capacidad de respuesta de las células granulosas y puede finalizarse antes de que el receptor se vuelva activo sobre las células granulosas. Posteriormente se puede obtener un nivel en suero más adecuado y estable de hCG para maduración y desarrollo de los folículos correctos.

En algunas modalidades de la invención, la hCG o LH de acción prolongada administrada durante la fase de estimulación es suficiente solo para soportar el desarrollo del folículo hasta la ovulación. En otras modalidades, la dosificación también es suficiente para proporcionar soporte para la fase lútea de acuerdo con la invención.

En un protocolo alternativo, la inducción de ovulación se lleva a cabo al administrar una dosificación relativamente baja de hCG, la dosificación es de 2000 UI o menos, tal como 1500 UI o menos, por ejemplo 1000 UI o menos, tal como 750 UI , 500 UI o 200 UI . Preferiblemente, la dosificación está en 3000 y 2000 UI . La inducción de ovulación también puede involucrar la administración conjunta de un agonista de GnRH. Este protocolo alternativo también representa un riesgo inherentemente bajo de OHSS debido a que la dosificación de hCG para inducción de ovulación es significativamente menor que la dosificación utilizada para inducción de ovulación en la técnica anterior.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para proporcionar soporte lúteo a una mujer que está recibiendo tratamiento reproductivo asistido, el método comprende administrar un agonista de LH durante la fase lútea por lo menos hasta dos semanas después de la ovulación.

De acuerdo con este aspecto, el agonista de LH se administra desde aproximadamente el momento de ovulación o toma del ovocito y continúa durante la fase lútea. Preferiblemente, la administración del agonista de LH continúa hasta por lo menos 28 días después de la ovulación.

Preferiblemente, el agonista de LH que es administrado durante la fase lútea es LH o un análogo de LH o una variante de LH, como se describe en la presente.

Las hormonas LH y hCG así como versiones de acción prolongada de estas se pueden administrar en dosificaciones y en intervalos como se describen en la presente solicitud. La mujer puede ser una persona quien ha experimentado terapia reproductiva asistida de acuerdo con la invención. La mujer también puede ser una mujer quien ha experimentado estimulación controlada de los ovarios de acuerdo con la técnica anterior, que incluye mujeres quienes han recibido una inyección en bolo de hCG para activación de ovulación. Estas mujeres tendrán niveles séricos suficientes de hCG para proporcionar soporte lúteo durante aproximadamente una semana después de activación de ovulación.

En modalidades preferidas, el agonista de LH se administra hasta por lo menos 6 semanas después de la ovulación, tal como 7 semanas, por ejemplo 8 semanas, tal como 9 semanas, por ejemplo 10 semanas después de la fertilización.

La hCG de acción prolongada o la LH de acción prolongada se pueden administrar cada segundo día, por ejemplo cada tercer día, por ejemplo cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día tal como cada noveno día, por ejemplo cada décimo día durante la fase de inducción de ovulación y/o la fase lútea y/o la fase gestacional .

La hCG de acción prolongada o la LH de acción prolongada también se pueden administrar cada 14 días, por ejemplo cada 21 días, por ejemplo cada mes o incluso de manera menos frecuente durante la fase de inducción de ovulación y/o la fase lútea subsecuente y/o la fase gestacional subsecuente.

Los métodos de estimulación controlada de ovarios de la presente invención generalmente resultan en mejoramiento que involucra uno o más de los siguientes parámetros: embarazos bioquímicos, nacimientos con producto vivo, tasas de implantación mejoradas, tasas de retención mejoradas, tasas reducidas de partos a mal término, tasas reducidas de mal término ectópico, presentación reducida de OHSS y conveniencia mejorada debido a una necesidad reducida o nulificada de administración de progesterona en la fase lútea.

Los protocolos de estimulación folicular de la presente invención se pueden utilizar junto con fertilización in vitro (IVF), a través de inyección citoplasmática de esperma (ICSI) , inseminación intrauterina (IUI), maduración in vitro (IVM) u otras formas derivadas de las mismas tales como ovulación de ovario solo.

Los métodos para proporcionar soporte lúteo se pueden utilizar junto con cualquiera de los protocolos de estimulación mencionados en lo anterior o junto con cualquier embarazo intentado o embarazo real en la cual exista la necesidad de estimular el nivel de progesterona.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método para inducir foliculogénesis y soportar la implantación subsecuente del embrión, que comprende: a. iniciar la estimulación por administración de FSH en el día del ciclo 1 a 3 de un ciclo menstrual, b. administrar un antagonista de GnRH desde el día 4 a 7 de la estimulación hasta ovulación, c. administrar un agonista de LH al administrar por lo menos una dosificación de hCG en el período desde los días 1 a 9, por lo menos una dosificación de hCG es suficiente para estimular el desarrollo del folículo hasta ovulación, d. suspender la administración de FSH cuando por lo menos un folículo tiene una media de diámetro de 12 a 14 mm, y e. proporcionar soporte lúteo al administrar una o más dosificaciones de un agonista de LH suficiente para proporcionar una concentración sérica de progesterona de por lo menos 20 nmoles/1 durante 7 a 10 días después de la ovulación .

Este método puede resultar en monofoliculogénesis o paucifoliculogénesis . El método también puede ser utilizado para estimulación de desarrollo del folículo en mujeres anovulatorias . El método también puede involucrar inducción de ovulación utilizando un disparo de activador de hCG o un disparo de activador de GnRH como parte de un protocolo de COS .

Un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un compuesto de LH a niños con el fin de proporcionar una concentración estable de andrógenos y reducir el número de inyecciones suministradas en estos niños j óvenes .

Un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un compuesto de LH a hombres con hipogonadismo hipogonadotrópico con el fin de proporcionar una concentración estable de hCG que pueda provocar producción de andrógeno testicular suficiente para provocar producción de esperma y mantener androgenos en un nivel aceptable.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura la es una figura esquemática de un protocolo de antagonista corto típico con activación con hCG/GnRHa, como se conoce en la técnica anterior. La figura muestra esquemáticamente la administración diaria de FSH desde el día 1 del ciclo menstrual hasta la activación de ovulación. Una dosis diaria de antagonista de GnRH se administra comenzando aproximadamente en el día 6 y hasta la activación de ovulación. La ovulación se activa por un disparo en bolo de agonista de hCG o GnRH cuando los folículos han alcanzado un tamaño de 16 a 18 mm de diámetro. A las 36 h después se recolectan los ovocitos. Dos días después, uno o más embriones fertilizados se transfieren de regreso al útero. Con el fin de proporcionar soporte lúteo se administra progesterona, por ejemplo, marginalmente o intramuscularmente .

La figura Ib es una figura esquemática de un protocolo antagonista corto alternativo con activación del agonista hCG/GnRH. El protocolo se basa en la administración de FSH (corifolitropina) de acción prolongada en el día 1 del protocolo. Desde el día 6 ó 7 y en adelante se administran dosificaciones diarias de FSH recombinante o urinaria para suplementar la corifolitropina . El antagonista de GnRH, de activación y soporte lúteo es como en la figura la.

La figura 2a es un protocolo COS ejemplar de la invención en donde las dosificaciones diarias de FSH se sustituyen por una inyección en bolo de una FSH de acción prolongada, tal como corifolitropina . El desarrollo del folículo es soportado por la administración de hCG de acción prolongada (S-hCG) , la cual se administra aproximadamente en el día 6 dependiendo del diámetro del folículo. Se administra un antagonista de GnRH desde aproximadamente el día 6 del protocolo y se induce ovulación con un agonista de GnRH. El soporte lúteo se puede proporcionar por progesterona o mediante el uso de métodos lúteos de la invención (figura 4a o figura 4b) .

La figura 2b es una ilustración esquemática de un protocolo de estimulación controlada de ovario (COS) de ejemplar de acuerdo con la invención. Se administra FSH como dosificaciones diarias de FSH urinaria o recombinante. Se suspende la administración de FSH desde aproximadamente el día 6, lo que corresponde a un tamaño de folículo de aproximadamente 12 a 14 mm. Se administra un antagonista de GnRH como dosificaciones diarias, comenzando el día 6 y hasta activación de ovulación. En el día 6 se administra un disparo en bolo de hCG de acción prolongada (de larga duración) o LH de acción prolongada. Se activa la ovulación por administración de un agonista de GnRH. No se muestra el soporte lúteo y se puede obtener por administración de progesterona como en la figura la o a través de la administración de una o más inyecciones subcutáneas de hCG o hCG o LH de acción prolongada o LH de acción prolongada durante la fase lútea.

La figura 2c es un protocolo COS ejemplar de la invención, en donde el reclutamiento de folículo está soportado por dosificaciones diarias de FSH recombinante o urinaria. El desarrollo del folículo está soportado por dosificaciones diarias de hCG o LH desde aproximadamente el día 6, que corresponde a un tamaño de folículo de aproximadamente 12 a 14 mm. Se administra un antagonista de GnRH como dosificaciones diarias, comenzando el día 6 y hasta activación de ovulación. La ovulación se activa por administración de un agonista de GnRH. No se muestra el soporte lúteo y se puede obtener por administración de progesterona, como en la figura la o mediante la administración de una o más inyecciones subcutáneas de hCG o hCG de acción prolongada o LH o LH de acción prolongada durante la fase lútea. En caso de embarazo, el soporte lúteo puede continuar hasta la semana gestacional 5 a 10.

La figura 3a es un protocolo COS ejemplar de la invención. En comparación con el protocolo en la figura 2b, la administración de hCG de acción prolongada (larga duración) o LH continúa dentro de la fase lútea para proporcionar soporte lúteo. En caso de embarazo, el soporte lúteo se puede continuar hasta la semana gestacional 5 a 10.

La figura 3b es un protocolo COS ejemplar de la invención. En comparación con el protocolo en la figura 3a, la hCG o LH se administra como inyecciones diarias de hCG o LH recombinantes o urinarias. La hCG puede ser sustituida por dosificaciones de LH equivalentes. En caso de embarazo, el soporte lúteo puede continuar hasta la semana gestacional 5 a 10.

La figura 3c es un protocolo de COS ejemplar de la invención. En comparación con el protocolo de la figura 3b, la administración de hCG/LH comienza de antemano desde el día 2 del ciclo menstrual como inyecciones diarias de hCG o LH . De manera alternativa, las dosificaciones diarias pueden ser sustituidas por dosificaciones equivalentes de una o más inyecciones de hCG de acción prolongada o LH de acción prolongada. En caso de embarazo, el soporte lúteo puede continuar hasta la semana gestacional 5 a 10.

La figura 4a es un protocolo ejemplar de la invención que ilustra el soporte lúteo. Sin considerar el protocolo de estimulación (no mostrado) , las dosificaciones diarias de la forma urinaria o recombinante de LH o hCG proporciona el soporte lúteo durante la fase lútea comenzando aproximadamente en el día 2 después de la ovulación. El soporte lúteo puede continuar hasta la semana gestacional 5 si la mujer está embarazada, por ejemplo hasta la semana gestacional 10.

La figura 4b es un protocolo ejemplar de la invención que ilustra soporte lúteo. Sin considerar el protocolo de estimulación (no mostrado) , una o más dosis de LH de acción prolongada o hCG de acción prolongada administradas cada 2 a 7 días proporcionan soporte lúteo durante la fase lútea comenzando aproximadamente en el día 2 después de la ovulación. El soporte lúteo puede continuar hasta la semana gestacional 5 si la mujer está embarazada, por ejemplo hasta la semana gestacional 10.

La figura 5 es una alineación ClustalX2 de cadenas de gonadotropina alfa de diferentes especies. Las secuencias se recuperaron de la base de datos Uniprot . Se proporcionan la ID de Uniprot y el número de acceso: Humano GLHA_HUMAN P01215 De ratón GLHA_MOUSE P01216 De rata GLHA_RAT P11962 Los residuos conservados de manera completa están marcados con fondo negro y el residuo aminoácido correspondiente se muestra en mayúsculas debajo de la alineación .

Los residuos semiconservados se muestran con fondo gris y están marcados con minúsculas debajo de la alineación.

La alineación se realizó con ClustalX2 (Larkin, M.A. , Blackshields , G., Brown, N.P., Chenna, R. , McGettigan, P.A., cWilliam, H., Valentín, F. , Wallace, I.M., Wilm, A., López, R. , Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G. (2007) Clustal W y Clustal X versión 2.0, Bioinformatics , 23:2947-2948) .

La figura 6 es una alineación ClustalX2 de cadenas beta de hormona luteinizante de diversas especies: Las secuencias se recuperaron de la base de datos Uniprot . Se proporciona la ID Uniprot y el número de acceso Humano LSHB_HUMA P01229 De ratón: LSHB_MOUSE 009108 De rata: LSHB_RAT P01230 De Gorila: LSHB_G0RG0 Q2Q1P1 De chimpancé: LSHB_PA TR Q2A1P2 La figura 7 es una alineación ClustalX2 de cadenas beta de hormona estimulante de folículos de diversas especies. Las secuencias se recuperaron de la base de datos Uniprot. Se proporciona la ID de Uniprot y el número de acceso: Subunidad beta de folitropina Humana : FSHB HUMAN P01225 De ratón: FSNB MOUSE Q60687 De rata: FSHB RAT P18427 De Gorila: FSHB GORGO A1BN60 Chimpancé FSHB PANTR Q2PUH2 La figura 8a es SDS PAGE no reductor del conjugado 1 con rHA y hCG como controles .

La figura 8b es SDS PAGE reductor del conjugado 1 con rHA y concentraciones diferentes de hCG como controles.

La figura 8c muestra el análisis por SEC-CLAR del conjugado 1 purificado.

La figura 9a muestra SDS PAGE no reductor del conjugado 3 con rHA y hCG como controles.

La figura 9b muestra el SDS PAGE reductor del conjugado 3 con rHA y concentraciones diferentes de hCG como controles .

La figura 9c muestra el análisis por SEC-CLAR del conjugado 3 purificado.

La figura 10a muestra el SDS PAGE no reductor del conjugado 4 con rHA y hCG como controles.

La figura 10b muestra el SDS PAGE reductor del conjugado 4 con rHA y concentraciones diferentes de hCG como controles .

La figura 10c muestra el análisis por SEC-CLAR del conjugado 4 purificado.

La figura lia muestra el SDS PAGE no reductor del conjugado 3V1 con K473P-rHA y hCG como controles.

La figura 11b muestra el SDS PAGE reductor del conjugado 3V1 con K573P-rHA y concentraciones diferentes de hCG como controles .

La figura 11c muestra el análisis por SEC-CLAR del conjugado 3V1 purificado.

La figura 12a muestra el SDS PAGE no reductor del conjugado 4V1 con K573P-rHA y hCG como controles.

La figura 12b muestra el SDS PAGE reductor del conjugado 4V1 con K573P-rHA y concentraciones diferentes de hCG como controles .

La figura 12c muestra el análisis por SEC-CLAR del conjugado 4V1 purificado.

La figura 13 es una confirmación de los vectores de gen único amplificados antes de la transfección.

La figura 14 muestra la transferencia Western de los productos 1 a 10 utilizando anti-HSA (albúmina sérica humana) .

La figura 15 muestra la transferencia Western de los productos 1 a 10 utilizando anti-subunidad o¡ común de gonadotropina .

La figura 16 muestra la transferencia Western de los productos 1 a 10 utilizando anti-subunidad ß de hCG.

La figura 17 muestra el análisis por SDS PAGE (no reductor y reductor) de los productos 1 a 10.

La figura 18 muestra el análisis SDS PAGE (no reductor y reductor) de los productos 11 a 12.

La figura 19a muestra la medición de actividad in vitro de hCG, conjugado 3 y conjugado 4.

La figura 19b muestra la medición de actividad in vitro de hCG, conjugado 3vi, conjugado 4V1, producto 11 y producto 12.

La figura 19c muestra la medición de actividad in vitro de hCG, producto 2, producto 3, producto 4 y producto 5.

La figura 19d muestra la medición de actividad in vitro de hCG, producto 7, producto 8, producto 9 y producto 10.

La figura 20a muestra la medición de actividad in vitro de hCG después de cuatro dosis diarias.

La figura 20b muestra la medición de actividad in vivo de hCG y conjugado 3 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20c muestra la medición de actividad in vivo de hCG y conjugado 3 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20d muestra la medición de actividad in vivo de hCG, conjugado 3 y conjugado 4 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20e muestra la medición de actividad in vivo de hCG, conjugado 3vl y conjugado 4V1 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20f muestra la medición de actividad in vivo de hCG, producto 2, producto 3 y producto 8 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20g muestra la medición de actividad in vivo de hCG, producto 11 y producto 12 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20h muestra la medición de actividad in vivo de hCG, producto 4, producto 5 y producto 10 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20i muestra la medición de actividad in vivo de hCG y producto 7 después de cuatro dosis diarias.

La figura 20j muestra la medición de actividad in vivo de hCG, conjugado 3, producto 11 y producto 12 después de una inyección en bolo único en el día 1.

La figura 21a muestra datos farmacocinéticos de hCG, conjugado 3 y conjugado 3VI en ratas macho hipofisectomizadas (escala lineal) .

La figura 21b muestra datos farmacocinéticos de hCG, conjugado 3 y conjugado 3VI en ratas macho hipofisectomizadas (escala logarítmica) .

La figura 21c muestra curvas estándar de hCG, conjugado 3 y conjugado 3VI .

La figura 21d muestra el cálculo de la vida media terminal para hCG, conjugado 3 y conjugado 3VI en ratas macho hipofisectomizadas .

La figura 22a muestra datos farmacocinéticos de hCG, conjugado 4V1, producto 11 y producto 12 en ratas macho hipofisectomizadas (escala lineal) .

La figura 22b muestra datos farmacocinéticos de hCG, conjugado 4V1, producto 11 y producto 12 en ratas macho hipofisectomizadas (escala logarítmica) .

La figura 22c muestra curvas estándar de hCG, conjugado 4V1, producto 11 y producto 12.

La figura 22d muestra el cálculo de la vida media terminal para hCG, conjugado 4V1, producto 11 y producto 12 en ratas macho hipofisectomizadas .

La figura 22e muestra datos farmacocinéticos del producto 7 y el producto 10 en ratas macho hipofisectomizadas (escala lineal) .

La figura 22f muestra datos farmacocinéticos del producto 7 y el producto 10 en ratas macho hipofisectomizadas (escala logarítmica) .

La figura 22g muestra curvas estándar del producto 7 y del producto 10.

La figura 22h muestra el cálculo de la vida media terminal para el producto 7 y el producto 10 en ratas macho hipofisectomizadas .

La figura 23a muestra datos farmacocinéticos de hCG, LH, conjugado 3, conjugado 3VI, producto 2, producto 3 y producto 7 en ratas macho adulto normales (escala lineal) .

La figura 23b muestra datos farmacocinéticos de hCG, LH, conjugado 3, conjugado 3VI, producto 2, producto 3 y producto 7 en ratas macho adulto normales (escala logarítmica) .

La figura 23c muestra curvas estándar de LH y el producto 7.

La figura 23d muestra el cálculo de la vida media terminal para hCG, LH, conjugado 3, conjugado 3 I, producto 2, producto 3 y producto 7 en ratas macho adulto normales.

DEFINICIONES En el presente contexto, el término "agonista de LH, como se utiliza en la presente significa una molécula de origen de mamífero o diferente de mamífero que se une y que activa un receptor de hormona luteinizante de un mamífero, tal como un humano, el agonista de LH puede ser una molécula orgánica pequeña, un péptido, un polipéptido, una proteína y se puede producir por métodos de síntesis, por medios recombinantes o se puede obtener del tejido o fluidos corporales. El término "agonista de LH", como se utiliza en la presente también incluye sales farmacéuticamente aceptables del mismo. El término "agonista de LH" incluye hLH, análogos y variantes de hLH y hLH de acción prolongada. El término también incluye hCG, análogos de hCG y variantes, y hCG de acción prolongada.

De la manera en que se utiliza en la presente, una "relación UI " es la relación del número de UI de un componente respecto al número de UI de otro componente. Es digno de notarse que las gonadotropinas pueden ahora expresarse en (masa/g) en vez de UI biológica. En este caso, se debe utilizar un factor de conversión para convertir el valor nuevo en UI . De la manera en que se utiliza en la presente, la concentración plasmática in vivo en un mamífero se mide por ELISA u otro método inmunológico conocido por las personas expertas en el ámbito y que se expresa en UI por litro utilizado de manera intercambiable con Ul/1.

En el presente contexto, el término "un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada" o "un compuesto de LH" (estos términos se utilizan de manera intercambiable en la especificación) , como se utiliza en la presente significa un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, tal como una hCG o hLH con la molécula farmacéuticamente aceptable unida al mismo con el fin de modificar las propiedades de la hCG o hLH. El término "compuesto de LH" , como se utiliza en la presente también incluye sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En el presente contexto, el término "una hormona luteinizante modificada" o "LH modificada" (estos términos se utilizan de manera intercambiable en la especificación) , como se utiliza en la presente, significa una LH de mamífero unida a una molécula farmacéuticamente aceptable, tal como la hLH con la molécula farmacéuticamente aceptable unida a la misma con el fin de modificar las propiedades de hLH. El término "LH modificada", como se utiliza en la presente también incluye sales farmacéuticamente aceptables de la misma.

En el presente contexto, el término "una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero" como se utiliza en la presente, significa cualquier molécula farmacéuticamente aceptable que tiene afinidad por un receptor Fe neonatal de mamífero (FcRN) tal como afinidad fuerte, afinidad débil o afinidad media. FcRn está activo en tejido epitelial adulto y se expresa en el lumen de los intestinos, vías respiratorias pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, colon y superficies rectales (patente de E.U.A. número 6,485,726) . Las proteínas de fusión constituidas de asociados de unión de FcRn (por ejemplo, IgG, fragmentos Fe) pueden ser distribuidos efectivamente a través de las barreras epiteliales por FcRN y de esta manera proporcionan medio no invasivo para administrar sistémicamente una molécula terapéutica deseada.

Adicionalmente , las proteínas de fusión que comprenden un asociado de unión FcRn son endocitadas y protegidas por las células que expresan el FcRn. En vez de estar marcados para degradación, estas proteínas de fusión son recicladas hacia el exterior a la circulación nuevamente y por lo tanto incrementan la vida media in vivo de estas proteínas. Un enfoque para mejorar la eficacia de una proteína terapéutica es incrementar su persistencia en suero, con lo que se proporcionan niveles circulantes mayores, administración menos frecuente y dosis reducidas. La vida media de una fusión de albúmina o conjugado o de una fusión de Fe o conjugado depende, en una instancia, de su unión dependiente de pH a FcRn. El FcRn, el cual se expresa sobre la superficie de células endoteliales , se une a albúmina y/o a Fe de una manera dependiente de pH y la protege de degradación. Algunas variantes de albúmina o variantes de fragmentos de Fe que se unen selectivamente más fuerte que la forma natural respectiva a FcRn a pH 6.0 pero no a pH 7.4 presentan una vida media terminal más prolongada en una diversidad de modelos en animales. Para las moléculas que contienen Fe diversas mutaciones localizadas en el límite entre los dominios CH2 y CH3 tal como T250Q/M428L (Hinton PR. et al., 2004, Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279 (8) : 6213-6) y 252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fe región of immunoglobulin G to modulate in vivo levéis. Nat . Biotechnol . 23 (10) : 1283-8) , se ha demostrado que incrementa la afinidad de unión a FcRn y la vida media de la molécula que contiene la variante Fe in vivo. No obstante, no siempre existe una relación directa entre la unión aumentada a FcRn y la vida media mejorada (Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgGl Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fe Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35:86-94). Las variantes de albúmina humana han demostrado, de una manera similar, un incremento en la afinidad de unión a FcRn y la vida media de la molécula que contiene una variante de albúmina in vivo (véanse WO 2010/092135 y WO2011/051489 ) .

En el presente contexto, el término "un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero", como se utiliza en la presente significa una región constante, es decir, un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero o un fragmento del mismo en donde el anticuerpo de mamífero se puede seleccionar de IgM, IgG, IgA, IgD e IgE de un mamífero, tal como un primate, por ejemplo humano, simio o mono; un equino, por ejemplo un caballo. Un fragmento Fe típico de un anticuerpo de mamífero es un fragmento Fe recombinante de un anticuerpo humano tal como un fragmento Fe recombinante de un anticuerpo IgG humano. La creación de proteínas de fusión comprendidas de regiones constantes de inmunoglobulina unidas a una proteína de interés o un fragmento de la misma ya han sido descritas (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,155,027; 5,428,130; 5,480,981 y 5,808,029). Estas moléculas habitualmente poseen actividad biológica asociada con la molécula unida de interés así como la función efectora, o alguna otra característica deseada, asociada con la región constante de inmunoglobulina . Las proteínas de fusión que comprenden una porción Fe de una inmunoglobulina pueden conferir varias propiedades deseables sobre una proteína de infusión que incluyen estabilidad aumentada, vida media sérica aumentada (véase Capón et al., (1989) Nature 337:525) así como unión a receptores Fe tal como el receptor Fe neonatal (FcRn) (patentes de E.U.A. números 6,086,875; 6, 030, 613 y 6,485, 726) .

En el presente contexto, "una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero" o "variante de Fe" (utilizados de manera intercambiable en la presente descripción) , como se utilizan en la presente significan el fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero, en donde uno o más residuos aminoácidos, tal como 1 a 10 residuos aminoácidos del fragmento Fe han sido sustituidos por otros residuos aminoácidos y/o en donde uno o más residuos aminoácidos tales como 1 a 10 residuos aminoácidos han sido suprimidos del fragmento Fe y/o en donde uno o más residuos aminoácidos, tal como 1 a 10 residuos aminoácidos han sido agregados al fragmento Fe y/o en donde uno o más residuos aminoácidos tal como 1 a 10 residuos aminoácidos en el fragmento Fe han sido modificados. La adición o supresión de residuos aminoácidos puede llevarse a cabo, por ejemplo, en la parte N-terminal del fragmento Fe y/o en la parte C-terminal del fragmento Fe. La variante Fe se refiere a una molécula o secuencia que ha sido modificada de Fe nativa pero que aún comprende un sitio de unión para el receptor natural, FcRn (WO 97/34631) . El término nativo se refiere a una Fe que no ha sido modificada por un humano. El documento WO 96/32478 describe variantes Fe ejemplares, así como interacción con el receptor salvaje. De esta manera, el término "variante de Fe" en una modalidad comprende una molécula o secuencia que es humanizada de Fe nativa no humana. Además, una Fe nativa comprende sitios que pueden ser removidos debido a que proporcionan rasgos estructurales o actividad biológica que no se requiere para las moléculas de fusión de la presente invención. De esta manera, la variante Fe comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios Fe nativos o residuos que afectan o que están involucrados en (1) formación de enlace disulfuro, (2) incompatibilidad con la célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad de la parte N-terminal ante la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glucosilación, (5) interacción con complemento, (6) unión a un receptor Fe diferente del receptor salvaje, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . La región Fe de IgG se puede modificar de acuerdo con procedimientos bien reconocidos tal como mutagénesis dirigida a sitio y similar para proporcionar IgG o fragmentos Fe modificados o porciones de los mismos que se unirán por FcRn. Estas modificaciones incluyen modificaciones remotas desde los sitios de contacto FcRn así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso incrementan la unión a FcRn. Por ejemplo, se pueden realizar las siguientes sustituciones de los siguientes residuos aminoácidos solos en Fe de IgGl humana (Fcyl) sin pérdida significativa de la afinidad de unión de Fe por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A,D270A E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S,P331A , P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A, en donde , por ejemplo, P238A representa una prolina natural sustituida por alanina en la posición número 238. Además de alanina, otros aminoácidos pueden ser sustituidos por los aminoácidos naturales en las posiciones especificadas en lo anterior. Se pueden introducir mutaciones de manera única en Fe, lo que da lugar a más de cien asociados de unión FcRn distintos a partir de Fe nativo. Adicionalmente, combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales se pueden introducir juntas lo que da lugar a cientos adicionales de asociados de unión de FcRn. Algunas de las mutaciones anteriores pueden conferir funcionalidad nueva ante el asociado de unión FcRn. Por ejemplo, una modalidad incorpora N297 A, removiendo un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la unión a células efectoras inmunitarias y disminuir potencialmente la inmunogenicidad con lo que se incrementa la vida media circulante del asociado de unión FcRn y vuelve al asociado de unión FcRn incapaz de unirse a FcyRI , FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA sin deteriorar la afinidad por FcRn (Routledge et al. (1995) Transplantation 60:847; Friend et al. (1999) Transplantation 68:1632; Shields et al (1995) J. Biol . Chem. 276:6591). Adicionalmente, por lo menos tres receptores gamma Fe humanos parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región de bisagra inferior, generalmente los aminoácidos 234-237. Por lo tanto, puede surgir otro ejemplo de funcionalidad nueva e inmunogenicidad potencial disminuida a partir de mutaciones de esta región, como por ejemplo al sustituir los aminoácidos 233-236 de IgGl humana "ELLG" con la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con supresión de un aminoácido) . Se ha demostrado que FcyRI, FcyRII y FcyRIII, los cuales median diversas funciones efectoras, no se unirán a IgGl cuando se introducen estas mutaciones (Ward and Ghetie (1995) Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol . 29:2613). Como un ejemplo adicional de funcionalidad nueva que surge de mutaciones descritas en lo anterior, se puede incrementar la afinidad por FcRn más allá de la forma natural en algunas instancias. Esta afinidad aumentada puede reflejar una tasa "activada" aumentada, una tasa "inactivada" disminuida o ambas, una tasa "activada" aumentada y una tasa "inactivada" disminuida. Las mutaciones que se considera que imparten una afinidad aumentada por FcRn incluyen T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. (2001) J. Biol . Chem. 276:6591). Además, estas variantes del fragmento Fe incluyen, sin limitación, la tecnología de "protuberancia en orificios" o "KnH", como se describe, por ejemplo en Atwell et al J. Mol. Biol. (1997), 270, 26-35 y en Ridway et al Protein Engineering, vol . 9, no. 7, pp 617-621, 1996. La tecnología de término "protuberancia en orificio" o "KnH", como se utiliza en la presente se refiere a la tecnología que dirige el pareamiento de dos polipéptidos juntos in vitro o in vivo al introducir una protuberancia (saliente) en un polipéptido y una cavidad (orificio) en el otro polipéptido en la superficie de contacto en la cual interactúan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las superficies de contacto de unión Fc:Fc, superficies de contacto CL:CHI o superficie de contacto VH:VL de anticuerpos (por ejemplo, documentos de E.U.A. 2007/0178552; 12/811,207; 20100286374, O 96/027011, WO 98/050431 y Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788). Esto es especialmente útil al activar al pareamiento de dos cadenas pesadas diferentes juntas durante la elaboración de anticuerpos multiespecífieos de moléculas de fusión Fe heterodiméricas . Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fe pueden comprender además dominios variables únicos unidos a cada región Fe o pueden comprender adicionalmente dominios variables de cadena pesada diferentes que forman pares con dominios variables de cadena ligera similares o diferentes. La tecnología KnH también se puede utilizar para parear dos dominios extracelulares de receptores diferentes uniéndolos o cualquier otra secuencia polipeptídica que comprenda diferentes secuencias de reconocimiento objetivo (por ejemplo, que incluyen aficuerpos, pepticuerpos u otras fusiones Fe) . La tecnología KnH también se puede utilizar para parear dos cadenas diferentes, por ejemplo moléculas de gonadotropina similares a FSH, LH, hCG o TSH en una fusión Fe .

En el presente contexto, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se pretende que indique sales las cuales no son dañinas para el mamífero sujeto que es tratado. Estas sales incluyen sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, sales de metal farmacéuticamente aceptables, sales de amonio y amonio alquilado. Las sales de adición de ácido incluyen sales de ácidos inorgánicos así como ácidos orgánicos. Los ejemplos representativos de ácidos inorgánicos adecuados incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, nítrico y similares. Los ejemplos representativos de ácidos orgánicos adecuados incluyen los ácidos fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzoico, cinámico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maleico, málico, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metansulfónico, etansulfónico, tartárico, ascórbico, pamoico, bismetileno salicílico, etano disulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencensulfónico, ácidos p-toluensulfónicos y similares. Los ejemplos adicionales de sales de adición de ácido inorgánico u orgánico farmacéuticamente aceptables incluyen las sales farmacéuticamente aceptables enumeradas en <J. Pharm. Sci . 66, 2, (1977) la cual se incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos de sales de metal incluyen sales de litio, sodio, potasio, magnesio y similares. Los ejemplos de sales de amonio y amonio alquilado incluyen sales de amonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, etilamonio, hidroxietilamonio, dietilamonio, butilamonio, tetrametilamonio y similares.

En el presente contexto, el término "gonadotropina coriónica" , como se utiliza en la presente,. significa gonadotropina coriónica de origen de mamífero, por ejemplo primates tales como gonadotropina coriónica humana o gonadotropina coriónica equina tal como gonadotropina coriónica de caballo y gonadotropina coriónica recombinante tal como gonadotropina coriónica humana recombinante y análogos de estas gonadotropinas coriónicas. De la manera en que se utiliza en la presente, "CG" y "gonadotropina coriónica" son intercambiables. Cuando CG es un análogo de una gonadotropina coriónica de un mamífero, tal como hCG y hCG recombinante, se entiende que el análogo es el compuesto obtenido al sustituir uno o más residuos aminoácidos en la CG, por ejemplo, hCG, secuencia con otro aminoácido natural o no natural; y/o al agregar uno o más aminoácidos naturales o no naturales a la CG, por ejemplo hCG, secuencia; y/o al suprimir uno o más residuos aminoácidos de la CG, por ejemplo, hCG, secuencia, en donde cualquiera de estas etapas opcionalmente puede estar seguida por generación de derivados adicionales de uno o más residuos aminoácidos. En particular, las sustituciones son conservadoras en el sentido de que un residuo aminoácido se sustituye por otro residuo aminoácido del mismo grupo, es decir, por otro residuo aminoácido con propiedades similares. Los aminoácidos pueden ser divididos convenientemente en los siguientes grupos en base en sus propiedades: aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina) , aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (tales como glutamina, cisterna y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina, prolina, metionina y valina) , aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina y treonina) . Típicamente, la CG tiene por lo menos 80% de identidad con hCG y, típicamente, tiene por lo menos 20% de la actividad in vivo de CG de hCG.

En el presente contexto, el término "hormona luteinizante " o "hormona luteinizante de mamífero", como se utiliza en la presente, significa hormona luteinizante de origen de mamífero, tal como de primates, por ejemplo, hormona luteinizante humana o de caballo, y hormona luteinizante recombinante tal como la hormona luteinizante recombinante de humano, caballo, simio o mono, y análogos de estas hormonas luteinizantes . Como se utiliza en la presente, "LH" y "hormona luteinizante" son intercambiables. Cuando LH es un análogo de una hormona luteinizante de un mamífero tal como hLH y hLH recombinante , se entiende que el análogo es el compuesto que se obtiene al sustituir uno de los residuos aminoácidos en la LH, por ejemplo, hLH, secuencia con otro aminoácido natural o no natural; y/o al agregar uno o más aminoácidos naturales o no naturales a la secuencia de LH, por ejemplo, hLH; y/o al suprimir uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de LH, por ejemplo hLH, en donde cualquiera de estas etapas opcionalmente puede ser seguida por generación de derivados adicionales de uno o más residuos aminoácidos. En particular, estas sustituciones son conservadoras en el sentido de que un residuo aminoácido está sustituido con otro residuo aminoácido del mismo grupo, es decir, por otro residuo aminoácido con propiedades similares. Los aminoácidos pueden dividirse convenientemente en los siguientes grupos en base en sus propiedades: aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina) , aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (tales como glutamina, cisteína y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina, prolina, metionina y valina) , aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptofano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina y treonina) . Típicamente, la LH tiene por lo menos 80% de identidad con hLH y típicamente tiene por lo menos 20% de la actividad de LH in vivo de hLH. Para propósitos de la presente invención, hLH, análogos de hLH y variantes y hLH de acción prolongada no incluyen a hCG, análogos y variantes de hCG y hCG de acción prolongada.

En el presente contexto, el término "hormona estimulante folicular", como se utiliza en la presente, significa hormona estimulante folicular de origen de mamífero tal como de humano, equino, bovino u hormona estimulante folicular porcina, y hormona estimulante folicular recombinante tal como la hormona estimulante folicular recombinante humana, equina, bovina o porcina y análogos de estas hormonas estimulantes foliculares. Como se utiliza en la presente, "FSH" y "hormona estimulante folicular" son términos intercambiables. Para la estimulación del crecimiento de folículos la FSH se puede derivar exogenamente o se puede producir endógenamente en la mujer en cantidades mayores de lo normal, por ejemplo al proporcionar citrato de clomifeno que actúa como un antagonista de estradiol en la hipófisis .

Cuando la FSH es un análogo de una hormona estimulante folicular de un mamífero tal como hFSH y hFSH recombinante, se entiende que el análogo es el compuesto obtenido al sustituir uno o más residuos aminoácidos en la secuencia de FSH, por ejemplo hFSH con otro aminoácido natural o no natural; y/o al agregar uno o más aminoácidos naturales o no naturales a la secuencia de FSH, por ejemplo hFSH; y/o al suprimir uno o más residuos aminoácidos de la secuencia de FSH, por ejemplo hFSH, en donde cualquiera de estas etapas opcionalmente puede estar seguida por generación de derivados adicionales de uno o más residuos aminoácidos. En particular, estas sustituciones son conservadoras en el sentido de que un residuo aminoácido está sustituido por otro residuo aminoácido del mismo grupo, es decir, por otro residuo aminoácido con propiedades similares. Los aminoácidos convenientemente se pueden dividir en los siguientes grupos en base en sus propiedades: aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina) , aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (tales como glutamina, cisteína y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina, prolina, metionina y valina) , aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina , triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina y treonina) . La FSH producida de manera recombinante o un análogo de FSH típicamente se deriva de líneas de células de mamífero tales como líneas de células de humano o de hámster, por ejemplo líneas de células que se seleccionan de CHO, BHK y HEK. Típicamente, la FSH tiene por lo menos 80% de identidad con hFSH y típicamente tiene por lo menos 20% de la actividad de FSH in vivo de hFSH.

El término "una molécula que tiene actividad de FSH", como se utiliza en la presente significa una molécula que se une a y que activa un receptor de FSH cuando se administra a un mamífero, por ejemplo la molécula puede seleccionarse, sin limitación, de cualquiera de moléculas orgánicas pequeñas.

En el presente contexto, el término "un enlazante" como se utiliza en la presente, significa un enlace de valencia o una porción multifuncional tal como una porción bifuncional que separa el agonista de LH, por ejemplo el LH de mamífero y la molécula farmacéuticamente aceptable. La porción multifuncional tal como bi- o trifuncional se une covalentemente a uno o más agonistas de LH, tal como uno o más LH de mamífero, y se une de manera covalente a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables de manera que genera el compuesto LH, tal como la LH modificada. En enlazante puede ser estable lo que significa que no se producirán reacciones químicas significativas, por ejemplo hidrólisis en condiciones fisiológicas (por ejemplo, temperatura de 37°Celsius y pH de 7.4) durante el período de tiempo del tratamiento. Esto puede determinarse por estudios de estabilidad conocidos en el ámbito. El enlazante puede ser lábil lo que significa que se rompe un enlace químico, típicamente por hidrólisis en condiciones relevantes fisiológicamente (por ejemplo, temperatura de 37° Celsius y H de 7.4). Esto se puede determinar por estudios de estabilidad conocidos en el ámbito. El enlazante puede ser un enlazante químico lo que significa que es generado por química orgánica fuera de una célula viva. El enlazante puede ser una porción azúcar tal como una glucosilación en una proteína o puede prepararse químicamente y utilizarse para unir el agonista de LH, por ejemplo, la LH de mamífero y la molécula farmacéuticamente aceptable. El enlazante puede ser un puente disulfuro tal como un enlace -S-S-, entre dos residuos aminoácidos de cisteína (Cys) en cada uno del agonista de LH, por ejemplo, la LH de mamífero y la molécula farmacéuticamente aceptable. El enlazante puede ser un enlazante fusionado lo que significa que el compuesto de LH, por ejemplo, la LH modificada, se puede expresar en una célula viva como un polipéptido o proteína. El enlazante puede ser un enlazante hidrofílico que separa un agonista de LH, por ejemplo la LH de mamífero y una molécula farmacéuticamente aceptable con una porción química, la cual comprende por lo menos 5 átomos diferentes de hidrógeno en donde 30-50% de estos son ya sea N u O. El enlazante puede ser hidrolizable , como se describe en los documentos de E.U.A. 6515100; 7122189; 7700551; WO2004089280 , O2006138572 y WO2009095479. Los compuestos típicos útiles como enlazantes en la presente invención incluyen aquellos que se seleccionan del grupo que tienen ácidos dicarboxílieos , maleimido hidrazidas, PDPH, SPDP, LC-SPDP, GMBS, hidrazidas de ácido carboxílico y péptidos pequeños. Los ejemplos más específicos de compuestos útiles como enlazantes, de acuerdo con la presente invención incluyen: (a) ácidos dicarboxílicos tales como ácido succínico, ácido glutárico y ácido adípico; (b) maleimido hidrazidas tales como N- [ácido maleimidocaproico] hidrazida (EMCH) , N- [ácido maleimido propiónico] hidrazida (MPH o B PH) , 4-[N-maleimidometil] ciclohexan-1-carboxilhidrazida y N- [ácido k-maleimidoundecanoico] hidrazida (KMUH) , hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil) butírico (MPBH) ; (c) éster de NHS-3-maleimido propionato de succinimida (MPS-EDA) ; (d) enlazantes de PDPH tales como (3 - [2 -piridilditio] propionil hidrazida) conjugado a una proteína reactiva de sulfhidrilo ; (e) 3- (2-piridilditio) -propionato de N-succinimidilo (SPDP) , (f ) 6- (3- [2 -piridilditio] -propionamido) hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP), (g) éster de N- [?-maleimidobutiriloxi ) succinimida (GMBS) y (h) hidrazida de ácido carboxílico que se seleccionan de 2 a 5 átomos de carbono. Otros enlazantes no peptídicos también son posibles. Por ejemplo, también se pueden utilizar enlazantes alquilo tales como -NH-(CH2)m-C(0)-, en donde m es un número entero que se selecciona de 2 a 20. Estos enlazantes de alquilo pueden estar sustituidos adicionalmente por cualquier grupo sin impedimento estérico tal como un alquilo inferior, acilo inferior (por ejemplo de 1 a 6 átomos de carbono), halógeno (por ejemplo Cl, Br, I, F) , CN, NH2, fenilo, etc. Un enlazante no peptídico ejemplar es un enlazante de PEG. Los enlazantes adicionales útiles de acuerdo con la presente invención se describen en la patente de E.U.A. número 6,660,843. El compuesto de LH de la presente invención en donde la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona al agonista de LH opcionalmente puede comprender por lo menos un enlazante peptídico. En una modalidad, el enlazante está constituido de aminoácidos que se unen juntos por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se encuentran de modo natural. En diversas modalidades el enlazante puede comprender 1 a 5 aminoácidos, 1 a 10 aminoácidos, 1 a 20 aminoácidos, 10 a 50 aminoácidos, 50 a 100 aminoácidos o 100 a 200 aminoácidos. En una modalidad, los aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En una modalidad, un enlazante está constituido de una mayor parte de aminoácidos que están sin impedimento estérico tal como glicina y alanina. En una modalidad el enlazante puede comprender la secuencia Gn (de manera equivalente, -(Gly)n-). En una modalidad el enlazante puede comprender la secuencia (GGS)n o (GGGGS)n. En cada instancia, N es un número entero tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los ejemplos de enlazantes incluyen, pero no se limitan a GGG, SGGSGGS (SEC ID NO: 58), GGSGGSGGSGGSGGG (SEC ID NO: 59), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEC ID NO: 60) y GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 57) . En una modalidad el enlazante es un enlazante de 8 aminoácidos EFAGAAAV (SEC ID NO: 56) .

Las diferentes técnicas para unir dos o más moléculas juntas, tal como el agonista de LH, por ejemplo la LH de mamífero y la molécula farmacéuticamente aceptable y opcionalmente por medio de un enlazante multifuncional tal como un enlazante bifuncional, están disponibles en la técnica anterior y una referencia adecuada en la presente es O0158493 que incluye todos los documentos relevantes enumerados y mencionados en la presente.

En el presente contexto, el término "una molécula farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente significa una molécula que se selecciona de cualquiera de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas, receptores, glucosilaciones , azúcares, polímeros (por ejemplo, polietilenglicoles , PEG) , ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) , hormonas las cuales, cuando se unen al agonista de LH por ejemplo la LH de mamífero aumentan la vida media en suero del agonista de LH, por ejemplo la LH de mamífero o el compuesto de LH, por ejemplo, la LH modificada. Típicamente, las moléculas farmacéuticamente estables son, sin limitación, albúmina tal como albúmina humana, albúmina recombinante o polímeros tales como PEG, por ejemplo PEG de un peso molecular de por lo menos 10 kDa tal como desde 10 kDa a 150 kDa. Adicionalmente, las moléculas farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero, transferrina, albúmina tal como albúmina humana, albúmina recombinante , variantes de albúmina, CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 8 a 22 o polímero tal como PEG, por ejemplo PEG de un peso molecular de por lo menos 5 kDa tal como desde 10 kDa a 150 kDa, típicamente 10 a 40 kDa.

En el presente contexto, el término "vida media plasmática in vivo" se utiliza en su significado normal, es decir, el tiempo que se requiere para que la cantidad del agonista de LH, por ejemplo LH de mamífero o compuesto de LH, por ejemplo LH modificada en un sistema biológico se reduzca a una mitad de su valor por procesos biológicos.

El término "vida media en suero" el cual se puede utilizar de manera intercambiable con "vida media plasmática" o "vida media" se utiliza en su significado normal, es decir, el tiempo que se requiere para que la cantidad de agonista de LH, por ejemplo LH de mamífero o compuesto de LH, por ejemplo LH modificada, la forma recombinante o urinaria de hCG o LH o FSH o hCG de acción prolongada, LH de acción prolongada o FSH de acción prolongada en un sistema biológico se reduzca a una mitad de su concentración. Así, como se utiliza en la presente, la "vida media en suero" significa la vida media en suero in vivo. La determinación de la vida media en suero con frecuencia es más sencilla que la determinación de la vida media funcional y la magnitud de la vida media en suero habitualmente es una buena indicación de la magnitud de la vida media funcional in vivo. Preferiblemente, la vida media en suero se mide en un mamífero, de manera más preferible en una especie de homínido tal como orangután, chimpancés o gorilas, de manera más preferible en humanos. La vida media en suero mencionado en la presente solicitud son vidas medias determinadas en humanos. Una indicación de la vida media o cualquier cambio en la vida media también se puede obtener en roedores tales como en ratón o rata o hámster. Además, la vida media se puede medir en mamíferos más grandes que tengan un peso corporal en el mismo intervalo que los seres humanos o que se encuentren cercanos al peso corporal de los seres humanos diferente a los roedores; preferiblemente mono, perro, cerdo o ganado (bovino) . Las gonadotropinas las cuales tienen una vida media más prolongada que las gonadotropinas recombinante o urinaria (FSH, LH o hCG) se consideran de "acción prolongada" de acuerdo con la presente invención.

El término "aumentado", como se utiliza en relación con la vida media plasmática, se utiliza para indicar que la vida media relevante del compuesto de LH, por ejemplo la LH modificada, se ha incrementado de manera estadísticamente significativa en relación a las del agonista de LH, por ejemplo, la LH de mamífero, determinada bajo condiciones comparables. Por ejemplo, la vida media relevante se puede incrementar en por lo menos aproximadamente 25%, tal como por lo menos aproximadamente 50%, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente 100%, 150%, 200%, 250% o 500%. La medición de la vida media plasmática in vivo se puede llevar a cabo de numerosas maneras como se describe en la literatura. Un incremento en la vida media plasmática in vivo se puede cuantificar como una disminución en la depuración o como un incremento en la media del tiempo de permanencia (MRT) . El compuesto de LH, por ejemplo LH modificada de la presente invención para el cual la depuración disminuye a menos de 70%, tal como menos de 50%, tal como menos de 20%, tal como menos de 10% de la depuración del agonista de LH, por ejemplo LH de mamífero, determinado en un análisis adecuado se afirma que tiene una vida media plasmática in vivo aumentada. El compuesto de LH, por ejemplo LH modificada, de la presente invención para la cual la MRT se incrementa en más de 130%, tal como más de 150%, tal como más de 200%, tal como más de 500% de la MRT del agonista de LH, por ejemplo la LH de mamífero, en un análisis adecuado se afirma que tiene una vida media plasmática in vivo aumentada. La depuración y la media del tiempo de residencia se pueden determinar en estudios farmacocinéticos estándar utilizando animales de prueba adecuados. Está dentro de las capacidades de una persona experta en el ámbito seleccionar un animal de prueba adecuado para una proteína dada. Las pruebas en humanos, por supuesto, representan la prueba final. Los animales de prueba adecuados incluyen ratas macho Sprague-Dawley normales, ratones y macacos. Habitualmente , los ratones y ratas se inyectan en un bolo subcutáneo único mientras que a los monos se les puede inyectar un bolo subcutáneo único o una dosis iv única. La cantidad inyectada depende el animal de prueba. Subsecuentemente se toman muestras de sangre durante un período de 1 a 10 días, según sea apropiado (dependiendo de la sensibilidad del análisis puede ser por un período tan prolongado como 30 días) para la determinación de depuración y MR . Las muestras de sangre convenientemente se analizan por técnicas de ELISA u otras técnicas inmunológicas .

En el presente contexto, el término "origen de mamífero", como se utiliza en la presente significa obtenido de un mamífero, por lo tanto un agonista de LH de origen de mamífero puede ser, por ejemplo una CG humana o LH humana obtenida de tejido o sangre de un mamífero o se puede obtener por medios recombinantes , tal como proteínas recombinantes , polipéptidos recombinantes, por ejemplo un agonista de LH de origen de mamífero puede ser una CG de mamífero recombinante o una LH de mamífero recombinante, por ejemplo las formas humanas recombinantes de CG o LH .

En el presente contexto, el término "origen no de mamífero", como se utiliza en la presente, significa obtenido de una fuente la cual no es un mamífero tal como péptidos sintéticos, oligopéptidos y polipéptidos o moléculas orgánicas pequeñas, por ejemplo un agonista de LH de origen no de mamífero puede ser una molécula orgánica pequeña o un péptido corto de 5 a 20 aminoácidos que se une y activa el receptor de LH.

En el presente contexto, el término "concentración en plasma", como se utiliza en la presente, significa la concentración que se puede medir en circulación en cualquier momento dado después de la inyección del agonista de LH .

En el presente contexto, el término "una inyección", como se utiliza en la presente, significa la administración por una vía parenteral tal como inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa u otro dispositivo de administración.

En el presente contexto, el término "tratamiento con FSH", como se utiliza en la presente significa tratamiento estándar con hormona estimulante folicular. Se requiere FSH para reclutamiento folicular (es decir, el crecimiento temprano de folículos del ovario) al inicio del ciclo menstrual espontáneo y también soporta la foliculogénesis en etapa media y tardía. Se administra FSH terapéuticamente para inducir foliculogénesis en mujeres anovulatorias y mujeres que están experimentando COS. En los métodos de estimulación ovulatoria tradicionales, se administra FSH durante el tratamiento hasta el momento en que se recuperan los ovocitos.

En el presente contexto, el término "análogo" o "similar" (utilizados de manera intercambiable en la presente descripción) como se utilizan en la presente, significa un polipéptido o proteína en donde uno o más residuos aminoácidos del polipéptido o proteína han sido sustituidos por otros residuos aminoácidos y/o en donde uno o más residuos aminoácidos han sido suprimidos del péptido y/o en donde uno o más residuos aminoácidos han sido agregados al polipéptido o proteína. La adición o supresión de residuos aminoácidos puede llevarse a cabo, por ejemplo, en la parte N-terminal del péptido y/o en la parte C-terminal del péptido. Se puede utilizar un sistema sencillo para describir análogos: por ejemplo, un análogo de hCG que comprende la mutación R133C designa un análogo en donde el R, que se encuentra de manera natural en la posición 133 de hCG ha sido sustituido con C. Otro ejemplo, un análogo de hLH que comprende la mutación L121C designa un análogo en donde la L que se encuentra de manera natural en la posición 121 de la cadena beta de hLH ha sido sustituido con C. Las fórmulas de los polipéptidos o análogos de proteína se bosquejan utilizando las abreviaturas de una sola letra estándar para aminoácidos utilizada de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC-IUB.

En el presente contexto, el término "identidad", como se utiliza en la presente, se refiere a una relación entre la secuencias de dos o más proteínas, determinadas al comparar las secuencias. En el ámbito, el término "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre proteínas, determinado por el número de coincidencias entre las cuerdas de dos o más residuos aminoácidos. El término "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones en las separaciones (si las hay) resueltas por un modelo matemático particular o un programa de computadora (es decir, "algoritmos"). La identidad de las proteínas relacionadas se puede calcular fácilmente por métodos conocidos. Estos métodos incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J". Applied Math. 48, 1073, (1988). Los métodos preferidos para determinar identidad se designan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar identidad se describen en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programa GCG, que incluyen a GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res., 12, 387, (1984); Genetics Computer Group, University of isconsin, Madison, is.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra) . El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar identidad. Por ejemplo, utilizando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dos proteínas para las cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (la "secuencia coincidente", como se determina por el algoritmo) . Un castigo por abertura de separación (el cual se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la "diagonal" es la calificación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y un castigo por extensión de separación (la cual habitualmente es {fracción (1/10)} multiplicada por el castigo de abertura de separación) , así como la matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. Una matriz de comparación estándar (véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol . 5, supp . 3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919, (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se utiliza por el algoritmo. Los parámetros preferidos para una comparación de secuencia de proteína incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453, (1970) ; matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, (1992) ; castigo por separación: 12, castigo por longitud de separación: 4, umbral de similitud: 0. El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados en lo anterior son parámetros implícitos para comparaciones de proteínas (junto con carencia de castigo para separaciones en los extremos) utilizando el algoritmo GAP. La homología/ identidad de una secuencia de aminoácidos se determina convenientemente a partir de las secuencias alineadas utilizando, por ejemplo, el programa Clustal , versión 1.8, junio de 1999 utilizando parámetros implícitos (Thompson et al., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progresive múltiple sequence alignment through sequences weighting, position-specific gap penalties and weigh matrix choice, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680) y se analizan mediante el uso de GENEDOC versión 2.5 (Nicholas et al., 1997 GeneDoc : Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW . NEWS 4:14; Nicholas, K. B. and Nicholas H. B. Jr. 1997 GeneDoc :Analysis and Visualization of GeneticVariation) .

El componente de proteína más abundante en la sangre circulante de las especies de mamífero es la albúmina sérica la cual normalmente está presente en una concentración de aproximadamente 3 a 4.5 gramos por 100 mililitros de sangre completa. La albúmina sérica es una proteína sanguínea de aproximadamente 70,000 unidades Dalton (Da) la cual tiene varias funciones importantes en el sistema circulatorio. Funciona como un transportador de una diversidad de moléculas orgánicas encontradas en la sangre, como el transportador principal de diversos metabolitos tales como ácidos grasos y bilirrubina a través de la sangre y, debido a su abundancia, como un regulador osmótico de la sangre circulante. En el presente contexto, "una albúmina", como se utiliza en la presente, significa albúmina de origen de mamífero o de origen diferente de mamífero, tal como albúmina sérica humana que se describe en Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin : Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pplO, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-5521 10-3), o albúmina humana recombinante , o albúmina modificada tal como albúmina humana modificada como se describe en los documentos WO2011051489 y O2010092135.

El documento O2011051489 la especificación se relaciona con variantes de una albúmina original que tiene vida media plasmática alterada en comparación con la albúmina original. La presente invención también se relaciona con polipeptidos de fusión y conjugados que comprenden albúmina variante .

El documento WO2010092135 basado en la estructura tridimensional de albúmina, los inventores han diseñado polipéptidos variantes (muteínas) las cuales tienen uno o más residuos cisteína con un grupo tiol libre (a continuación denominado como "tio-albúmina" ) . El polipéptido variante se puede conjugar a través del átomo de azufre del residuo cisteína a un asociado de conjugación tal como un compuesto bioactivo.

El documento WO2005054286 , la especificación se relaciona con proteínas que comprenden interleucina 11 (IL-11) (que incluye, pero que no se limita a fragmentos y variantes de los mismos) los cuales presentan propiedades trombopoyéticas o antiinflamatorias, fusionados a albúmina (que incluye, pero que no se limita a fragmentos o variantes de albúmina) .

El documento WO2004083245 describe un agente que tiene una vida media mayor que la albúmina producida de manera natural en un paciente con NS, el agente comprende un primer polipéptido similar a albúmina unido a un segundo polipéptido .

El documento WO03066681 describe una composición que comprende una proteína diferente de albúmina estabilizada por la adición de albúmina sérica humana recombinante altamente purificada. La proteína diferente de albúmina puede ser factor VIII.

En el presente contexto, el término "un polímero", como se utiliza en la presente, significa una molécula formada por enlace covalente de dos o más raonómeros, en donde ninguno de los monómeros es un residuo aminoácido, excepto en donde el polímero es albúmina humana u otra proteína plasmática abundante. El término "polímero" puede ser utilizado de manera intercambiable con el término "molécula polimérica" . Se pretende que el término abarque moléculas de carbohidrato unidas por glucosilación in vitro. Las moléculas de carbohidrato unidas por glucosilación in vivo tales como N- u O-glucosilación (como se describe adicionalmente en lo siguiente) se denominan en la presente como "una porción oligosacárida" . Excepto cuando el número de moléculas poliméricas está indicado de manera expresa, cada referencia a "un polímero", "una molécula polimérica" , "el polímero" o "la molécula polimérica" como se utiliza en la presente invención, indicará una referencia a una o más moléculas de polímero. El polímero puede ser hidrosoluble o un polímero insoluble en agua tal como una porción PEG. La porción PEG puede tener un tamaño promedio que se selecciona del intervalo de 500 Da a 200,000 Da, tal como desde 500 Da a 100,000 Da, por ejemplo desde 2000 Da a 50,000 Da. Estas moléculas PEG se pueden obtener de, por ejemplo, Shearwater Inc .

En el presente contexto, el término "una composición farmacéutica", como se utiliza en la presente significa una composición que contiene un compuesto de LH, por ejemplo, una LH modificada, de la presente invención y/o una LH modificada de la presente invención y una FSH, y opcionalmente uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables y se puede preparar por técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editada por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pa. Las composiciones pueden presentarse en formas convencionales, por ejemplo, cápsulas, tabletas, aerosoles, soluciones, suspensiones o aplicaciones tópicas. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo, por inyección i.v., o subcutánea y se pueden presentar en forma de dosis unitaria en ampolletas, jeringas llenadas previamente, recipientes de infusión de volumen pequeño o de dosis múltiple con un conservador agregado. Las composiciones pueden adquirir formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de las formas oleosas o no acuosas de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos incluyen propilenglicol , polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo) y pueden contener agentes de formulación tales como agentes conservadores, humectantes, emulsificantes o que mejoren la suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico o sólido estéril o por liofilización de solución para constitución antes de su uso con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos. Los aceites útiles en las formulaciones parenterales incluyen aceite de petróleo, animal, vegetal o sintético. Los ejemplos específicos útiles en estas formulaciones incluyen aceite de cacahuate, de frijol de soya, de ajonjolí, de semilla de algodón, de maíz, de oliva, petrolato y aceite mineral. Los ácidos grasos adecuados para uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico . El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácido graso adecuados. Las formulaciones parenterales típicamente contendrán desde aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 25%, tal como desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 25% en peso del ingrediente activo en solución. Se pueden utilizar conservadores de amortiguadores. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección estas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un balance hidrofílico-lipofílico (HLB, por sus siglas en inglés) desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en estas formulaciones típicamente varía desde aproximadamente 0.000001 hasta aproximadamente 15% en peso, por ejemplo desde aproximadamente 0.000001 hasta aproximadamente 5% en peso o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácido graso de polietilensorbitán tal como monooleato de sorbitán y los aductos de peso molecular alto de óxido de etileno con una base hidrofóbica formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol . Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes sellados de dosis única o de dosis múltiples, tales como ampolletas y frascos, y se pueden almacenar en una condición liofilizada que requiere únicamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso.

En el presente contexto, el término "tecnología de reproducción asistida", como se utiliza en la presente significa métodos que intentan mejorar la posibilidad de concebir ya sea de manera natural o por recuperación de un ovocito y espermatozoides y realizar fertilización in vitro, esto puede ser a través de fertilización in vitro (IVF) o por inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI) , inseminación intrauterina (IUI) , maduración in vitro (IVM) u otras formas derivadas de las mismas.

El término "pérdida recurrente del embarazo" o "aborto habitual", como se utiliza en la presente (usada de manera intercambiable) se presenta en aproximadamente 1% de mujeres fértiles quienes intentan sin éxito concebir en tres o más embarazos y el embarazo no llega a término antes de 12 semanas de gestación. Debido a la unión del embrión y la implantación temprana en el útero están controladas con precisión por el ámbito hormonal local, los trastornos endocrinos con frecuencia se relacionan con errores en la gestación temprana aunque una multitud de factores pueden resultar en un cuadro clínico similar. El útero experimenta cambios esenciales de desarrollo durante el período de preimplantación, estimulado por estrógeno y progesterona .

Secretada por el CL, la progesterona es importante para la implantación exitosa y conjugación del embarazo. Por lo tanto, las condiciones relacionadas con una secreción inadecuada de progesterona por el CL es probable que afecten de manera negativa el resultado del embarazo.

El término "bolo", como se utiliza en la presente, es la administración de un compuesto que se suministra para incrementar la concentración en sangre, suero o plasma a un nivel eficaz. La administración puede suministrarse por cualquier vía de administración que incluye administración oral, por inhalación o intravenosa, por inyección intramuscular, intratecal o subcutánea.

El término "gonadotropina" , como se utiliza en la presente, es una hormona que se encuentra de modo natural que pertenece a un grupo de glucoproteínas heterodiméricas que incluyen hormona estimulante de los folículos (FSH, por sus siglas en inglés) , hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) y gonadotropina coriónica (CG, por sus siglas en inglés), tal como gonadotropina coriónica humana. Estas hormonas regulan la función de las gonadas en hombres y mujeres. Cada una de estas hormonas que se encuentran de manera natural está constituida de dos subunidades unidas de modo no covalente: una subunidad a, la cual es común para FSH, LH y hCG, y una subunidad ß, la cual es única para cada una de estas, y la cual confiere especificidad biológica a cada hormona. En la totalidad de las gonadotropinas que se encuentran de modo natural, cada subunidad tiene cadenas laterales oligosacáridas unidas a asparagina (N-unidas) . En la subunidad OÍ común de las hormonas humanas, estas se unen en la posiciones 52 y 78 (SEC ID NO: 1) . Tanto en FSH como en hCG humanas, dos cadenas laterales oligosacáridas unidas en N están unidas a la subunidad beta en las posiciones 7 y 24 en FSH (SEC ID NO: 10) .

La cadena alfa de las gonadotropinas preferidas de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste de secuencias que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 1, 2 ó 3, de manera más preferible 85%, de manera más preferible 90%, de manera más preferible 95%. Preferiblemente, una variante comprende los residuos cisteína conservados en la posición y separación de la SEC ID NO: 1. En una modalidad particularmente preferida las gonadotropinas comprenden la subunidad alfa humana que tiene la SEC ID NO: 1.

Al igual que con todas las glucoproteínas, las variaciones en la estructura de oligosacáridos se producen las gonadotropinas lo que resulta en un arreglo de isoformas que se encuentran dentro de la hipófisis y en circulación. Además, existen diferencias en el grado de "rematado" de carbohidratos terminales por ácido siálico. Las isoformas se pueden separar en base en su carga, la cual está determinada principalmente por el número y distribución de oligosac ridos N-unidos sialilados. Las formas altamente sialiladas tendrán un pH más ácido y se les denominará "ácidas". las formas menos sialiladas tienen pH comparativamente mayor y se les denonina "básicas" .

Como una consecuencia de sus diferencias estructurales las isoformas de gonadotropina difieren en su capacidad para unirse a receptores objetivo-célula. El grado de sialilación afecta su capacidad para sobrevivir en circulación. Por ejemplo, en el caso de FSH, las isoformas altamente ácidas/sialiladas tienen vidas medias en plasma considerablemente más prolongadas en modelos en animales.

Días - los protocolos de la presente invención comienzan en cierto punto en el ciclo menstrual. El día 1 del ciclo menstrual es el primer día de menstruación. Cuando se hace referencia a días de un protocolo de estimulación, el día 1 es el día de la primera dosificación de FSH que se administra. El día 2 de un protocolo de estimulación es el día posterior, etc. En la fase lútea, los días se calculan ya sea desde el día de la ovulación o desde el día de captación del ovocito.

Tamaño del folículo - La función ovárica se puede medir por ultrasonografía ginecológica del volumen folicular. La medición del diámetro del folículo ovárico habitualmente se realiza utilizando ultrasonografía . Actualmente, el volumen del folículo ovárico también se puede medir rápidamente y de modo automático a partir de imágenes de ultrasonido reconstruidas tridimensionalmente (Salama S, Arbo E, Lamazou F, Levaillant JM, Frydman R, Fanchin R (abril del 2010) . Reproducibility and reliability of automated volumetric measurement of single preovulatory follicles using SonoAVC", Fértil. Steril, 93 ( 6 ) : 2069 - 73 ) .

Orina - derivado o urinario. Los términos se utilizan de manera intercambiable. El término se refiere al origen de gonadotropinas purificadas de orina.

En el presente contexto, el término "tratamiento de infertilidad", como se utiliza en la presente, significa métodos que ayudan a las mujeres de una pareja infértil o una mujer sola a concebir.

En el presente contexto, el término "promover la fertilidad", como se utiliza en la presente, significa métodos que mejorarán la fertilidad de una pareja, una mujer o un hombre .

En el presente contexto, el término "sujeto mamífero", "mamífero" o "un mamífero" (estos términos se utilizan de manera intercambiable en la especificación) , como se utiliza en la presente, significa cualquier mamífero tal como un humano, una vaca, un cerdo, un caballo, un borrego, un perro, un gato y un chivo.

Los términos "un", "uno" y "el" y referencias similares, como se utiliza en el contexto para describir la invención se deben considerar que abarcan las formas tanto singulares como plurales, a menos que se indique en otro sentido en la presente o que se contradiga con claridad por el contexto.

Una "cantidad eficaz" de un compuesto de LH, como se utiliza en la presente, significa una cantidad del compuesto de LH que se va a administrar suficiente para promover fertilidad en un mamífero o para tratar infertilidad en un mamífero en necesidad del mismo. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como una "cantidad eficaz". Las cantidades eficaces para cada propósito dependerán de la gravedad de la condición así como el peso y el estado general del sujeto. Se entenderá que determinar una dosificación apropiada se puede obtener utilizando experimentación de rutina, al construir una matriz de valores y al probar diferentes puntos en la matriz, todo lo cual se encuentra dentro de las habilidades habituales de un médico o veterinario entrenado. Las dosificaciones típicas de administración de hCG serán de 50 a 500 UI diariamente o dosificaciones de un compuesto de LH que proporcionarán un efecto biológico similar.

Una "cantidad eficaz" de una LH modificada, como se utiliza en la presente, significa una cantidad de la LH modificada que se va a administrar suficiente para ayudar a inducir el desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , en tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero en necesidad del mismo. Dado que la LH modificada se pretende que sea utilizada en combinación con FSH como se describe en la presente, la LH modificada "ayudará" en este tratamiento, junto con FSH. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como una "cantidad eficaz" . Las cantidades eficadas para cada propósito dependerán de la gravedad de la condición así como el peso y estado general del sujeto. Se entenderá que determinar una dosificación apropiada se puede obtener mediante experimentación habitual . Al construir una matriz de valores y probar puntos diferentes en la matriz, lo cual estará dentro de las habilidades habituales de un médico o veterinario con entrenamiento. Las dosificaciones típicas de administración de hFSH serán de 50-500 UI diariamente o dosificaciones de una molécula que tenga actividad de FSH que proporcionará un efecto biológico similar.

El término "grupo de acilación" , como se utiliza en la presente, significa un grupo R- (C=0) - en donde R se selecciona de cadenas de carbono saturadas o insaturadas, de cadena lineal o ramificadas, que opcionalmente comprenden uno o más de O, N, S o P, tal como ácido alcanocarboxílico de cadena lineal o ramificada. Diversos ejemplos de grupos de acilación adecuados se describen en los documentos WO2006/037810, WO00/34331, WO2006/097537 , WO2011/080103. En los ejemplos particulares de grupos de acilación adecuados tienen la estructura CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 4 a 40, por ejemplo, 8 a 22 tal como un grupo de acilación que se selecciona del grupo que comprende CH3 (CH2) 8C0- , CH3 (CH2) 9CO- , CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)nCO-, CH3 (CH2) 12C0- , CH3 (CH2) 13C0- , CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)15C0-, CH3 (CH2) 16C0- , CH3 (CH2) 17CO- , CH3(CH2)i8CO-, CH3 (CH2)19CO-, CH3 (CH2) 20CO- , CH3 (CH2) 21CO- y CH3 (CH2) 22CO- . Los ejemplos adicionales de grupos de acilación adecuados tienen la estructura HOOC- (CH2) nCO- , en donde n es 4 a 40, por ejemplo 12 a 20, típicamente HOOC- (CH2) 14CO- , HOOC- (CH2) 15CO- , HOOC- (CH2)16CO-, HOOC- (CH2) 17C0- y HOOC- (CH2) 18CO- . Véase también el documento de E.U.A. 5905140 para ejemplos adicionales de grupos de acilación.

El término "tratamiento" y "tratar" , como se utiliza en la presente en relación a LH modificada significa la administración y cuidado de un paciente con el propósito de inducir desarrollo folicular y tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero.

El término "tratamiento" y "tratar" , como se utiliza en la presente en relación a un compuesto LH significa la administración y cuidado de un paciente con el propósito de tratar infertilidad o para promover la fertilidad. El paciente que va a ser tratado preferiblemente es un mamífero; en particular un ser humano, pero también puede incluir animales tales como perros, gatos, caballos, vacas, borregos y cerdos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Compuesto de hormona luteinizante biológicamente activo de acción prolongada La presente invención se relaciona con un compuesto de LH biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, en donde la administración del compuesto LH puede realizarse una o dos veces en relación con los procedimientos de ART, especialmente en la fase folicular. Esto es una ventaja considerable con respecto a los procedimientos de ART actuales y genera tratamientos de infertilidad mejorados.

Además, la presente invención se relaciona con un compuesto de LH biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, en donde la administración del compuesto LH se puede realizar a intervalos regulares en relación con los procedimientos de ART para sostener el soporte de las fases lútea y gestacional . Esto es una ventaja considerable con respecto a los procedimientos ART actuales y genera tratamiento de infertilidad mejorados.

En un aspecto amplio, la presente invención se relaciona con un compuesto de LH biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o compuesto de LH el cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo de un agonista de LH administrado de la misma manera que el compuesto de LH.

En otro aspecto amplio, la presente invención se relaciona con un compuesto de LH biológicamente activo de acción prolongada que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o el compuesto de LH el cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo de CG endógena.

En un aspecto adicional la presente invención se relaciona con un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada que comprende una CG de mamífero o un análogo de la misma o una LH de mamífero o un análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, transferrina y un CH3 (CH2) nC0- , , en donde n es 8 a 22 y un polímero.

En una modalidad, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una albúmina, tal como albúmina humana, albúmina humana recombinante , una albúmina humana modificada con unión aumentada a FcRn de mamífero, una albúmina recombinante modificada con unión aumentada a una FcRn de mamífero. Típicamente, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de albúmina humana recombinante (SEC ID NO: 20) . Típicamente la molécula farmacéuticamente se selecciona de albúmina humana K573P recombinante (SEC ID NO: 21) .

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de un fragmento de Fe de un anticuerpo de mamífero tal como un fragmento Fe recombinante de un anticuerpo de mamífero. Típicamente, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de la SEC ID NO : 22.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una variante de un fragmento de Fe de un anticuerpo de mamífero, tal como una variante recombinante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero. Típicamente, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90% de identidad, tal como por lo menos 95% de identidad con la SEC ID NO: 22, excluyendo la SEC ID NO: 22.

En una modalidad adicional, el agonista de LH se puede seleccionar de una molécula orgánica pequeña, un péptido, un polipéptido, una proteína y se puede producir por métodos de síntesis, medio recombinante o se puede obtener a partir de tejido o sangre. En una modalidad particular el agonista de LH es de origen no mamífero. En otra modalidad particular, el agonista de LH es de origen mamífero, tal como una proteína que se obtiene por medios recombinantes .

En una modalidad adicional, la CG de mamífero o análogo de la misma es una LH de mamífero o análogo de la misma que se selecciona de CG de mamífero recombinante o análogo de la misma o una LH de mamífero recombinante o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, el agonista de LH se selecciona de una CG de mamífero o una LH de mamífero. Cuando el agonista de LH es CG de mamífero típicamente es CG de primate, por ejemplo, CG de humano o CG de simio o CG de mono, pero también se puede seleccionar de otras especies de mamífero tal como CG equina, por ejemplo CG de caballo. Cuando el agonista de LH es una LH de mamífero, típicamente es una LH de primate, tal como una LH humana, LH de simio o LH de mono; las secuencias de LH de vaca; la secuencia de LH de cerdo; la secuencia de LH equina tal como LH de caballo; la secuencia de LH de borrego, la secuencia de LH de perro; la secuencia de LH de gato y la secuencia de LH de chivo. Típicamente, el agonista de LH es una CG humana.

En una modalidad adicional el agonista de LH se selecciona de un análogo de una CG de mamífero o un análogo de una LH de mamífero. Cuando el agonista de LH es un análogo de CG de mamífero, el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de gonadotropina coriónica, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad. Típicamente, el agonista de LH es un análogo de CG humana que tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia humana correspondiente de gonadotropina coriónica tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad. Cuando el agonista de LH es una análogo de una LH de mamífero, el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de hormona leuteinizante , tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad. Habitualmente , el agonista de LH es un análogo de LH humana que tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia humana correspondiente de hormona leuteinizante, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad.

Cuando el agonista de LH se selecciona de un polipéptido o proteína tal como un análogo de una CG de mamífero o un análogo de LH de mamífero, puede estar glucosilada. Habitualmente , el agonista de LH es una hCG la cual está glucosilada.

También puede ser que el compuesto LH como tal esté glucosilado y la glucosilación puede ser en uno del agonista de LH o sobre la molécula farmacéuticamente aceptable, cuando la molécula se selecciona de un polipéptido o proteína, tal como una albúmina humana.

El agonista de LH puede estar unido a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras, por ejemplo directamente a través de un enlace de valencia o indirectamente a través de un enlazante, enlazante el cual habitualmente es un enlazante bifuncional aunque también puede ser un enlazante multifuncional . En modalidades adicionales, el enlazante se selecciona de un enlazante químico, una porción de azúcar, un puente disulfuro, un enlazante fusionado, un enlazante hidrofílico, un enlazante hidrolizable . En una modalidad adicional, el agonista de LH se fusiona a la molécula farmacéuticamente aceptable a través se un enlazante peptídico. En una modalidad adicional el agonista de LH se fusiona directamente a la molécula farmacéuticamente aceptable de manera que genera un polipéptido o proteína. Al expresar el compuesto LH a partir de una célula hospedadora tal como una célula de CHO o célula de levadura. En una modalidad adicional, el agonista de LH se une a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante estable. En otra modalidad, el agonista de LH se une a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante lábil.

En consecuencia, el agonista de LH puede estar unido a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas manera utilizando técnicas que son bien conocidas en el ámbito previo y la presente invención también abarca la situación en donde uno o más de los agonistas de LH está unido a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables, tal como dos agonistas de LH unidos a una molécula farmacéuticamente aceptable o un agonista de LH unido a dos moléculas farmacéuticamente aceptables. En una modalidad adicional, el agonista de LH está unido a una o dos moléculas farmacéuticamente aceptables, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad adicional, la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se une a la molécula farmacéuticamente aceptable y en donde el enlazante se selecciona de un enlazante químico, opcionalmente un enlazante bifuncional. Típicamente, el enlazante químico de selecciona de una porción azúcar, un puente disulfuro, un enlazante hidrofílico, un enlazante hidrolizable , ácido dicarboxílico, hidrazidas de ácido carboxílico, maleimido hidrazidas, PDPH, SPDP, LC-SPDP, G BS, enlazantes alquilo y enlazantes PEG. En una modalidad adicional, el enlazante químico se selecciona de ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, N- [ácido maleimido caproico] hidrazida (EMCH) , N- [ácido maleimidopropionico] hidrazida (MPH o BMPH) , 4-[N-maleimidometil] ciclohexan-1-carboxilhidrazida, N- [k-ácido maleimidoundecanoico] hidrazida (KMUH) , hidrazida del ácido 4 - (4 -N-maleimidofenil ) butírico (MPBH) , éster de succinimida de NHS-3-maleimidopropionato (MPS-EDA) , (3- [2-piridilditio] ropionilhidrazida) conjugado con proteína reactiva con sulfurhidrilo, 3 - (2 -piridilditio) -propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-(3 - [2 -piridilditio] -propionamido) hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP), éster de N- (?-maleimidobutiriloxi) succinimida (GMBS), hidrazidas de ácido carboxílico que tienen de 2 a 5 átomos de carbono, -NH- (CH2 ) ra-C (O) - , en donde m es un número entero de 2 a 20 opcionalmente sustituido con un grupo no impedido esteáricamente como alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, acilo de 1 a 6 átomos de carbono, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2 o fenilo.

En una modalidad adicional la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma está unida químicamente de modo directo a la molécula farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable está unida a la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable está unida a la cadena beta de una CG de mamífero o análogo de la misma o a la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma está fusionada a la molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, tal como una albúmina, un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero o una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero, opcionalmente a través de un enlazador peptídico.

En una modalidad adicional, el enlazador peptídico tiene por lo menos un aminoácido, por ejemplo desde aproximadamente 1 a 200 aminoácidos, típicamente de 1 a 50 aminoácidos en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se encuentran de modo natural. Típicamente, el enlazante peptídico tiene de 1 a 40 aminoácidos, tal como de 1 a 30, tal como 1 a 20, tal como 1 a 10 aminoácidos.

En una modalidad adicional, el enlazante peptídico se selecciona de un enlazante constituido de aminoácidos que se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Típicamente, el enlazante peptídico está constituido de una mayor parte de aminoácidos que están estericamente no impedidos tales como glicina y alanina. En particular, el enlazante peptídico comprende una secuencia que se selecciona de -(G)n-, (GGS)n o (GGGGS)n, en donde n es un número entero de 1 a 50. Típicamente, n es un número entero que se selecciona de 1 a 10 tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10.

En una modalidad adicional, el enlazante peptídico se selecciona de GGG, SGGSGGS (SEC ID NO: 58), GGSGGSGGSGGSGGG (SEC ID NO: 59), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEC ID NO: 60), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 57) y EFAGAAAV (SEC ID NO: 56) .

En otra modalidad la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se fusiona directamente a la molécula farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte N-terminal de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte N-terminal de la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena alfa de la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena beta de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena beta de la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte C-terminal de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte C-terminal de LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena alfa de la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena beta de la CG de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena beta de la LH de mamífero o análogo de la misma.

En una modalidad adicional, la GC de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de una CG de mamífero o análogo de la misma. Típicamente, una hCG.

En una modalidad adicional, la CG de mamífero o análogo de la misma es una LH de mamífero o análogo de la misma que se selecciona de una LH de mamífero o análogo de la misma. Típicamente, una hLH.

En una modalidad adicional, la GC de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de dos CG de mamífero o análogos de las mismas. Típicamente, dos hCG.

En una modalidad adicional, la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de dos LH de mamífero o análogo de la misma. Típicamente, dos hLH.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula farmacéuticamente aceptable. Típicamente, una albúmina o un fragmento Fe o una variante de un fragmento Fe.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de dos moléculas farmacéuticamente aceptables. Típicamente, dos albúminas o dos fragmentos Fe o dos variantes de un fragmento Fe o una combinación de las mismas.

Los compuestos LH preferidos de la presente invención se seleccionan del conjugado 1 (conjugado hCG-PDPH-rHA) , conjugado 3 (conjugado hCG-SPDP-rHA) , conjugado 4 (conjugado hCG-PDPH-rHA activado por EDC) , conjugado 3VI (conjugado hCG-SPDP-rHA-K573P) y conjugado 4V1 (conjugado hCG-PDPH-rHA-K573P activado por EDC) .

Otros compuestos LH preferidos de la presente invención se seleccionan del producto 2 que consisten de la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 26, el producto 3 que consiste de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 28, el producto 4 que consiste de la SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 27, el producto 5 que consiste de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 29, el producto 7, que consiste de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 26, el producto 8 que consiste de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 30, el producto 9 que consiste de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 27, el producto 10 que consiste de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 31, el producto 11 que consiste de la SEC ID NO: 32 y SEC ID NO: 33, el producto 12 que consiste de la SEC ID NO: 32 y SEC ID NO: 34, el producto 13 que consiste de la SEC ID NO: 32 y SEC ID NO: 61, y el producto 14 que consiste de la SEC ID NO: 32 y SEC ID NO: 62.

Con el fin de producir el compuesto de LH el cual se puede administrar una o dos veces en relación con los procedimientos de ART, el compuesto de LH, cuando se administra a un mamífero, debe resultar en el agonista LH o el compuesto LH que tiene una vida media plasmática in vivo aumentada por lo menos 1.5 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por ejemplo de 1.5 veces a 25 veces.

En una modalidad adicional, el agonista de LH tiene una vida media plasmática in vivo de por lo menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, por ejemplo de 2 a 20 días. En una modalidad adicional, el compuesto de LH tiene una vida media plasmática in vivo de por lo menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, por ejemplo de 2 a 20 días.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición corporal biológica o concentración del agonista de LH o compuesto LH suficiente para inducir un folículo antral desde aproximadamente 10 mm de diámetro hasta una etapa preovulatoria (es decir, de aproximadamente 15 a 30 mm de diámetro) en la cual un ovocito en maduración puede finalizar la maduración para estar listo para reanudación de la meiosis .

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición de cuerpo biológico o concentración del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para inducir producción de andrógeno en un adolescente temprano, aproximadamente 1 año antes del nacimiento de la descendencia masculina o en la pubertad de sujetos femeninos y masculinos.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición de cuerpo biológico o concentración del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para el soporte en sujetos con hipogonadas e hipogonadotróficos .

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición corporal biológica o concentración del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para sostener progesterona en la fase peri-, en la fase ovulatoria y en la fase post-ovulatoria de un sujeto mamífero con el objetivo de regular el endometrio y útero para evitar o permitir la implantación de un blastocisto de mamífero.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición corporal biológica o concentración del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para sostener una progesterona en la fase peri . , ovulatoria o post-ovulatoria de un sujeto mamífero con el objetivo de preparar el endometrio y útero para implantación.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una concentración en plasma del agonista de LH o compuesto de LH para soportar la formación y mantenimiento del CL, cuando se suministra una inyección durante la fase folicular del ciclo menstrual en relación con el tratamiento con FSH, preferiblemente con 5-10 días después del inicio del tratamiento con FSH.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una concentración del agonista de LH o compuesto de LH para estimular suficiente liberación de progesterona desde CL después de una inyección durante la fase folicular del ciclo menstrual en relación con el tratamiento con FSH, preferiblemente 5-10 días después del inicio del tratamiento con FSH.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable tiene una unión a un receptor Fe neonatal (FcRn) tal como una unión dependiente de pH que permite que el compuesto LH escape a la degradación lisosómica, como se describe en Roopenian et al., "FcRn: the neonatal Fe receptor comes of age", Nature reviews, Immunology, vol . 7, p. 715.725, sept . 2007.

Una molécula farmacéuticamente aceptable típica la cual tiene unión para FcRn se selecciona de una albúmina, tal como albúmina modificada con unión aumentada a FcRn, albúmina humana o albúmina humana recombinante .

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de cualquiera de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas, receptores, glucosilaciones , grupos de acilación, azúcares, polímeros (por ejemplo, polietilenglicoles , PEG) , ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) y hormonas. Típicamente, la molécula farmacéuticamente aceptable, sin limitación, se selecciona de un fragmento Fe de anticuerpo de mamífero, transíerrina, albúmina tal como albúmina humana, albúmina recombinante, variantes de albúmina; un grupo de acilación tal como CH3 (CH2) nC0- , en donde n es 8 a 22; o un polímero tal como PEG, por ejemplo PEG de un peso molecular de por lo menos 5 kDa, por ejemplo de 10 kDa a 150 kDa, típicamente de 10 a 40 kDa.

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de un polímero tal como PEG. Típicamente, la porción PEG puede tener un tamaño promedio que se selecciona del intervalo de 500 Da a 200.000 Da, por ejemplo de 500 Da a 100.000 Da, por ejemplo de 2000 Da a 50.000 Da.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el compuesto LH de la presente invención y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, la composición farmacéutica es para inyección, tal como inyección subcutánea.

En relación con los procedimientos de ART, más de un medicamento en el tratamiento de infertilidad o para promover la fertilidad se pueden administrar, de modo concomitante o secuencial. Por lo tanto, está dentro del alcance de la presente invención utilizar un compuesto de LH de la presente invención en procedimientos ART tal como IVF o ICSI, para tratamiento de infertilidad o para promover la fertilidad en combinación con uno o más compuestos terapéuticamente activos adicionales utilizados habitualmente en el tratamiento de infertilidad o para promover la fertilidad. Por analogía, también está dentro del alcance de la presente invención utilizar un compuesto de LH de la presente invención en combinación con otros compuestos terapéuticamente activos utilizados normalmente en el tratamiento de infertilidad o para promover fertilidad en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infertilidad o para promover fertilidad.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en el tratamiento de infertilidad o para promover fertilidad de un sujeto mamífero, tal como tratamiento por tecnologías de reproducción asistida, por ejemplo tratamiento IVF o ICSI o un descenso incompleto de los testículos.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en un método para tratamiento reproductivo asistido en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces durante la fase folicular, la dosificación es suficiente para soportar el desarrollo del folículo. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones de bolo único. En una modalidad, la dosificación también es suficiente para proporcionar soporte lúteo.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto LH de la presente invención para uso en un método para tratamiento reproductivo asistido en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces durante la fase lútea por lo menos hasta dos semanas después de la ovulación. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones de bolo único. En una modalidad, el compuesto de LH se administra por primera vez después de la ovulación.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en un método para tratamiento reproductivo asistido en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces, durante la fase gestacional en por lo menos hasta dos semanas después de la ovulación. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones de bolo único. En una modalidad, el compuesto de LH se administra por primera vez después de la ovulación.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en un método para el tratamiento de pérdida de embarazo recurrente en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro o más veces durante el período gestacional temprano hasta 12 semanas antes de la concepción. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones de bolo único. En una modalidad, el compuesto de LH se administra por primera vez después de la ovulación.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en un método para mejorar la producción de progesterona y optimizar las probabilidades para un embarazo exitoso, en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro o más veces durante las primeras 12 semanas de gestación. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones de bolo único. En una modalidad, el compuesto de LH se administra por primera vez después de la ovulación.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un compuesto de LH de la presente invención para uso en un método para tratamiento reproductivo asistido en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una o dos veces, en relación con la inducción de ovulación. El compuesto de LH se puede administrar como una o varias inyecciones en bolo únicas .

En relación con la activación de ovulación se pueden utilizar diversos regímenes de tratamiento. En una modalidad se utiliza un agonista de GnRH para activación de ovulación. En otra modalidad se utiliza una hCG para activación de ovulación.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en promover la fertilidad o tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero masculino hipogonadal hipogonadotrópico .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el compuesto de LH de la presente invención para uso en promover la fertilidad o tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero masculino joven o adolescente que presenta criptorquidismo .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método de tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad eficaz del compuesto LH de la presente invención.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método para promover fertilidad de un sujeto mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad eficaz del compuesto LH de la presente invención .

En una modalidad adicional el sujeto mamífero se selecciona de un humano, una vaca, un cerdo, un caballo, un borrego, un perro, un gato y un chivo, típicamente un sujeto humano .

En un aspecto adicional la presente invención se relaciona con un método para preparar un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada tal como cualquiera de los conjugados descritos de la presente invención, que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, el método comprende hacer reaccionar un agonista de LH con un enlazante unido a una molécula farmacéuticamente aceptable, o hacer reaccionar un agonista de LH con un enlazante y después unir el enlazante a una molécula farmacéuticamente aceptable, o hacer reaccionar un enlazante con una molécula farmacéuticamente aceptable y después hacer reaccionar un agonista de LH con el enlazante unido a la molécula farmacéuticamente aceptable o por expresión del agonista de LH y la molécula farmacéuticamente aceptable de una célula hospedadora.

LH de mamífero modificado de acción prolongada La presente invención se relaciona con una LH de mamífero modificada de acción prolongada, por ejemplo LH humano unida, por ejemplo, fusionada a albúmina o conjugada a un grupo de acilación o PEG que antagoniza y activa el receptor de LH en un mamífero y proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma o la LH modificada es de 2 a 48 horas en un mamífero. La LH modificada suministrada ya sea en la fase folicular o como soporte de la fase lútea se considera que mejora la conveniencia del paciente y el resultado del tratamiento.

Además, el uso de una LH de mamífero modificada de acción prolongada no interferirá con los efectos específicos de que la hCG hiperglucosilada secretada del embrión de implantación ejercerá y será posible para el paciente para su conveniencia más temprana posible detectar si se encuentra embarazada mediante el uso de pruebas de embarazo comunes.

De modo colectivo, estos hallazgos sugieren que la preparación de LH de mamífero modificada de acción prolongada, en la cual los efectos específicos de LH a nivel de receptor se mantienen en combinación con una presencia constante de circulación serán capaces de optimizar COS en la fase folicular del ciclo menstrual y por lo tanto el resultado de tratamiento final.

En un aspecto amplio la presente invención se relaciona con una LH modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un compuesto de hormona leuteinizante (LH) biológicamente activo de acción prolongada que comprende una LH de mamífero o una análogo de la misma unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, transferrina y un CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 8 a 22 y un polímero para uso en combinación con una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH o para uso simultáneo, secuencial o separado para inducir desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , un tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o para inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero.

En una modalidad, la FSH se deriva exógenamente en el sujeto femenino mamífero. En otra modalidad, la FSH se produce endógenamente en el sujeto femenino mamífero.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, tal como una albúmina, por ejemplo albúmina humana, albúmina humana recombinante , albúmina humana modificada con unión aumentada a un FcRn de mamífero, una albúmina recombinante modificada con unión aumentada a una FcRn de mamífero; un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero tal como un fragmento Fe recombinante o un anticuerpo de mamífero; y una variante un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en el sujeto femenino mamífero.

En una modalidad adicional, la LH de mamífero tiene una vida media plasmática in vivo de por lo menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, por ejemplo de 4 a 48 horas, 5 a 40 horas, 6 a 36 horas, 7 a 30 horas, 8 a 28 horas, 9 a 26 horas, o 10 a 24 horas, típicamente de 6 a 8 horas. En una modalidad adicional, la LH modificada tiene una vida media plasmática in vivo de por lo menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, por ejemplo de 4 a 48 horas, 5 a 40 horas, 6 a 36 horas, 7 a 30 horas, 8 a 28 horas, 9 a 26 horas o 10 a 24 horas, típicamente de 6 a 8 horas.

Ante la administración de la LH modificada a un mamífero es importante que se alcance una concentración plasmática in vivo suficiente y que se mantenga durante un tiempo que se requiera para proporcionar un efecto de inducir desarrollo folicular en tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero. En modalidades adicionales, la LH modificada de la presente invención proporciona una concentración plasmática in vivo de la LH modificada, la LH de mamífero o una mezcla de las mismas, en un mamífero en el intervalo de 2 a 30 Ul/1, tal como 2 a 4 UI/1, 4 a 8 UI/1 a 14 UI/1, 14 a 20 Ul/1 o 20 a 30 Ul/1.

La LH de mamífero o análogo de la misma puede ser recombinante o sintética o una combinación de las mismas y se puede producir por métodos de síntesis tal como métodos químicos estándar, que incluye síntesis por un procedimiento automatizado o por medios recombinantes o se puede obtener de orina, tejido o sangre. En una modalidad adicional la LH de mamífero es una LH recombinante. En una modalidad adicional, la LH de mamífero es LH humana recombinante (rhLH) .

En una modalidad adicional la LH de mamífero se puede seleccionar de la secuencia de LH humana, la secuencia de LH de vaca, la secuencia de LH de cerdo, la secuencia de LH de caballo, la secuencia de LH de borrego, la secuencia de LH de perro, la secuencia de LH de gato y la secuencia de LH de chivo .

En una modalidad adicional, el análogo de LH de mamífero es una LH recombinante. El análogo de LH de mamífero el cual puede ser producido por medios recombinantes típicamente se selecciona de un análogo de la LH de mamífero, en donde el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de LH, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad. Por ejemplo, el análogo de LH de mamífero se selecciona de un análogo de LH humana en donde el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia humana de LH, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad. O bien, el análogo de LH de mamífero se selecciona de un análogo de la LH de caballo, en donde el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia LH de caballo, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad.

La LH de mamífero o análogo de una LH de mamífero, como se utiliza de acuerdo con la presente invención puede estar glucosilada. Típicamente, la LH de mamífero o análogo está glucosilada tal como una hLH la cual está glucosilada.

También puede ser que la LH modificada como tal esté glucosilada y la glucosilación puede ser en la LH de mamífero o sobre la molécula farmacéuticamente aceptable, cuando la molécula se selecciona de un polipéptido o proteína tal como albúmina humana. La LH de mamífero o análogo de la misma se puede unir a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras, por ejemplo directamente a través de un enlace de valencia o indirectamente a través de un enlazante, enlazante el cual típicamente es un enlazante bifuncional, aunque también puede ser un enlazante multifuncional . En modalidades adicionales, el enlazante se selecciona de un enlazante químico, una porción de azúcar, un puente disulfuro, un enlazante fusionado, un enlazante hidrofílico, o un enlazante hidrolizable . En una modalidad adicional, la LH de mamífero o análogo de la misma se fusiona a una molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante peptídico. En una modalidad adicional, la LH de mamífero o análogo de la misma se fusiona directamente a una molécula farmacéuticamente aceptable de manera que se genera un polipéptido o proteína, por expresión de la LH modificada a partir de una célula hospedadora tal como una célula CHO o célula de levadura. En una modalidad adicional, la LH de mamífero o análogo de la misma se une a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante estable. En otra modalidad la LH de mamífero o análogo de la misma se une a la molécula f rmacéuticamente aceptable a través de un enlazante lábil.

En consecuencia, la LH de mamífero o análogo de la misma se puede unir a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica anterior y la presente invención también comprende la situación en una o más de LH de mamífero o análogo de la misma se une a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables de manera que dos LH de mamífero o análogo de la misma unidas a una molécula farmacéuticamente aceptable o una LH de mamífero o análogo de la misma unida a dos moléculas farmacéuticamente aceptables. En una modalidad adicional, la LH de mamífero o análogo de la misma está unida a una o dos moléculas farmacéuticamente aceptables, tal como una molécula farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad adicional, la molécula farmacéuticamente aceptable tiene unión a receptor Fe neonatal (FcRn) , tal como una unión dependiente de pH que permite que la LH modificada escape a la degradación lisosómica, como se describe en Roopenian et al., "FcRn: the neonatal Fe receptor comes of age", Nature reviews, Immunology, vol . 7, p. 715.725, sept . 2007.

Una molécula farmacéuticamente aceptable típica la cual tiene unión para FcRn se selecciona de una albúmina, tal como albúmina modificada con unión aumentada o reducida a FcRn, albúmina humana o albúmina humana recombinante .

En una modalidad adicional la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de cualquiera de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas, receptores, glucosilaciones , grupos de acilación, azúcares, polímeros (por ejemplo, polietilenglicoles , PEG) , ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y AR ) y hormonas. Típicamente, la molécula farmacéuticamente aceptable, se selecciona, sin limitación, de un fragmento Fe de anticuerpo de mamífero, transíerrina, albúmina tal como albúmina humana, albúmina recombinante, variantes de albúmina; un grupo de acilación tal como CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 8 a 22; o un polímero tal como PEG, por ejemplo PEG de un peso molecular de por lo menos 5 kDa, tal como de 10 kDa a 150 kDa, típicamente de 10 a 40 kDa.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de la presente invención y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En relación con los procedimientos de ART, y en particular con la inducción de desarrollo folicular o COS como se explica en la presente, se puede administrar más de un medicamento, ya sea de modo concomitante o secuencial . Por lo tanto está dentro del alcance de la presente invención utilizar una LH modificada de la presente invención en procedimientos de ART, tal como inducción de COS, para tratamiento de infertilidad o para promover fertilidad en combinación con uno o más de otros compuestos terapéuticamente activos utilizados habitualmente en el tratamiento de infertilidad o para promover la fertilidad.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una LH modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero para uso en combinación con el FSH o molécula que tiene actividad de FSH para uso simultáneo, secuencial o separado para inducir desarrollo folicular en tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular el ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero. En una modalidad, la FSH se selecciona de FSH de mamífero, tal como FSH humana, en particular FSH recombinante, por ejemplo rhFSH. En una modalidad particular la FSH se selecciona de Puregon, Gonal F, Elonva, Fostinorm, Bravelle, Menopur .

En una modalidad adicional, la combinación de una LH modificada de la presente invención y una FSH o una molécula que tiene actividad FSH es para inducir desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , un tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero. En una modalidad adicional, la combinación de una LH modificada de la presente invención y una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH es para inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de una sujeto femenino mamífero. Típicamente, al inducir desarrollo folicular o COS; la LH modificada de la presente invención y una FSH o una molécula que tenga actividad de FSH se administran en un intervalo de relación UI (FSH: LH modificada) de 20:1 1:20. En modalidades adicionales, la FSH: LH modificada se administra en relaciones UI que varían de 18:1 a 1:18, 15:1 a 1:15, 12:1 a 1:12, 9:1 a 1:9, 5:1 a 1:5 tal como 4:1 a 1:4.

Aunque como se establece en lo anterior la FSH y LH modificada se pueden administrar de manera simultánea, secuencial o separado, la combinación típicamente se administra junta ya sea como un kit de partes que comprenden la LH modificada y FSH en formas de dosificación separadas que pueden ser la misma, por ejemplo dos inyecciones separadas en un kit, tal como inyecciones subcutáneas o como una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de la presente invención y una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que la LH modificada y la FSH se administren subcutáneamente, preferiblemente dentro de la pared abdominal anterior. Las formulaciones para administración parenteral habitualmente son estériles. Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosa y no acuosa las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos los cuales vuelven a la formulación isotónica con la sangre del sujeto mamífero al que se administra; suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes también se encuentran dentro del alcance de la invención. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo ampolletas selladas y frascos, y se pueden almacenar en condición liofilizada que requiere únicamente la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyecciones extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas. Las formulaciones se pueden administrar a través de una jeringa llenada previamente, un autoinyector o un autoinyector de dosis múltiples. Típicamente, el compuesto LH y la FSH o la molécula que tiene actividad de FSH se proporcionan para uso simultáneo en una composición farmacéutica .

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método para inducir desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , en tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la LH modificada de la presente invención de manera simultánea, secuencial o separada en combinación con una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH. En una modalidad adicional, la FSH o la molécula que tiene actividad de FSH se selecciona de FSH de mamífero tal como FSH humana, en particular FSH recombinante , por ejemplo rhFSH.

En una modalidad adicional, el sujeto mamífero se selecciona de un humano, una vaca, un cerdo, un caballo, un borrego, un perro, un gato y un chivo, típicamente, un sujeto humano .

En un aspecto adicional la presente invención se relaciona con un método para preparar una LH modificada de la presente invención, tal como cualquiera de los conjugados descritos en la presente de la presente invención que comprende LH de mamífero o un análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o un análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero, el método comprende hacer reaccionar una LH de mamífero o un análogo de la misma con un enlazante unido a una molécula farmacéuticamente aceptable o hacer reaccionar una LH de mamífero o análogo de la misma con un enlazante y después unir el enlazante a una molécula farmacéuticamente aceptable o hacer reaccionar un enlazante con una molécula farmacéuticamente aceptable y después hacer reaccionar una LH de mamífero o análogo de la misma con el enlazante unido a la molécula farmacéuticamente aceptable o por expresión de la LH de mamífero o análogo de la misma y la molécula farmacéuticamente aceptable a partir de una célula hospedadora .

Métodos de la invención La figura la y la figura Ib describen protocolos para estimulación controlada de ovarios, como se conoce en la técnica anterior. El protocolo en la figura la comienza con la administración de FSH, recombinante o urinaria en el día 1-3 del ciclo menstrual. Se administra FSH en dosificaciones diarias hasta la inducción de ovulación. Desde aproximadamente el día 6, se administra un antagonista de GnRH para evitar una purga prematura de LH antes de la inducción de ovulación. La ovulación se induce al administrar una carga de activación de 5,000 a 10,0000 UI de hCG recombinante . De manera alternativa, la ovulación se puede inducir por activación del agonista de GnRH. Esto habitualmente se realiza cuando uno a tres folículos tienen un tamaño de 17 mm. Con el fin de proporcionar soporte lúteo, se administra progesterona por vía vaginal o intramuscular, comenzando en el día de transferencia del embrión. Se continúa la administración de progesterona por lo menos hasta el día 28 del protocolo de estimulación. En muchos casos se administra progesterona hasta la semana 5 o incluso hasta la semana 10 del embarazo.

En la figura Ib, las dosificaciones diarias de FSH en los días 1 a 6 se sustituyen por una dosificación de FSH de acción prolongada (corifolitropina) . En aproximadamente el día 5 a 7 el nivel de suero de corifolitropina disminuye y se suministran dosificaciones diarias de FSH recombinante o urinaria hasta activación de ovulación. La ventaja de utilizar corifolitropina es que la mujer no necesita visitar la clínica y recibir inyecciones de FSH los días 2 a 5 ó 6.

La figura 2a es una ilustración esquemática de una modalidad del protocolo de estimulación de acuerdo con la presente invención en base en la administración de gonadotropinas de acción prolongada. En este caso, la FSH de acción prolongada, tal como la corifolitropina alfa se administra los días 1 a 3 de un ciclo menstrual. En el caso de corifolitropina la dosificación puede ser de 100 y 150 g para la mujer. La dosificación y la vida media en suero se selecciona de manera que el nivel de suero de FSH disminuye en las etapas posteriores de la fase folicular de manera que se reduce de manera significativa el reclutamiento de folículo adicional en la fase tardía de la fase folicular. Esto sirve para reducir el número de folículos estimulados para desarrollarse y de esta manera se reduce el riesgo de OHSS.

Al igual que en los protocolos conocidos, se administra un antagonista de GnRH comenzando en los días 4 a 7 del protocolo de estimulación. El desarrollo de folículo se estimula por administración de una dosificación de una hCG de acción prolongada en el día 6 del protocolo de estimulación o más temprano. Una LH de acción prolongada también se puede utilizar. La dosificación de hCG de acción prolongada o LH es suficiente para estimular el desarrollo de folículo y suficientemente baja para reducir el riesgo de OHSS. La hCG de acción prolongada o LH se administra en una dosificación que proporciona una respuesta biológica similar a la respuesta obtenida con un nivel de suero de 4-15 Ul/litro. Para reducir aún más el riesgo de OHSS, se utiliza un disparo de activador de agonista de GnRH para inducir ovulación cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 15 mm, preferiblemente cuando 3 folículos tienen un diámetro de 17 mm. El intervalo de dosificaciones adecuados entre 0.1 y 1 mg cuando se administran por vía subcutánea o intranasal. El soporte de la fase lútea se puede proporcionar por administración ya sea de progesterona como en los protocolos conocidos (ilustrados en la figura 2a) o por la administración de un agonista de LH como se describe e ilustra en la presente (figura 4a y figura 4b) .

La figura 2b ilustra un protocolo de la invención, en donde la foliculogénesis es estimulada por administración de FSH recombinante o derivada de orina como inyecciones diarias desde el día 1 hasta aproximadamente el día 6. Las dosificaciones diarias preferidas de FSH son 150-225 UI al día. El día exacto de suspensión de la administración de FSH se determina por exploración UV y medición del diámetro de folículo. Cuando por lo menos un folículo ha alcanzado un diámetro de 12 a 14 mm se suspende la administración de FSH y se administra una dosis única de hCG o LH de acción prolongada para estimular el desarrollo del folículo como se describe en lo anterior. La inducción del ovocito y el soporte lúteo como se describe en la figura 2a. En el régimen de la figura 2b, el antagonista y el agonista de GnRH se administran como se describe para la figura 2a.

La figura 2c ilustra un protocolo de la invención, en donde la foliculogénesis y el desarrollo del folículo se estimulan por administración de dosificaciones diarias de FSH como en la figura 2b y las dosificaciones diarias de hCG o LH partiendo de aproximadamente el día 6. Las dosificaciones adecuadas de hCG durante la fase folicular incluyen 25-400 UI al día, tal como 50-300 UI al día, de manera más preferible 100-300, tal como 150-250, por ejemplo 175-225 UI al día. En el régimen de la figura 2c, el antagonista y agonista de GnRH se administran como se describe para la figura 2a. El soporte lúteo no se ilustra aquí pero puede ser ya sea por administración de progesterona o administración de LH/hCG, como se ilustra en la figura 4a o la figura 4b.

En un protocolo alternativo basado en la administración de hCG o LH de acción prolongada (de larga duración) ilustrado en la figura 3a, la FSH, el antagonista de GnRH y el agonista de GnRH se administran como se describe para el protocolo en la figura 2b. El desarrollo del folículo y el soporte lúteo se proporcionan al administrar hCG o LH de acción prolongada a intervalos de 2 a 7 días (ilustrado por 5 días) partiendo, por ejemplo, desde aproximadamente el día 6 en la fase folicular y continuando por lo menos hasta la prueba de embarazo. En caso de embarazo, la administración de LH o hCG de acción prolongada puede continuar hasta la semana 5, por ejemplo hasta la semana 10 del embarazo.

Una dosificación adecuada de hCG o LH de acción prolongada durante la fase folicular es una dosificación que proporciona una respuesta biológica similar a la respuesta obtenida con un nivel en suero de 4-15 Ul/litro.

En protocolos alternativos, la hCG recombinante o urinaria o la LH se administran en dosificaciones diarias durante la fase folicular y a través de la fase lútea (figura 3b y figura 3c) . Las figuras ilustran la administración de hCG, pero de igual manera es concebible que se administre LH. La administración de hCG puede comenzar en el día 6 de la estimulación pero de igual manera puede comenzar antes, por ejemplo en el día 2 de la estimulación. Las dosificaciones adecuadas de hCG urinaria o recombinante durante la fase folicular incluyen 25-400 UI al día, por ejemplo 50-300 UI al día, de manera más preferible 100-300, tal como 150-250, por ejemplo, 175-225 UI al día. En la fase lútea se prefiere utilizar LH o un análogo o variante de LH, dado que la administración de hCG recombinante o urinaria puede resultar en una detección falsa de embarazo bioquímico. La mayor parte de las pruebas de embarazo de dispositivo de flujo lateral se basa en la detección de hCG urinaria. Las dosificaciones adecuadas de hCG recombinante o urinaria en la fase lútea incluyen 25-400 UI de hCG por día, preferiblemente 50-200 UI de hCG por día, por ejemplo 75-200, tal como 100-150 ó 120-170 Ul/dia.

El protocolo en la figura 3c ilustra otro protocolo de la invención en el cual se administra hCG (o LH) de antemano desde el día 2 del protocolo de estimulación. De otro modo, el protocolo es idéntico al protocolo de la figura 3b. La estimulación del folículo del protocolo en la figura 3b y en la figura 3c también se puede realizar con hCG de acción prolongada o LH de acción prolongada, la cual se administra como una dosificación única en el día 1, 2 ó 3 en el protocolo de estimulación.

La figura 4a y la figura 4b ilustran protocolos para soporte lúteo de acuerdo con la invención. De acuerdo con la modalidad ilustrada (figura 4a) se proporciona soporte lúteo al administrar dosificaciones diarias de LH (o hCG) desde aproximadamente el momento de recolección de los ovocitos y continuando hasta el día 28 del protocolo. Un intervalo de dosificación preferido de LH recombinante urinario para soporte lúteo incluye dosificaciones diarias de 100 a 600 UI de LH al día, de manera preferible 150 a 450 UI de LH al día, tal como 200 a 400 UI de LH al día, por ejemplo, 250 a 350 Ul/día. Un intervalo de dosificación preferido de hCG recombinante o urinaria incluye 25 a 400 UI de hCG al día, preferiblemente 50 a 200 UI de hCG al día, por ejemplo, 75 a 200, tal como 100 a 150 o 120 a 170 Ul/día.

El soporte lúteo continúa hasta por lo menos dos semanas después de la ovulación, pero puede continuar hasta la semana 5 ó 10 gestacional.

Se pueden obtener resultados similares al administrar LH de acción prolongada hCG de acción prolongada (figura 4b) una o más bases durante la fase lútea en una dosificación que proporciona una respuesta biológica similar a la respuesta obtenida al administrar dosificaciones diarias de las dosificaciones preferidas de LH. El protocolo de soporte lúteo se puede utilizar junto con cualquier tipo de ART.

Los diferentes protocolos de la invención se pueden combinar de muchas maneras en la medida en que no se desvíen del concepto inventivo de la invención como se define en las reivindicaciones independientes.

HORMONA ESTIMULANTE DE FOLICULO (FSH) La hormona estimulante de folículo (FSH, por sus siglas en inglés) regula el desarrollo, crecimiento, maduración en la pubertad y procesos reproductivos del cuerpo humano .

Tanto en hombres como en mujeres, FSH estimula la maduración de células germinales. En los hombres, la FSH induce a las células de sertoli a secretar inhibina y estimula la formación de uniones estrechas sertoli-sertoli (zona ocluida) . En mujeres, FSH estimula el crecimiento y reclutamiento de folículos de ovario inmaduros en el ovario. En los folículos antrales tempranos (pequeños) , la FSH es el factor de supervivencia principal que rescata a los folículos de apoptosis (muerte programada de las células somáticas del folículo y el ovocito) . En el período de transición de la fase lútea-folicular los niveles en suero de progesterona y estrógeno (principalmente estradiol) disminuyen y ya no suprimen más la liberación de FSH, en consecuencia FSH alcanza un pico aproximadamente en el día tres (día uno del primer día del ciclo menstrual) .

La FSH es una glucoproteína heterodimérica . Cada unidad monomérica es una molécula de proteína con una o más cadenas oligosacáridas unidas covalentemente a cadenas laterales de aminoácidos; dos de estas unidades monoméricas constituyen la proteína funcional completa. El dímero de proteína contiene dos unidades polipeptídicas , marcadas como subunidades a y ß. Las subunidades de LH, FSH, TSH y hCG son idénticas y contienen 92 aminoácidos (véase la figura 5) . FSH tiene una subunidad ß de 118 aminoácidos (FSHB) la cual confiere su acción biológica específica y es responsable de la interacción con el receptor de FSH. La parte azúcar de la hormona está constituida de fucosa, galactosa, mañosa, galactosamina, glucosamina y ácido siálico, este último es crítico para su vida media biológica. La vida media de FSH es de 3 a 4 horas .

El gen para la subunidad a se localiza en el cromosoma 6p21.1-23. Se expresa en diferentes tipos de células. El gen para la subunidad ß de FSH se localiza en el cromosoma llpl3 y se expresa en gonadotropos de las células de la hipófisis, controlado por GnRH, inhibido por inhibina e incrementado por activina.

La cadena beta de la FSH preferida de la presente invención se selecciona del grupo que consiste de secuencias que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NOS: 10, 11, 12, 13 ó 15, de manera más preferible 85%, de manera mucho más preferible 90%, de manera más preferible 95%. Preferiblemente, una variante comprende los residuos cisteína conservados en la posición y separación de la SEC ID NO: 10. En una modalidad particularmente preferida, la FSH comprende la subunidad alfa humana que tiene la SEC ID NO: 10.

Se entenderá por aquellos expertos en el ámbito que FSH puede ser sustituida por un análogo biológicamente activo o por un compuesto que estimule la secreción endógena de FSH. En esta última clase se incluyen inhibidores de aromatasa y anti-estrógenos tales como tamoxifeno y citrato de clomifeno (CC) . Estos compuestos estimulan la secreción endógena de FSH al remover la retroalimentación negativa ejercida por estrógeno en el hipotálamo (ya sea por receptores antagonizantes de estrógeno, como en el caso de CC y tamoxifeno o por disminuir en gran medida las concentraciones de estrógeno, como en el caso de los inhibidores de aromatasa) . Otros tipos de análogos de FSH incluyen, por ejemplo, análogos de FSH de cadena sencilla en los cuales la subunidad [beta] está fusionada al CTP de hCG, el cual a su vez está fusionado a la subunidad [alfa] de FSH, como se describe en el documento WO 96/05224 (FSH de cadena sencilla-CTP) .

En una modalidad adicional, la FSH se selecciona de un análogo de una FSH de mamífero o un análogo de una FSH de mamífero. Cuando la FSH es un análogo de una FSH de mamífero, el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de FSH, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad. La identidad de secuencia se aplica tanto a las cadenas alfa como beta de FSH.

Las dos formas más comunes utilizadas son gonadotropina menopáusica humana urinaria (que contiene actividad de FSH y LH) y FSH recombinante (que contiene FSH sin actividad alguna de LH) . Debido a la vida media relativamente breve de todas las preparaciones de FSH utilizadas actualmente, los protocolos clínicos para inducción del desarrollo multifolicular en mujeres estimuladas por IVF requieren inyecciones diarias. El uso de versiones de acción prolongada de FSH, que presentan vidas medias prolongadas se puede utilizar para sustituir las inyecciones diarias de FSH.

La actividad de FSH normalmente está indicada en UI siguiendo la farmacopea. Actualmente las preparaciones puras de FSH también se pueden fabricar y la actividad se puede proporcionar en masa (por ejemplo, 9 por frasco) . En la presente invención se entiende que la actividad proporcionada en UI se correlaciona con la actividad de FSH proporcionada con otras unidades.

En una modalidad de la invención la FSH es FSH de acción prolongada. Por acción prolongada se quiere indicar una proteína que tiene una vida media en suero la cual es por lo menos 1.5 veces la vida media en suero de FSH recombinante o urinaria, de manera más preferible por los menos 2 veces, de manera más preferible por lo menos 3 veces, de modo más preferible por lo menos 4 veces, de manera más preferible por lo menos 5 veces, de manera más preferible por lo menos 7 veces, de manera más preferible por lo menos 10 veces, tal como por lo menos 15 veces, por ejemplo por lo menos 20 veces tal como por lo menos 25 veces, por ejemplo, por lo menos 30 veces, 40 veces o 50 veces o más.

Preferiblemente, la vida media de FSH de acción prolongada es no mayor de 72 horas, tal como 48 horas. Esto vuelve más fácil controlar la administración de FSH en las fases posteriores de foliculogénesis .

La FSH de acción prolongada puede ser, por ejemplo, FSH-CTP, la cual se describe en el documento WO 93/06844 y tiene una subunidad [alfa] de FSH tipo natural y una subunidad [beta] que consiste de la subunidad [beta] de FSH humana natural (SEC ID NO: 10) fusionada en su parte carboxilo terminal al péptido carboxi terminal (CTP) de la subunidad [beta] de hCG (residuos 118 a la posición 145 de la secuencia hCG [beta] nativa, SEC ID NO: 9) . La subunidad beta resultante tiene la secuencia de la SEC ID NO: 15.

La corifolitropina alfa es una glucoproteína producida en células CHO por tecnología de ADN recombinante . La corifolitropina alfa se designa como un estimulante de folículo sostenido con el mismo perfil farmacodinámico que (rec)FSH, pero con una duración notablemente prolongada de actividad de FSH. Debido a su capacidad para iniciar y sostener el crecimiento folicular múltiple hasta por una semana, una inyección subcutánea única de la dosis recomendada de corifolitropina (ElonvaMR) puede sustituir parte o la totalidad de las primeras siete inyecciones de cualquier preparación diaria de (rec)FSH en un ciclo de tratamiento de COS. La duración prolongada de la actividad de FSH se obtiene al agregar el péptido carboxi terminal de la subunidad ß de gonadotropina coriónica humana (hCG) a la cadena ß e la FSH humana (SEC ID NO: 10) . La corifolitropina alfa no muestra ninguna actividad intrínseca LH/hCG. La corifolitropina alfa tiene una vida media de eliminación promedio de 69 horas (59 a 79 horas) .

La corifolitropina preferiblemente se puede administrar como una inyección en bolo de 40 a 240 por mamífero femenino, tal como por ejemplo 60 a 220 µ9 por mamífero femenino, tal como por ejemplo 80 a 200 9 por mamífero femenino, tal como por ejemplo 100 a 180 µ9 por mamífero femenino o tal como por ejemplo 100 a 150 µ9 por mujer. La corifolitropina puede, en otra modalidad, administrarse como una inyección en bolo de 40 a 120 µg por mamífero femenino, tal como por e emplo 60 a 100 µ9 por mamífero femenino, o tal como por ejemplo 70 a 90 µ9 por mamífero femenino. En otra modalidad adicional, la corifolitropina se administra como una inyección en bolo de 120 a 240 \i¡ por mamífero femenino, tal como por ejemplo 140 a 220 µ9 por mamífero femenino, tal como por ejemplo 160 a 200 µ9 por mamífero femenino o tal como por ejemplo 170 a 190 por mamífero femenino. La corifolitropina ha sido aprobada para dosificaciones de 100 µ< para mujeres menores de 60 kg y de 150 µg para mujeres de más de 60 kg.

La administración de corifolitropina como una inyección en un bolo preferiblemente es en los días 1 a 3 del ciclo menstrual, tal como por ejemplo en el día 1, día 2 o día 3 del ciclo menstrual.

Así, en una modalidad preferida, FSH es FSH de acción prolongada, tal como corifolitropina, preferiblemente administrada como una inyección en bolo de 40 a 240 µg por mamífero femenino en los días 1 a 3 del ciclo menstrual.

En aspectos de la invención en donde se utiliza FSH (o un análogo) junto con técnicas o regímenes de COS, las dosis apropiadas y los regímenes de administración serán evidentes para una persona experta en el ámbito y cualquier dosis y régimen de administración apropiados se pueden utilizar .

Por ejemplo, se puede administrar FSH en una dosificación que proporciona un nivel sérico de 1 a 50 UI de FSH por litro, tal como por ejemplo 2 a 40 UI de FSH por litro, tal como 3 a 35 UI de FSH por litro, por ejemplo, 4 a 30 UI de FSH por litro, tal como por ejemplo 5 a 25 UI de FSH por litro, por ejemplo, 7 a 20 UI de FSH por litro, tal como por ejemplo 10 a 15 UI de FSH por litro durante la fase folicular.

Se prefiere que se administre FSH en una dosificación que proporciona un nivel sérico de 5 a 25 UI de FSH por litro, de manera preferible 10 a 15 UI por litro durante la fase folicular.

En una modalidad, FSH se puede administrar en dosificaciones diarias de 50 a 600 UI de FSH al día, preferiblemente 100 a 300 UI de FSH al día, tal como 150 a 225 Ul/día. En algunos pacientes que presentan una respuesta disminuida a FSH puede ser deseable utilizar dosis de hasta 600 UI de FSH al día. Un régimen típico es el siguiente: el 51 paciente comienza con 150 UI de FSH al día, Si es adecuado el desarrollo folicular se puede mantener la dosis de 150 UI de FSH/día. Si el desarrollo folicular es inadecuado la dosis se puede implementar a 225, 300, 375, 450, 525 ó 600 UI de FSH/día. Idealmente, la dosis acumulativa de FSH no debe exceder de 6000 UI/ciclo.

La FSH utilizada en los métodos de la invención puede ser de cualquier fuente. Las fuentes son bien conocidas por una persona experta en el ámbito de inducción de ovulación y procedimientos de COS. Se puede utilizar una preparación urinaria de FSH, por ejemplo hMG la cual contenga actividad de FSH y LH, en una relación 1:1.

Así, en una modalidad de la FSH de la presente invención es FSH recombinante o derivada de orina administrada en dosificaciones diarias de 50 a 600 UI de FSH al día, preferiblemente 100 a 300 UI de FSH al día, tal como 150 a 225 Ul/día.

Se puede administrar FSH comenzando en el día del ciclo 1 a 3 del ciclo menstrual, tal como por ejemplo en el día 1 del ciclo, por ejemplo en el día 2 del ciclo o por ejemplo en el día 3 del ciclo del ciclo menstrual.

La administración de FSH se suspende cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de 12 a 14 mm, tal como por ejemplo 12 a 13 mm, por ejemplo 13 a 14 mm. La administración de FSH puede suspenderse, por ejemplo, en día del ciclo 4, 5, 7 ú 8 del ciclo menstrual. En casos típicos de la invención la administración de FSH se suspende en el día 6 del ciclo del ciclo menstrual. El propósito de suspender la administración de FSH es detener en la foliculogénesis adicional y permitir que los folículos más grandes maduren. Se le conoce en el ámbito que existe una correlación entre el número de folículos y el riesgo de OHSS .

Cuando se administra FSH, es FSH recombinante o derivada de orina, el suspender la administración de FSH simplemente requiere que no se administre más FSH. El nivel en suero de FSH después tenderá a disminuir durante el siguiente par de días a un nivel el cual ya no estimulará la foliculogénesis . Cuando se administra FSH de acción prolongada, por ejemplo corifolitropina alfa, la suspensión de la administración de FSH significa que debe suspenderse la administración de manera que el nivel de la actividad FSH sérica ya no estimule la foliculogénesis en los dos días después de que los primeros folículos han alcanzado los diámetros descritos antes. En el caso de administración de, por ejemplo corifolitropina alfa, se prefiere administrar solo una dosificación de corifolitropina alfa en el primer día del protocolo de estimulación. Si existe una necesidad de foliculogénesis adicional, se puede administrar FSH recombinante o derivado de orina posteriormente en el ciclo de estimulación pero antes de que los folículos alcancen un tamaño de 12 a 14 itim. De esta manera, se puede controlar más fácilmente el nivel del suero de FSH.

De manera general, el nivel de la actividad de FSH sérica, medida en UI o g por litro se encontraría en un nivel el cual está por debajo de 50% del nivel sérico durante los primeros 1 a 6 días del protocolo de estimulación, de manera más preferible por debajo de 25%, tal como debajo de 10%.

HORMONA LUTEINIZANTE (LH) LH es una hormona producida por la hipófisis anterior y es esencial para la reproducción tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, en el momento de menstruación, FSH inicia el crecimiento folicular, afectando específicamente células de granulosa. Con el incremento en estrógenos, los receptores de LH también se expresan sobre el folículo que madura, lo que produce una cantidad en aumento de estradiol. A la postre, en el momento de maduración del folículo, el incremento de estrógeno induce, por medio de la superficie de contacto hipotalámica el efecto de "retroalimentación positiva", una liberación de LH durante un período de 24 a 48 horas. Esta "descarga de LH" activa la ovulación, por lo que no solo libera al ovocito sino también inicia la conversión del folículo residual en un cuerpo lúteo que, a su vez, produce progesterona para preparar el endometrio para una posible implantación. LH es necesaria para mantener la función lútea durante las primeras dos semanas. En caso de un embarazo, la función lútea se mantendrá adicionalmente por la acción de hCG (una hormona muy similar a LH) a partir del embarazo recién establecido. La LH soporta a las células de la teca en el ovario que proporcionan andrógenos y precursores hormonales para producción de estradiol. LH es una glucoproteína heterodimérica . Cada unidad monomérica es una molécula de proteína con una o más cadenas oligosacáridas unidas covalentemente a cadenas laterales de aminoácidos; dos de estas unidades monoméricas constituyen la proteína funcional completa. El dímero proteínico contiene dos unidades polipeptídicas , marcadas como subunidades alfa y beta. Las subunidades alfa de LH, FSH, TSH y hCG son idénticas y contienen 92 aminoácidos. LH tiene una subunidad beta de 141 aminoácidos (LHB) la cual le confiere su acción biológica específica y es la responsable de la interacción con el receptor de LH. Esta subunidad beta contiene una secuencia de aminoácidos que presenta homologías con la de la subunidad beta de hCG y ambas estimulan el mismo receptor. No obstante, la subunidad beta de hCG contiene 24 aminoácidos adicionales y las dos hormonas difieren en la composición de sus porciones de azúcar.

La cadena beta de LH de la presente invención se selecciona del grupo que consiste de secuencias que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia con las SEC ID NOS: 4, 5, 6, 7 y 8, de manera más preferible 85%, de manera más preferible 90%, de manera más preferible 95%. Preferiblemente, una variante comprende los residuos cisteína conservados en la posición y separación de la SEC ID NO: 4. En una modalidad particularmente preferida, la LH comprende la subunidad alfa humana que tiene la SEC ID NO: 4.

La diferente composición de estos oligosacáridos afecta la bioactividad y velocidad de degradación y eliminación. La vida media biológica de LH es de 20 minutos lo cual es mucho más breve que la de FSH (3 a 4 horas) y de hCG (24 a 30 horas) .

Se entenderá por una persona experta en el ámbito que LH puede ser sustituida por un análogo biológicamente activo o por un compuesto que estimule la secreción de LH endógena. Los análogos de LH incluyen todas las moléculas las cuales ejercen los mismos efectos fisiológicos, bioquímicos o biológicos que LH y/o que se unen a los mismos receptores que LH. Algunos análogos de LH también pueden incluir LH de cadena sencilla. Se sabe que hCG comparte algunas acciones fisiológicas con LH. Algunos ejemplos de análogos de LH se describen, por ejemplo, en la patente Europea no. EP 0 322 226 (Applied Research Systems) , WO 92/22568 (University of Medicine & Dentistry of New Jersey) , WO 96/05224 (Washington University) , WO 90/09800 (Washington University) , WO 93/06844 (Washington University) , WO 98/43999 (Washington University) , WO 99/25849 (Washington University) , WO 00/61586 (Akzo Nobel) .

La LH y sus análogos o el agonista de LH se pueden seleccionar de una molécula orgánica pequeña, un péptido, un polipéptido, una proteína y se pueden producir por métodos sintéticos, medios recombinantes o se pueden obtener de sus fuentes naturales, por ejemplo de orina, tejido o sangre.

En una modalidad particular el agonista de LH es LH recombinante o derivada de orina. En otra modalidad el agonista de LH es de origen no mamífero. En otra modalidad particular el agonista de LH es de origen de mamífero tal como proteína obtenida por medios recombinantes. En una modalidad adicional, el agonista de LH se selecciona de gonadotropina coriónica (CG) de mamífero o una LH de mamífero. Cuando el agonista de LH es una CG de mamífero, típicamente es una CG de primate, por ejemplo una CG humana pero también se puede seleccionar de otras especies de mamífero tales como CG de caballo.

En una modalidad adicional el agonista de LH se selecciona de un análogo de una LH de mamífero o un análogo de una LH de mamífero. Cuando el agonista de LH es un análogo de una LH de mamífero el análogo preferiblemente tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de hormona leuteinizante , tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad, 98% de identidad. La variación en la secuencia puede estar en la cadena alfa, en la cadena beta o en ambas. El agonista de LH puede ser un análogo de una CG humana que tenga por lo menos 80% de identidad con la secuencia humana correspondiente de gonadotropina coriónica tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad. Cuando e agonista de LH es un análogo de una LH de mamífero el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de la hormona leuteinizante como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad. Típicamente, el agonista de LH es un análogo de una LH humana que tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia humana correspondiente de hormona leuteinizante tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad.

Cuando el agonista de LH se selecciona de un polipéptido o proteína, tal como un análogo en una CG de mamífero o un análogo de una LH de mamífero, puede estar glucosilada. Típicamente, el agonista de LH es una hCG la cual está glucosilada. También puede ser que el compuesto LH como tal esté glucosilado y la glucosilación puede ser en el agonista de LH o en la molécula farmacéuticamente aceptable, cuando la molécula se selecciona de un polipéptido o proteína, tal como una albúmina humana. El agonista de LH puede estar unido a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras, por ejemplo directamente a través de un enlace de valencia o indirectamente a través de un enlazante, enlazante el cual típicamente es un enlazante bifuncional, aunque también puede ser un enlazante multifuncional . En modalidades adicionales, el enlazante se selecciona de un enlazante químico, una porción de azúcar, un puente disulfuro, un enlazante fusionado, un enlazante hidrofílico, un enlazante hidrolizable . En una modalidad adicional, el agonista de LH se fusiona a la molécula farmacéuticamente aceptable a través se un enlazante peptídico. En una modalidad adicional el agonista de LH se fusiona directamente a la molécula farmacéuticamente aceptable de manera que genera un polipéptido o proteína. Al expresar el compuesto LH a partir de una célula hospedadora, tal como una célula de CHO o célula de levadura. En una modalidad adicional, el agonista de LH se une a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante estable. En otra modalidad, el agonista de LH se une a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazante lábil. En consecuencia, el agonista de LH puede estar unido a la molécula farmacéuticamente aceptable de diversas maneras utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica anterior y la presente invención también comprende la situación en donde uno o más agonistas de LH están unidos a una o más moléculas farmacéuticamente aceptables, de manera que dos agonistas de LH están unidos a una molécula farmacéuticamente aceptable o un agonista de LH está unido a dos moléculas farmacéuticamente aceptables. En una modalidad adicional, el agonista de LH está unido a una o dos moléculas farmacéuticamente aceptables, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable.

Cuando el agonista de LH es una LH de mamífero, típicamente es una LH humana, pero también se puede seleccionar de otras especies de mamífero tal como LH de vaca, LH de cerdo, LH de caballo, LH de borrego, LH de perro, LH de gato y LH de chivo. Típicamente, el agonista de LH es una LH humana o hCG humana. Normalmente, IVF involucra tratamiento de soporte de fase lútea diario con progesterona durante las primeras dos semanas después de la transferencia del embrión. Si se confirma la gestación en el día 28 del ciclo el tratamiento de soporte de la fase lútea diariamente con progesterona se puede extender por 5-10 semanas adicionales. En la presente invención, la administración de LH puede, no obstante, sustituir este tratamiento diario con progesterona. El suministrar soporte para la fase lútea y gestacional al administrar una o más dosificaciones de un agonista de LH puede resultar en un mejor desarrollo de ovocitos, ovocitos más sanos, implantación y retención mejoradas del embrión, riesgo reducido de embrazo bioquímico y puede reducir el riesgo de OHSS.

En una modalidad, el agonista de LH utilizado únicamente para soporte lúteo es un análogo de LH y no hCG o un análogo de hCG. Esto es debido a que en primer lugar, la administración de hCG en la fase lútea puede interferir con las pruebas de embarazo bioquímico, las cuales normalmente involucran la detección de hCG urinaria secretada por el cuerpo lúteo. Además, la administración de LH en vez de hCG en la fase lútea se espera que reduzca el riesgo de desarrollar OHSS debido a las diferentes afinidades de receptor de las dos proteínas.

En otra modalidad, el agonista de LH utilizado solo para soporte gestacional es un análogo de LH y no hCG o un análogo de hCG. Esto es debido, en primer lugar, a que la administración de hCG en la fase gestacional puede interferir con las pruebas de embarazo bioquímicas, las cuales normalmente involucran la detección de hCG urinaria secretada por el cuerpo lúteo. Además, la administración de LH en vez de hCG en la fase gestacional se espera que reduzca el riesgo de desarrollar OHSS debido a las diferentes afinidades de receptor de las dos proteínas.

Aunque tanto LH como hCG se unen y activan el receptor de LH, ambas hormonas existen como una familia de iso-hormonas que difieren en su composición oligosacárida . Cada una de las diferentes isoformas afecta al receptor de una manera específica y puede inducir respuestas celulares variables (Burgon PG et al., Endocrinology, 1996: 137:4827; Stanton PG et al., Mol Cell Endocrinol . 1996; 125: 133-141), como también se ha demostrado para las diferentes isoformas de FSH ( Barrios-de-Tomasi J, et al. Mol Cell Endocrinol. 2002; 186: 189-98, Yding Andersen C & Ezcurra D, Reproductive Biology Insights 2011: 4, 1-10) . De esta manera, los efectos más profundos y de ajuste fino de LH y hCG pueden diferir en realidad. Investigaciones recientes presentadas en la conferencia ESHRE en Estocolmo (julio del 2011) muestran en realidad que LH actúa mucho más rápido que hCG pero es menos eficiente en general a nivel de receptor (L. Casarini et al., ESHRE Estocolmo 2011 - P312, Universita degli Studi di Modena, Italia) . En una presentación del profesor Peter Humaindan (ESHRE, Estocolmo, 2011) se demostró adicionalmente que la adición de LH recombinante a FSH recombinante durante COS incrementa de manera significativa el rendimiento de ovocitos en comparación con dosis equivalentes de hCG agregadas, lo que sugiere efectos específicos de LH a nivel de receptor. La hCG es una proteína asociada a embarazo la cual es secretada después de la implantación del embrión aproximadamente 8 días después de la concepción. La hCG es capaz de estimular el cuerpo lúteo para permanecer activo y continuar su secreción de progesterona y otras sustancias necesarias para que se establezca el embarazo. Cuando hCG comienza a ser secretada desde el embrión implantado, LH está presente en cantidades apreciables, pero estos niveles son insuficientes para estimular el cuerpo lúteo adicionalmente y, a menos que la mujer quede embarazada, el cuerpo lúteo regresará, se producirá hemorragia menstrual y se iniciará un ciclo menstrual nuevo. De esta manera, en esta etapa la hCG de modo preferencial estimula el cuerpo lúteo. Aunque esta diferencia en LH y hCG ha intrigado a la ciencia durante cierto tiempo, ahora se ha demostrado que el receptor de LH (LH-R) cambia durante la fase lútea. El receptor funcional de longitud completa mantiene su expresión cuando está presente hCG mientras que LH es incapaz de llevar a cabo esto (Dickinson RE et al., Endocrinology 150: 2873-2881, 2009). Esto demuestra las diferencias en el efecto de LH y hCG durante la fase lútea.

El método para tratamiento reproductivo asistido en un mamífero del género femenino, como se describe en la presente, en una modalidad puede comprender adicionalmente suministrar soporte a la fase lútea administrando una o más dosificaciones de un agonista se LH que sustituya al soporte de la fase lútea de progesterona actual .

La actividad de LH normalmente está dada en UI siguiendo la farmacopea. Ahora también se pueden fabricar preparaciones puras de LH y la actividad se puede proporcionar en masa (por ejemplo, g por frasco) . En la presente invención se entiende que la actividad suministrada en UI se correlaciona con la actividad de LH suministrada en otras unidades, tales como unidades molares.

La LH urinaria o recombinante de acción prologada se puede administrar durante la fase folicular en vez de hCG (urinaria o recombinante o de acción prolongada) en dosificaciones que proporcionan una respuesta equivalente a la respuesta biológica proporcionada por las dosificaciones de hCG urinaria y recombinante descritas en la presente.

Una o más dosificaciones del agonista de LH serán suficientes para proporcionar una concentración de progesterona en suero de por lo menos 5 nmol/1, tal como por lo menos 10 nmol/1, tal como por lo menos 15 nmol/1 o tal como por lo menos 20 nmol/1 por lo menos hasta 5 días después de la ovulación o captación del ovocito, por lo menos hasta 10 días después de la captación del ovocito, de manera preferible por lo menos hasta 14, de modo más preferible por lo menos hasta 21 y de manera más preferible por lo menos hasta 28 días después de la ovulación o captación del ovocito. Preferiblemente, la administración de un agonista de LH puede continuar sobrepasando los 28 días después de la ovulación o captación del ovocito tal como hasta 5 semanas, tal como hasta 6 semanas, por ejemplo hasta 7 semanas, tal como hasta 8 semanas, por ejemplo hasta 9 semanas, tal como hasta 10 semanas o más.

En una modalidad preferida particular, el método para tratamiento reproductivo asistido comprende además proporcionar soporte lúteo al administrar una o más dosificaciones de un agonista de LH suficiente para proporcionar una concentración de progesterona en suero de por lo menos 20 nmol/1 en el día 7 después de la captación del ovocito.

Se prefiere que una o más dosificaciones en la fase lútea sean suficientes para mantener un nivel de progesterona en suero de por lo menos 20 nmol/1, por lo menos hasta 10 días después de la captación del ovocito, preferiblemente por lo menos hasta 14, de manera más preferible hasta 21, de manera más preferible por lo menos hasta 28 días después de la captación del ovocito.

Se prefiere que el agonista de LH administrado sea suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 4 a 12 UI de LH recombinante o urinaria por litro durante la fase lútea, de manera más preferible una concentración en suero de 4 a 12 Ul/1, tal como 8 a 12 Ul/1.

En una modalidad preferida la LH recombinante o derivada de orina se administra en la fase lútea a dosificaciones diarias de 100 a 600 UI de LH al día, preferiblemente 150 a 450 UI de LH al día, tal como 200 a 400 UI de LH al día, por ejemplo 250 a 350 Ul/día.

El agonista de LH, en una modalidad puede ser una LH de acción prolongada que presente una vida media en suero prolongada. La LH de acción prolongada puede comprender LH o un agonista de LH unido a una porción química tal como una molécula farmacéuticamente aceptable que proporcione una vida media en suero del agonista de LH o compuesto de LH la cual se incrementa sustancialmente cuando se compara con la vida media en suero de un agonista de LH administrado de la misma manera que el compuesto de LH o cuando se compara con la vida media plasmática in vivo de gonadotropina coriónica (CG) endógena. La LH modificada ya sea proporcionada en la fase folicular o como un soporte para la fase lútea se considera que mejora la conveniencia del paciente y el resultado del tratamiento cuando se compara con la administración convencional de progesterona .

En una modalidad preferida, el agonista de LH es una LH de acción prolongada que comprende hormona luteinizante unida a una porción química. En otra modalidad preferida, el agonista de LH es una hCG de acción prolongada que comprende gonadotropina coriónica humana unida a una porción química.

Con el fin de producir un compuesto de LH a largo plazo el cual puede ser administrado una o dos veces durante la fase lútea en relación con los procedimientos de tecnología de reproducción asistida (ART) , el compuesto LH a largo plazo, cuando se administra a un mamífero resultará en un agonista de LH o compuesto de LH que tiene vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de LH, por ejemplo, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, de manera preferible por lo menos 5 veces, de manera más preferible por lo menos 6 veces o tal como de 1.5 veces a 25 veces la vida media de LH.

En una modalidad preferida, el agonista de LH es una LH de acción prolongada que comprende hormona leuteinizante unida a una porción química, en donde la LH de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 6 veces la vida media de LH.

Cuando la LH de acción prolongada comprende gonadotropina coriónica humana unida a una porción química, la vida media en suero de la LH a largo plazo puede ser, por ejemplo, de por lo menos 1.2 veces la vida media de hCG, tal como por lo menos 1.3 veces la vida media de hCG, por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG, por lo menos 2 veces la vida media de hCG o tal como por lo menos 3 veces la vida media de hCG.

En una modalidad preferida, el agonista de LH puede ser una hCG de acción prolongada que comprende gonadotropina coriónica humana unida a una porción química, en donde la hCG de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

El soporte lúteo se proporciona a las mujeres antes de que se detecte embarazo bioquímico, implantación de embrión y el embarazo puede ser incierto y la mujer puede no estar embarazada en un ciclo dado. De esta manera, el mamífero del género femenino puede haber experimentado estimulación adicional de ciclos de ovulación y se prefiere que la vida media del agonista de LH administrado durante la fase lútea sea no mayor de 10 días, preferiblemente no mayor de 5 días de manera que el nivel pueda descender por debajo de un nivel el cual puede interferir con la ovulación subsecuente o el ciclo de estimulación en caso de que el mamífero de género femenino no realice un tratamiento nuevo en el siguiente ciclo.

Los ejemplos de LH y hCG de acción prolongada se encuentran en los ejemplos que se incluyen.

GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (hCG) La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una hormona glucoproteínica producida durante el embarazo que se produce por el embrión en desarrollo después de la concepción y posteriormente por los sincitiotrofoblastos (parte de la placenta) . Su papel es evitar la desintegración del cuerpo lúteo del ovario y de esta manera mantener la producción de progesterona que es crítica durante el embarazo en humanos. La hCG puede tener funciones adicionales; por ejemplo, se considera que hCG afecta la tolerancia inmunitaria del embarazo. En general, las pruebas de embarazo tempranas se basan en la detección o medición de hCG.

La gonadotropina coriónica humana interactúa con el receptor de LHCG y promueve el mantenimiento del cuerpo lúteo durante el inicio del embarazo lo que provoca que secrete la hormona progesterona . La progesterona enriquece el útero con un revestimiento grueso de vasos sanguíneos y capilares de manera que puede sostener al feto en crecimiento. Debido a su carga altamente negativa, la hCG puede repeler las células inmunitarias de la madre, protegiendo al feto durante el primer trimestre. También se ha establecido la hipótesis de que hCG puede ser un enlace placentario para el desarrollo de inmunotolerancia materna local. Por ejemplo, células endometriales tratadas con hCG inducen un incremento en la apoptosis de linfocitos T (destrucción de linfocitos T) . Estos resultados sugieren que hCG puede ser un enlace en el desarrollo de tolerancia inmunitaria peritrofoblástica y pueden facilitar la invasión de trofoblastos, el cual se sabe que acelera el desarrollo fetal en el endometrio. También se ha sugerido que los niveles de hCG están relacionados con la gravedad de los mareos matutinos en mujeres embarazadas.

La gonadotropina coriónica humana es una glucoproteína constituida de 244 aminoácidos con una masa molecular de 36.7 kDa. Es heterodimérica con una subunidad alfa idéntica a la de la hormona leuteinizante (LH) , hormona estimulante de folículos (FSH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la subunidad beta que es única a hCG (SEC ID NO: 9) .

La subunidad alfa tiene una longitud de 92 aminoácidos. La subunidad beta de hCG contiene 145 aminoácidos codificados por seis genes altamente homólogos que están distribuidos en tándem y pares invertidos en el cromosoma 19ql3.3 - CGB (1, 2, 3, 5, 7, 8). Las dos subunidades generan un núcleo hidrofóbico pequeño rodeado por una superficie alta con relación área respecto a volumen: 2.8 veces la de una esfera. La gran mayoría de los aminoácidos exteriores son hidrofílicos .

La cadena beta de hCG preferida de la presente invención se selecciona del grupo que consiste de secuencias que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 9, de manera más preferible 85%, de manera más preferible 90%, de manera más preferible 95%. Preferiblemente, una variante comprende los residuos cisteína conservados en la posición y separación de la SEC ID NO : 9. En una modalidad particularmente preferida, la hCG comprende la subunidad alfa humana que tiene la SEC ID NO: 9.

La hCG puede ser diferenciada de LH por la presencia en la subunidad beta del péptido C terminal, CTP, que consiste de los aminoácidos 112 a 145 de la SEC ID NO: 9, se puede realizar una diferenciación inmunológicamente y por determinación de secuencia.

La hCG que se utiliza puede ser de cualquier fuente, con la condición de que no esté contaminada con material alguno (particularmente otras gonadotropinas) la cual pueda afectar sustancialmente su acción. Se puede utilizar hCG urinaria, aunque se prefiere utilizar hCG recombinante (rhCG) , debido a su alta pureza. Se aplican condiciones similares a la fuente de hCG para uso en la presente invención.

La actividad de hCG normalmente está dada en UI siguiendo la farmacopea. Actualmente también se pueden fabricar preparaciones puras de hCG y la actividad está dada en masa (por ejemplo, µg por frasco) . En la presente invención se entiende que la actividad dada en UI se correlaciona con la actividad de hCG dada en otras unidades tales como unidades molares .

Los análogos de hCG incluyen todas las moléculas las cuales ejercen los mismos efectos fisiológicos, bioquímicos o biológicos que hCG y/o que se unen a los mismos receptores que hCG. Se sabe que la hormona leuteinizante (LH) comparte ciertas acciones fisiológicas con hCG. Algunos análogos de hCG incluyen hCG de cadena sencilla, en el cual la parte C terminal de la subunidad [beta] está fusionada a la parte N terminal de la subunidad [alfa] (Sugahara et al., PNAS, 92, 1995, 2041-2045). Otros ejemplos de análogos son como se describen, por ejemplo, en la patente Europea no. EP 0 322 226 (Applied Research Systems) , en el documento WO 92/22568 (University of Medicine & Dentistry of New Jersey) , WO 96/05224 (Washington University) , WO 90/09800 (Washington University) , WO 93/06844 (Washington University) , WO 98/43999 (Washington University) , WO 99/25849 (Washington University) .

En relación a los tratamientos de fertilidad, la gonadotropina coriónica humana se utiliza extensamente de modo parenteral como un inductor de ovulación en el lugar de la hormona leuteinizante . En presencia de uno o más de folículos de ovario maduros, la ovulación puede ser activada por la administración de hCG. Dado que la ovulación se presentará 24 a 36 horas después de la inyección de hCG, los procedimientos se pueden programar para aprovechar esta secuencia de tiempo. De esta manera, los pacientes que experimentan IVF, en general, reciben hCG para activar el proceso de ovulación, pero tienen sus óvulos recuperados en aproximadamente 36 horas después de la inyección, algunas horas antes de que los óvulos en realidad sean liberados del ovario .

En el método de la presente invención, por lo menos una dosificación de hCG se administra en el período del día 1 a 9 de la estimulación o del ciclo menstrual, la dosificación es suficiente para estimular el desarrollo de folículo hasta activación de ovulación.

Se prefiere que la hCG administrada sea suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 4 a 15 UI de LH por litro durante la fase lútea, de manera más preferible una concentración en suero de 4 a 12 o de 5 a 12 tal como 5 a 8 Ul/1.

Como se describe en lo anterior, la hCG puede ser recombinante o derivada de orina. Así, en una modalidad, la hCG se administra como dosificaciones diarias de hCG recombinante o derivada de orina. La administración diaria de hCG puede llevarse a cabo, por ejemplo hasta que se activa la maduración del folículo o se induce/activa la ovulación con un bolo convencional de hCG.

Para administración diaria de hCG durante la fase folicular la dosificación debe estar en el intervalo de 25-4000 UI de hCG/día, preferiblemente 25 a 1000 UI de hCG/día, de manera más preferible 30 a 1000 ó 30 a 500 UI de hCG/día, de manera más preferible 25 a 400 UI por día, tal como 50 a 300 UI al día, de manera más preferible 100 a 300, tal como 150 a 250, . por ejemplo, 175 a 225 UI al día. También es posible administrar hCG en una base menos frecuente, por ejemplo cada dos, tres, o cuatro días, preferiblemente cada dos días, hasta que se activa la ovulación. En este régimen, se pueden utilizar dosis tales como las indicadas en lo anterior, aunque se prefiere una dosis de 50 a 400 UI de hCG.

Así, en una modalidad preferida la dosificación diaria de hCG, cuando se administra en la fase lútea es de 25 a 400 UI de hCG al día, preferiblemente 50 a 200 UI de hCG al día, por ejemplo 75 a 200, tal como 100 a 150 ó 120 a 170 Ul/día.

En una modalidad de la presente invención, la hCG es una hCG de acción prolongada que presenta una vida media en suero prolongada. La hCG de acción prolongada puede comprender hCG unida a una porción química tal como una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media en suero del compuesto de hCG el cual se incrementa sustancialmente cuando se compara con la vida media en suero de una hCG administrada de la misma manera que la hCG de acción prolongada.

La vida media de la hCG de acción prolongada puede ser, por ejemplo, de por lo menos 1.2 veces la vida media de hCG, tal como por lo menos 1.3 veces la vida media de hCG, por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG, por lo menos 2 veces la vida media de hCG o tal como por lo menos 3 veces la vida media de hCG.

En una modalidad preferida, la hCG es una hCG de acción prolongada con una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

En una modalidad, la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo, cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo cada décimo día durante la fase de inducción de ovulación y/o las fases lútea subsecuente y/o gestacional. En una modalidad adicional, la hCG de acción prolongada también se puede administrar cada 14 días, por ejemplo cada 21 días, por ejemplo cada mes o incluso con menos frecuencia durante la fase de inducción de ovulación y/o la fase lútea subsecuente y/o la fase gestacional subsecuente. Como se menciona en lo anterior, se prefiere el desplazar desde la administración de hCG a administración de LH en la fase lútea. La hCG de acción prolongada en una modalidad se administra como una inyección de bolo única durante la fase folicular, la dosificación será suficiente para sostener el desarrollo del folículo y preferiblemente también suficiente para proporcionar soporte lúteo.

En una modalidad de la presente invención, la hCG de acción prolongada se administra como una inyección de bolo único cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 8 mm, tal como por lo menos 9 mm, por lo menos 10 mm, tal como por ejemplo por lo menos 11 mm, tal como por lo menos 13 mm, por lo menos 14 mm o tal como por ejemplo por lo menos 15 mm.

En una modalidad preferida de la hCG de acción prolongada se administra como inyección de bolo único cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por menos 12 mm .

La hCG de acción prolongada en una modalidad se administra como una inyección de bolo único durante la administración de FSH.

Se prefiere que la dosificación de hCG en la fase folicular sea suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 1 a 12 UI de hCG por litro durante la fase folicular.

Se prefiere adicionalmente que en donde la hCG sea hCG recombinante o derivada de orina se administre en dosificaciones diarias de 25 a 300 UI de hCG al día, preferiblemente 50 a 200, tal como 125 a 200 Ul/día, por ejemplo, 150 a 200 Ul/día.

Preferiblemente, la hCG se administra diariamente desde el día 5 de la fase folicular y hasta la activación de ovulación .

La hCG puede ser administrada adicionalmente desde el día 2 de la fase folicular de manera que la hCG se administre desde el día 2 de la fase folicular y hasta la ovulación.

ACTIVACION DE OVULACION En tiempo exacto de administración del tratamiento de activación de ovulación se determina por medición UV del diámetro del folículo. Habitualmente el tratamiento de activación se lleva a cabo cuando por lo menos un folículo tiene una media de diámetro de por lo menos 15 mm. Preferiblemente, el tratamiento de activación se lleva a cabo cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de 16 mm, de manera más preferible 17 mm. En muchos casos, el tratamiento de activación se lleva a cabo cuando por lo menos 2 folículos han alcanzado los tamaños indicados, de manera más preferible cuando por lo menos 3 folículos han alcanzado los tamaños indicados. En una modalidad particularmente preferida, la activación de ovulación se induce cuando tres o más folículos tienen un diámetro de 17 mm.

En un aspecto de la invención, la ovulación se activa por administración de una dosificación terapéuticamente eficaz de un agonista de GnRH como se describe en la presente. En otro aspecto de la invención, la ovulación se activa por una dosificación relativamente baja de hCG o un análogo de hCG o variante de hCG de acción prolongada. Cuando la hCG recombinante o urinaria se utiliza la dosificación de activación es de 2000 UI o menos, tal como 1500 UI o menos, por ejemplo, 1000 UI o menos. Una dosificación baja de hCG o análogo/variante/hCG de acción prolongada se puede suplementar con una dosificación de un agonista de GnRH.

AGONISTA DE HORMONA LIBERADORA DE GONADOTROPINA El agonista de hormona liberadora de gonadotropina (agonista de GnRH, GnRH-A) es un péptido sintético modelado después de que la neurohormona GnRH hipotálamica que interactúa con el receptor de hormona liberadora de gonadotropina para inducir su respuesta biológica, la liberación de las hormonas de la hipófisis FSH y LH. Los agonistas no se disocian rápidamente del receptor de GnRH. Como un resultado, cuando se administre el agonista de GnRH inicialmente existe un incremento en la secreción de FSH y LH (el denominado "efecto de descarga") . NO obstante, después de aproximadamente 10 días se obtiene un efecto hipogonadal profundo (es decir, disminución en FSH y LH) a través del receptor por regulación por disminución en la internalización de receptores. Generalmente este hipogonadismo inducido y reversible es el objetivo terapéutico .

En un aspecto de la invención, un agonista de GnRH se administra con el fin de activar la ovulación.

Los ejemplos de agonistas de GnRH probados incluyen: leuprolida (Lupron, Eligard) ; buserelina (Suprefact, Suprecor) , nafarelina (Synarel) ; histerelina (Supprelin) ; goserelina (Zoladex) ; deslorelina (Suprelorin, Ovuplant) ; triptorelina .

Las dosis apropiadas y los regímenes de administración serán evidentes para las personas expertas en el ámbito y se puede utilizar cualquier dosis apropiada y régimen de administración. Los agonistas se pueden administrar subcutáneamente o por aspersión intranasal .

Modo de ilustración, una dosificación utilizada comúnmente y terapéuticamente eficaz de buserelenina es 0.5 mg (subcutáneamente) o 0.2 mg (intranasalmente) . La triptorelina se puede administrar en una dosificación de 0.2 mg subcutáneamente y leuprolida se puede administrar en una dosificación de 1.0 mg subcutáneamente.

ANTAGONISTA DE LA HORMONA LIBERADORA DE G0NADOTR0PINA Los antagonistas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) (bloqueadores de receptor) son una clase de compuestos que son de estructuras similares a la GnRH natural (una hormona elaborada por neuronas en el hipotálamo) pero que tiene un efecto antagonista. Los antagonistas de GnRH son moléculas peptídicas que se elaboran de múltiples aminoácidos con frecuencia producidos de modo sintético. Los antagonistas de GnRH compiten con GnRH natural por la unión a los receptores de GnRH y de esta manera disminuyen o bloquean la acción de GrRH en el cuerpo.

Los antagonistas de GnRH se unen de manera competitiva y reversible a receptores GnRH en la hipófisis, bloqueando la liberación de hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante de folículo (FSH) de la hipófisis. En mujeres, la reducción en LH subsecuentemente lleva la supresión de liberación de estrógeno de los ovarios.

A diferencia de los agonistas de GnRH, los cuales provocan una estimulación inicial del eje hipotalámico-hipofisiario-gonadal (HPGA, por sus siglas en inglés) lo que genera una descarga en los niveles de estrógeno, los antagonistas de GnRH tienen un inicio de acción inmediata, lo que reduce rápidamente los niveles de hormona sexual sin una descarga inicial.

Los antagonistas de GnRH aprobados actualmente adecuados para uso en los métodos de la presente invención incluyen los siguientes: Cetrorelix; Ganorelix; Abarelix; Degarelix. Las dosis apropiadas y los regímenes de administración serán evidentes para las personas expertas en el ámbito y se puede utilizar cualquier dosis que reciben de administración apropiados.

Las modalidades anteriores así como las modalidades que se describirán en lo siguiente deben considerarse como referencia a cualquiera de los aspectos que se describen en la presente así como cualquiera de las modalidades descritas en la presente a menos que se especifique que una modalidad se relaciona con un aspecto o aspectos específicos de la presente invención.

Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitudes de patente y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en la misma medida a si en cada referencia fuera indicada individualmente y específicamente, incorporada como referencia y se establecen en su totalidad en la presente.

Todos los encabezados y encabezados secundarios se utilizan en la presente por conveniencia únicamente y no deben considerarse como limitantes de la invención de modo alguno.

Cualquier combinación de los elementos descritos en lo anterior en todas las posibles variaciones de los mismos está abarcado por la invención a menos que se indique en otro sentido en la presente o que se contradiga claramente en otro sentido por el contexto.

La mención de intervalos de valores en la presente se pretende simplemente que sirva como un método breve de referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique en otro sentido en la presente y cada valor separado se incorpora en la especificación como si fuera mencionado individualmente en la misma. A menos que se establezca en otro sentido, todos los valores exactos proporcionados en la presente son representativos de valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los valores ejemplares exactos proporcionados con respecto a un factor particular o medición se puede considerar que también proporcionan una medición aproximada correspondiente, modificada por el término "aproximadamente", cuando sea apropiado).

Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique en otro sentido en la presente o se contradiga claramente en otro sentido por el contexto.

El uso de cualquiera y la totalidad de los ejemplos o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente se pretende simplemente que ilumine mejor la invención y no represente una limitación respecto al alcance de la invención a menos que se indique en otro sentido. Ninguna parte de lo descrito en la especificación debe considerarse que indica que elemento alguno es esencial para la práctica de la invención a menos que se establezca de modo explícito de esta manera.

La cita e incorporación de documentos de patente en la presente se realiza por conveniencia únicamente y no refleja punto de vista alguno respecto a la validez, patentabilidad y/o de lo adecuado de tales documentos de patente .

La descripción en la presente de cualquier aspecto o modalidad de la invención utilizando términos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene", con referencia a un elemento o elementos se pretende que proporcione fundamento para un aspecto o modalidad similares de la invención en donde "consiste de", "consiste esencialmente de" o "comprende sustancialmente" a ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca en otro sentido o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en la presente indicando que comprende un elemento particular debe entenderse que también describe una composición que consiste de ese elemento, a menos que se establezca en otro sentido o se contradiga claramente por el contexto) .

La invención incluye todas las modificaciones equivalentes de la materia objeto mencionadas en los aspectos de las reivindicaciones presentadas en este documento en la extensión máxima permitida por la ley aplicable.

La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos los cuales, no obstante, no deben considerarse como limitantes del alcance de la protección. Los rasgos descritos en la descripción precedente y en los ejemplos que siguen pueden, tanto de modo separado como en cualquier combinación de los mismos, ser material para llevar a cabo la invención en diversas formas de la misma.

LISTA DE MODALIDADES 1. Un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo, de acción prolongada, que comprende un agonista de LH unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo del agonista de LH o compuesto de LH la cual se incrementa sustancialmente en comparación con la vida media plasmática in vivo de un agonista de LH administrado de la misma manera que el compuesto de LH. 2. El compuesto de LH de la modalidad 1, en donde el agonista de LH se selecciona de una CG de mamífero o un análogo de la misma, o una LH de mamífero o un análogo de la misma, tal como una hLH recombinante o hGH. 3. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el agonista de LH se une químicamente a una molécula farmacéuticamente aceptable, opcionalmente a través de un enlazante bifuncional. 4. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición o concentración corporal biológica del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para impulsar a un folículo antral desde aproximadamente 10 mm de diámetro hasta la etapa preovulatoria de aproximadamente 15 a 30 mm de diámetro en la cual un ovocito madurante puede finalizar la maduración para estar listo para reanudación de la meiosis. 5. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición o concentración corporal biológica del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para soportar a sujetos hipogonadales hipogonadotróf icos . 6. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la molécula farmacéuticamente aceptable proporciona una composición o concentración corporal biológica del agonista de LH o compuesto de LH suficiente para sostener progesterona en la fase peri-, en la fase ovulatoria y en la fase post-ovulatoria de un sujeto mamífero con el objeto de regular el endometrio y el útero para evitar o permitir la implantación de un citoblasto de mamífero. 7. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la molécula armacéuticamente aceptable proporciona una concentración en plasma del agonista de LH o compuesto de LH para soportar la formación y mantenimiento del cuerpo lúteo/cuerpos lúteos (CL) , cuando se suministra una inyección durante la fase folicular del ciclo menstrual en relación con el tratamiento con la hormona estimulante de folículo (FSH) , preferiblemente 5 a 10 días después del inicio del tratamiento con FSH. 8. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el agonista de LH se selecciona de la secuencia de CG humana o LH humana, la secuencia de CG de vaca o LH de vaca, la secuencia de CG de cerdo o LH de cerdo, la secuencia de CG de caballo o LH de caballo, la secuencia de CG de borrego o LH de borrego, la secuencia de CG de perro o LH de perro, la secuencia de CG de gato o LH de gato y la secuencia de CG de chivo o LH de chivo . 9. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de gonadotropina coriónica u hormona luteinizante , tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad. 10. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el agonista de LH o compuesto de LH tiene una vida media plasmática in vivo aumentada por lo menos 1.5 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, tal como desde 1.5 veces a 25 veces. 11. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el agonista de LH o el compuesto de LH está glucosilado. 12. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una albúmina o un polímero, tal como una albúmina modificada con unión aumentada a FcRN, albúmina humana, albúmina humana recombinante o PEG. 13. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes. 14. El compuesto de LH de cualquiera de las modalidades precedentes, para uso en promover la fertilidad de un sujeto mamífero, tal como el tratamiento por tecnologías de reproducción asistida. 15. Una hormona luteinizante modificada que comprende una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en un mamífero. 16. La LH modificada de la modalidad 15 para proporcionar una concentración plasmática in vivo de la LH modificada, la LH de mamífero o una mezcla de las misma en un mamífero en el intervalo de 2 a 30 Ul/1. 17. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 16, en donde la LH de mamífero o análogo de la misma es una LH recombinante, por ejemplo rhLH. 18. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 17, en donde la LH modificada comprende un análogo de la LH de mamífero, en donde el análogo tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia 7 de mamífero correspondiente de LH. 19. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 18, en donde la LH de mamífero se selecciona de la secuencia de LH humana y la secuencia de LH de caballo. 20. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 19, en donde la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de cualquiera de moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos , proteínas, receptores, glucosilaciones , grupos de acilación, azúcares, polímeros (por ejemplo, polietilenglicoles, PEG) , ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) , hormonas, típicamente, moléculas farmacéuticamente aceptables que son, sin limitación, albúmina, tal como albúmina humana, albúmina recombinante, variantes de albúmina, CH3 (CH2) nC0- , en donde n es 4 a 40 o polímero, tal como PEG, por ejemplo PEG de un peso molecular de por lo menos 5 kDa, tal como desde 10 kDa a 150 kDa, típicamente 10 a 40 kDa. 21. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 20, en donde la LH de mamífero o análogo de la misma está unida químicamente a la molécula farmacéuticamente aceptable, opcionalmente a través de un enlazante bifuncional o está fusionada a la molécula farmacéuticamente aceptable, opcionalmente a través de un enlazante peptídico. 22. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 21, en donde la LH de mamífero o análogo de la misma o la LH modificada está glucosilada. 23. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 22, en donde la LH de mamífero o análogo de la misma está unida a una o dos moléculas farmacéuticamente aceptables, preferiblemente una molécula farmacéuticamente aceptable. 24. Una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 23. 25. Una composición farmacéutica que comprende la LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 23 y una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH. 26. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 15 a 23, para uso en combinación con una FSH o una molécula que tiene actividad de FSH para uso simultáneo, secuencial o separado para inducir desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , en tratamiento anovulatorio de un sujeto femenino mamífero o inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto femenino mamífero. 27. La LH modificada de la modalidad 26, en donde la administración de FSH:LH, las relaciones de UI varían de 20:1 a 1:20. 28. La LH modificada de cualquiera de las modalidades precedentes 25 a 27 , en donde la FSH se selecciona de FSH de mamífero tal como FSH humana, en particular FSH recombinante, por ejemplo, rhFSH.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 METODO PARA PRODUCIR hCG DE ACCION PROLONGADA La hCG de acción prolongada producida por conjugación química de hCG a albúmina sérica humana o una variante de albúmina sérica humana con capacidad de selección mejorada o afinidad reducida por el receptor Fe neonatal.

La conjugación química se puede realizar utilizando una multitud de químicas y enlazantes diferentes conocidos en el ámbito que incluyen enlazantes con una alta estabilidad covalente y enlazantes con menor estabilidad covalente que tienen el potencial de liberar el componente activo de la molécula de albúmina típicamente por hidrolización de un enlace químico lábil.

Los grupos de unión adecuados de la molécula de albúmina son evidentes de la siguiente tabla. 1 Especialmente adecuado es el acoplamiento al residuo cisteína libre sobre la molécula de albúmina (Cys 34) , por ejemplo por métodos descritos en el documento WO2010092135 , especialmente los métodos que utilizan PDPH (3 - (2-piridiltio) propionil hidazida) para unir albúmina a hCG por medio de un enlace hidrazona a hCG. En otro aspecto, el método en WO2010092135 que utiliza EMCH ( (3 , 31 -N- (ácido -maleimidocaproico) hidrazida) para unir albúmina a hCG por medio de un enlace hidrazona a hCG es lo que se utiliza.

Los grupos de unión adecuados sobre la molécula de hCG incluyen aquellos en la Tabla anterior e incluyen químicas para acoplamiento para las porciones de glucosilacion de la molécula de hCG.

El acoplamiento a las porciones de glucosilacion se prefieren dado que estas se espera que no tengan interacción directa con el receptor de hCG y por lo tanto el acoplamiento no interferirá con la función.

Se describe otra tecnología de acoplamiento adicional por Neose (véase, por ejemplo el documento de E.U.A. 2004/0126838) utilizando glucoconjugación enzimática. Esta tecnología se puede utilizar para unir, por ejemplo, albúmina a hCG utilizando un enlazante adecuado.

En el caso especial en donde la conjugación química a la molécula de hCG reduce fuertemente la actividad funcional será preferible utilizar un enlazador lábil que pueda liberar una hCG funcional. Es preferible unir únicamente una molécula de albúmina por molécula de hCG.

En otra instancia, el acoplamiento de la hCG y la molécula de albúmina se puede realizar por fusión genética de las dos moléculas. Dado que la molécula de hCG tiene dos cadenas, existen cuatro posibilidades de orientación diferentes : albúmina-hCG (cadena alfa) albúmina-hCG (cadena beta) hCG(cadena alfa) -albúmina hCG (cadena beta) -albúmina hCG recombinante empacada en una jeringa llenada previamente en el producto OvitrelleMR producido por Merck Serono está disponible y contiene 0.5 mi de solución con 250 g de hCG recombinante. Los excipientes de la formulación se pueden retirar por diálisis sin filtración en gel . La albúmina o variantes de albúmina se pueden producir como se describe en el documento WO2010092135. La hCG y la albúmina se pueden conjugar utilizando la química de PDPH o EMCH como se describe en el documento WO2010092135.

EJEMPLO 2 Lista de secuencias y su ID (nombre) UniProt (www.uniprot.org) y AC (acceso) Cadena alfa de hormonas de glucoproteína : Humana GLHA-HUMAN P01215 SEC ID NO: 1 De ratón GLHA-MOUSE P01216 SEC ID NO : 2 De rata GLHA-RAT P11962 SEC ID NO: 3 >GLHA_HU AN P01215_Mature 25-116 APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRS TMLVQKNVTSESTCC VAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS >GLHA_MOUSE P01216_Mature 25-120 LPDGDFIIQGCPECKL ENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVP NITSE ATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS >GLHA_RAT P11962_Mature 25-120 LPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSE ATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTDCHCSTCYYHKS Cadena beta de hormona luteinizante : Humana: LSHB_HUMAN P01229 SEC ID NO : 4 De ratón: LSHB_MOUSE 009108 SEC ID NO: 5 De rata: LSHB_RAT P01230 SEC ID NO: 6 De gorila: LSHB_GORGO Q2Q1P1 SEC ID NO: 7 De chimpancé: LSHB_PANTR Q2Q1P2 SEC ID NO : 8 >LSHB_HUMAN P01229_Mature 21-141 SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITV TTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQWCTYR DVRFESIRLPGCPRGVDPWSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLF L >LSHB_PA TR Q2QlP2_Mature 21-141 SREPLRPWCHPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQWCTYR DVRFESIRLPGCPRGVDPWSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLF L >LSHB_GORGO Q2QlPl_Mature 21-141 SREPLRPRCRPINATLAVE EGCPVCITV TTICAGYCPTM RVLQGVLPPLPQWCTYR DVRFESIXLPGCPRGVDPMVSFPVALSCRCGPCHRSTSDCGGPNDHPLTCDHPQLSGLLF L >LSHB_MOÜSE O09108_Mature 21-141 SRGPLRPLCRPVNATLAAENEFCPVCITFTTSICAGYCPS VRVLPAALPPVPQPVCTYR ELAFASVRLPGCPPGVDPIVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRTQPMACDLPHLPGLLL L >LSHB_RAT P01230_Mature 21-141 SRGPLRPLCRPVNATLAAENEFCPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQPVCTYR ELRFASVRLPGCPPGVDPIVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRTQPMTCDLPHLPGLLL F Gonadotropina coriónica beta (hCG-B) : Humana: CGHB_HU A P01233 SEC ID >CGHB_HUMA P01233_Mature 21-165 SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITV TTICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQWCNYR DVRFESIRLPGCPRGVNPWSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSS SKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ Hormona estimulante del folículo Subunidad beta de folitropina Humana : FSHB_HUMAN P01225 SEC ID NO De ratón: FSNB_MOUSE Q60687 SEC ID NO De rata: FSHB_RAT P18427 SEC ID NO De gorila: FSHB GORGO A1BN60 SEC ID NO chimpancé : FSHB_PANTR Q2PUH2 SEC ID NO >FSHB_HUMAN P01225_Mature 19-129 NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYET VRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE >FSNB_MOUSE Q60687_Mature 21-130 SCELTNITISVEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETV RLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE >FSHB_RAT P18427_Mature 21-130 SCELTNITISVEKEECRFCISINTT CEGYCYTRDLVYKDPARPNTQ VCTFKELVYETI RLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE >FSHB_GORGO AlBN60_Mature 21-129 CELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYE VR VPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE >FSHB_PANTR Q2PUH2_Mature 21-129 CELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGHCYTRDLVY DPARPNIQKTCTFKELVYETVR VPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE Corifolitropina alfa La corifolitropina alfa consiste de la cadena alfa de gonadotropina (SEC ID NO: 1) y la cadena beta de FSH + los 28 aminoácidos de la parte C terminal de hCG (marcados en negrillas) .

SEC ID NO: 15 NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYET VRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKESSSSKAPPP SLPSPSRLPGPSDTPILPQ EJEMPLO 3 Método para producir hLH de acción prolongada Se produce hLH de acción prolongada mediante conjugación química de hLH a albúmina sérica humana o una variante de albúmina sérica humana con capacidad de selección mejorada o afinidad reducida por el receptor Fe neonatal .

La conjugación química se puede realizar utilizando una multitud de químicas y enlazantes diferentes conocidos en el ámbito que incluyen enlazantes con una estabilidad covalente alta y enlazantes con una estabilidad covalente menor que tengan el potencial de liberar el componente activo de la molécula de albúmina habitualmente por hidrol i zación de un enlace químico lábil.

Los grupos de unión adecuados sobre la molécula de albúmina serán evidentes de la tabla s iguient e : specialmente adecuado el acoplamiento residuo cisteína libre en la molécula de albúmina (Cys 34), por ejemplo, mediante los métodos descritos en el documento WO2010092135 , especialmente los métodos que utilizan PDPH (3- (2-piridiltio) propionil hidrazida) para unir albúmina a hCG por medio de un enlace hidrazona a hCG. En otro aspecto el método en WO2010092135 utilizando EMCH ( (3 , 3 ' -N- (ácido e -maleimidocaproico) hidrazida) para unir albúmina a hCG por medio de un enlace hidrazona a hLH es lo que se utiliza.

Los grupos de unión adecuados sobre la molécula de hLH incluyen aquellos que se incluyen en la tabla anterior e incluyen químicas para acoplamiento a las porciones de glucosilación de la molécula de hLH. El acoplamiento a las porciones de glucosilación se prefiere dado que estos se espera que no tengan interacción directa con el receptor de hLH y de esta manera, el acoplamiento no interferirá con la función .

Otra tecnología de acoplamiento adicional se describe por Neose (véase, por ejemplo, el documento de E.U.A. 2004/0126838) utilizando glucoconjugación enzimática. Esta tecnología se puede utilizar para unir, por ejemplo, albúmina a hLH utilizando un enlazante adecuado.

En el caso especial en donde la conjugación química a la molécula de hLH reduce fuertemente la actividad funcional será preferible utilizar un enlazador lábil que pueda liberar una hLHCG funcional. Es preferible unir únicamente una molécula de albúmina por molécula de hLH.

En otra instancia, el acoplamiento de la hLH y la molécula de albúmina se puede realizar por fusión genética de las dos moléculas. Dado que la molécula de hLH tiene dos cadenas, existen cuatro posibilidades de orientación diferentes : albúmina-hLH (cadena alfa) albúmina-hLH (cadena beta) hLH (cadena alfa) -albúmina hLH (cadena beta) -albúmina La hLH recombinante empacada como polvo liofilizado en el producto LuverisMR producido por EMD Serono está disponible y se puede reconstituir en solución de 1.0 mi que contiene 82.5 UI de hLH recombinante . Los excipientes de formulación se pueden separar por diálisis y filtración en gel. La albúmina o variantes de albúmina se pueden producir como se describe en el documento WO2010092135. La hLH recombinante y la albúmina se pueden conjugar utilizando la química de PDPH o EMCH como se describe en el documento O2010092135.

EJEMPLO 4 Unión covalente de SPA-PEG a hLH o variantes de la misma LH humana y variantes de la misma se unen covalentemente a SPA-PEG 5000, SPA-PEG 12,000 y SPA-PEG 20,000 como se describe más adelante (NOF Corporation) ("PEGilación de hLH y variantes de la misma en solución") .

PEGilación de hLH y variantes de la misma en solución LH humana y variantes de la misma se PEGilan en una concentración de 250 pg/ml en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8.5. El excedente molar de PEG es 5-100 veces con respecto a los sitios de PEGilación sobre la proteína. La mezcla de reacción se coloca en un termomezclador durante 30 minutos a 37°C. 10 a 12000 rpm. Después de 30 minutos, se obtiene el bloqueo de la reacción al agregar un exceso molar de glicina.

La cromatografía de intercambio catiónico se aplica para eliminar el exceso de PEG, glicina u otros productos secundarios de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción de PEGilación se diluye con citrato de sodio 20 mM, pH 2.5 hasta que la fuerza iónica es menor de 7 mS/cm. Se ajusta el pH a 2.5 utilizando HC1 5 N. La mezcla se aplica a una columna SP-sepharose FF equilibrada con citrato de sodio 20 mM, pH 2.5. El material no unido se elimina por lavado de la columna utilizando 4 volúmenes de columna de amortiguador de equilibrio. La proteína PEGilada se eluye en tres volúmenes de columna al agregar citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 750 mM, la hLH PEGilada pura se concentra y se realiza intercambio de amortiguador utilizando dispositivos de concentración VivaSpin, un límite de peso molecular (mwco) : de 10 kDa .

EJEMPLO 5 Producción y caracterización de conjugados 1:1 entre hCG y albúmina humana recombinante o variante K573 de albúmina humana Materiales La albúmina humana recombinante (Recombumin, Novozymes Biopharma) se suministra como solución de 200 mg/ml. Al frasco original se le divide en alícuotas, en alícuoas de 50 x 1 mi en un gabinete de flujo laminar. Las alícuotas se almacenan refrigeradas.

La albúmina humana recombinante, varía ante K573P se puede producir como se describe en el documento O2011051489. El compuesto (112 mg/ml) se almacena refrigerado. Se produce hCG recombinante a partir del producto Ovitrelle (Merck Serono) y los excipientes de la formulación se separan por un cambio de amortiguador utilizando columnas de eliminación de sal PD-10 desechables de GE Healthcare como se describe para cada conj ugado .

Se adquieren PDPH ( (3- [2 -piridiltio] ropionil hidrazida) , EMCH (N- [ácido maleimido caproico) hidrazida) ) , SPDP (3 - (2 -piridilditio) -propionato de N-succinimidilo) y EDC (clorhidrato de l-etil-3 - [3 -dimetilaminopropil] carbodiimida) de Thermo Fisher Scientific Inc.

Todas las demás sustancias químicas y materiales son de calidad convencional en el laboratorio.

Métodos CLAR de exclusión de tamaño (SEC-CLAR) : La SEC-CLAR analítica se llevó a cabo utilizando un equipo Agilent HPllOO acoplado con un detector de longitud de onda múltiple. Las columnas analíticas utilizadas fueron: TSK g3000 SWXL (7.8 mm de diámetro interno x longitud de 30 era) con columna de protección TSK-S XL.

TSK g3000 SWXL (7.5 mm de diámetro interno x longitud de 60 cm) con columna de protección TSK-SWXL.

La CLAR en escala preparativa se llevó a cabo utilizando el sistema Waters HPLC. Las columnas preparadas utilizadas fueron: Superdex 200 26/600 Hiload Superdex 200 10/300 GL Todas las columnas se corren en PBS filtrado a 0.2 pm, a 7.4 pH a menos que se describa en otro sentido. Las detecciones a 280 nm.

Las condiciones de corrida típicas/tiempos de análisis se muestran en la Tabla siguiente.

Geles no reductores de SDS : La separación óptima/resolución para geles no reductores de SDS se obtiene utilizando geles Tris-glicina Novex 4-12%. El amortiguador de corrimiento es amortiguador de corrimiento Tris acetato SDS. La preparación de la muestra es la siguiente: Se agregan 5 µ? de amortiguador de muestra LDS a una muestra de 15 µ?. Se incuban 5 minutos a temperatura ambiente. Se cargan en el gel 10 µ? de muestra. 03 Todos los geles se corren a un voltaje constante de 150V, un tiempo de corrimiento de -60 minutos.

Los geles se lavan durante 5 minutos con agua desionizada, se tiñen con Gel Code Blue Safe-Stain (ThermoFisher) y se destiñen utilizando agua desionizada.

Geles reductores SDS : La separación/resolución óptima para geles no reductores SDS se obtiene utilizando geles de Tris-glicina Novex 4-12%. El amortiguador de corrimiento es amortiguador de corrimiento de SDS Tris-glicina. La preparación de las muestras es la siguiente: 5 µ? de amortiguador de muestra LDS. 2 µ? de agente reductor NuPAGE 15 µ? de muestra.

Las muestras se calientan a 85°C durante dos minutos y se cargan 10 µ? de muestra sobre el gel. Todos los geles se corren a un voltaje constante de 150V, tiempo de corrimiento de -60 minutos. Los geles se lavan y se tiñen/destiñen al igual que los geles no reductores.

Métodos espectrofotométricos (A280) : La medición se realizó utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-160 con una microcubeta de cuarzo de 1 cm sobre un intervalo de 220-320 nm, posterior a corrección de valor inicial contra un amortiguador de muestra.

Mediciones de endotoxina: Las mediciones de endotoxina se llevaron a cabo utilizando el Charles River Portable Test System (PTS) con 1-0.01 EU/ml. Las muestras se analizaron después de dilución con una relación 1/10 de reactivo de dispersión (0.05 mi de muestra + 0.1 mi de agente de dispersión + 0.35 mi de agua LAL) . Se utilizó un cartucho de endotoxina PTS para analizar las muestras posterior a la dilución.

A : Producción del conjugado 1 El conjugado 1 es una conjugación 1:1:1 de hCG-PDPH-albúmina por conjugación del enlazante PDPH a ácidos siálicos oxidados en hCG y acoplamiento adicional de hCG-PDPH a rHA por medio de la formación de un enlace disulfuro a la cisteína libre en rHA, como se describe para PDPH por el fabricante.

Preparación hCG: Se acumularon 30 jeringas de Ovitrelle (totalizando 15 mi, 7.5 mg de hCG) y se concentraron a ~5 mg/ml utilizando concentradores centrífugos vivaspin 500 en una centrífuga de gabinete a 13,000 rpm. La solución concentrada se cambia de amortiguador utilizando tres columnas de eliminación de sal PD-10 equilibradas en solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.4. Se cargaron 500 µ? de solución sobre cada columna y se lavaron con 2.5 mi de PBS . Se eluyó hCG en 1 mi de PBS .

El amortiguador cambió la concentración de hCG y se determinó por medición de A280 utilizando un coeficiente de extinción de 0.459 para una solución de 1 mg/ml .

Oxidación por peryodato de hCG.

Se preparó una solución de 1 mg/ml de peryodato de sodio en H20. Esto se agregó a una solución enfriada de hCG (44 µ? por mg de hCG) , se envolvió en una lámina para protegerlo de la luz y se colocó en hielo durante 35 minutos. El peryodato que no ha reaccionado se separa de la mezcla de reacción utilizando dos columnas de eliminación PD-10, equilibradas en solución salina amortiguada con fosfato, a pH 7.4. La mezcla de reacción se divide en dos alícuotas iguales, cargadas en las columnas y se lavan en un volumen total de 2.5 mi con PBS . La hCG oxidada se eluye en alícuotas de 500 µ? de PBS. Las fracciones pico que contienen proteínas se identificaron por medición A280 y se acumularon. Se determinó la concentración de hCG por medición a A280. La solución de hCG oxidada se concentró a ~8 mg/ml de hCG utilizando un concentrador centrífugo vivaspin 500.

Reacción de hCG oxidada con PDPH: Se prepara una solución de 100 mg/ml de PDPH en sulfóxido de dimetilo (D SO) . Esto se agregó a la solución de hCG oxidada para proporcionar un exceso molar de 32.5 veces de PDPH (3 µ? de solución de PDPH por mg de HCG) , se mezcló ligeramente y se colocó en un baño maría a 25 °C durante 3 horas. Para remover el reticulante que no ha reaccionado, la mezcla de reacción se carga en una columna PD-10 equilibrada en PBS y se lava en un volumen total de 2.5 mi con PBS. La hCG-PDPH se eluye en alícuotas de 500 µ? de PBS. Las fracciones pico se identificaron por medición a A280 y se acumularon.

Preparación de rHA: Se purificó rHA con ecombumin para eliminar el dímero rHA, antes de la reacción con hCG-PDPH. Se cargaron 500 µ? de rHA en una columna Superdex 200 10/300 gl y se eluyeron en PBS como se describe en lo anterior. Se recolectaron los picos de monómero. Se determinó la concentración de rHA por mediciones a A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1 mg/ml de 0.51. La rHA ha purificado y se concentra a -200 mg/ml utilizando un concentrador centrífugo vivaspin 500 en una centrífuga de gabinete a 13,000 rpm.

Reacción de hCG-PDPH con rHA: Se agrega rHA purificada a la solución de hCG-PDPH para proporcionar un exceso molar en 5 veces de rHA (12.8 mg de rHA por mg de hCG) , se mezclan ligeramente y se colocan en baño maría a 25 °C durante 3 horas.

Purificación del conjugado 1:1:1: La mezcla de reacción se divide en dos alícuotas de 500 µ? . La primera alícuota se carga sobre una columna Superdex 200 10/300 GL y se eluye en PBS como se describe en lo anterior. Se recolecta el pico de conjugado. Esto se repite con la segunda alícuota de la mezcla de reacción. Los picos de conjugado se acumulan y se determina la concentración de conjugado por medición a A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1 mg/ml de 0.496.

La solución de conjugado se vuelve a concentrar 10 veces, a un volumen de 700 µ? utilizando concentradores centrífugos vivaspin 500. Esta solución de conjugado concentrado se purifica en alícuotas de 100 µ? utilizando una columna Superdex 200 10/300 GL como en lo anterior.

La solución de conjugado purificado se filtra a través de un filtro de 0.2 µp?, se pipetea en alícuotas de 50 µ? en tubos Eppendorf de 500 µ? estériles y se congelan.

Las muestras se analizan al reducir SDS-PAGE no reductor (figura 8a y figura 8b) y por SEC-CLAR (figura 8c) .

La estabilidad del conjugado 1 se analiza por 96 horas en cuatro condiciones diferentes: 5°C (pH 7.4), 37°C (pH 7.4), 37 °C (pH 6.4) y 37 °C (pH 5.4). Las muestras se analizan por SEC-CLAR Los resultados del análisis de estabilidad es que hCG no conjugado es liberado a una velocidad inicial de aproximadamente 40% al día.

B : Producción de conjugado 3 El conjugado 3 es una conjugación 1:1:1 de hCG-SPDH-albúmina producido por la conjugación del enlazante SPDP a aminas libres (sobre las partes N terminales o sobre cadenas laterales lisinas) en hCG y acoplamiento adicional de hCG-SPDP a rHA por medio de formación de un enlace disulfuro a la cisteína libre en rHA, como se describe por el fabricante de SPDP.

Preparación de hCG: Se acumularon veinte jeringas de Ovitrelle (10 mi, 5 mg de hCG) y se concentraron a aproximadamente 2 mi utilizando 6 concentradores centrífugos VivaspinSOO en una centrífuga de gabinete a 13,000 rpm. La solución concentrada se cambió en amortiguador utilizando dos columnas de eliminación de sal PD-10, equilibradas en amortiguador citrato a pH 5.9. La mitad de la solución se cargó sobre cada columna y se lavó en un volumen total de 2.5 mi con amortiguador citrato. El hCG se eluye en alícuotas de 500 µ? de amortiguador citrato. Las fracciones pico se identificaron por medición a A280 y se acumularon. Se determinaron concentración de hCG por medición a A280 utilizando un coeficiente de extinción de 0.459 y se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml con amortiguador citrato.

Reacción de hCG con SPDP: Se preparó una solución de 2.5 mg/ml de SPDP en DMSO. Esto se agregó a la solución de hCG para proporcionar un exceso molar 10 veces de SPDP (50 µ? de solución de SPDP por mg de hCG) , se mezcló ligeramente y se colocó en un baño maría a 25°C durante 1 hora. Para eliminar el reticulante que no reaccionó la mitad de la mezcla de reacción se cargó sobre cada uno de dos columnas PD10 equilibradas en solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.4 y se lavó en un volumen total de 2.5 mi con PBS . El conjugado de hCG-SPDP se eluy en alícuotas de 500 µ? de PBS. Las fracciones pico que contienen proteína se identificaron por medición a A280 y se acumularon.

Preparación de rHA: Se purificó rHA utilizando una columna Superdex 200 26/600 Hiload. Se cargaron 3 mi de rHA en la columna y se eluyeron en PBS, como se describe en lo anterior. Se recolectó el pico de monómero. Se determinó la concentración de rHA por medición a A280, como en lo anterior.

Reacción de hCG-SPDP con rHA: Se agregó rHA purificada a la solución de hCG-SPDP para proporcionar un exceso molar de 5 veces de rHA (12.8 mg de rHA por mg de hCG) , se mezcló ligeramente y se colocó en un baño maría a 25 °C, durante la noche. Se cargaron 3 mi de la mezcla de reacción sobre una columna Superdex 200 26/600 Hiload y se eluyeron en PBS como se describe en lo anterior. Se recolectó el pico conjugado. La solución se filtró por esterilización y se colocó en un incubador a 37 °C durante 48 horas, para hidrólisis del reticulante unido débilmente.

Purificación final del conjugado 1:1:1: Después de la hidrólisis, la solución se concentró a un volumen de aproximadamente 3 mi utilizando concentradores centrífugos vivaspin 500. La solución concentrada se cargó en una columna Superdex 200 26/600 Hiload y se eluyó en PBS. Se recolectaron los picos de conjugado. Se determinó la concentración de conjugado por medición a A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1 mg/ml de 0.496. La solución de conjugado purificado se concentra a aproximadamente 1 mg/ml como en lo anterior, se filtra a través de un filtro de 0.2 micrómetros en alícuotas de 50 µ? en tubos Eppendorf de 500 µ? estériles y se congela.

Las muestras se analizan al reducir SDS-PAGE no reductor (figura 9a y figura 9b) y por SEC-CLAR (figura 9c) .

La estabilidad del conjugado 3 se analizó por 96 horas a 37°C (pH 7.4). Las muestras se analizaron por SEC-CLAR: El resultado del análisis de estabilidad muestra que el conjugado 3 es razonablemente estable y que hCG no conjugado se libera a una velocidad inicial de aproximadamente 2% por día.

C: Producción del conjugado 4 El conjugado 4 es una conjugación 1:1:1 de hCG-PDPH-albúmina producido por conjugación del enlazante PDPH a hCG activado con EDC por lo que los grupos de ácido carboxílico en hCG reaccionarán con PDPH. La hCG-PDPH se acopla adicionalmente a rHA por medio de formación de un enlace disulfuro a la cisteína libre a rHA, como se describe por el fabricante de PDPH y EDC.

Preparación de hCG: Se acumularon veinte jeringas de Ovitrelle (10 mi, 5 mg de hCG) y se concentraron a un volumen de aproximadamente 1.5 mi utilizando 6 concentradores centrífugos Vivaspin 500 en una centrífuga de gabinete a 13,000 rpm. La solución de hCG concentrada se cambió de amortiguador utilizando 3 columnas PD-10 equilibradas con amortiguador MES a pH 5.3. Se cargaron aproximadamente 500 µ? de solución en cada columna y se lavaron en un volumen total de 3 mi con amortiguador MES. Se eluyó hCG en 1.0 mi de amortiguador MES. Se determinó la concentración de hCG por medición de A280 utilizando un coeficiente de extinción de 0.459.

Reacción de hCG con EDC y PDPH: Se prepara una solución de 50 mg/ml de PDPH en DMSO. Esto se agregó a la solución de hCG para proporcionar PDPH 5 mM en la mezcla de reacción (1.15 mg/ml de PDPH) y se mezcló ligeramente. Se preparó una solución de 50 mg/ml de EDC en amortiguador MES y se agregó de inmediato a la solución de hCG/PDPH para proporcionar EDC 2.5 mM en la mezcla de reacción (0.48 mg/ml de EDC) . La mezcla de reacción se mezcló ligeramente y se colocó en un baño maría a 25 °C durante 30 minutos. Para separar el reticulante que no ha reaccionado, la mitad de la mezcla de reacción se cargó sobre cada una de las dos columnas de PD-10 equilibradas en solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.4 y se lavó en un volumen total de 2.5 mi con PBS. La hCG-PDPH se eluye en alícuotas de 500 µ? de PBS. Las fracciones pico que contienen proteínas se identificaron por medición a A280 y se acumularon.

Preparación de rHA: Se purificó rHA utilizando una columna Superdex 200 26/600 Hiload. Se cargaron 3 mi de rHA en la columna y se eluyeron con PBS. Se recolectó el pico de monómero. Se determinó la concentración de rHA por medición a A280 como en lo anterior.

Reacción de hCG-PDPH con rHA: Se agregó rHA purificado a la solución de hCG-PDPH para proporcionar un exceso molar 5 veces de rHA (12.8 mg de rHA por mg de hCG) , se mezcló ligeramente y se colocó en baño maría a 25 °C durante 3 horas. La mitad de la mezcla de reacción se cargó en una columna Superdex 200 26/600 Hiload después de tres horas. La segunda mitad se cargó dos horas después, al completar el primer ciclo. La solución de conjugado se concentró a un volumen de aproximadamente 3 mi utilizando concentradores centrífugos vivaspin500.

La solución se filtró por esterilización y se colocó en un incubador a 37 °C durante 36 horas, para hidrólisis de un reticulado unido débilmente.

Purificación final del conjugado 1:1: Se cargaron 3 mi de solución de conjugado hidrolizado en una columna Superdex 200 26/600 Hiload y se eluyó en PBS como se describe en lo anterior. Se recolectó el pico de conjugado. Se determinó la concentración de conjugado por medición a A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1 mg/ml de 0.496. La solución de conjugado purificado se concentró a aproximadamente 1 mg/ml como en lo anterior, se filtró a través de un filtro de 0.2 ym, se pipeteó en alícuotas de 50 µ? en tubos Eppendorf de 500 µ? estériles y se congeló.

Las muestras se analizaron al reducir SDS-PAGE no reductor (figura 10a y figura 10b) y por SEC-CLA (figura 10c) .

La estabilidad del conjugado 4 se analizó por 96 horas a 37 °C (pH 7.4) . Las muestras se analizaron por SEC-CLAR: conjugado 3 es razonablemente estable y que el hCG no conjugado es liberado a una velocidad inicial de aproximadamente 2% por día.

D: Producción del conjugado 3VI El conjugado 3V1 es rhCG-SPDP-rHA (K573P) .

Se prepara un conjugado de hCG y variante de rHA (K573P) utilizando reticulante de SPDP, utilizando el método utilizado para producir el conjugado 3 descrito en lo anterior. Las muestras se analizan por SDS-PAGE reductor y no reductor (figura lia y figura 11b) y por SEC-CLAR (figura 11c) .

Se analizó la estabilidad del conjugado 3V1 para 96 horas a 37 °C (pH 7.4) . Las muestras se analizaron por SEC-CLAR : El resultado del análisis de estabilidad es que el conjugado 3V1 es razonablemente estable y que el hCG no conjugada es liberada a una velocidad inicial de aproximadamente 2% al día.

E: Producció del conjugado 4V1 El conjugado 4V1 es rhCG-PDPH-rH (K573P) .

Se prepara un conjugado de hCG y variante de rHA (K573P) utilizando reticulantes de EDC y PDPH, utilizando el método usado para producir el conjugado 4 como se describe en lo anterior. Las muestras se analizan por SDS-PAGE reductor y no reductor (figura 12a y figura 12b) y por SEC-CLAR (figura 12c) .

El resultado del análisis de estabilidad es que el conjugado 4V1 es razonablemente estable y que la hCG no conjugada se libera a una velocidad inicial de aproximadamente 2% al día.

EJEMPLO 6 Producción de fusiones de hCG-albúmina y fusiones de hLH- albúmina .

Construcción de plásmidos de expresión Se construyeron genes que codifican para la subunidad a común de gonadotropina, la subunidad ß de hCG y la subunidad ß de hLH y las fusiones de estos tres con el gen de albúmina sérica humana ya sea en el extremo 31 o en el extremo 5' mediante ensamblado de oligonucleótidos sintéticos utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . Se incluye a la secuencia codificante para las secuencias de señal humanas naturales de los genes relevantes y para albúmina sérica humana se incluye el gen que codifica para el pro-péptido natural. Se optimizó el uso de codones de los genes para alta expresión en células de mamífero. Los genes relevantes son: Las secuencias de genes se sintetizaron por GeneArt AG y se subclonaron en los vectores pEE12.4 y pEE6.4, respectivamente, como se muestra en las Tablas siguientes Se utilizaron el sitio de restricción N-terminal Hind III y el sitio de restricción C-terminal EcoRI . Brevemente, 5 µ9 del vector lanzadera liofilizado se producen por GeneArt y se resuspenden en 50 µ? de agua estéril libre de endotoxina. Una cantidad de 10 µ? de la solución de 10 ng/ml de ADN generada se mezclaron con 2.5 µ? de cada uno de enzimas de restricción de alta fidelidad EcoRI y HindIII, 5 µ? de amortiguador NEB lOx y 30 µ? de agua estéril libre de endotoxina, en hielo. Las muestras después se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Se agregaron 8.3 µ? de amortiguador de carga de ADN 6x y las muestras se sometieron a electroforesis a 120 V durante 40-60 min en un gel de agarosa 1% p/v con bromuro de etidio. Se utilizó 10 µ? de la escalera ADN Lonza SimplyLoad Tándem como escalera de referencia. Se generó una imagen del gel de agarosa utilizando BioSpectrum Imaging System (UVP) .

Los fragmentos relevantes se extrajeron del gel utilizando un equipo de extracción en gel QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las ligaciones se establecieron utilizando una relación 1:6 y 1 : 12 de estructura principal del vector para insertar ADN, 1 µ? de ligasa T4 quick, 20 µ? de amortiguador de ligación T4 quick 2x, se ajustó el volumen de reacción a 20 µ? con agua estéril libre de endotoxina cuando fue necesario y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se utilizaron alícuotas de 10 µ? de la reacción de ligación para transformar células de Escherichia coli One Shot Top 10 químicamente competentes utilizando el método de choque térmico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se dispersaron sobre placas de agar Luria Bertani que contienen ampicilina (50 µ9/?pa1) y se incubaron durante la noche a 37 °C hasta que fueron evidentes las colonias bacterianas. Para la criba de recombinantes , las colonias bacterianas solas se tomaron en 15 mi de medio Luria Bertani (LB) que contiene 50 µg/ml de ampicilina y se incubaron a 37 °C durante 6 horas con agitación. El ADN vector se aisló a partir de 10 mi de estos cultivos de crecimiento utilizando el sistema QIAGEN miniprep y se eluyeron en 30 µ? de amortiguador EB . Se identificaron recombinantes positivos por digestión con HindIII y EcoRI . Las alícuotas de los vectores generados se enviaron para secuenciado de genes en un laboratorio independiente utilizando cebadores de vector específicos directos (GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC) e inversos 2 0 (CAAATGTGGTATGGCTGA) . La tabla a continuación muestra los vectores GS utilizados para cada gen.

Amplificación de ADN; Para amplificación de ADN, se utilizan 5 mi de cultivos de crecimiento producidos durante el cribado de colonias para inocular 1.5 1 de medio Luria Bertani (LB) que contiene 50 g/ml de ampicilina y se incuba a 37 °C durante la noche con agitación a 220 rpm. El ADN vector se aisla utilizando el sistema QIAGEN Plasmid Plus Gigaprep. En todos los casos, se mide la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo-Scientific) y se ajusta a 1 mg/ml con agua estéril libre de endotoxina. La figura 13 muestra la configuración de los tamaños de genes.

Cultivo rutinario de células CH0K1SV: Se cultivan células CH0K1SV en medio CD-CHO suplementado con glutamina 6 mM. Las células se incuban en un incubador en agitación a 36.5°C, 10% de C02/ 85% de humedad y 140 rpm. Las células se subcultivan habitualmente cada 3-4 días, sembrando a 2 x 105 células/ml y se propagan con el fin de tener suficientes células disponibles para transfección. Las células se desechan en el pasaje 20.

Transfeccion.es transitorias de células CHOK1SV: Se realizan transfecciones transitorias utilizando células CHOK1SV que han estado en cultivo un mínimo de dos semanas. Las células se subcultivan 24 h antes de la transfección y la viabilidad de las células es de >99% en el momento de la transfección. Todas las fransfecciones se llevan a cabo por medio de electroporación utilizando un equipo Gene Pulse MXCell (Bio-Rad) , un sistema basado en placa para electroporación. Para cada transfección las células viables se resuspenden y se calientan previamente en medio a 2.86 x 107 células/ml. Se toma una alícuota de 80 µg de ADN (40 g por vector de gen único) dentro de cada pozo y se agregan 700 µ? de suspensión de células. Las células se someten a electroporación a 300 V, 1300 F. Las células transfectadas se transfieren a un medio calentado previamente en matraces Erlenmeyer y los pozos se enjuagan dos veces con medio calentado previamente el cual también se transfiere a los matraces. Los cultivos de células transfectadas se incuban en un incubador de agitación a 36.5°C, 10% de C02, 85% de humedad y 140 rpm durante 6 días. Se mide la viabilidad de las células en el momento de recolección utilizando un contador de células automatizado Cedex HiRes (Roche) .

Purificación de productos unidos a albúmina: Para todas las purificaciones, el sobrenadante de cultivo se recolectó y clarificó por centrifugación a 2000 rpm, durante 10 min. El sobrenadante clarificado se concentró aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 100-150 mi utilizando filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) con un filtro MWCO de 30 kDa. El sobrenadante concentrado se purificó utilizando 5 mi de resina CaptureSelect HSA (BAC, 191.2970.05) la cual se empaca en una columna 10/50 Tricorn (GE Healthcare, 28-4064-14) a un caudal de 2 ml/min. La columna se equilibra y se lava con fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 125 mM (amortiguador PBS) , pH 7.4 después del cargado de sobrenadante de cultivo de células. La elusión se inicia con Tris 20 mM, cloruro de magnesio 2 M, pH 7.4. Después de cada corrida la columna se limpia en el lugar con amortiguador PBS, pH 2.0.

Purificación de las formas naturales de hCG y LH: El sobrenadante clarificado se concentra aproximadamente 10 veces a aproximadamente 100-150 mi utilizando filtración de flujo tangencial (TFF) con un filtro MWCO de 10 kDa. El sobrenadante concentrado se purifica utilizando una columna HiTrap Capto Q (5 mi, GE Healthcare, 11-0013-03) a un flujo de 5 ml/min. La columna se equilibra y lava con Tris 20 mM, pH 8.0 después del cargado del sobrenadante de cultivo celular. La elusión se inicia por aplicación de un gradiente de elusión lineal a Tris 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8.0 sobre 20 volúmenes de columna. Después de cada corrida, la columna se limpia en el lugar con NaOH 0.5 M.

Análisis de productos 1-10 por SDS-PAGE Se preparan muestras reducidas para análisis al mezclar con amortiguador de muestra NuPage 4x LDS (Invitrogen, NP0007) y agente reductor de muestra NuPage lOx (Invitrogen, NP0009) y se incuba a 70°C durante 10 min. Para muestras no reducidas, el agente reductor y la incubación con calor se omiten. Las muestras se someten a electroforesis en 1.5 mm de geles prevaciados NuPage 4-12% Bis-Tris Novex (Invitrogen, NP0315) con amortiguador de corrimiento NuPage MES SDS bajo condiciones desnaturalizantes. Se incluyen en el gel alícuotas de 10 µ? de SeeBlue Plus 2 de estándar de peso molecular teñido previamente (Invitrogen, LC5925) de un anticuerpo control de proteína hCG a 1 mg/ml. 10 µ? de cada muestra a 1 mg/ml se cargan sobre el gel. Una vez sometido a electroforesis los geles se tiñen con InstanBlue (TripleRed, ISB01L) durante 30 min a temperatura ambiente. Las imágenes de los geles teñidos se analizan en un equipo BioSpectrum Imaging System (UVP) (véase la figura 17) .

Análisis de productos 1-10 por métodos de transferencia Western Los geles preparados como se describen para SDS PAGE con la inclusión de un control apropiado (albúmina sérica humana (Abcam, ab7473) o hCG (Ovitrelle, Serono) , se transfieren sobre una membrana de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0.2 ym) utilizando el módulo X-Cell II Blot (Invitrogen) en amortiguador de transferencia NuPAGE (Invitrogen) durante 1.5 horas a 25 V, 100-125 mA. Se realiza la transferencia Western utilizando los kits Western Breeze Chromogenic Western Blot Immunodetection (Invitrogen) , de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Brevemente, las membranas se bloquean durante 30 min, temperatura ambiente y se lavan 2x con 20 mi de H20. Las membranas se incuban con una solución primaria de anticuerpo, durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lava con 4x de 20 mi de solución de lavado y se incuba con solución de anticuerpo secundario durante 30 min a temperatura ambiente. La membrana se lava una vez más con 4x 20 mi de solución de lavado seguido por 2x 20 mm de H20 incubado en 5 mi de sustrato cromogénico hasta que se desarrollan las bandas, después se enjuaga 2x con 20 mi de H20 y se seca. Las imágenes de las membranas secas se analizan en un BioSpectrum Imaging System (UVP) .

Transferencia Western anti-HSA: Esta transferencia Western utiliza un anticuerpo de chivo ant i -albúmina sérica humana (Abcam, abl9180) como anticuerpo primario. Se utiliza en una dilución 1:2000 (concentración final, 0.5 yg/ml) . Se utiliza un kit Goat Western Breeze Chromogenic Western Blot Immunodetection (Invitrogen, WB7107) Véase la figura 14.

Transf rencia Western anti-cadena alfa hCG: Esta transferencia Western utiliza un anticuerpo de chivo policlonal anti-cadena alfa de hCG (Abcam, ab20712) como anticuerpo primario. Se utiliza en una dilución 1:10000 (concentración final, 0.6 µg/ml) . Se utiliza un kit de Goat Western Breeze Chromogenic Western Blot Immunodetection (Invitrogen, WB7107) , véase la figura 15.

Transferencia Western anti-cadena beta de hCG: Esta transferencia Western utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón anti-cadena beta de hCG (Abcam, ab9582) como anticuerpo primario. Se utiliza a una dilución 1:333.33 (concentración final, 0.6 µg/ml) . Se utiliza un kit de Mouse Western Breeze Chromogenic Western Blot Immunodetec ion (Invitrogen, WB7103), véase la figura 16.

El análisis de transferencia Western identifica y confirma con éxito los bloques de construcción individuales de los productos .

Análisis por SEC Se analizan muestras por duplicado por SEC-CLAR en un sistema de CLAR serie Agilent 1200 utilizando una columna Zorbax GF-250 4 m 4.6 mm ID x 25 cm (Agilent) o una columna Zorbax GF-250 4 pm 9.2 mm ID x 25 cm (Agilent) . Las alícuotas de muestra a una concentración de 1 mg/ml se filtran a través de un filtro de 0.2 µt? antes de inyección. Se inyectan respectivamente alícuotas de 20 ó 100 µ? y se corren a 1 ml/min durante 5 a 15 minutos. Los niveles de agregado solubles se analizan utilizando el programa Chemstation.

EJEMPLO 7 Producción de fusión hCG-Fc y fusión LH-Fc Construcción de los plásmidos de expresión Los genes que codifican para la fusión de la subunidad a común de gonadotropina y un enlazante (GGGGSGGGGSGGGGS) con la Fe de IgGl humana, fusión a la subunidad ß de hCG y un enlazante (GGGGSGGGGSGGGGS) con el Fe de IgG humana y la fusión de la subunidad ß de hLH y un enlazante (GGGGSGGGGSGGGGS) con la Fe de IgGl humana se construye por ensamblado de oligonucleótidos sintéticos utilizando reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Se incluye a la secuencia que codifica para las secuencias de señal humanas naturales de los genes relevantes. Se optimiza el uso de codones de los genes para expresión alta en células de mamífero. Los genes relevantes son: Las secuencias de genes se sintetizan por GeneArt AG y se subclonan en los vectores pEE12.4 y pEE6.4, respectivamente, como se muestra en las Tablas a continuación. Todo el trabajo se realiza como se describe en el Ejemplo 6.

La figura 13 muestra confirmación de los tamaños los genes .

La amplificación de ADN, el cultivo y transfección de células CHOK1SV se realiza como se descri en el Ejemplo 6.

Purificación : Se utiliza la purificación por proteína A para purificar los productos de la fusión de Fe. El sobrenadante clarificado se purifica utilizando una columna preempacada de 5 mi HiTrap MabSelect SuRE (GE Healthcare, 11-0034-94) en un purificador AKTA (10 ml/min) . La columna se equilibra con fosfato de sodio 50 raM, cloruro de sodio 125 mM, pH 7.3, se lava con fosfato de sodio 50 mM y cloruro de sodio 1 mM, pH 7.3 y se eluye con formiato de sodio 10 mM, pH 3.5. Las fracciones eluidas se ajustan de inmediato en pH a pH 7.3.

Análisis de los productos 11 y 12 por SDS PAGE Los materiales purificados se analizan por SDS-PAGE reducido y no reducido como se describe en el Ejemplo 6 (véase la figura 18) .

Análisis por SEC-CLAR Los materiales purificados se analizan adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño como se describe en el Ejemplo 6 confirmando pureza e identidad.

EJEMPLO 8 Medición de la actividad in vi ro de las variantes de hCG y LH: La línea MLTC-1 (línea de células de tumor de Leydig murina (ATCC-CRL-2065) ) , que expresa los receptores LH/hCG se siembra en una densidad de células apropiada y se expone con variantes de LH/hCG en el día de cultivo. En respuesta a esta exposición se activa la vía estereoidogénica en las células y la progesterona y testosterona se produce y se secreta.

Las células se propagan en medio RPMI para el análisis sembradas en una concentración de 80000 c/ml u 8000 c/pozo .

Cultivo celular: Día 0: siembra de las células MLTC Día 1 - T = 0 h: Exposición de acuerdo con la instalación experimental Día 1 - T = 4 h: Recolección del medio agotado para cuantificación de progesterona y/o testosterona Medio agotado de los pozos por duplicado se acumula y almacena a -20 °C.

Día 2 - T = 24 h: Recolección del medio agotado para cuantificación de progesterona y/o testosterona.

El medio agotado de los pozos por duplicado se acumula y almacena a -20 °C Cuantificación de esteroide en medio agotado: Los niveles de hormona esteroide se miden utilizando el sistema Meso Scale Discovery Multi-Spot Assay System: El medio agotado se agrega a una placa de progesterona o testosterona humana de 96 pozos MULTI-SPOT. 1. Se agregan 25 µ?/???? del reactivo de detección (solución del diluyente 22 que contiene progesterona SULFO-TAG) . 2. Se agregan 25 µ?/???? de calibrador o muestra y se incuban a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora . 3. Se prepara el instrumento SECTORMR de manera que la placa puede ser leída de inmediato después de la adición del amortiguador de lectura. 4. Se lavan las placas 3 veces con PBS . 5. Se agregan 150 µ?/???? de amortiguador de lectura IX. T. Evitar burbujas. El uso de una multipipeta electrónica con un ajuste de velocidad moderada se recomienda . 6. Se lee la placa en el instrumento SECTOR.

Todos los amortiguadores y los estándares de referencia se proporcionan por el vendedor.

Se calcula la CE50 para todos los compuestos utilizando el programa Prism de Graphpad Software, Inc. Las gráficas se ajustan utilizando regresión no lineal con o sin pendientes fijas y/o valores máximo y mínimo.

Se aplica el método a los compuestos del ejemplo 5 y los productos del ejemplo 6 y el ejemplo 7. Los resultados se muestran en las figuras 19a a 19d.

EJEMPLO 9 Potencia in vivo de las variantes de LH/hCG El objetivo del estudio es determinar la potencia del material de prueba de hCG/LH con respecto a sus actividades estimulantes de HCG en el análisis de LH . Se determinó el efecto sobre la estimulación de crecimiento en las vesículas seminales de ratas macho y maduras. Se utilizaron regímenes de dosificación diferentes, por ejemplo dosificación diaria, dosificación cada tercer día o dosificación los días uno, dos, tres o cuatro. Los compuestos de LH producidos en el ejemplo 5 y los productos elaborados en el ejemplo 6 y en el ejemplo 7 se comparan con el material de referencia Ovitrelle. Los resultados se representan como peso de vesículas seminales después de dosificación de Ovitrelle y los compuestos LH en niveles variables durante cuatro días .

Los materiales tanto de referencia como de prueba se reconstituyen diariamente en amortiguador PBS-albúmina (albúmina 0.1%) y se ajustan las concentraciones antes de administración. La administración es subcutáneamente en el cuello a 0.2 ml/rata.

Se utilizaron ratas Wister SPF macho de 21 a 23 días de edad al arribo. Las ratas dentro de un intervalo de peso no mayor de 10 g en el primer día de administración de dosis se utilizaron en el estudio. En el día 5, 24 horas después de la última dosificación las ratas fueron sacrificadas por una sobredosis de anestesia con C02/02.

Se extirparon las vesículas seminales y se trituraron y se secaron. El peso de las vesículas seminales se determinó y se registró.

El método se aplica a los compuestos del ejemplo 5 y los productos del ejemplo 6 y el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la figura 20a a 20j .

EJEMPLO 10 Medición del contenido de hCG en suero de rata.

El suero recolectado de ratas expuestas a productos que contienen LH se enviaron a Bioscientia GmbH, Institut für Medizinische Diagnostik GmbH, Konrad-Adenauer-Str . 17, 55218 Ingelheim, Alemania para análisis utilizando un análisis ADVIA Centaur Total hCG (ThCG) .

El análisis ADVIA Centaur Total (ThCG) es un inmunoanál i s i s tipo emparedado de dos sitios utilizando tecnología quimioluminométrica directa el cual utiliza cantidades constantes de dos anticuerpos. El primer anticuerpo, en el Lite Reagent (reactivo ligero) es un anticuerpo de chivo policlonal anti-hCG que ha sido purificado por afinidad y marcado con éster de acridinio. El segundo anticuerpo, en la fase sólida, es un anticuerpo monoclonal de ratón purificado anti-hCG el cual se acopla covalentemente a partículas paramagnét icas . Estos dos anticuerpos son específicos para diferentes epítopos que están presentes tanto en la subunidad ß libre como en la subunidad ß de hCG intacta .

El sistema automáticamente realiza las siguientes acciones : · suministra 50 µ? de muestra en una cubeta; suministra 100 µ? de reactivo ligero y 450 µ? de fase sólida y se incuba durante 7.5 minutos a 37 °C; separa, aspira, y lava las cubetas con reactivo de agua 3; * suministra 300 µ? de cada reactivo ácido y reactivo de base para iniciar la reacción quimioluminiscente ; reporta resultados de acuerdo con la opción seleccionada, como se describe en las instrucciones de operación del sistema o en el sistema de ayuda en línea.

Existe una relación directa entre la cantidad de hCG presente en la muestra de suero y la cantidad de unidades de luz relativas (RLU) detectadas por el sistema.

Las curvas de dilución de los productos que contienen hCG respectivas se utilizan para calibración de los datos obtenidos.

EJEMPLO 11 Medición del contenido de inmunorreactividad similar a LH en suero de rata.

El suero recolectado de ratas expuestas a productos que contienen LH se envía a Bioscientia GmbH, Institut für Medizinische Diagnostik GmbH, Konrad-Adenauer-Str . 17, 55218 Ingelheim, Alemania, para análisis utilizando el análisis CobasMR Luteinizing Hormone ECLIA (Elecsys) .

El análisis Elecsys LH utiliza dos anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra LH humana. Los dos anticuerpos específicos utilizados reconocen conformaciones particulares, con los anticuerpos biotinados que detectan un epítopo construido a partir de ambas subunidades mientras que el anticuerpo con la marca de complejo de rutenio detecta un epitopo de la subunidad ß. Como un resultado, el análisis Elecsys LH muestra reactividad cruzada despreciable con FSH, TSH, hCG, hGH y hPL.

Principio de la prueba Primera incubación: 20 µ? de muestra, anticuerpo monoclonal biotinado específico para LH y un anticuerpo monoclonal específico para LH marcado con complejo de rutenio forman un complejo tipo emparedado.

Segunda incubación: después de adición de micropartículas recubiertas con estreptavidina, el complejo se une a la fase sólida por medio de interacción de biotina y estreptavidina .

La mezcla de reacción se aspira en la célula de medición en donde las micropartículas son captadas magnéticamente sobre la superficie del electrodo. Las sustancias no unidas después se recuperan de ProCell/ProCell M. Aplicación de un voltaje al electrodo después induce emisión quimioluminiscente la cual se mide por un fotomultiplicador .

Los resultados se determinan por medio de una curva de calibración la cual es generada específicamente por el instrumento mediante calibración por dos puntos y una curva maestra proporcionada por código de barras y el reactivo.

Las curvas de dilución de productos que contienen LH respectivos se utilizan para calibración de los datos obtenidos.

EJEMPLO 12 Datos PK en ratas Nistar macho hipofisectomizadas Los perfiles farmacocinéticos de los compuestos de LH se miden en ratas istar macho hipofisectomizadas.

Los compuestos de LH se administran subcutáneamente a dosificaciones variables en un tiempo de 0 horas. La sangre se muestrea de las ratas en puntos de tiempo variables - las primeras 4 muestras de sangre de cada rata se recolectan por hemorragia sublingual utilizando agujas de uso único de 19G. La quinta muestra y la muestra de sangre terminal se recolectan bajo anestesia.

Se prepara suero de acuerdo con la siguiente instrucción : Las muestras de sangre se recolectan en tubos SST con activador de coagulación, Sarstedt RefNo. 41.1500.005. Las muestras se invierten 5x y después se permite que coagulen durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan de inmediato después de coagulación durante 10 minutos a 2500G, 20 °C. El suero se divide en dos frascos de almacenamientos - 50 µ? en cada frasco. Se agregan 300 µ? de PBS/BSA a uno de los frascos.

Las muestras de suero se congelan a = -15°C en los siguientes 60 minutos después de la centrifugación.

Las marcas de suero de los compuetsos de LH se miden como se describe en el ejemplo 10 para compuestos que contienen hCG y como se describen en el ejemplo 11 para compuestos que contienen LH. El método se aplica a los compuestos desde el ejemplo 5 y a los productos del ejemplo 6 y el ejemplo 7. Los resultados se muestran en las figuras 21a a figura 21d y en la figura 22a a la figura 22h.

EJEMPLO 13 Datos PK en ratas macho adulto normales Los perfiles farmacocinéticos de los compuestos de LH se midieron en ratas macho Spraque Dawley normales.

Los compuestos de LH se administraron por vía subcutánea a dosificaciones variables en un tiempo de 0 horas. Se tomaron muestras de sangre de las ratas en puntos de tiempo variables - las primeras 4 muestras de sangre de cada rata se recolectaron por sangrado sublingual utilizando agujas de uso único de 19G. La quinta muestra y la muestra de sangre terminal se recolectaron bajo anestesia.

Se preparó suero de acuerdo con la siguiente instrucción .

Las muestras de sangre se recolectaron en tubos SST con activador de coagulación, Sarstedt RefNo. 41.1500.005. Las muestras se invierten 5x y después se permite que coagulen durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan de inmediato después de coagulación durante 10 minutos a 2500G, 20 °C. El suero se divide en dos frascos de almacenamiento - 100 µ? en cada frasco. Se agregan 250 µ? de PBS/BSA a uno de los frascos.

Las muestras de suero se congelan a = -15°C en los siguientes 60 minutos después de centrifugación.

Los niveles de suero de los compuestos de LH se miden como se describe en el Ejemplo 10 para compuestos que contienen hCG y como se describe en el Ejemplo 11 para compuestos que contienen LH. El método se aplica a los compuestos del ejemplo 5 y a los productos del ejemplo 6. Los resultados se muestran desde la figura 23a a la figura 23d.

EJEMPLO 14 Comparación de hCG proporcionada en la fase folicular tardía como un sustituto para FSH y el soporte de fase lútea proporcionado como inyecciones diarias de r-hCG en dosis baja o r-LH, en comparación con el protocolo de antagonista de GnRH estándar suplementado con administración de progesterona en fase lútea.

ANTECEDENTES Cada vez se vuelve más claro que el método actual de soporte de la fase lútea para optimizar las probabilidades de implantación de establecimiento de un embarazo están definidas pobremente. Además, los regímenes actuales de administración de soporte en fase lútea no parecen proporcionar concentraciones suficientes de progesterona en todos los pacientes para asegurar resultados óptimos. Además, el modo de administración de los productos de soporte en fase lútea utilizados más comúnmente tienen un número de efectos secundarios que reducen el cumplimiento y la aceptación de los pacientes.

El objetivo del presente estudio es determinar si es posible desarrollar protocolos de estimulación nuevos en los cuales no se requiera administración de progesterona en fase lútea mediante combinación de la administración en fase folicular de hCG en dosis bajas (es decir, 150-200 UI al día) como un sustituto para la estimulación de FSH en la fase folicular tardía mientras se utiliza inyección de agonista de GnRH para inducción de ovulación. El uso de un agonista de GnRH para inducción de ovulación se sabe que reduce el gasto de hipófisis de gonadotropina lo que resulta en una función insuficiente del cuerpo lúteo. No obstante, el riesgo de síndrome de hiperestimulacion de los ovarios (OHSS) se reduce simultáneamente a un nivel casi despreciable. Con el fin de asegurar una fase lútea adecuada que sostenga el establecimiento de un embarazo, así como el mantenimiento del riesgo de OHSS en niveles bajos, el presente estudio administra inyecciones diarias de r-hCG (125 UI por día) o r-LH (es decir, 300 UI al día) desde el día de captación de ovocitos para estimular la función del cuerpo lúteo y aumentar la producción endógena de progesterona sin la administración de progesterona exógena en relación con activación de ovulación de agonista de GnRH.

MATERIALES Y METODOS Se planea realizar dos estudios, uno sobre cada una de dos clínicas que incluyen un total de 90 mujeres por clínica en una evaluación clínica aleatorizada .

Criterios de inclusión : 1. Mujeres, en edades entre 25 y 40 años 2. Valores iniciales de FSH y LH <12 UI/I 3. Duración del ciclo menstrual entre 25-34 días 4. Indice de masa corporal (BMI) entre 18 y 30 5. Ambos ovarios presentes y ausencia de anomalías uterinas Criterios de exclusión 1. La presencia de solo un ovario 2. Anomalías uterinas 3. Síndrome de ovario poliquístico 4. Diabetes, epilepsia, enfermedad hepática, renal, cardíaca, que incluye enfermedades metabólicas a juicio del doctor que realice el tratamiento 5. Alergia hacia alguna sustancia presente en los fármacos utilizados para administración 6. Participación anterior en el estudio Tratamiento hormonal Tratamiento del grupo I: Desde el día del ciclo dos se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono) Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija para los primeros 4 días. La dosis es de 150 ó 225 UI al día dependiendo de la edad, BMI , FSH basal, cuenta de folículo en el antro y volumen del ovario. Después de 4 días se puede ajustar dependiendo de la respuesta de los ovarios.

Cuando los últimos cuatro folículos alcanzan un diámetro de 12 tnra, la dosis FSH diaria (sin importar cual dosis específica se utilizó inicialmente) se intercambia con 200 UI de hCG diariamente (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) - véanse instrucciones para dilución más adelante. Para evitar incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo que comienza en el día 5 de estimulación en la mañana. En este día se suministran s.c. 0.25 mg/día de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) diariamente y continuará hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos alcanzan un diámetro de 17 mm se induce la ovulación en todos los pacientes por la administración de un bolo único de agonista de GnRH tal como 0.5 mg de buserelina s.c. (Suprefact; Sanofi -Aventis , Horsholm, Dinamarca) seguido por toma de ovocitos (OPU) 34 horas después. En relación con OPU, en aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina la administración de 125 UI r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) (véanse instrucciones de dilución más adelante) diariamente se iniciarán para soporte de fase lútea y estimulación de la producción endógena de progesterona . La administración de r-hCG continuará hasta que se realice la prueba de embarazo. No se administra progesterona exógena.

Tratamiento en el grupo II: Desde el día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija de 225 UI diariamente. Además, desde el día del ciclo dos se administrará una dosis fija de 150 UI de hCG diariamente (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) -véanse instrucciones para dilución más adelante. Para evitar un incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo comenzando en el día 5 de estimulación en la mañana. En este día se suministran 0.25 mg/día de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) s.c. diariamente y se continuará hasta e incluyendo el día de inducción de ovulación.

Cuando por lo menos cuatro folículos alcanzan un diámetro de 12-13 mm, la dosis de FSH diaria se suspende mientras que la dosis de hCG continuará con 150 UI diariamente hasta la inducción de ovulación.

Cuando tres o más folículos alcancen un diámetro de 17 mm se induce ovulación en todos los pacientes por la administración de un antagonista de GnRH de bolo único de 0.5 mg de buserelina s.c. (Suprefact; Sanofi-Aventis, Hetrsholm, Dinamarca) seguido por captación de ovocitos (OPU) 34 horas después. En relación con la OPU, en aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina, la administración de 125 UI UI r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) (véanse instrucciones para dilución a continuación) diariamente se iniciarán para soporte de fase lútea y estimulación de producción de progesterona endógena. La administración de r-hCG se continuará hasta que se realice la prueba de embarazo. No se administra progesterona exógena .

Tramiento en el grupo III: A partir del día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija para los primeros 4 días. La dosis es de ya sea 150 ó 225 UI al día dependiendo de la edad, BMI, FSH basal y cuenta de folículos en el antro y el volumen del ovario. Después de 4 días se pueden ajustar las dosis dependiendo de la respuesta de los ovarios. Para evitar incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo que comienza en el día de estimulación 5 en la mañana. En este día, se suministra s.c. 0.25 mg/día de antagonista de GnRH (Cetrotide, erck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y se continuará hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos alcanzan un diámetro de 17 mm se induce la ovulación en todos los pacientes por administración de un bolo único de 0.5 mg de buserelina s.c. (Suprefact; Sanofi-Aventis , H0rshol, Dinamarca) seguido por captación de ovocitos (OPU) 34 horas después. En relación con la OPU, en aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina. Se inicia la administración de 300 UI de r-LH (r-LH, Luveris, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) diariamente para soporte de fase lútea y estimulación de producción de progesterona endógena. La administración de r-LH continuará hasta que se realice la prueba de embarazo.

No se administra progesterona exogena.

Grupo control: A partir del día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija por los primeros 4 días. La dosis es ya sea 150 ó 225 UI al día, dependiendo de la edad, BMI, FSH basal y cuenta de folículos y el volumen del ovario. Después de 4 días, se pueden ajustar las dosis dependiendo de la respuesta de los ovarios . Para evitar incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo, comenzando en el día 5 de estimulación en la mañana. En este día, se suministran s.c. diariamente 0.25 mg/día de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y se continuará hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos alcanzan un diámetro de 17 mm se inducirá ovulación en todos los pacientes por administración de un bolo único de 250 de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck- Serono, Hellerup, Dinamarca) seguido por captación de ovocito (OPU) 34 a 35 horas después. Para soporte de la fase lútea se administrarán diariamente por vía vaginal progesterona micronizada, 90 mg al día (Crinone; Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y por vía oral 4 mg al día de estradiol (Estrofem; Novo Nordisk, Copenague, Dinamarca) comenzando en el día después de OPU y continuando hasta el día de la prueba de embarazo.

Para todos los grupos: Los procedimientos de laboratorio serán seguidos por las clínicas participantes bajo procedimientos normales y serán independientes de la aleatorización . Un máximo de dos embriones se transferirán en el día 2 después de la recuperación. Todos los parámetros de laboratorio que incluyen tasa de fertilización, tasa de separación serán monitoreados . Un embarazo bioquímico se define por una concentración plasmática de ß-hCG = 10 Ul/1 en el día 12 después de ET . El embarazo clínico se define como un saco gestacional intrauterino con un latido cardíaco 3 semanas después de una prueba hCG positiva.

ALEATORIZACION Las pacientes participantes se distribuirán aleatoriamente en uno de los cuatro grupos en el día de estimulación 1.

MUESTRAS DE SANGRE Y ANALISIS DE HORMONAS Las muestras de sangre se recolectarán en 1) el día de la inducción de ovulación, 2) el día de OPU, 3) el día de OPU más siete y 4) en el día 14 después de OPU. Las alícuotas en suero (la muestra se divide en dos ampolletas iguales) se mantienen congeladas a -20°C para análisis subsecuente de LH, progesterona y hCG. Las hormonas se medirán utilizando cada laboratorio participante en el análisis casero.

MEDIDAS DE RESULTADOS El resultado primario es el nivel de progesterona en fase lútea media. Las medidas del resultado secundario incluyen la tasa de embarazo que se está llevando a cabo, la tasa de pérdida de embarazo temprano y la tasa de OHSS.

DILUCION DE r-hCG PARA ESTIMULACION Una ampolleta de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck- Serono, Hellerup, Dinamarca) que contiene 250 µ9 de r-hCG que corresponde a aproximadamente 6.500 UI . Mediante la utilización de una jeringa de 2 mi con una aguja de inyección se extrae 1 mi de líquido de una botella con 10 mi de solución salina fisiológica estéril por penetración del tapón de caucho. El contenido de la ampolleta posteriormente se puede inyectar en los 9 mi restantes de solución salina en la botella. La concentración de hCG ahora constituye 650 Ul/ml en la botella. Con el fin de proporcionar estimulación del paciente con 200 UI de hCG, se extraen 0.3 mi (o, con precisión, 195 UI) de la botella para reextraerse para e inyectarse por medio de una jeringa estéril de 1 mi.

Con el fin de recuperar 125 UI de hCG, 0.19 mi de la botella pueden ser extraídos nuevamente e inyectados por medio de una jeringa estéril de 1 mi .

Con el fin de recuperar un total de 150 UI de hCG, se pueden volver a extraer 0.23 mi de la botella y se inyectan por medio de una jeringa estéril de 1 mi.

La r-hCG para estimulación se debe preparar fresca cada día.

PARTICIPANTES Y ACTIVIDAD CLINICA En el estudio participaron dos clínicas de fertilidad. Una clínica de fertilidad lleva a cabo un ensayo que comprende un grupo de tratamiento I y un grupo de tratamiento II y un grupo control que incluye un total de 90 pacientes (3 grupos de 30 pacientes) . La otra clínica de fertilidad lleva a cabo un ensayo que comprende un grupo de tratamiento I, un grupo de tratamiento III y un grupo control que incluye un total de 90 pacientes (3 grupos de 30 pacientes) .

EJEMPLO 15 La hCG administrada en la fase folicular tardía es un sustituto para FSH y el soporte de la fase lútea administrado como inyecciones diarias de una dosis baja de r-hCG o r-LH se compararon con un protocolo de antagonista de GnRH estándar suplementado con administración de progesterona en fase lútea. La hCG natural se administra como dosis pequeñas diarias para ilustrar el efecto de S-hCG como se describe en esta solicitud de patente.

ANTECEDENTES Se ha vuelto cada vez más evidente que el método actual de soporte de la fase lútea para optimizar las probabilidades de implantación y establecimiento de embarazo están definidas pobremente. Adicionalmente , los regímenes actuales de administración de soporte de la fase lútea no parecen proporcionar concentraciones suficientes de progesterona en todos los pacientes para asegurar resultados óptimos. Además, el modo de administración de los productos de soporte de fase lútea utilizados más comúnmente tienen numerosos efectos secundarios que reducen el cumplimiento y aceptación de la paciente.

El objetivo del presente estudio es determinar si es posible desarrollar un protocolo de estimulación nuevo en el cual no se requiera administración de progesterona en fase lútea al combinar la administración en fase folicular de hCG en dosis baja (es decir, 150-200 UI al día) como un sustituto para estimulación de FSH en la fase folicular tardía, mientras que se utiliza la inyección de agonista de GnRH para inducción de ovulación. El uso de un agonista de GnRH para inducción de ovulación se sabe que reduce la salida en la hipófisis de gonadotropinas que resultan en una función insuficiente del cuerpo lúteo. No obstante, se reduce simultáneamente el riesgo de síndrome de hiperestimulación de los ovarios (OHSS) a un nivel casi insignificante. Con el fin de asegurar una fase lútea apropiada que sostenga el establecimiento de un embarazo, así como el mantenimiento del riesgo de OHSS en niveles bajos, los pacientes en el presente estudio se les administran inyecciones diarias de r-hCG (125 UI al día) o r-LH (es decir, 300 UI al día) desde el día de la captación de los ovocitos para estimular la función del cuerpo lúteo y aumentar la producción endógena de progesterona sin administración de progesterona exógena en relación con un activador de ovulación agonista de GnRH.

MATERIALES Y METODOS Se incluyeron en este ensayo aleatorizado prospectivo un total de 32 mujeres quienes se detallan a continuación .

Criterios de inclusión: 1. Mujeres con edades entre 25 y 40 años 2. Valores iniciales de FSH y LH <12 Ul/1 3. Duración del ciclo menstrual entre 25 y 34 días 4. Indice de masa corporal (BMI) entre 18 y 30 5. Presencia de ambos ovarios y ausencia de anomalías uterinas Criterios de exclusión 1. La presencia de solo un ovario. 2. Anomalías uterinas 3. Síndrome de ovario poliquístico 4. Diabetes, epilepsia, enfermedad hepática, renal, cardíaca que incluye enfermedades metabólicas a juicio del doctor que realice el tratamiento 5. Alergia hacia cualquier sustancia presente en los medicamentos utilizados para administración 6. Participación anterior en el estudio Tratamiento hormonal Grupo de tratamiento I: A partir del día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija por los primeros 4 días. La dosis es de 150 ó 225 UI al día, dependiendo de la edad, BMI , FSH basal, cuenta de folículos antrales y el volumen de los ovarios. Después de 4 días, las dosis se ajustan dependiendo de la respuesta de los ovarios.

Cuando por lo menos cuatro folículos han alcanzado un diámetro de 12 mm, la dosis FSH diaria (sin importar cual dosis específica se utilizó inicialmente) se cambia con 200 UI de hCG diariamente (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) - véanse instrucciones para dilución más adelante. Para evitar un incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo que comienza en el día de estimulación 5 en la mañana. En este día, se administran 0.25 mg de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) s.c. diariamente y se continúa hasta e incluyendo el día de inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos han alcanzado un diámetro de 17 mm se induce la ovulación en todos los pacientes por la administración de un bolo único de un agonista de GnRH, tal como 0.5 mg de buserelina s.c. (Suprefact; Sanofi-Aventis, Horsholm, Dinamarca) seguido por captación de ovocito (OPU) 34 horas después. En relación con la OPU, a aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina se inicia la administración de 125 UI de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) (véanse instrucciones para dilución más adelante) diariamente para soporte de fase lútea y estimulación de producción de progesterona endógena. La administración de r-hCG continúa hasta que se realiza la prueba de embarazo. No se administra progesterona exógena .

Grupo de tratamiento II: Desde el día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija de 225 UI diariamente. También, desde el día dos del ciclo se administra una dosis fija de 150 UI de hCG diariamente (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) -véanse instrucciones para dilución más adelante. Para evitar un incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo comenzando en el día de estimulación 5 en la mañana. En este día, se suministran s.c. diariamente 0.25 mg de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y se continúa hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación.

Cuando por lo menos cuatro folículos han alcanzado un diámetro de 12-13 mm, se suspende la dosis diaria de FSH mientras se continúa la dosis de hCG con 150 UI diariamente hasta la inducción de ovulación.

Cuando tres o más folículos han alcanzado de 17 mm se induce ovulación en todos los pacientes mediante la administración de un bolo único de antagonista de GnRH de 0.5 mg de buserelina, s.c. (Suprefact; Sanofi-Aventis , Horsholm, Dinamarca) seguido por captación de ovocito (OPU) 34 horas después. En relación con la OPU, en aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina se inicia la administración de 125 UI de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) (véanse instrucciones para dilución más adelante) diariamente para soporte de la fase lútea y estimulación de la producción de progesterona endógena. La administración de r-hCG continúa hasta que se realiza la prueba de embarazo. No se administra progesterona endógena .

Grupo de tratamiento III: Desde el día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija durante los primeros 4 días. La dosis es ya sea 150 ó 225 UI al día, dependiendo de la edad, BMI, FSH basal y cuenta de folículos antrales y volumen de los ovarios. Después de 4 días, se ajustan las dosis dependiendo de la respuesta de los ovarios. Para evitar un incremento prematuro de LH se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo comenzando en el día 5 de estimulación en la mañana. En este día, se suministran s.c. diariamente 0.25 mg de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y continúa hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos han alcanzado un diámetro de 17 mm se induce la ovulación en todos los pacientes por administración de un bolo único de 0.25 mg de buserelina s.c. (Suprefact; Sanofi-Aventis, Itersholm, Dinamarca) seguido por captación de ovocito (OPU) 34 horas después. En relación con la OPU, en aproximadamente 35 horas después de la inyección de buserelina, se inicia la administración de 300 UI de r-LH (r-LH, Luveris, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) diariamente para soporte de la fase lútea y administración de producción de progesterona endógena. La administración de r-LH continúa hasta que se realiza la prueba de embarazo. No se administra progesterona exogena.

Grupo control (grupo de tratamiento 4) : Desde el día dos del ciclo se administra FSH recombinante (r-hFSH; Gonal-F, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) en una dosis fija por los primeros 4 días. La dosis es de ya sea 150 ó 225 UI al día, dependiendo de la edad, BMI , FSH basal y cuenta de folículo antral y el volumen de los ovarios. Después de 4 días se ajustan las dosis dependiendo de la respuesta de los ovarios. Para evitar un incremento prematuro de LH, se utiliza un protocolo de antagonista de GnRH fijo comenzando en el día 5 de estimulación en la mañana. En este día, se suministran s.c. diariamente 0.25 mg de antagonista de GnRH (Cetrotide, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y se continúa 4 hasta e incluyendo el día de la inducción de ovulación. Cuando tres o más folículos han alcanzado un diámetro de 17 mm se induce ovulación en todos los pacientes por administración de un bolo único de 250 µg de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) seguido por captación de ovocito (OPU) 34 a 35 horas después. Para soporte de la fase lútea se administran diariamente por vía vaginal progesterona micronizada, 90 mg al día (Crinone; Merck-Serono, Hellerup, Dinamarca) y, por vía oral 4 mg al día de estradiol (Estrofem; Novo Nordisk, Copenague, Dinamarca) comenzando el día después de OPU y continuando hasta el día de la prueba de embarazo.

Para todos los grupos: Los procedimientos de laboratorio siguieron los procedimientos normales de las clínicas participantes y fueron independientes de la aleatorización . Un máximo de dos embriones se transfirieron en el día 2 después de la recuperación. Todos los parámetros de laboratorio incluyendo la tasa de fertilización y tasa de separación se monitorearon . Se define un embarazo bioquímico por una concentración en plasma de ß-hCG = 10 Ul/1 en el día 12 después de ET. El embarazo clínico se define como un saco gestacional intrauterino con un latido cardíaco 3 semanas después de una prueba hCG positiva.

ALEATORIZACION Las pacientes participantes se distribuyeron aleatoriamente a uno de cuatro grupos en el día 1 de estimulación .

MUESTRAS DE SANGRE Y ANALISIS DE HORMONAS Las muestras de sangre se recolectaron en 1) el día de inducción de ovulación, 2) el día de OPU, 3) el día de OPU más siete y 4) en el día 14 después de OPU. Las alícuotas de suero (las muestras se diluyeron en dos ampolletas iguales) se mantienen congeladas a -20 °C para análisis subsecuente de LH, progesterona y hCG. Las hormonas se midieron utilizando cada laboratorio participante en el análisis casero.

MEDICIONES DE RESULTADOS El resultado primario es el nivel de progesterona en fase lútea media.

DILUCION DE r-hCG PARA ESTIMULACION Una ampolleta de r-hCG (r-hCG, Ovitrelle, Merck- Serono, Hellerup, Dinamarca) contiene 250 ig de r-hCG que corresponde a aproximadamente 6.500 UI . Utilizando una jeringa estéril de 2 mi con una aguja de inyección se extrae 1 mi de líquido de una botella con 10 mi de solución salina fisiológica estéril al perforar el tapón de caucho. El contenido de la ampolleta se inyecta subsecuentemente en los 9 mi restantes de solución salina en la botella. La concentración de hCG ahora constituye 650 Ul/ml en la botella. Para proporcionar la estimulación al paciente con 200 UI de hCG, 0.3 mi (o, con precisión, 195 UI ) de la botella se vuelven a extraer y se inyectan por medio de una jeringa estéril de 1 mi.

Con el fin de recuperar un total de 125 UI de hCG, se vuelven a extraer 0.19 mi de la botella y se inyectan por medio de una jeringa estéril de 1 mi .

Con el fin de recuperar un total de 150 UI de hCG, se vuelven a extraer 0.23 mi de la botella y se inyectan por medio de una jeringa estéril de 1 mi .

La r-hCG para estimulación se prepara fresca cada día.

RESULTADOS Los datos demuestran con claridad que los requerimientos de dosificación propuestos de rhCG en la fase folicular y en la fase lútea y el régimen de dosificación propuesta para estimulación en la producción de progesterona por rhLH en la fase lútea muestran un efecto positivo y pronunciado sobre la producción de progesterona en la fase lútea media.

METODOS FARMACOLOGICOS EJEMPLO 16 Manera de determinar la biopotencia de un compuesto de LH de acción prolongada tal como hCG unido a albúmina humana (SUS-hCG) La biopotencia de SUS-hCG se determinará utilizando uno de los dos análisis establecidos in vivo. La farmacopea y los autoridades solicitan el bioanálisis de Van Hell. (Van Hell et al., Acta Endocrin. 47:409 (1964) el cual determina la actividad biológica de LH de productos de gonadotropina que contienen LH que mide la ganancia en peso de la vesícula seminal. El análisis de supresión de ácido ascórbico ovárico, el cual mide la disminución de ácido ascórbico en el ovario en respuesta a tratamientos de LH exógena, suministrados a ratas pseudoembarazadas (Parlow AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarían ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300-320). Este último análisis muestra mayor sensibilidad para detectar bioactividad de LH en comparación con el análisis descrito en la farmacopea mencionado primero al ser más sensible en casi un orden de magnitud.

Además, la bioactividad in vitro de SUS-hCG se determinará utilizando análisis convencionales en células tales como el bioanálisis en células de Leydig MA10 descrito por Ascoli, Endocrinology 108:88 (1981) o el análisis de células de Leydig en ratón en el cual el incremento en testosterona, inducido por LH, in vitro por células de Leydig de ratón se mide por técnicas inmunológicas convencionales tales como análisis RIA (Van Damme et al., Acta Endocrinol . (Copenh.) 1974 : 77 ; 655 ) .

Para todos los análisis la bioactividad de SUS-hCG se comparará con hCG recombinante y la hCG derivada de orina humana y mediante el uso de los estándares apropiados de The National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC Herts, Reino Unido) .

La cantidad de proteína hCG en una composición dada se determinará utilizando tecnologías inmunológicas estándar tales como análisis de ELISA o análisis de RIA y se caracterizarán por transferencia Western y medición del contenido de proteína total utilizando los análisis de Bradford y/o Lowry.

EJEMPLO 17 Manera de determinar la biopotencia de una LH modificada de acción prolongada (S-LH) , tal como hLH unida a un grupo de acilación, PEQ o albúmina humana en combinación con F5H La biopotencia de S-LH se determinará utilizando uno de los dos análisis establecidos in vivo. La farmacopea y las autoridades piden el bioanálisis de Van Hell. (Van Hell 30 et al., Acta Endocrin. 47: 409 (1964) el cual determina la actividad biológica de LH de producto de gonadotropina que contienen LH midiendo la ganancia en peso de la vesícula seminal. El análisis de supresión de ácido ascórbico en ovario, el cual mide la disminución en el ácido ascórbico del ovario en respuesta a los tratamientos de LH exógena administrada a ratas pseudoembarazadas (Parlow 32 AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarían ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300-320). Este último análisis muestra mayor sensibilidad para detectar la bioactividad de LH en comparación con el análisis descrito en la farmacopea mencionado primero que es más sensible en casi un orden de magnitud.

Además, la bioactividad in vitro de S-LH se determinará utilizando análisis estándar en células tal como el bioanálisis de célula de Leydig MA10 descrito por Ascoli, Endocrinology 108:88 (1981) o el análisis en células de Leydig de ratón en el cual el incremento en testosterona, inducido por LH, in vitro en células de Leydig de ratón se mide por técnicas inmunológicas estándar tal como análisis de RIA (Van Damme et al., Acta Endocrinol . (Copenh.) 1974 : 77 ; 655) .

Para todos los análisis la bioactividad de S-LH se comparará con hCG recombinante , LH recombinante y hCG derivada de orina humana y utilizando los estándares apropiados de The National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSCH Herts, Reino Unido) .

La cantidad de proteína LH en una composición dada se determinará utilizando técnicas inmunológicas estándar tales como análisis de ELISA o análisis de RIA y se caracteriza por transferencia Western y medición del contenido de proteína total utilizando los análisis de Bradford y/o Lowry.

El efecto de S-LH en combinación con FSH para sostener desarrollo folicular múltiple y desarrollo de embriones in vivo se realizará en ratones como se describe por Yding Andersen C et al . , Requirements for human chorionic gonadotropin and recombinant human luteinizing hormone for follicular development and maturation. J. Assist. Reprod. Gen., 1999, 16, 536-541, en relación a las hormonas LH y hCG nativas. Se estimulará a los ratones con una dosis fija de FSH para inducir desarrollo folicular múltiple y en combinación con cantidades variables de actividad de LH/hCG. A los ratones se les inducirá para que ovulen y que se apareen con un macho. Posteriormente, se sacrificará a los ratones y se recuperará el oviducto y se lavará para determinar el número de citoblastos presentes. El número de citoblastos de una manera semicuantitativa expresará la potencia del componente de LH.

EJEMPLO 18 Manera de determinar la biopotencia de una LH modificada de acción prolongada tal como hLH unida a un grupo de acilación, PEG o albúmina humana en combinación con FSH La biopotencia de LH de acción prolongada se puede determinar utilizando uno de los dos análisis establecidos in vivo. La farmacopea y las autoridades solicitan el bioanálisis de Van Hell. (Van Hell et al., Acta Endocrin. 47: 409 (1964) el cual determina la actividad biológica de LH de productos de gonadotropina que contienen LH al medir la ganancia en peso de vesícula seminal. El análisis de supresión de ácido ascórbico en ovario, el cual mide la disminución de ácido ascórbico en ovario en respuesta a tratamientos de LH exógena suministrada a ratas pseudoembarazadas (Parlow AF: Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarían ascorbic acid. In Human Pituitary Gonadotropins Edited by: Albert A. Springfield; CC Thomas; 1961:300-320). Este último análisis muestra mayor sensibilidad para detectar bioactividad de LH en comparación con el análisis descrito en la farmacopea mencionado primero que es más sensible en casi un orden de magnitud.

Además, la bioactividad in vitro de LH de acción prolongada se determinará utilizando análisis estándar en células tal como el bioanálisis en célula de Leydig MA10 descrito por Ascoli, Endocrinology 108: 88 (1981) o el análisis de célula de Leydig en ratón en el cual el incremento en testosterona, inducido por LH, in vitro por células de Leydig de ratón se mide por técnicas inmunológicas estándar tal como análisis RIA (Van Damme et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 1974:77,655).

Para todos los análisis la bioactividad de LH de acción prolongada se comparará con hCG recombinante , LH recombinante y hCG derivada de orina humana mediante la utilización de los estándares apropiados de The National Institute of Biological Standards and Controls (NIBSC Herts, Reino Unido) . La cantidad de proteína LH en una composición dada se determinará utilizando técnicas inmunológicas estándar tales como análisis de ELISA o análisis RIA y se caracterizará por transferencia Western y medición del contenido de proteína total utilizando los análisis de Bradford y/o Lowry.

EJEMPLO 19 Datos de estudios combinados PK/PD en ratas macho normales y sometidas a hipofisectomía Los compuestos de LH se administran por vía subcutánea en dosificaciones variables en un tiempo de O horas. Se toman muestras de sangre de las ratas en puntos de tiempo variables pero por lo menos diariamente hasta por cuatro semanas. Las primeras muestras de sangre de cada rata se recolectan por extracción sublingual utilizando agujas de uso único de 19G. La muestra de sangre terminal se recolecta bajo anestesia. El material tanto de referencia como de prueba se reconstituye diariamente en amortiguador PBS-albúmina (albúmina 0.1% y se ajustan las concentraciones antes de la administración) . La administración es subcutánemente en el cuello en 0.2 ml/rata.

Para el estudio en ratas sometidas a hipofisectomía, se adquieren ratas Wistar macho de 95-110 g de Taconic-M&B y se someten a hipofisectomía utilizando procedimiento trans auricular. Para el estudio en ratas normales, se utilizan ratas macho Sprague Dawley con un peso de aproximadamente 250 g. Se prepara el suero de acuerdo con la siguiente instrucción: Las muestras de sangre se recolectan en tubos SST con activador de coagulación, Sarstedt RefNo. 41.1500.005. Las muestras se invierten 5x y después se permite que coagulen durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan inmediatamente después de coagulación durante 10 minutos a 2500G, 20 °C. El suero se divide en dos frascos de almacenamiento - 50 µ? en cada frasco. Se agregan 300 µ? de PBS/BSA a uno de los frascos.

Las muestras de suero se congelan a = -15°C en los siguientes 60 minutos después de la centrifugación.

Los niveles séricos de los compuestos de LH se miden como se describe en el ejemplo X y Z.

Los niveles en suero de testosterona se miden como se describe en el ejemplo Y.

En el último día las ratas se sacrifican por una sobredosis de anestesia de C02/02. Se extirpan las vesículas seminales y se machacan y se secan. Se determina y se registra el peso de las vesículas seminales.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (128)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo, de acción prolongada, caracterizado porque comprende una CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, transferrina y un CH3 (CH2) nC0- , en donde n es 8 a 22 y un polímero.

2. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero.

3. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una albúmina, un fragmento Fe o un anticuerpo de mamífero y una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero.

4. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la molécula armacéuticamente aceptable se selecciona de una albúmina tal como albúmina humana, albúmina humana recombinante , una albúmina modificada con unión aumentada a un FcRn de mamífero, una albúmina recombinante modificada con una unión aumentada a un FcRn de mamífero.

5. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero tal como un fragmento Fe recombinante de un anticuerpo de mamífero.

6. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero .

7. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la albúmina se selecciona de albúmina humana recombinante (SEC ID NO: 20) y albúmina humana 573P (SEC ID NO: 21) .

8. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el fragmento Fe se selecciona de la SEC ID NO: 22.

9. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la variante del fragmento Fe se selecciona de una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 22, excluyendo la SEC ID NO: 22.

10. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de CG de mamífero recombinante o análogo de la misma.

11. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de LH de mamífero recombinante o análogo de la misma.

12. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la CG de mamífero recombinante o análogo de la misma se selecciona de la secuencia de CG de primate, tal como CG de humano, CG de simio o CG de mono; y la secuencia de CG equina, tal como CG de caballo.

13. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la LH de mamífero recombinante o análogo de la misma se selecciona de la secuencia de LH de primate, tal como LH humana, LH de simio o LH de mono; la secuencia de LH de vaca; la secuencia de LH de cerdo; la secuencia de LH equina tal como LH de caballo; la secuencia de LH de borrego; la secuencia de LH de perro; la secuencia de LH de gato y la secuencia de LH de chivo.

14. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de un análogo que tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de mamífero correspondiente de hormona de gonadotropina coriónica u hormona luteinizante , respectivamente, tal como 85% de identidad, 90% de identidad, 95% de identidad o 98% de identidad.

15. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de PEG, por ejemplo, PEG de un peso molecular de por lo menos 5 kDa tal como desde 10 kDa a 150 kDa, típicamente de 10 a 40 kDa.

16. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se une a la molécula farmacéuticamente aceptable y en donde el enlazante se selecciona de un enlazante químico, opcionalmente un enlazante bifuncional.

17. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el enlazante químico se selecciona de una porción azúcar, un puente disulfuro, un enlazante hidrofílico, un enlazante hidrolizable, ácidos dicarboxílieos , hidrazidas de ácido carboxílico, maleimido hidrazidas, PDPH, SPDP, LC-SPDP, GMBS, enlazantes alquilo y enlazantes PEG.

18. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el enlazante químico se selecciona de ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, hidrazida de N- [ácido maleimido caproico] (EMCH) , hidrazida de N- [ácido maleimidopropiónico] (MPH o BMPH) , 4- [N-maleimidometil] ciclohexan-l-carboxilhidrazida, hidrazida de N- [k-ácido maleimidoundecanoico] (KMUH) , hidrazida del ácido 4- (4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH) , éster de succinimida de NHS-3 -maleimidopropionato (MPS-EDA) , (3-[2-piridilditio] propionilhidrazida) conjugado a proteína reactiva con sulfurhidrilo, 3- (2 -piridilditio) -propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6 -( 3 - [2 -piridilditio] -propionamido) hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP), éster de N- (?-maleimidobutiriloxi) succinimida (GMBS), hidrazidas de ácido carboxílico que tienen de 2 a 5 átomos de carbono, -NH-(CH2 ) m-C (O) - , en donde m es un número entero de 2 a 20, opcionalmente sustituido con cualquier grupo no impedido estéricamente como alquilo de 1 a S átomos de carbono, acilo de 1 a 6 átomos de carbono, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2 o fenilo.

19. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma está unida químicamente de modo directo a la molécula farmacéuticamente aceptable.

20. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable está enlazada a la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la LH de mamífero o análogo de la misma.

21. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable está unida a la cadena beta de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la LH de mamífero o análogo de la misma.

22. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 15, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se fusiona a la molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, tal como una albúmina, un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero o una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero, opcionalmente a través de un enlazante peptídico.

23. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el enlazante peptídico tiene por lo menos un aminoácido tal como desde 1 a 200 aminoácidos, típicamente 1 a 50 aminoácidos en donde los aminoácidos se seleccionan de los veinte aminoácidos que se encuentran de modo natural .

24. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el enlazante peptídico se selecciona de un enlazante constituido de aminoácidos que se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina; un enlazante constituido en su mayor parte de aminoácidos que están estéricamente no impedidos, tal como glicina y alanina; un enlazante que comprende la secuencia que se selecciona de -(G)n-, (GGS)n o (GGGGS)n, en donde n es un número entero de 1 a 50 tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10.

25. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el enlazante peptídico se selecciona de GGG, SGGSGGS (SEC ID NO: 58), GGSGGSGGSGGSGGG (SEC ID NO : 59), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEC ID NO: 60), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 57) y EFAGAAAV (SEC ID NO: 56) .

26. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se fusiona directamente a la molécula farmacéuticamente aceptable .

27. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte N terminal de la CG de mamífero o análogo de la misma o una parte N-terminal de la LH de mamífero o análogo de la misma.

28. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la parte N-terminal de la cadena alfa de la LH de mamífero o análogo de la misma.

29. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte N-terminal de la cadena beta de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la parte N-terminal de la cadena beta de la LH de mamífero o análogo de la misma.

30. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a una parte C-terminal de la CG de mamífero o análogo de la misma o a una parte C-terminal de LH de mamífero o un análogo de la misma.

31. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena alfa de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la parte C-terminal de la cadena alfa de la LH de mamífero o análogo de la misma.

32. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula fa macéuticamente aceptable se fusiona a la parte C-terminal de la cadena beta de la CG de mamífero o análogo de la misma o a la parte C-terminal de la cadena beta de la LH de mamífero o análogo de la misma.

33. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o la LH de mamífero o análogo de la misma está glucosilado.

34. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de una CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma.

35. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la CG de mamífero o análogo de la misma o una LH de mamífero o análogo de la misma se selecciona de dos CG de mamífero o análogo de la misma o dos LH de mamífero o análogo de la misma.

36. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula farmacéuticamente aceptable.

37. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de dos moléculas farmacéuticamente aceptables.

38. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del conjugado 1 (conjugado hCG-PDPH-rHA) , el conjugado 3 (conjugado hCG-SPDP-rHA) , el conjugado 4 (conjugado hCG-PDPH-rHA activado por EDC) , conjugado 3V1 (conjugado hCG-SPDP-rHA-K573 ) , conjugado 4VI (conjugado de hCG-PDPH-rHA-K573P activado por EDC) , el producto 2 que consiste de la SEC ID NO: 9 y la SEC ID NO: 26, el producto 3 que consiste de la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO : 28, el producto 4 que consiste de la SEC ID NO : 9 y la SEC ID NO: 27, el producto 5 que consiste de la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 29, el producto 7, que consiste de la SEC ID NO: 4 y la SEC ID NO: 26, el producto 8 que consiste de la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 30 , el producto 9 que consiste de la SEC ID NO: 4 y la SEC ID NO: 27, el producto 10 que consiste de la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 31, el producto 11 que consiste de la SEC ID NO: 32 y la SEC ID NO: 33, el producto 12 que consiste de la SEC ID NO: 32 y la SEC ID NO: 34, el producto 13 que consiste de la SEC ID NO: 32 y la SEC ID NO : 61, y el producto 14 que consiste de la SEC ID NO: 32 y la SEC ID NO: 62.

39. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

40. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque es para inyección, tal como inyección subcutánea.

41. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para usarse en promoción de la fertilidad de un sujeto mamífero, tal como tratamiento con tecnologías de reproducción asistida.

42. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para terapia reproductiva asistida en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces, de manera preferible como una o varias inyecciones en bolo único, durante la fase folicular, la dosificación es suficiente para soportar el desarrollo del folículo .

43. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 42, para usarse en la dosificación también es suficiente para proporcionar soporte lúteo.

44. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para terapia reproductiva asistida en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces, de manera preferible como una o varias inyecciones en bolo único, durante la fase lútea por lo menos hasta 2 semanas después de la ovulación.

45. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para terapia reproductiva asistida en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces, preferiblemente como una o varias inyecciones en bolo único, durante la fase gestacional por lo menos hasta 2 semanas después de la ovulación.

46. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para el tratamiento de pérdida recurrente de embarazo en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro o más veces, de manera preferible como una o varias inyecciones de bolo único durante el período gestacional temprano hasta 12 semanas después de la concepción.

47. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para mejorar la producción de progesterona y optimizar las probabilidades de un embarazo exitoso, en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez, dos veces, tres veces o cuatro o más veces, de manera preferible como una o varias inyecciones de bolo único durante las primeras 12 se semanas de gestación.

48. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, en donde el compuesto de LH se administra por primera vez después de la ovulación .

49. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en un método para terapia reproductiva asistida en un mamífero del género femenino en donde el compuesto de LH se administra en una dosificación una vez o dos veces, de manera preferible como una o varias inyecciones de bolo único, en relación con la inducción de ovulación.

50. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 49, para usarse donde el agonista de GnRH se utiliza para activación de ovulación.

51. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 49, para usarse donde se utiliza una hCG para activación de ovulación.

52. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en promover la fertilidad o el tratamiento de infertilidad en un sujeto mamífero masculino hipogonadal hipogonadotrópico .

53. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 40, para usarse en promover la fertilidad o el tratamiento de infertilidad de un sujeto mamífero del género masculino joven o adolescente que presenta criptorquidismo .

54. Un compuesto de hormona luteinizante (LH) biológicamente activo, de acción prolongada, caracterizado porque comprende un LH de mamífero o un análogo de la misma unido a una molécula farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, transferrina y un CH3 (CH2) nCO- , en donde n es 8 a 22 y un polímero para uso en combinación con un FSH o una molécula que tiene actividad de FSH para uso simultáneo, secuencial o separado para inducir desarrollo folicular, tal como paucifoliculogénesis o unifoliculogénesis , en tratamiento anovulatorio de un sujeto mamífero del género femenino para inducir COS en la fase folicular del ciclo menstrual de un sujeto mamífero del género femenino.

55. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la FSH se deriva exógenamente o se produce endógenamente en el sujeto mamífero del género femenino.

56. El compuesto de LH de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la molécula farmacéuticamente aceptable se selecciona de una molécula que tiene unión a un receptor Fe neonatal de mamífero, tal como una albúmina, por ejemplo albúmina humana, albúmina humana recombinante , una albúmina humana modificada con unión aumentada a FcRn de mamífero, una albúmina recombinante modificada con unión aumentada a FcRn de mamífero; un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero tal como un fragmento Fe recombinante de un anticuerpo de mamífero; y una variante de un fragmento Fe de un anticuerpo de mamífero.

57. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56, caracterizado porque proporciona una vida media plasmática in vivo de la LH de mamífero o análogo de la misma, o la LH modificada la cual es de 2 a 48 horas en el sujeto mamífero del género femenino.

58. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 57, caracterizado porque el compuesto de LH y la FSH o la molécula que tiene actividad de FSH se proporcionan para uso simultáneo en una composición farmacéutica.

59. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 58, caracterizado porque la FSH o una molécula que tiene actividad de FSH se selecciona de FSH de mamífero, tal como FSH humana, en particular FSH recombinante , por ejemplo, rhFSH.

60. El compuesto de LH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, caracterizado porque la FSH o una molécula que tiene actividad de FSH se administra en una relación UI de FSH o la molécula que tiene actividad de FSH respecto a LH de 20:1 a 1:20.

61. Un método para terapia reproductiva asistida en un humano del género femenino, caracterizado porque el método comprende : a. iniciar la estimulación por administración de FSH en el día del ciclo 1 a 3 de un ciclo menstrual, b. administrar un antagonista de GnRH del día 4 a 7 de la estimulación hasta activación de ovulación, c. proporcionar un agonista de LH a la mujer al administrar por lo menos una dosificación de un agonista de LH en el período del día 1 a 9 de la estimulación, la dosificación es suficiente para estimular el desarrollo del folículo hasta activación de ovulación, d. suspender la administración de FSH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de 12 a 14 mm, e. inducir la ovulación con por lo menos una dosificación de un agonista de GnRH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 15 mm.

62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el agonista de LH es una hCG de acción prolongada con una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo, cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo, cada décimo día durante la fase de inducción de ovulación.

64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 63, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo, cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo, cada décimo día durante la fase lútea subsecuente.

65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo, cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo, cada décimo día durante la fase gestacional subsecuente .

66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada décimo cuarto día, tal como cada vigésimo primero, por ejemplo cada mes o incluso menos frecuentemente durante la fase de inducción de ovulación y/o la fase lútea subsecuente y/o la fase gestacional subsecuente,

67. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra como una inyección en bolo única durante la fase folicular, la dosificación es suficiente para soportar el desarrollo del folículo y de manera preferible también suficiente para proporcionar soporte lúteo.

68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 66, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra como una inyección en bolo única durante la fase folicular, la dosificación es suficiente para soportar el desarrollo de folículo y preferiblemente también suficiente para proporcionar soporte gestacional .

69. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 68, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra como una inyección de bolo única cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 12 mm.

70. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra como una inyección en bolo única durante la administración de FSH.

71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 70, caracterizado porque la dosificación del agonista de LH en la fase folicular es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 1 a 12 UI de hCG por litro durante la fase folicular.

72. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 71, caracterizado porque la hCG en la fase folicular es hCG recombinante o derivada de orina administrada en dosificaciones de 25 a 400 UI al día, tal como 50 a 300 UI al día, de manera más preferible 100 a 300, tal como 150 a 250, por ejemplo 175 a 225 UI al día.

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la hCG se administra diariamente del día 5 de la fase folicular o hasta activación de ovulación.

74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la hCG se administra adicionalmente desde el día 2 de la fase folicular.

75. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el agonista de LH se selecciona del grupo que consiste de LH y LH de acción prolongada, preferiblemente LH de acción prolongada.

76. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 75, caracterizado porque la FSH se administra en una dosificación que proporciona un nivel en suero de 5 a 25 UI de FSH por litro, preferiblemente 10 a 15 UI por litro durante la fase folicular.

77. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 76, caracterizado porque la FSH es FSH recombinante o derivada de orina administrada en dosificaciones diarias de 50 a 600 UI de FSH al día, preferiblemente 100 a 300 UI de FSH al día, tal como 150 a 225 Ul/día.

78. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 77, caracterizado porque la FSH es FSH de acción prolongada, tal como corifolitropina, preferiblemente administrada como una inyección en bolo de 40 a 250 µ<3 por mamífero de género femenino en los días 1 a 3 del ciclo menstrual .

79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 78, caracterizado porque el antagonista de GnRH se selecciona del grupo que consiste de cetrorelix, ganirelix, abarelix y degarelix.

80. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 79, caracterizado porque el agonista de GnRH se selecciona del grupo que consiste de leuoprolida, buserelina, nafarelina, histrelina, goserelina, deslorelina y triptorelina .

81. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 80, caracterizado porque el soporte lúteo subsecuente se proporciona por administración de una o más dosificaciones de un agonista de LH suficiente para proporcionar una concentración de progesterona sérica de por lo menos 20 nmol/1 en el día 7 después de la captación del ovocito.

82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque una o más dosificaciones son suficientes para mantener un nivel de progesterona en suero de por lo menos 20 ml/1 por lo menos hasta 10 días después de la captación del ovocito, preferiblemente por lo menos hasta 14, de manera más preferible por lo menos hasta 21, de modo más preferible por lo menos hasta 28 días después de la captación del ovocito.

83. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el agonista de LH es LH recombinante o derivada de orina.

84. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizado porque la LH administrada es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 2 a 12 UI de LH por litro durante la fase lútea, de manera más preferible una concentración en suero de 4 a 12 UI/1, tal como 6 a 12 UI/1.

85. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 84, caracterizado porque la LH se administra a dosificaciones diarias de 100 a 600 UI de LH al día, preferiblemente 150 a 450 UI de LH al día, tal como 200 a 400 UI de LH al día, por ejemplo, 250 a 350 Ul/día.

86. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el agonista de LH es una LH de acción prolongada que comprende hormona luteinizante unida a una porción química, en donde la LH de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 6 veces la vida media de LH.

87. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el agonista de LH es hCG recombinante o derivada de orina.

88. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el agonista de LH es una hCG de acción prolongada que comprende gonadotropina coriónica humana unida a una porción química, en donde la hCG de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

89. El método de conformidad con la reivindicación 87 u 88, caracterizado porque la hCG administrada es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 5 a 15 UI de LH por litro durante la fase lútea, de manera más preferible, una concentración en suero de 4 a 12 Ul/1, tal como 5 a 12, por ejemplo 5 a 8 UI al día.

90. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la hCG se administra en dosificaciones diarias de hCG recombinante o derivada de orina .

91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la dosificación diaria de hCG es de 25 a 400 UI de hCG al día, preferiblemente de 50 a 200 UI de hCG al día, por ejemplo de 75 a 200, tal como 100 a 150 ó 120 a 170 Ul/día.

92. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 91, caracterizado porque en la ovulación se activa cuando por lo menos un folículo que tiene un diámetro de por lo menos 16 mm, de manera más preferible 17 mm, de modo más preferible cuando por lo menos 2 ó 3 folículos tienen un diámetro de 17 mm.

93. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 92, caracterizado porque la técnica de reproducción asistida resulta en estimulación controlada del ovario o hiperestimulación .

94. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 61 a 93, caracterizado porque la técnica de reproducción asistida se utiliza junto con fertilización in vitro, inyección intracitoplásmica de esperma, maduración in vitro e inseminación intrauterina.

95. Un método para proporcionar soporte lúteo a mujeres que experimentan tratamiento reproductivo asistido, caracterizado porque comprende administrar un agonista de LH durante la fase lútea, por lo menos hasta las 2 semanas después de la ovulación.

96. El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque el agonista de LH se administra hasta por lo menos 3 semanas después de la ovulación, tal como 4 semanas, por ejemplo, 5 semanas, tal como 6 semanas, tal como 7 semanas, por ejemplo, 8 semanas tal como 9 semanas, por ejemplo 10 semanas después de la ovulación.

97. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 96, caracterizado porque el agonista de LH es suficiente para proporcionar un nivel en suero de por lo menos 20 nmol/1 de progesterona .

98. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 97, caracterizado porque el agonista de LH se selecciona del grupo que consiste de LH, variantes de secuencia de LH y LH de acción prolongada.

99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el agonista de LH es LH recombinante o derivada de orina.

100. El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque la LH administrada es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración en suero de 4 a 12 UI de LH por litro durante la fase lútea, de manera más preferible una concentración en suero de 4 a 12 Ul/1 tal como 8 a 12 Ul/1.

101. El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque la LH se administra en dosificaciones diarias de 100 a 600 UI de LH al día, preferiblemente 150 a 450 UI de LH al día, tal como 200 a 400 UI de LH al día, por ejemplo 250 a 350 Ul/día.

102. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el agonista de LH es una LH de acción prolongada que comprende hormona luteinizante unida a una porción química, en donde la LH de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 6 veces la vida media de LH.

103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la LH de acción prolongada se administra cada segundo día tal como cada tercer día, por ejemplo cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como noveno día, por ejemplo cada décimo día, durante la fase lútea.

104. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la LH de acción prolongada se administra cada segundo día tal como cada tercer día, por ejemplo cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como noveno día, por ejemplo cada décimo día, durante la fase gestacional.

105. El método de conformidad con la reivindicación 103 ó 104, caracterizado porque la LH de acción prolongada se administra cada décimo cuarto día, tal como cada vigésimo primer día, por ejemplo cada mes o incluso con menos frecuencia durante las fases lútea y gestacional.

106. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 97, caracterizado porque el agonista de LH se selecciona del grupo que consiste de hCG, variantes de secuencia de hCG y hCG de acción prolongada.

107. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el agonista de LH es una hCG de acción prolongada que comprende gonadotropina coriónica humana unida a una porción química, en donde la hCG de acción prolongada tiene una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

108. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la hCG administrada es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración sérica de 2 a 12 UI de LH por litro durante la fase lútea, de manera más preferible una concentración sérica de 4 a 12 UI/1.

109. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 106 a 108, caracterizado porque la hCG se administra en dosificaciones diarias de hCG recombinante o derivada de orina.

110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la dosificación diaria de hCG es de 25 a 400 UI de hCG al día, preferiblemente de 50 a 200 UI de hCG al día, por ejemplo 75 a 200, tal como 100 a 150 ó 120 a 170 Ul/día.

111. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 106 a 108, caracterizado porque la hCG es una hCG de acción prolongada con una vida media en suero de por lo menos 1.5 veces la vida media de hCG.

112. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 106 a 111, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo, cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo, cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo, cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo cada décimo día durante la fase lútea.

113. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 106 a 111, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada segundo día, tal como cada tercer día, por ejemplo cada cuarto día, tal como cada quinto día, por ejemplo cada sexto día, tal como cada séptimo día, por ejemplo cada octavo día, tal como cada noveno día, por ejemplo cada décimo día, durante la fase gestacional.

114. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 113, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra cada décimo cuarto día, tal como vigésimo primer día, por ejemplo cada mes o incluso menos frecuentemente durante las fases lútea y gestacional.

115. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 106 a 112, caracterizado porque la hCG de acción prolongada se administra como una inyección en bolo única durante la fase folicular, la dosificación es suficiente para proporcionar soporte lúteo.

116. El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque la dosificación de hCG en la fase folicular es suficiente para proporcionar una respuesta biológica similar a la respuesta proporcionada por una concentración sérica de 1 a 12 UI de hCG por litro durante la fase folicular.

117. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 116, caracterizado porque la técnica reproductiva asistida ha sido inducida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 94.

118. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 116, caracterizado porque la ovulación ha sido activada por un disparo activador de hCG, hCG de acción prolongada, un agonista de GnRH o una combinación de agonista y hCG.

119. Un método para inducir foliculogénesis y soportar implantación subsecuente de embrión en un humano del género femenino, caracterizado porque comprende: a. iniciar la estimulación por administración de FSH en el día del ciclo 1 a 3 de un ciclo menstrual, b. administrar un antagonista de GnRH del día 4 a 7 de la estimulación, hasta la ovulación, c. administrar un agonista de LH al administrar por lo menos una dosificación de hCG en un período desde el día 1 a 9, la por lo menos una dosificación de hCH es suficiente para estimular el desarrollo del folículo hasta la ovulación, d. suspender la administración de FSH cuando por lo menos un folículo tiene una media de diámetro de 12 a 14 mm, y e. proporcionar soporte lúteo por administración de una o más dosificaciones de un agonista de LH suficiente para proporcionar una concentración de progesterona sérica de por lo menos 20 nmol/1 7 a 10 días después de la ovulación.

120. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque resulta en monofoliculogénesis o paucifoliculogénesis .

121. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque es un método de estimulación de ovario controlada que involucra inducción de ovulación al administrar un disparo de activación de hCG o un agonista de GnRH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 15 mm, de manera más preferible por lo menos 16 mm, por ejemplo, cuando por lo menos 3 folículos tienen un diámetro de 17 mm.

122. El método de conformidad con la reivindicación 120 ó 121, caracterizado porque el soporte lúteo se proporciona adicionalmente por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 91 a 110.

123. Un método para terapia reproductiva asistida en un humano del género femenino, caracterizado porque comprende : a. iniciar la estimulación mediante administración de FSH en el día del ciclo 1 a 3 de un ciclo menstrual , b. administrar un antagonista de GnRH del día 4 a 7 de la estimulación hasta activación de la ovulación, c. proporcionar un agonista de LH a la mujer al administrar por lo menos una dosificación de un agonista de LH en el período del día 1 a 9 de la estimulación, la dosificación es suficiente para estimular el desarrollo de folículo hasta activación de la ovulación, d. suspender la administración de FSH cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de 2 a 14 mm, e. inducir ovulación con por lo menos una dosificación de 2000 UI de hCG o menos cuando por lo menos un folículo tiene un diámetro de por lo menos 15 mm.

124. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la inducción de ovulación adicionalmente involucra administración de un agonista de GnRH.

125. El método de conformidad con la reivindicación 123 ó 124, caracterizado porque comprende una o más de las características como se especifican en cualquiera de las reivindicaciones 72 a 85.

126. FSH, un agonista de LH, antagonista de GnRH y agonista de GnRH, para usarse de conformidad con cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 61 a 94.

127. Un agonista de LH, para usarse en suministrar soporte lúteo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 a 118.

128. FSH, un agonista de LH, un antagonista de GnRH y un agonista de LH, para usarse en el método de conformidad con la reivindicación 121.