JP2018531237A6 - 多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、タンパク質結合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、多数の生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチド結合体、その用途、及びその製造方法に関するものである。

Description

本発明は、多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体、その用途、及びその製造方法に関する。

経済成長と生活方式の変化に応じて食習慣にも最近多くの変化があった。特に、忙しい現代人は、ファーストフードなどの高熱量の食事と活動量の減少、過度なストレス、不規則な生活パターンなどにより、各種の成人病が増加している。
過体重及び肥満は、血圧とコレステロール値を増加させて、心臓病、糖尿病、関節炎などの様々な疾患の発病または悪化の原因となっている。非アルコール性脂肪肝も、過体重、肥満、高脂血症、インスリン抵抗性、糖尿病などがリスク要因であり、放置すると肝線維化、肝硬変、肝がんにつながることがある。
糖尿病、肥満、高脂血症、脂肪肝などの代謝性疾患に問題を引き起こす成人病を一つ以上経験している患者は、他の成人病が発症する可能性が高く、このような患者は、同時に一つ以上の複数の成人病を同時に治療及び調節しなければならない。
一方、インスリンは、膵臓のベータ細胞から分泌されるペプチドとして体内の血糖を調節するのに非常に重要な役割を担う物質である。このようなインスリンの分泌量が不足したり、正常な機能が行われず、血中のブドウ糖の濃度が高くなる代謝性疾患を糖尿病という。インスリンが正常に分泌されないか、分泌されたインスリンが体内で正常に作用せず、体内の血糖が調節されずに上昇する場合を第２型糖尿病といい、膵臓からインスリンを分泌せず、血糖が上昇する場合を第１型糖尿病という。第２型糖尿病の場合、化学物質を主成分とする経口用血糖降下剤を用いて治療し、一部の患者にはインスリンを用いて治療することもある。一方、第１型糖尿病の場合には、インスリンの投与が必須的に要求される。
インスリンは、現在、注射剤として用いて、皮下注射で投与することを原則としており、作用時間に応じて投与方法が異なる。インスリン注射の投与は、飲み薬に比べて血糖降下の効果がより迅速に示され、飲み薬を使用することができない環境でも安全に使用でき、容量の制限もない。しかし、１日３回ずつ継続的に使用する必要があるため、注射針への拒否感、投与方法の難しさ、低血糖の症状、長期的なインスリン投与により発生する体重増加の現象などが欠点として挙げられる。また、体重増加の現象は、心血管疾患のリスクを高め、血糖の調節機能を低下させる副作用につながることがある。

グルカゴンは、薬物の治療または疾病、ホルモンや酵素の欠乏などの原因で血糖が低下し始めた場合、膵臓で生産される。グルカゴンは、肝臓でグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように信号し、血糖のレベルを正常なレベルまで高める役割をする。それだけではなく、グルカゴンは、血糖の上昇効果に加えて、食欲抑制及び脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ（hormone sensitive lipase）を活性化させて、脂肪分解を促進することによって抗肥満の効果を示すと報告された。このようなグルカゴンの誘導体の一つであるグルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ‐１）は、糖尿病患者の高血糖症を減少させる治療剤として開発中である物質であって、インスリンの合成と分泌促進、グルカゴンの分泌阻害、胃空腹抑制、グルコースの使用増進とともに、飲食物の摂取を阻害する機能を有する。ＧＬＰ‐１と約５０％のアミノ酸相同性を有するトカゲ毒液（lizard venom）から作られるエキセンジン４（exendin-4）も、ＧＬＰ‐１受容体を活性化させ、糖尿病患者の高血糖症を減少させることが知られている。しかし、前記ＧＬＰ‐１を含む肥満治療用の医薬は、嘔吐と吐き気の副作用を発生させるという問題点を示すことが報告された。
繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）はＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３を含む繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の亜科（subfamily）に属する分泌型ポリペプチドである。これは血管新生、類似分裂生殖、パターン形成、細胞分化、代謝調節及び組織損傷の修復をはじめとするさまざまな生理学的機能において重要な役割を果たす。ＦＧＦ２１は、主に肝臓で発現されることが報告されており、虚血性血管疾患、創傷治癒、及び肺、気管支または肺胞細胞機能の損傷に関連する疾患及び多数の他の障害に対する治療剤として記述されてきた。

特許文献１によると、ＦＧＦ２１をインスリンの存在及び不在下でマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で長時間処理（７２時間）すると、ＦＧＦ２１は前記脂肪細胞でグルコースの受容を刺激する。また、ｏｂ/ｏｂ及びｄｂ/ｄｂマウス及び８週齢のＺＤＦラットで空腹及び食後血糖（blood glucose）、トリグリセリド（triglyceride）及びグルカゴン（glucagon）レベルを投与量依存的な（dose-dependent）方式で減少させることが明らかになった。このように、ＦＧＦ２１が糖尿病及び肥満の治療のための療法として用いられうる効果が証明されたことがある。
一方、本発明者は、天然型に比べて半減期が増加されたインスリンアナログ、イミダゾアセチルエキセンジン４（Imidazoacetyl（CA）exendin-4、CA‐エキセンジン４）のような生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体を介して、免疫グロブリンＦｃ領域に部位選択的な共有結合で連結したタンパク質結合体及びこれを含む組成物をそれぞれ開発した（特許文献２及び３）。ただし、２種類以上の生理活性ポリペプチドが１単位の免疫グロブリンＦｃ領域に非ペプチド性重合体を介してそれぞれ結合された形態に対しては示したことがない。
このような背景下で、本発明者らは併用投与や複合製剤の形態で使用するとき、二重的に投与される免疫グロブリンＦｃの量を下げながら、同時に２つ以上の効果を有する単一物質を開発するために鋭意努力した結果、多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチド結合体を開発した。具体的に、二量体（dimeric form）である免疫グロブリンＦｃのいずれか１単位に、非ペプチド性重合体を介してそれぞれの生理活性を示す２種類のポリペプチドが共有結合された形態の異種二量体（heterodimer）結合体を開発した。
このような異種二量体の結合体は、免疫グロブリンＦｃの一つの単位に非ペプチド性重合体によって１種類の生理活性物質が共有結合された単量体（monomer）結合体と試験管内力価を比較したとき、単量体結合体の生理活性の程度に対して異種二量体の結合体の該当生理活性の程度が同等であることを確認した。ここで、該当異種二量体の結合体の人体投与時、２つ以上の単量体結合体を併用投与したり、これらの複合製剤を使用する場合に比べて、投与された免疫グロブリンＦｃの濃度を半分に減少させることができ、投与されるタンパク質の濃度及びタンパク質の量も減少して、タンパク質の濃度に応じて発生しうる粘度も増加及びそれに伴う注射投与時の患者の苦しみの問題を減少させうることを確認し、本発明を完成した。

国際公開特許ＷＯ２００３/０１１２１３ 国際公開特許ＷＯ２０１４‐１３３３２４ 国際公開特許ＷＯ２００８‐０８２２７４ 米国特許公開ＵＳ２０１６‐０００８４８３ Ａ１ 米国公開特許ＵＳ２０１０‐０１０５８７７ Ａ１ 国際公開特許ＷＯ９７/３４６３１号 国際公開特許ＷＯ９６/３２４７８号

H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979

本発明の一つの目的は、多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体を提供することにある。
具体的に、生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体であって、 前記タンパク質結合体は、（ｉ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部；（ｉｉ）前記Ｆｃ領域またはその一部に共有結合で連結された非ペプチド性重合体；及び（ｉｉｉ）前記非ペプチド性重合体に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドを含み、
この時、前記Ｆｃ領域またはその一部が２つのポリペプチド鎖の二量体であり、この２つのポリペプチド鎖のそれぞれには１つ以上の前記非ペプチド性重合体が連結されている結合体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記タンパク質結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質結合体を含む組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質結合体を含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性の増加のための組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質結合体またはこれを含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、目的とする疾患を治療する方法を提供することにある。

本発明を具現するための一つの態様は、多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体である。
具体的に、一つの様態は、
（ｉ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部；
（ｉｉ）前記Ｆｃ領域またはその一部に共有結合で連結された非ペプチド性重合体；及び
（ｉｉｉ）前記非ペプチド性重合体に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドを含み、
この時、前記Ｆｃ領域またはその一部が２つのポリペプチド鎖の二量体であり、この２つのポリペプチド鎖のそれぞれには１つ以上の前記非ペプチド性重合体が連結されている、
２つ以上の生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体である。
一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域が非糖鎖化されることを特徴とする。
他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなるグループから選択された１つ〜４つのドメインからなることを特徴とする。
他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ（hinge）領域をさらに含むことを特徴とする。
他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせ（combination）及びこれらのハイブリッド（hybrid）のＦｃ領域からなる群から選択されることを特徴とする。

他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ1、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのＦｃ領域からなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
他の具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
他の具体例として、前記共有結合は、アルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択された非ペプチド性重合体の末端反応基を、Ｆｃ領域またはその一部または生理活性ポリペプチド内のアミノ基と反応させて形成したことを特徴とする。
他の具体例として、前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートあることを特徴とする。
他の具体例として、非ペプチド性重合体の両末端反応基がアルデヒド基を有することを特徴とする。
他の具体例として、非ペプチド性重合体は、一方の末端で免疫グロブリンＦｃのアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つを介して結合し、他方の末端で生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基の側鎖、アルギニン残基の側鎖、ヒスチジン（histidine）残基の側鎖またはシステイン（cysteine）残基側鎖のいずれか１つを介して結合していることを特徴とする。
他の具体例として、非ペプチド性重合体がポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール‐プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、脂肪酸、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
他の具体例として、非ペプチド性重合体がポリエチレングリコール単独重合体であることを特徴とする。

他の具体例として、生理活性ポリペプチドがホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、前記生理活性ポリペプチドが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、オキシントモジュリン（oxyntomodulin）、エキセンジン３（ｅｘｅｎｄｉｎ‐３）、エキセンジン４（ｅｘｅｎｄｉｎ‐４）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、Ｇタンパク質関連受容体（G-Protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体アンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、アンジオテンシン、ブラジキニン 、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxyt℃in）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Motilin）、血管作用性腸ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide; ANP）、バリンナトリウム利尿ペプチド（Barin natriuretic peptide; BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide; CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid beta‐protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Oste℃alcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅセレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）、フューゼオン（Fuzeon）及びそれらのアナログからなる群から選ばれることを特徴とする。

他の具体例として、生理活性ポリペプチドが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、オキシントモジュリン（oxyntomodulin）、エキセンジン３（ｅｘｅｎｄｉｎ‐３）、エキセンジン４（ｅｘｅｎｄｉｎ‐４）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ヒト成長ホルモン、インターフェロン‐アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、Ｆａｂ’抗体断片及びそれぞれのアナログからなる群から選択されることを特徴とする。
他の具体例として、前記Ｆｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された生理活性ポリペプチドは異なる種類であることを特徴とする。
他の具体例として、前記タンパク質結合体は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる種類の生理活性ポリペプチドの２単位がそれぞれ非ペプチド性重合体を介して連結されたことを特徴とする。
他の具体例として、前記タンパク質結合体は、異なる種類の生理活性ポリペプチドがそれぞれ非ペプチド性重合体を介して１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に連結されて、前記異なる種類の生理活性ポリペプチドは、互いに異なる割合で存在することを特徴とする。
他の具体例として、非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドは、非ペプチド性重合体が連結された部位ではなく他の部位に追加の生理活性ポリペプチドがさらに連結されていることを特徴とする。
他の具体例として、前記タンパク質結合体は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる種類の生理活性ポリペプチドの３単位以上がそれぞれ非ペプチド性重合体を介して連結されたことを特徴とする。
本発明を具現するための他の様態は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部に対して、同一の生理活性を示す３単位以上の生理活性ポリペプチドのそれぞれが非ペプチド性重合体を介して共有結合で連結された、生理活性ポリペプチドの同種多量体（homomultimer）結合体である。

本発明を具現するためのもう一つの様態は、前記結合体の製造方法である。
具体的に、（ａ）生理活性ポリペプチドが一方の末端に連結されて、他方の末端に残りの反応基を有する非ペプチド性重合体と（ｂ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部に１つ以上の生理活性ポリペプチドのそれぞれが非ペプチド性重合体を介して連結されており、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に残りの反応基を有する生理活性ポリペプチド結合体を提供する段階；及び前記（ａ）の生理活性ポリペプチドに連結された非ペプチド性重合体の残りの反応基と前記（ｂ）の生理活性ポリペプチド結合体の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基を共有結合で連結させる段階を含む製造方法である。
一つの具体例として、前記（ａ）の非ペプチド性重合体は、アルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択された、残りの反応基を有することを特徴とする。
他の具体例として、前記（ｂ）の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基が、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部のアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つに位置することを特徴とする。
他の具体例として、前記（ａ）の生理活性ポリペプチドは、（ｂ）の生理活性ポリペプチドと互いに同一の種類であるか、互いに異なる種類であることを特徴とする。
他の具体例として、前記（ａ）の生理活性ポリペプチドと前記（ｂ）の生理活性ポリペプチドは、シングル単位 （single unit）であることを特徴とする。
本発明を具現するための他の様態は、前記タンパク質結合体を含む組成物である。
一つの具体例として、前記組成物は、生理活性プリペプチドの生体内持続性及び安定性の増加のための組成物であることを特徴とする。
他の具体例として、前記組成物は、薬学的組成物であることを特徴とする。
本発明の具現するための他の様態は、前記タンパク質結合体またはこれを含む組成物を、これを必要とする固体に投与する段階を含む、目的とする疾患を治療する方法である。

本発明では、２つ以上の生理活性ポリペプチドが免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体を介して連結された結合体は、１つの生理活性ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結した単量体結合体のそれぞれと同一または類似の生理活性を有することができるため、単量体結合体を用いる場合に比べて、免疫グロブリンＦｃの人体に不要な投与量を減少させることができる。
また、互いに異なる種類の生理活性ポリペプチドを含む本発明による結合体の場合、２つ以上の薬効を１つの結合体内に有する利点もさらに有することができる。

インスリンアナログ及びイミダゾ‐アセチル（Imidazo-acetyl、CA）エキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体（heterodimer）結合体のＨＰＬＣ分析結果である。該当の図において、持続型インスリンアナログ結合体は、単量体結合体の形態のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を意味し、持続型CA‐エキセンジン４結合体は、単量体結合体の形態のCA‐エキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとがＰＥＧを介して連結された結合体を意味する。 インスリンアナログ及びイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（１２％）の結果である。 インスリンアナログ及びイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の抗免疫グロブリンＦｃに対するウェスタンブロット分析結果である。 インスリンアナログ及びイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の抗エキセンジン４に対するウェスタンブロット分析結果である。 インスリンアナログ及びイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の抗インスリンに対するウェスタンブロット分析結果である。 ２単位のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体（homodimer）結合体のＨＰＬＣ分析結果である。該当の図において、持続型インスリンアナログ結合体は、単量体結合体の形態のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃとがＰＥＧを介して連結された結合体を意味する。 ２単位のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの分析結果である。 ２単位のイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体のＨＰＬＣ分析結果である。 ２単位のイミダゾ‐アセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの分析結果である。 インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＨＰＬＣ分析結果である。 インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの分析結果である。 イミダゾ‐アセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＨＰＬＣ分析結果である。 イミダゾ‐アセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの分析結果である。 イミダゾ‐アセチルエキセンジン４及び繊維芽細胞成長因子２１と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＨＰＬＣ分析結果である。 イミダゾ‐アセチルエキセンジン４及び繊維芽細胞成長因子２１と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析結果である。

本発明を実施するための具体的な内容を説明すると、次の通りである。一方、本願で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用されてもよい。つまり、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本発明の範囲が限定されるとは言えない。
本発明を具現するための一つの様態は、多数の生理活性プリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体を提供する。
具体的に、
（ｉ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部；
（ｉｉ）前記Ｆｃ領域またはその一部に共有結合で連結された非ペプチド性重合体；及び
（ｉｉｉ）前記非ペプチド性重合体に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドを含み、
この時、前記Ｆｃ領域またはその一部が２つのポリペプチド鎖の二量体であり、この２つのポリペプチド鎖のそれぞれには１つ以上の前記非ペプチド性重合体が連結されている、
２つ以上の生理活性ポリペプチドを含む、生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体を提供する。

本発明の用語、「タンパク質結合体」は、生理活性ポリペプチドと任意の他の要素とを含む結合体、具体的に生理活性ポリペプチドと任意の他の要素とが共有結合で連結された物質を意味する。
前記任意の他の要素は、生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させたり、腎臓排出を減らすなどの生理活性ポリペプチドの生体内作用において、ある有利な機能を有する任意の物質もなりうる。
前記任意の他の要素は、担体を含み、本発明のタンパク質結合体を形成しうる担体の例として、生理活性ポリペプチドに連結した後に血中の安全性を高めることができるアルブミン、トランスフェリン、抗体、抗体断片、エラスチン、ヘパリン、キチン（chitin）のような糖重合体（polysaccharide）、フィブロネクチ（fibronectin）などであってもよいが、これに限定されない。
本発明の一つの具体的な実施形態で、前記他の要素は免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合能を保有するＦｃ領域の一部であってもよいが、これに限定されない。
前記免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部は、２つのポリペプチド鎖の二量体形態（dimeric form）であってもよい。ここで、前記２つのポリペプチド鎖はジスルフィド結合などのあらゆる任意の組み合わせを介して二量体の形態を有してもよい。また、タンパク質結合体に用いられるＦｃ領域の一部は、ＦｃＲｎに結合しうるＦｃ領域の一部になってもよい。
より具体的に、前記タンパク質結合体は、２つまたはそれ以上の生理活性ポリペプチドが１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に非ペプチド性重合体を介して連結された形態であってもよいが、これに限定されない。
本発明の一実施形態において、前記タンパク質結合体は、二量体形態である免疫グロブリンＦｃ領域またはＦｃＲｎに対する結合能を維持するＦｃ領域の一部を構成するそれぞれの免疫グロブリン重鎖の鎖ごとに非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドが連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
前記非ペプチド性重合体は、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部、具体的に、Ｆｃ領域またはその一部を構成する免疫グロブリン重鎖の鎖に介在して、共有結合で両方を連結させることができる。
これらのタンパク質結合体は、同種多量体または異種多量体、より具体的に、同種二量体または三量体あるいは異種二量体または三量体、より具体的に、同種二量体または異種二量体の形態であってもよい。

本発明で用語、「同種多量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して同一の生理活性を示す２単位以上のポリペプチドのそれぞれが、非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
つまり、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に非ペプチド性重合体を介して連結された生理活性ポリペプチドが、すべて同一の生理活性を示す種類であり、これにより単一の生理活性を示すことができる。
前記「同種多量体」は、本明細書で「同種多量体の結合体」と混用されて使用される。
本発明で用語、「同種二量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して同一の生理活性を示す２単位のポリペプチドそれぞれが、非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
具体的に、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに対して、同一の生理活性を示すポリペプチド２単位それぞれが非ペプチド性重合体を介して連結された構造であってもよい。
前記「同種二量体」は、本明細書で「同種二量体の結合体」と混用されて使用される。
本発明で用語、「同種三量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して同一の生理活性を示す３単位のポリペプチドそれぞれが、非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
例えば、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに、１つの非ペプチド性重合体及び２つの非ペプチド性重合体が連結され、当該非ペプチド性重合体に３単位の生理活性ポリペプチドそれぞれが連結された形態の構造であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
前記「同種三量体」は、本明細書で「同種三量体の結合体」と混用されて使用される。
本発明で用語、「異種多量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる生理活性を示すポリペプチド２単位以上（例えば、２単位あるいは３単位またはそれ以上）が、それぞれ非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
これにより、前記異種多量体の結合体は、２つ以上の生理活性ポリペプチドを含み、二重または多重生理活性を示すことができる。
例えば、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに１つまたは２つ以上の非ペプチド性重合体が連結されて、当該非ペプチド性重合体に生理活性ポリペプチドが連結された形態の構造であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。

前記「異種多量体」は、本明細書で「異種多量体の結合体」と混用されて使用される。
このような異種多量体は、異種二量体、異種三量体などの形態であってもよいが、特にこれに限定されない。
本発明で用語、「異種二量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる生理活性を示す２単位のポリペプチドそれぞれが、非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
具体的に、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに対して、異なる生理活性ポリペプチド２単位それぞれが非ペプチド性重合体を介して連結された構造であってもよい。
前記「異種二量体」は、本明細書で「異種二量体の結合体」と混用されて使用される。
本発明で用語、「異種三量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して、異なる生理活性を示す３単位のポリペプチドそれぞれが非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
例えば、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに、１つの非ペプチド性重合体及び２つの非ペプチド性重合体が連結され、当該非ペプチド性重合体に３単位の生理活性ポリペプチドそれぞれが連結された形態の構造であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
前記「異種三量体」は、本明細書で「異種三量体の結合体」と混用されて使用される。

ここで、特にこれに限定されないが、前記同種多量体もしくは異種多量体の結合体を構成する非ペプチド性重合体を介して、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドは、非ペプチド性重合体が連結された部位でない他の異なる部位に追加の生理活性ポリペプチドがさらに連結されている形態であってもよい。
ここで、追加の生理活性ポリペプチドは、リンカーを介して２つ以上の生理活性ポリペプチドが連結されたり、直接的に連結された形態であってもよいが、これに限定されず、前記リンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであってもよいが、これに限定されない。
免疫グロブリンＦｃの１単位のポリペプチド鎖に非ペプチド性重合体で連結された生理活性ポリペプチドの部位に連続的に１つ以上、または１種類以上の生理活性ポリペプチドがリンカーによって連結された形態も含む。
この時、追加される生理活性ポリペプチドは、それと連結された生理活性ポリペプチドと同一の種類の生理活性ポリペプチドであってもよいが、これに限定されない。この場合、同種多量体を構成する生理活性ポリペプチド、そして、異種多量体を構成する生理活性ポリペプチドのすべての種類あるいは一部の種類は、多数のポリペプチド（multiple polypeptides）として存在してもよい。つまり、多数のポリペプチドの形態として生理活性ポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域に非ペプチド性重合体を介して連結された形態を含む構造であってもよいが、特にこれに限定されない。
また、前記異種多量体において異なる種類の生理活性ポリペプチドは、互いに異なる割合で存在してもよい。
例えば、１単位の免疫グロブリンＦｃまたはその一部を構成する２つのポリペプチド鎖のそれぞれに、非ペプチド性重合体を介して連結された異なる生理活性ポリペプチドの２種類が連結されており、この生理活性ポリペプチドの２種類のいずれか１つは、これとの同一の種類の生理活性ポリペプチドがさらに連結されていることにより、２種類の生理活性ポリペプチドの間に異なる割合で存在しうる。しかし、その割合は制限されない。
本発明の一実施形態において、前記タンパク質結合体は、インスリンアナログの１単位とインスリン分泌ペプチドであるイミダゾ‐アセチルエキセンジン４の１単位が、１単位のＦｃ領域のポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された、異種二量体である。

本発明の一実施形態において、前記タンパク質結合体は、インスリンアナログの１単位とグルカゴンアナログの１単位が、１単位のＦｃ領域のポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された、異種二量体である。
本発明の一実施形態において、前記タンパク質結合体は、インスリン分泌ペプチドであるイミダゾ‐アセチルエキセンジン４の１単位とグルカゴンアナログの１単位が、１単位のＦｃ領域のポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された、異種二量体である。
本発明の一実施形態において、前記タンパク質結合体は、インスリン分泌ペプチドであるイミダゾ‐アセチルエキセンジン４の１単位とＦＧＦ２１の１単位が、１単位のＦｃ領域のポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された、異種二量体である。
先に述べた異種多量体、特に異種多量体は、これを構成する単一の生理活性ポリペプチドに対する単量体結合体と同等であるか、互いに相応する生理活性を示してもよいが、特にこれに限定されるものではない。

本発明で用語、「単量体」は、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域に対して、生理活性を示す１単位のポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
具体的に、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域の２つのポリペプチド鎖のいずれか１つのポリペプチド鎖に、１単位の生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して連結された形態の結合体をいう。
前記「単量体」は、本明細書で「単量体結合体」と混用して使用される。
前記タンパク質結合体を構成する一部分である生理活性ポリペプチドは、人体内で生理活性を示すようにする物質であって、生理活性を示しうるペプチドはすべて該当されてもよい。
例えば、生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されてもよい。
また、例えば、これに限定されるものではないが、インスリン分泌ペプチド、血液因子、消化促進ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸内ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、ニューロペプチド（neuropeptide）、下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド及び生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体またはこれらのアナログからなる群から選択されてもよい。ここで、ＧＬＰ‐１受容体アゴニスト、レプチン（Leptin）受容体アゴニスト、ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体アンタゴニスト、ＭＣＨ（Melanin-concentrating hormone）受容体アンタゴニスト、Ｙ２/３受容体アゴニスト、ＭＣ３/４受容体アゴニスト、胃/膵臓リパーゼ（gastric/pancreatic lipase）阻害剤、５ＨＴ２ｃアゴニスト、β３Ａ受容体アゴニスト、アミリン（Amylin）受容体アゴニスト、グレリン（Ghrelin）アンタゴニスト、グレリン受容体アンタゴニストなどになってもよい。
より具体的に、生理活性ポリペプチドは、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、オキシントモジュリン（oxyntomodulin）、エキセンジン３（ｅｘｅｎｄｉｎ‐３）、エキセンジン４（ｅｘｅｎｄｉｎ‐４）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、Ｇタンパク質関連受容体（G-Protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体アンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、アンジオテンシン、ブラジキニン 、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxyt℃in）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Motilin）、血管作用性腸ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide; ANP）、バリンナトリウム利尿ペプチド（Barin natriuretic peptide; BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide; CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid beta‐protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Oste℃alcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅセレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）、フューゼオン（Fuzeon）及びそれらのアナログからなる群から選択されるものであってもよい。

本発明の一実施形態によると、１）インスリンまたはそのアナログ及びグルカゴンまたはそのアナログの組み合わせ；２）インスリンまたはそのアナログ及びインスリン分泌ペプチドまたはそのアナログの組み合わせ；３）インスリン分泌ペプチドまたはそのアナログ及びグルカゴンまたはそのアナログの組み合わせ；及び４）インスリン分泌ペプチドまたはそのアナログ及びＦＧＦ２１またはそのアナログの組み合わせが異種多量体に適用されてもよいが、特にこれに限定されるものではない。
前記生理活性ポリペプチドは、天然型生理活性ポリペプチドだけでなく、そのアナログもすべて含む。
ここで、前記アナログは、当該天然型ポリペプチドの生理活性を有するポリペプチドの前駆物質（precursors）、誘導体（derivatives）、または断片（fragments）などを含む。このようなアナログは、自然的に発生したものであってもよく、自然に存在しない（non-naturally ℃curring）ものであってもよい。
本発明で用語、「天然型ポリペプチドの誘導体」は、天然型ポリペプチドに比べてアミノ酸配列に１つ以上の差があるペプチド、天然型ポリペプチド配列を改質（modification）を介して変形させたペプチド、天然型ポリペプチドのような生理活性を保有する天然型ポリペプチドの模倣体を含む。
具体的に、天然型ポリペプチドの誘導体は、天然型ポリペプチドの一部のアミノ酸が置換（substitution）、追加（addition）、削除（deletion）及び修飾（modification）のいずれか１つの方法またはこれらの方法の組み合わせを介して変形させてもよい。
また、天然型ポリペプチドの誘導体の製造のためのこれらの変形は、Ｌ型またはＤ型アミノ酸、及び/または非天然型アミノ酸を用いた変形；及び/または天然型配列を改質、例えば側鎖作用基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などのように改質することにより、変形するものをすべて含む。
また、天然型ポリペプチドのアミノ及び/またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたものをすべて含む。
前記置換されたり、追加されたアミノ酸は、ヒトタンパク質で通常に観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然発生アミノ酸を用いてもよい。非定型アミノ酸の商業源には、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ及びＧｅｎｚｙｍｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれてもよい。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと典型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂａｃｈｅｍや韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購入可能である。

本発明で用語、「天然型ポリペプチドもしくは天然型ポリペプチドの誘導体の断片」は、天然型ポリペプチドもしくは天然型ポリペプチドの誘導体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。このような天然型ポリペプチド断片は、天然型ポリペプチドの生理活性を同一または相応する程度に保有してもよい。
前記インスリンに対する情報及びインスリンアナログの例について特許文献２及びその対応の特許文献４の明細書の全文が本願の参考資料として含まれる。
このようなインスリンアナログは、インスリンＡ鎖またはＢ鎖が変形されたものであってもよく、例えば、Ｂ鎖の８番のアミノ酸、２３番のアミノ酸、２４番のアミノ酸、２５番のアミノ酸、Ａ鎖の１番のアミノ酸、２番のアミノ酸、１４番のアミノ酸及び１９番のアミノ酸からなる群から選択された１つのアミノ酸がアラニンに置換されたものであってもよく、具体的には、Ｂ鎖の８番のアミノ酸、２３番のアミノ酸、２４番のアミノ酸、２５番のアミノ酸、Ａ鎖の１番、２番及び１９番のアミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸がアラニンに置換されるか、Ａ鎖の１４番のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギンに置換されたものであってもよい。しかし、これに限定されるものではなく、インスリンのように、体内で血糖調節機能を保有するインスリンアナログであれば、本発明の範囲に制限なく含まれる。

また、１つの例として、前記インスリンアナログは、下記一般式（１）で表される配列番号６８のＡ鎖と、下記一般式（２）で表される配列番号６９のＢ鎖とを含むペプチドであってもよい：
一般式（１）
Ｘａａ１-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｘａａ２-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-Ｘａａ３-Ｌｅｕ-Ｘａａ４-Ｇｌｎ-Ｘａａ５-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｘａａ６-Ｃｙｓ-Ｘａａ７（配列番号６８）
前記一般式（１）において、
Ｘａａ１は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ２は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ３は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ４は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ５は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチニン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Ｘａａ６は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Ｘａａ７は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。

一般式（２）
Ｐｈｅ-ＶａＬ‐Ａｓｎ-Ｇｌｎ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-ＶａＬ‐Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｘａａ８-Ｌｅｕ-ＶａＬ‐Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｘａａ９- Ｔｙｒ-Ｘａａ１０-Ｘａａ１１-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ（配列番号６９）
前記一般式（２）において、
Ｘａａ８は、チロシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１０は、トレオニンであるか、不在であり、
Ｘａａ１１は、プロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在である。
ここで、天然型インスリンの配列は除外されてもよい。

より具体的な一つの態様で、前記一般式（１）で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はアラニン、グルタミン酸、またはアスパラギンであり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、前記一般式（２）で、Ｘａａ８はチロシンまたはグルタミン酸であり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるか、不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに限定されない。
より具体的な一つの態様で、前記一般式（１）で、Ｘａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はグルタミンであり、Ｘａａ３はセリンであり、Ｘａａ４はグルタミン酸、またはアスパラギンであり、Ｘａａ５はロイシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアスパラギンであり、前記一般式（２）で、Ｘａａ８はチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるか、不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに限定されない。
より具体的な一つの態様では、前記インスリンアナログは、前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９は不在であり、Ｘａａ１０はトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるＢ鎖を含むものであってもよいが、これに限定されない。

前記ペプチドは、前記一般式（１）のＡ鎖を含み、前記配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０が不在であり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸または、不在であるＢ鎖を含むものであってもよいが、これに限定されない。
前記ペプチドは、前記配列番号６８のＡ鎖で、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるものであってもよいが、これに限定されない。
前記ペプチドは、前記配列番号６８のＡ鎖で、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアスパラギンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９がフェニルアラニンであり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるものであってもよいが、これに限定されない。
別の態様で、前記配列番号６８のＡ鎖で、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がグルタミン酸であり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がチロシンであり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるものであってもよいが、これに限定されない。
別の態様で、前記配列番号６８のＡ鎖で、Ｘａａ１がグリシンであり、Ｘａａ２がグルタミンであり、Ｘａａ３がセリンであり、Ｘａａ４がアラニンであり、Ｘａａ５がロイシンであり、Ｘａａ６がチロシンであり、Ｘａａ７がアスパラギンであり、配列番号６９のＢ鎖で、Ｘａａ８がグルタミン酸であり、Ｘａａ９が不在であり、Ｘａａ１０がトレオニンであり、Ｘａａ１１はプロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であるか、不在であるものであってもよいが、これに限定されない。

また、前記インスリンアナログは、天然型インスリンＡ鎖の１４番のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン、またはアラニンに変異されて/変異されるか、天然型インスリンＢ鎖の２５番のアミノ酸が欠失されて/欠失されるか、Ｂ鎖の１６のアミノ酸であるチロシンがグルタミン酸に変異されたものであってもよいが、これに限定されない。
前記インスリン分泌ペプチド及びその誘導体の例としては、特許文献３及びその対応の特許文献５の明細書の全文が本願の参考資料として含まれる。
例えば、インスリン分泌ペプチドは、インスリン分泌機能を保有するペプチドとして膵臓のベータ細胞のインスリンの合成及び発現を刺激しうる。インスリン分泌ペプチドの例としては、ＧＬＰ（Glucagon like peptide）−１、エキセンジン３及びエキセンジン４などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記インスリン分泌ペプチドのアナログは、インスリン分泌ペプチドのＮ末端のアミン基を除去した形態、インスリン分泌ペプチドのＮ末端アミン基をヒドロキシルグループに置換した形態、インスリン分泌ペプチドのＮ末端アミン基を２つのメチルグループに修飾した形態、またはインスリン分泌ペプチドの１番目のアミノ酸であるヒスチジンのアルファ炭素を除去した形態などであってもよいが、これに限定されない。
エキセンジン４アナログに対するより具体的な例としては、エキセンジン４のＮ末端のアミン基を除去したデス‐アミノ‐ヒスチジルエキセンジン４、エキセンジン４のＮ末端アミングループをヒドロキシルグループに置換したベータ‐ヒドロキシ‐イミダゾプロピオニルエキセンジン４、エキセンジン４のアミノ末端アミン基を二つのメチルグループに修飾したジメチルヒスチジル‐エキセンジン４、及びエキセンジン４の１番目のアミノ酸であるヒスチジンのアルファ炭素を除去したイミダゾアセチル‐エキセンジン４などが挙げられるが、これに限定されない。

前記グルカゴンアナログは、特にこれに限定されないが、下記一般式（３）のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
Ｘ１-Ｘ２-ＱＧＴＦ-Ｘ７-ＳＤ−Ｘ１０-Ｓ-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０-Ｘ２１-Ｆ-Ｘ２３-Ｘ２４-ＷＬ-Ｘ２７-Ｘ２８-Ｘ２９-Ｘ３０（一般式（３）、配列番号４５）
前記式で、
Ｘ１は、ヒスチジン、デスアミノヒスチジル（desamino-histidyl）、ジメチルヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、ベータヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxy imidazopropionyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、ベータカルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）、トリプトファン、またはチロシンであるか、不在であってもよく；
Ｘ２は、アルファメチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）、Ａｉｂ（aminoisobutyric acid）、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリンまたはＤ−セリンであり；
Ｘ７は、トレオニン、バリンまたはシステインであり；
Ｘ１０は、チロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２は、リジンまたはシステインであり；
Ｘ１３は、チロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４は、ロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５は、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインであり；
Ｘ１６は、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、アルファメチルグルタミン酸、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ１７は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、システイン、またはバリンであるか、不在であり；
Ｘ１８は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ１９は、アラニン、アルギニン、セリン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２０は、リジン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、アルファメチルグルタミン酸、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２１は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、またはシステインであるか、不在であり；
Ｘ２３は、イソロイシン、バリン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２４は、バリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、アルファメチルグルタミン酸、またはロイシンであるか、不在であり；
Ｘ２７は、イソロイシン、バリン、アラニン、リジン、メチオニン、グルタミン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２８は、グルタミン、リジン、アスパラギン、またはアルギニンであるか、不在であり；
Ｘ２９は、リジン、アラニン、グリシン、またはトレオニンであるか、不在であり；
Ｘ３０は、システインであるか、不在であってもよい。
（ただし、天然型グルカゴンと配列が同一の場合は、除く。）

また、より具体的には、
前記一般式（３）において、
Ｘ１は、ヒスチジン、トリプトファン、またはチロシンであるか、不在であり；
Ｘ２は、セリンまたはＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり；
Ｘ７は、トレオニン、バリン、またはシステインであり；
Ｘ１０は、チロシンまたはシステインであり；
Ｘ１２は、リジンまたはシステインであり；
Ｘ１３は、チロシンまたはシステインであり；
Ｘ１４は、ロイシンまたはシステインであり；
Ｘ１５は、アスパラギン酸またはシステインであり；
Ｘ１６は、グルタミン酸、セリンまたはシステインであり；
Ｘ１７は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、システインまたはバリンであり；
Ｘ１８は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、またはシステインであり；
Ｘ１９は、アラニン、またはシステインであり；
Ｘ２０は、グルタミン、アスパラギン酸、リジンまたはシステインであり；
Ｘ２１は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリン、またはシステインであり；
Ｘ２３は、イソロイシン、バリンまたはアルギニンであり；
Ｘ２４は、バリン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸、リジン、グルタミンまたはロイシンであり；
Ｘ２７は、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、グルタミンまたはアルギニンであり；
Ｘ２８は、グルタミン、リジン、アスパラギンまたはアルギニンであり；
Ｘ２９は、トレオニンであり；
Ｘ３０は、システインであるか、不在であってもよい。

より具体的な例として、グルカゴンアナログは、以下のような種類が挙げられるが、これに限定されるものではない。ただし、ここで配列番号１は、天然型グルカゴンの配列を意味する。

表１

（前記表に記載された配列でＸと表記されたアミノ酸は、非天然型アミノ酸であるアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を、アミノ酸記号の下の下線は、環形成を意味する。）

前記ＦＧＦ２１のアナログは、次のような例を挙げられる。
特にこれに限定されないが、前記ＦＧＦ２１アナログは、天然型繊維芽細胞成長因子２１（Fibroblast Growth Factor21、FGF21）に比べてＦＧＦ受容体（FGF receptor、FGFR）、または補助受容体（beta-klotho）に対する結合力が減少されて、天然型ＦＧＦ２１に比べて１つ以上のアミノ酸が変異された、ＦＧＦ２１アナログであってもよい。
具体的に、前記ＦＧＦ２１アナログは、天然型ＦＧＦ２１アミノ酸配列に基づいて、最初のアミノ酸及び/または２番目のアミノ酸が欠失されたものであってもよく、さらに１６７番目のアミノ酸及び１６８番目のアミノ酸から選択された一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換または修飾されたものであってもよいが、これに限定されない。
前記ＦＧＦ２１アナログは、天然型ＦＧＦ２１のＮ末端の１番目のアミノ酸であるヒスチジン及び/または２番目のアミノ酸であるプロリンが欠失されたものであってもよく、別途またはさらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、この中の１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
また、ＦＧＦ２１アナログは、１番目のアミノ酸であるヒスチジンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、この中の１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
また、ＦＧＦ２１アナログは、２番目のアミノ酸であるプロリンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、この中の１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
さらに、ＦＧＦ２１アナログは、１番目のアミノ酸であるヒスチジン及び２番目のアミノ酸であるプロリンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがその他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、この中の１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。

ＦＧＦ２１アナログは、１番目のアミノ酸であるヒスチジンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンまたは１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがトレオニン、アラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、具体的に１６７番目のアミノ酸であるセリンがトレオニンに置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがアラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、この中の一つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
また、本発明のＦＧＦ２１アナログは、２番目のアミノ酸であるプロリンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンまたは１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがトレオニン、アラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、具体的に１６７番目のアミノ酸であるセリンがトレオニンに置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがアラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、この中で１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
さらに、ＦＧＦ２１アナログは、１番目のアミノ酸であるヒスチジン及び２番目のアミノ酸であるプロリンが欠失され、さらに天然型ＦＧＦ２１の１６７番目のアミノ酸であるセリンまたは１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがトレオニン、アラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、具体的に、１６７番目のアミノ酸であるセリンがトレオニンに置換されたものであってもよく、１６８番目のアミノ酸であるメチオニンがアラニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンに置換されたものであってもよく、この中の１つ以上を含む置換の組み合わせを有するものであってもよい。
また、ＦＧＦ２１アナログは、天然型ＦＧＦ２１の５番目のアミノ酸、６番目のアミノ酸、７番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、９番目のアミノ酸、１６８番目のアミノ酸、１７２番目のアミノ酸、１７６番目のアミノ酸、１７７番目のアミノ酸、及び１７８番目のアミノ酸からなる群から選択された１つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。これらの他のアミノ酸は、アラニンであってもよいが、特にこれに限定されない。
このようなＦＧＦ２１アナログのより具体的な例として、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５ 、６６及び６７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１アナログが挙げられる。

また、本発明でタンパク質結合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような生分解性重合体または生体内アルブミンとの結合力を有する脂肪酸が修飾された形態であってもよく、また、アルブミンや免疫グロブリンのような持続性に優れたタンパク質がさらに結合された形態であってもよく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態が含まれてもよいが、これに制限されない。
前記タンパク質結合体で、非ペプチド性重合体は、一方の末端で免疫グロブリンＦｃのアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つを介して結合し、他方の末端で生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基の側鎖、アルギニン残基の側鎖、ヒスチジン（histidine）残基の側鎖またはシステイン（cysteine）残基の側鎖のいずれか１つを介して結合する形態であってもよい。
前記「非ペプチド性重合体」は、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体をいう。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結される。本発明で、前記非ペプチド性重合体は、非ペプチド性リンカーと混用して使用されてもよい。
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸‐グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよく、具体的には、ポリエチレングリコール単独重合体である。当該分野で、すでに知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造しうる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。

既存のインフレームフュージョン（inframe fusion）方法で製造された融合タンパク質で用いられたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、担体による活性薬物の血中半減期の増加効果を期待するほど得ることができないということである。しかし、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いて、担体と同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。したがって、本発明で用いられる非ペプチド性重合体は、前記のような役割、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば制限なく使用されてもよい。非ペプチド性重合体の分子量は、０超過〜１００ｋＤａ以下、１〜１００ｋＤａの範囲、具体的には０超過、例えば、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ以下の範囲であってもよく、または０．５ｋＤａ〜２０ｋＤａ、０．５ｋＤａ〜5ｋＤａ、または５ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲であってもよいが、これに限定されない。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域と結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが使用されてもよい。
また、前記非ペプチド性重合体は、２つ以上の末端を有するものであってもよく、その例として２末端を有する非ペプチド性重合体及び３末端を有する非ペプチド性重合体であってもよいが、これに限定されない。

非ペプチド性重合体の両末端は、免疫グロブリンＦｃと生理活性を示す２つまたはそれ以上のそれぞれのポリペプチドのアミングループまたはチオールグループ（Thiol group）に結合してもよい。
一つのタンパク質結合体にリンカーとして用いられる非ペプチド性重合体は、１種類またはそれ以上の種類が用いられてもよい。
例えば、生理活性を示すポリペプチド１単位と免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部のいずれか１つのポリペプチド鎖のアミングループが介在する非ペプチド性重合体のその両末端と結合し、また他の生理活性を示すポリペプチドの他の１単位と免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部のいずれか１つのポリペプチド鎖とを連結する非ペプチド性重合体は、その一方の末端はアミングループと結合し、他方の末端はチオールグループと結合する形態であってもよい。
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドと結合しうる反応基を有し、これを介して免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドと連結されうる。
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基はアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基またはスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）が挙げられるが、これに限定されない。
前記アルデヒド基の種類としては、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などが挙げられるが、これに限定されない。

前記で、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよい。
前記タンパク質結合体で、共有結合はアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択された、非ペプチド性重合体の末端反応基をＦｃ領域またはその一部や生理活性ポリペプチド内のアミノ基と反応させて形成したものであってもよい。
前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基を有する場合、非特異的反応を最小化して、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド基による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド基は、低ｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成しうる。
前記非ペプチド性重合体であるリンカーの両末端反応基は、互いに同一であるか、異なってもよい。
例えば、一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、例えば、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を持つことができる。また、例えば、前記の非ペプチド性重合体の一方の末端には、反応基としてアルデヒド基を含み、他方の末端には、マレイミド基、スクシンイミド基、アルデヒド基（例えば、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基）などを含んでもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体の一方の末端がアルデヒド基の反応基を含み、他方の末端がマレイミド基の反応基を含む場合、非特異的反応を最小化して、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的でありうる。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記様々な反応基で活性化するか、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて、本発明の持続型タンパク質結合体を製造しうる。

本発明で、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び/または重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明のタンパク質結合体の一部分をなす一構成であってもよい。
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含んでもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等であるか、向上された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び/または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び/またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインのうち１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。しかし、これに制限されるものではない。
また、一つの具体例としては、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態（dimeric form）であってもよい。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられてもよい。
また、ジスルフィド結合を形成しうる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されてもよいなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されることもあり、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されることもある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献６、特許文献７などに開示されている。

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野で知られている（非特許文献１）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｙ/ＰＨｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ、Ａｓｐ/Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などで修飾（ modification）されることもできる。
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットまたはモルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインで処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）₂に切断される。サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いて、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（Ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内での不要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物の担体としての本来の目的により合致する形態は、糖鎖が除去されたり非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であるといえる。

本発明で、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的な実施形態では、大腸菌で生産して糖鎖化されないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物由来であってもよく、より具体的な実施形態では、ヒト起源である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態では、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態では、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知されたＩｇＧ由来である。さらに具体的な実施形態では、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態では、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であるが、これに限定されるものではない。
一方、本発明で「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。

本発明を具現するための別の態様は、前記結合体の製造方法を提供する。
前記結合体については、先に説明した通りである。
具体的に、
（ａ）生理活性ポリペプチドが一方の末端に連結されて、他方の末端に残りの反応基を有する非ペプチド性重合体と、（ｂ）１つの単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部に１つ以上の生理活性ポリペプチドのそれぞれが非ペプチド性重合体を介して連結されており、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に残りの反応基を有する生理活性ポリペプチド結合体を提供する段階；及び
前記（ａ）の生理活性ポリペプチドに連結された非ペプチド性重合体の残りの反応基と前記（ｂ）の生理活性ポリペプチド結合体の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基を共有結合で連結させる段階を含んでもよい。
ここで、前記（ａ）の非ペプチド性重合体が、アルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択された、残りの反応基を有してもよい。
また、前記（ｂ）の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基が、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部のアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つに位置するしたものであってもよい。
また、前記（ａ）の生理活性ポリペプチドは（ｂ）の生理活性ポリペプチドと互いに同一の種類であるか、互いに異なる種類であってもよく、より具体的には、互いに異なる種類である。
また、前記（ａ）の生理活性ポリペプチドと前記（ｂ）の生理活性ポリペプチドはシングル単位（single unit）であってもよいが、これに制限されない。

本発明を具現するための別の態様は、前記タンパク質結合体を含む組成物を提供する。
前記タンパク質結合体については、先に説明した通りである。
また、前記組成物は、生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性の増加のための組成物であってもよい。
また、前記組成物は、薬学的組成物であってもよい。前記薬学的組成物の目的は、含まれる生理活性ポリペプチドの種類に応じて異なってもよいが、糖尿病または肥満のような疾患などが該当してもよく、これらの疾患に対する予防または治療用薬学的組成物として用いられてもよい。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでもよい。このような薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤は、非自然的に発生する（non-naturally ℃curring）ものであってもよいが、これに限定されない。
本発明で用語、「薬学的に許容」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時に使用される薬物などの医学分野でよく知られている要素に応じて、当業者によって容易に決定されてもよい。
前記担体は、特にこれに限定されないが、経口投与の際には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いてもよく、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いてもよく、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いてもよい。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。

また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか１つの剤形を有してもよい。
本発明の組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して、様々な形態で製造されてもよい。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造してもよく、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造してもよい。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などで剤形化してもよい。
また、前記組成物は、薬学的分野で通常の方法によって患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、より具体的な実施形態では、ペプチド医薬品の投与に有用な製剤形態で剤形化して、当業界で通常に使用する投与方法を用いて、経口、または皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髓膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む非経口投与経路によって投与されてもよいが、これに限定されるものではない。
また、前記組成物は、生理食塩水または有機溶媒のような薬剤で許可された複数の担体（carrier）と混合して使用されてもよく、安定性や吸収性を増加させるためにグルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）またはグルタチオンのような抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤（chelating agents）、低分子タンパク質または他の安定化剤（stabilizer）が薬剤として使用されてもよい。

本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などのいくつかの関連因子と一緒に、活性成分であるタンパク質結合体の種類に応じて決定される。
本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（single dose）で患者に投与されてもよく、多重投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment prot℃ol）によって投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて、有効成分の含量を異にすることができる。具体的に、本発明の薬学的組成物の望ましい全容量は１日当たりの患者の体重１ｋｇ当たり、約０．０００１μｇ〜５００ｍｇであってもよい。しかし、前記組成物の容量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食物及び排泄率などのさまざまな要因を考慮して、患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定してもよい。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
本発明を具現するための別の態様は、前記タンパク質結合体またはこれを含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、目的とする疾患の治療方法に関する。
前記タンパク質結合体またはそれを含む組成物については、先に説明した通りである。
前記タンパク質結合体に適用された生理活性ポリペプチドの種類に応じて、目的とする疾患は当業者が適切に選択しうる。

（実施例）
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
実施例１．インスリンアナログ及びイミダゾアセチル（Imidazo-acetyl）エキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体（heterodimer）結合体の製造
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ、３ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）を天然型インスリンに比べて半減期が増加されたインスリンアナログ（特許文献２に開示される）のＮ末端にＰＥＧ化させるために、前記インスリンアナログと３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧとのモル比を１：４、タンパク質の濃度を５ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約２時間反応させた。この際、反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウム（sodium citrate）緩衝液（ｐＨ５．０）とイソプロパノールとの混合溶媒に還元剤である３ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム[sodium cyanoborohydride（NaCNBH₃）]が添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、エタノールが含まれた緩衝液０．２５Ｍ塩化カリウム（potassium chloride）の濃度勾配を利用して、ＳＰセファロース高性能（GE、米国）に適用してモノＰＥＧ化された（Monopegylated）インスリンアナログを精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたインスリンアナログと持続型イミダゾアセチルエキセンジン４（「CA‐エキセンジン４」とも命名）結合体（特許文献３に開示される）を互いに反応させた。前記持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体は、１単位のイミダゾアセチルエキセンジン４が１単位の免疫グロブリンＦｃにＰＥＧを介して結合された形態である、単量体結合体に相当する。
具体的に、前記モノＰＥＧ化されたインスリンアナログと持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体とのモル比を１：０．２、タンパク質の濃度を５〜１０ｍｇ/ｍｌにして、約２５℃で約１６時間反応させた。反応液は、１００ｍＭヘぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．２）と塩化ナトリウム（sodium chloride）に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（PolyLC、米国）に適用し、２０ｍＭビストリス（ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６．０）と０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用して、１単位の免疫グロブリンＦｃにインスリンアナログとＣＡ‐エキセンジン４がそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された結合体を精製した。

実施例２．２単位のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃを含む同種二量体（homodimer）結合体の製造
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ、３ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）を天然型インスリンに比べて半減期が増加されたインスリンアナログ（特許文献２に開示される）のＮ末端にＰＥＧ化させるために、インスリンアナログと３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧとのモル比を１：４、タンパク質の濃度を５ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約２時間反応させた。この際、反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）とイソプロパノールとの混合溶媒に還元剤である３ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％エタノールを含む緩衝液と０．２５Ｍ塩化カリウムの濃度勾配を用いて、ＳＰセファロース高性能（GE、米国）に適用して、モノＰＥＧ化されたインスリンアナログを精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたインスリンアナログと単量体結合体の形態の持続型インスリン結合体（特許文献２に開示される）を互いに反応させた。前記持続型インスリン結合体は、１単位のインスリンアナログが１単位の免疫グロブリンＦｃにＰＥＧを介して結合された形態である単量体結合体に該当する。該当単量体結合体のインスリンアナログは、前記モノＰＥＧ化されたインスリンアナログと同一の種類である。
具体的に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたインスリンアナログと単量体結合体の形態の持続型インスリン結合体とのモル比が１：０．２、タンパク質の濃度を１５ｍｇ/ｍｌにして、前記モノＰＥＧ化されたインスリンアナログと単量体結合体の形態の持続型インスリン結合体を約２５℃で約１６時間反応させた。反応液は、１００ｍＭヘぺス緩衝液（ｐＨ８．２）と塩化ナトリウムに還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムとが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、セファデックス Ｇ２５（GE、米国）に適用して２０ｍＭビストリス（Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６．０）で緩衝液交換した。その後、反応液は２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．０）と０．２５Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用し、１．３Ｍ硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）と２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）の濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、１単位の免疫グロブリンＦｃにインスリンアナログ２単位がそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された結合体を精製した。

実施例３．２単位のイミダゾアセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体の製造
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ、３．４ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）をイミダゾアセチルエキセンジン４（Bachem、米国）（特許文献３に開示される）のリジン位置にＰＥＧ化させるために、イミダゾアセチルエキセンジン４と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧとのモル比を１：１５、タンパク質の濃度を６ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約１３．５時間反応させた。この際、反応は１００ｍＭヘぺス緩衝液（ｐＨ７．５）とイソプロパノールとの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、イソプロパノールが含まれた緩衝液と０．２５Ｍ塩化カリウムの濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（GE、米国）に適用して、モノＰＥＧ化されたイミダゾアセチルエキセンジン４を精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたイミダゾアセチルエキセンジン４と単量体結合体の形態の持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体（特許文献３に開示される）とのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約２０時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、塩化ナトリウムと５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）の濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ（GE、米国）に適用して未反応液を除去し、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用し、硫酸アンモニウムと２０ｍＭトリス（ｐＨ7.5）の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、１単位の免疫グロブリンＦｃにイミダゾアセチルエキセンジン４の２単位がそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された同種二量体の結合体を精製した。

実施例４．インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の製造
マレイミド‐１０Ｋ ＰＥＧ-ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（マレイミド基とプロピオンアルデヒド基をそれぞれ１つずつ有するＰＥＧ、１０ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）をグルカゴンアナログのシステイン（cysteine）残基にＰＥＧ化させるために、グルカゴンアナログとマレイミド‐１０Ｋ ＰＥＧ-ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤとのモル比を１：１．３、タンパク質の濃度を３ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約１時間反応させた。ここで、前記グルカゴンアナログは、天然型グルカゴン配列が変異されたもので、システイン残基を含むグルカゴンアナログである。この際、反応は５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）とイソプロパノールとの混合溶媒環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、エタノールが含まれた緩衝液と０．２５Ｍ塩化カリウムの濃度勾配を用いて、ＳＰセファロース高性能（GE、米国）に適用して、モノＰＥＧ化されたグルカゴンアナログを精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたグルカゴンアナログと単量体結合体の形態の持続型インスリンアナログ結合体（特許文献２に開示される）とのモル比を１：７．５、タンパク質の濃度を２５ｍｇ/ｍｌにして、約４℃で約１６時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）とイソプロパノールとの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭビストリス（Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６．５）と０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用して、硫酸アンモニウムと２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、１単位の免疫グロブリンＦｃにインスリンアナログとグルカゴンアナログがそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された異種二量体の結合体を精製した。

実施例５．イミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の製造
マレイミド‐１０Ｋ ＰＥＧ-ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（マレイミド基とプロピオンアルデヒド基をそれぞれ１つずつ有するＰＥＧ、１０ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）をグルカゴンアナログのシステイン残基にＰＥＧ化させるために、実施例４と同様に、ＰＥＧ化反応条件及び精製条件に従ってモノＰＥＧ化されたグルカゴンアナログを精製した。ここで、前記グルカゴンアナログは、天然型グルカゴン配列が変異されたもので、システイン残基を含むグルカゴンアナログである。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化されたグルカゴンアナログと単量体結合体の形態の持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体（特許文献３に開示される）を実施例４と同様に、結合体の反応条件及び精製条件に従って１単位の免疫グロブリンＦｃにイミダゾアセチルエキセンジン４とグルカゴンアナログがそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された異種二量体の結合体を精製した。

実施例６．イミダゾアセチルエキセンジン４及び繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の製造
３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を２つ有するＰＥＧ、３．４ｋＤａ、ＮＯＦ、日本）を繊維芽細胞成長因子２１のＮ末端にＰＥＧ化させるために、繊維芽細胞成長因子２１と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧとのモル比を１：３、タンパク質の濃度を５ｍｇ/ｍｌにして、４〜８℃で約２時間反応させた。ここで、前記繊維芽細胞成長因子２１は、ＦＧＦ２１ ｃＤＮＡ（OriGene、RC204538）に基づいて製作されたＦＧＦ２１発現ベクターを大腸菌に形質転換し、大腸菌の周辺細胞質でＦＧＦ２１を発現させた後、これを抽出及び精製して収得したものである。この際、反応は１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．０）と０．２５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用して、モノＰＥＧ化された繊維芽細胞成長因子２１を精製した。
次に、前記精製されたモノＰＥＧ化された繊維芽細胞成長因子２１と単量体結合体の形態の持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体（特許文献３に開示される）とのモル比を１：３、タンパク質の濃度３０ｍｇ/ｍｌにして、約４〜８℃で約１６時間反応させた。反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加された環境下で行われた。反応が終了した後、前記反応液は、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．０）と０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（GE、米国）に適用し、硫酸アンモニウムと２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE、米国）に適用して、１単位の免疫グロブリンＦｃにイミダゾアセチルエキセンジン４及び繊維芽細胞成長因子２１がそれぞれＰＥＧを介して共有結合で連結された異種二量体の結合体を精製した。

実施例７．インスリンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の分析
前記実施例１に基づいて製造された異種二量体の結合体の純度を確認するために、ＲＰ‐ＨＰＬＣは、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表２でＲＰ‐ＨＰＬＣ（％）は、ＩＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％（Area％）として、異種二量体の結合体の純度を示す。

表２
前記結果からわかるように、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて９５％以上の純度を確認した。
異種二量体（heterodimer）結合体は、単量体結合体である持続型インスリンアナログ結合体及び持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果は図１、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は図２に示した。抗免疫グロブリンＦｃ、抗エキセンジン４、抗インスリンに対するウエスタンブロットの結果は、それぞれ図３、図４、図５に示した。

実施例８．２単位のインスリンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体の分析
前記実施例２に基づいて製造された持続型インスリンアナログ結合体の同種二量体の純度を確認するために、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表３で、ＩＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％として、持続型インスリンアナログ結合体の同種二量体の純度を示す。

表３
前記の結果からわかるように、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて９５％以上の純度を確認した。
持続型インスリンアナログ結合体の同種二量体は、持続型インスリンアナログ結合体の単量体（monomer）と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果は図６、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は図７に示した。

実施例９．２単位のイミダゾアセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む同種二量体の結合体の分析
前記実施例３に従って製造された持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体の同種二量体の純度を確認するために、ＳＥ‐ＨＰＬＣ、ＲＰ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表４でＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＲＰ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％として、持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体の同種二量体の純度を示す。

表４
前記の結果からわかるように、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて８０％以上の純度を確認した。
持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体の同種二量体（homodimer）は、持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体の単量体（monomer）と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＳＥ‐ＨＰＬＣ、ＲＰＥ‐ＨＰＬＣの結果は図８、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は、図９に示した。

実施例１０．インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の分析
前記実施例４に従って製造された異種二量体の結合体の純度を確認するために、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表５でＲＰ‐ＨＰＬＣ（％）、ＩＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％として、異種二量体の結合体の純度を示す。

表５
前記の結果からわかるように、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて９５％以上の純度を確認した。
異種二量体（heterodimer）結合体は、持続型インスリンアナログ結合体及び持続型グルカゴンアナログ結合体と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果は図１０、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は図１１に示した。

実施例１１．イミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の分析
前記実施例５に従って製造された異種二量体の結合体の純度を確認するために、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表６でＲＰ‐ＨＰＬＣ（％）、ＩＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％として、異種二量体の結合体の純度を示す。

表６
前記の結果からわかるように、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて９０％以上の純度を確認した。
異種二量体の結合体は、持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体及び持続型グルカゴンアナログ結合体と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果は図１２、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は図１３に示した。

実施例１２．イミダゾアセチルエキセンジン４及び繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の分析
前記実施例６に従って製造された異種二量体の結合体の純度を確認するために、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣを用いて分析した。表７でＲＰ‐ＨＰＬＣ（％）、ＩＥ‐ＨＰＬＣ（％）とＳＥ‐ＨＰＬＣ（％）は、領域％として、異種二量体の結合体の純度を示す。

表７
前記の結果からわかるように、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果はすべて９５％以上の純度を確認した。
異種二量体の結合体は、持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体及び持続型繊維芽細胞成長因子２１の結合体と一緒に分析して比較した。これに対するそれぞれのＲＰ‐ＨＰＬＣ、ＩＥ‐ＨＰＬＣ、ＳＥ‐ＨＰＬＣの結果は図１４、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果は図１５に示した。

実施例１３．インスリンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の力価（試験管内）分析
前記実施例１で製造されたインスリンアナログ及びエキセンジン４を含む異種二量体、前記実施例２で製造されたインスリンアナログの同種二量体、及び前記実施例３で製造されたイミダゾアセチルエキセンジン４の同種二量体の力価の確認のために製造されたそれぞれの細胞株を用いて、試験管内での細胞活性を測定する方法を用いた。
前記各細胞株は、ＣＨＯ（chinese hamster ovary）にヒトＧＬＰ‐１受容体とヒトインスリン受容体β遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＬＰ‐１とインスリンの活性を測定するのに適している。したがって、各同種二量体の活性をそれぞれの形質転換細胞株を用いて測定した。
インスリンアナログ側の力価を確認及び単量体の持続型インスリンアナログ結合体との比較のために、ヒトインスリンを３４４．４ｎＭから３倍ずつ０．２ｎＭまで連続的に希釈して、単量体の持続型インスリンアナログ結合体、インスリンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４を含む異種二量体、インスリンアナログの同種二量体及び免疫グロブリンＦｃを２００３７．１ｎＭから３倍ずつ９．２ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトインスリン受容体βが発現されたＣＨＯ細胞をＫＲＢ緩衝液で洗浄し、連続的に希釈された各物質を１００μｌずつ前記細胞に添加した後、１０分間３７℃の温度条件でＣＯ₂培養器で培養した。その後、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を２５μｌずつ加えて細胞を溶解させ、前記細胞溶解物をホスホ‐インスリン受容体βサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Phospho-Insulin Receptor β Sandwich ELISA kit、Cell signaling、USA）に適用してリン酸化されたインスリン受容体βを測定し、そこからＥＣ₅₀値を算出した後、相互比較した。ＥＣ₅₀値及びヒトインスリンに対する相対力価は下記表８に示した。
イミダゾアセチルエキセンジン４側の力価の確認及び単量体の持続型イミダゾアセチルエキセンジン４結合体との比較のために、イミダゾアセチルエキセンジン４を５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈して、インスリンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４を含む異種二量体、イミダゾアセチルエキセンジン４の同種二量体及び免疫グロブリンＦｃを４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトＧＬＰ‐１受容体が発現されたＣＨＯ細胞で培養液を除去して、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、１５分間常温で培養した。次に、細胞溶解緩衝液が含まれた検出混合物（detection mix）を１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰキット（PerkinElmer、USA）に適用して蓄積されたｃＡＭＰの量を測定し、そこからＥＣ₅₀値を算出した後、相互比較した。ＥＣ₅₀値及びイミダゾアセチルエキセンジン４に対する相対力価は下記表８に示す。
実験の結果、２種類以上の生理活性ポリペプチド物質が免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結された結合体の場合、それぞれ１種類の生理活性ポリペプチド物質を免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結された結合体と同様の生理活性を有することを確認した。

表８
新規なインスリンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４（CA‐エキセンジン４）誘導体のＧＬＰ‐１受容体とインスリン受容体での試験管内活性の比較
１）各単量体対比統計的に有意な差はない。（ｐ≧０．０５、ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）
２）各単量体対比統計的に有意な差があり。（ｐ<０．０５、 ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ）

実施例１４．インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の力価（試験管内）分析
前記実施例４で製造されたインスリンアナログ及びグルカゴンアナログを含む異種二量体の力価を確認するために、試験管内で細胞活性を測定する方法を用いた。
まず、インスリンの力価を分析するために、脂肪細胞に分化させたマウス由来の３Ｔ３−Ｌ１細胞株を用いたグルコース吸収能（glucose uptake、または脂質合生能）試験を実施した。３Ｔ３−Ｌ１細胞株（ATCC、CL-173）を１０%ＮＢＣＳ（新生仔牛血清）を含むＤＭＥＭ（Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430）培地を用いて、週２〜３回継代培養し維持した。３Ｔ３−Ｌ１細胞株を分化用培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に懸濁した後、４８ウェルプレートにウェル当たり５Ｘ１０⁴細胞になるように接種した後、３７℃で４８時間培養した。脂肪細胞への分化のために、分化用培地に１μｇ/ｍｌのヒトインスリン（Sigma, Cat. No. I9278）、０．５ ｍＭ ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879）、1μＭデキサメタゾン（Dexamethasone, Sigma, Cat. No. D4902）を混合して、既存の培地を除去した後、ウェル当たり２５０μｌずつ添加した。４８時間後、分化用培地に１μｇ/ｍｌのヒトインスリンのみを添加した培地に再び交換した。その後、４８時間ごとに１μｇ/ｍｌのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら、１０〜１４日間、脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。
グルコース吸収能の試験のために、脂肪細胞の分化が終結された細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で１回水洗した後、２５０μｌずつ入れ、４時間血清の枯渇を誘導した。ヒトインスリン、ヒトグルカゴン、持続型インスリンアナログ単量体、持続型グルカゴンアナログ単量体、インスリン/グルカゴンアナログ異種二量体及び免疫グロブリンＦｃを１０，０００ｎＭから０．０１ｎＭまで無血清ＤＭＥＭ培地で１０倍ずつ順次希釈して用意した。用意された試料を細胞にそれぞれ２５０μｌずつ添加した後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ₂培養器で培養した。培養が終わった培地のグルコース残量を測定するために、２００μｌの培地を取って、Ｄ‐ＰＢＳでそれぞれ５倍希釈した後、ＧＯＰＯＤ分析（GOPOD Assay Kit, Megazyme, Cat. No. K-GLUC）を行った。グルコース標準溶液の吸光度を基準に培地の残りのグルコース濃度を換算し、各試料のグルコース吸収能に対するＥＣ₅₀を算出して下記表９に示した。
次に、グルカゴンの力価を分析する前記に記載のＣＨＯ（ＣＨinese hamster ovary）細胞にヒトグルカゴン受容体を発現するように形質転換された細胞株を用いて、試験管内での細胞ｃＡＭＰ活性を測定する方法を用いた。
インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の力価を確認及び持続型グルカゴンアナログ結合体との比較のために、ヒトグルカゴンを５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈して、持続型グルカゴンアナログ単量体結合体及び持続型インスリンアナログ単量体結合体、そして前記インスリンアナログ及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体、最後に免疫グロブリンＦｃを４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトグルカゴン受容体が発現されたＣＨＯ細胞で培養液を除去し、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、ｃＡＭＰ抗体が含まれた緩衝液を５μｌずつ追加した後、１５分間常温で培養した。次に、細胞溶解緩衝液が含まれた検出混合物を１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰキット（PerkinElmer、USA）に適用して、蓄積されたｃＡＭＰを介してＥＣ₅₀値を算出した後、相互比較した。ＥＣ₅₀値とヒトグルカゴンに対する相対力価は下記表９に示した。
表９に示すように、本発明に係るインスリンアナログ及びグルカゴンアナログを含む異種二量体は、１０．１%のインスリン活性と１０．７%のグルカゴン活性を示し、これは持続型インスリンアナログ単量体及び持続型グルカゴンアナログ単量体のそれぞれと同様の数値と確認された。
前記結果から、２種類以上の生理活性ポリペプチド物質が免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結された結合体の場合、それぞれ１種類の生理活性ポリペプチド物質を免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結した結合体と同様の生理活性を有することが確認できた。

表９
インスリンアナログ及びグルカゴンアナログの誘導体の試験管内活性の比較
ＮＤ：Ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ、最大値の評価された濃度まで容量の反応曲線が飽和されなかった

実施例１５．イミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の結合体の力価（試験管内）分析
前記実施例５で製造されたイミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログを含む異種二量体の力価確認のために製造されたそれぞれの細胞株を用いて、試験管内でのｃＡＭＰ活性を測定する方法を用いた。
前記各細胞株は、ＣＨＯ細胞にヒトグルカゴン受容体とヒトグルカゴン様ペプチド‐１（ＧＬＰ‐１）受容体の遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、グルカゴンアナログとイミダゾアセチルエキセンジン４の活性を測定するのに適している。したがって、各異種二量体の活性をそれぞれの形質転換細胞株を用いて測定した。
イミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログと免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体の力価の確認及び持続型イミダゾアセチルエキセンジン４の単量体結合体と持続型グルカゴンアナログ単量体結合体との比較のために、ヒトグルカゴン及びグルカゴン様ペプチド‐１（ＧＬＰ‐１）を５０ｎＭから４倍ずつ０．００００４８ｎＭまで連続的に希釈して、持続型グルカゴンアナログ単量体結合体と持続型イミダゾアセチルエキセンジン４の単量体結合体、グルカゴンアナログ及びイミダゾアセチルエキセンジン４と免疫グロブリンＦｃとを含む異種二量体、最後に免疫グロブリンＦｃを４００ｎＭから４倍ずつ０．０００３８ｎＭまで連続的に希釈した。前記培養されたヒトグルカゴンとグルカゴン様ペプチド‐１受容体が発現されたＣＨＯ細胞で培養液を除去し、連続的に希釈された各物質を５μｌずつ前記細胞に添加した後、ｃＡＭＰ抗体が含まれた緩衝液を５μｌずつ追加した後、１５分間常温で培養した。次に、細胞溶解緩衝液が含まれた検出混合物を１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、９０分間常温で反応させた。前記反応が完了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰキット（PerkinElmer、USA）に適用して蓄積されたｃＡＭＰを介してＥＣ₅₀値を算出した後、相互比較した。ＥＣ₅₀値及びヒトグルカゴン及びヒトＧＬＰ‐１に対する相対力価は下記表１０に示した。
表１０に示すように、本発明に係るイミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログを含む異種二量体は、４．６%のグルカゴン様ペプチド‐１活性と５．１%のグルカゴン活性を示し、これは持続型イミダゾアセチルエキセンジン４単量体及び持続型グルカゴンアナログ単量体のそれぞれと同様の数値と確認された。
前記結果から、２種類以上の生理活性ポリペプチド物質が免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結された結合体の場合、それぞれ１種類の生理活性ポリペプチド物質を免疫グロブリンＦｃに非ペプチド性重合体で連結した結合体と同様の生理活性を有することが確認できた。

表１０
イミダゾアセチルエキセンジン４及びグルカゴンアナログ誘導体の試験管内活性の比較
ＮＤ：Ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ、最大値の評価された濃度まで容量の反応曲線が飽和されなかった
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (28)

1. ２つ以上の生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記タンパク質結合体は、
   （ｉ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部；
   （ｉｉ）前記Ｆｃ領域またはその一部に共有結合で連結された非ペプチド性重合体；及び
   （ｉｉｉ）前記非ペプチド性重合体に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドを含み、
   前記Ｆｃ領域またはその一部が２つのポリペプチド鎖の二量体であり、この２つのポリペプチド鎖のそれぞれには１つ以上の前記非ペプチド性重合体が連結されている、タンパク質結合体。
2. 免疫グロブリンＦｃ領域が、非糖鎖化されることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質結合体。
3. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなるグループから選択された１つ〜４つのドメインからなる、請求項１に記載のタンパク質結合体。
4. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ（hinge）領域をさらに含む、請求項１に記載のタンパク質結合体。
5. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、これらの組み合わせ（combination）及びこれらのハイブリッド（hybrid）のＦｃ領域からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
6. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのＦｃ領域からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
7. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１に記載のタンパク質結合体。
8. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項７に記載のタンパク質結合体。
9. 前記共有結合が、アルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択された非ペプチド性重合体の末端反応基を、Ｆｃ領域またはその一部または生理活性ポリペプチド内のアミノ基と反応させて形成したものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
10. 前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートある、請求項９に記載のタンパク質結合体。
11. 前記非ペプチド性重合体の両末端反応基が、アルデヒド基である、請求項９に記載のタンパク質結合体。
12. 非ペプチド性重合体が、一方の末端で免疫グロブリンＦｃのアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つを介して結合し、他方の末端で生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基の側鎖、アルギニン残基の側鎖、ヒスチジン（histidine）残基の側鎖またはシステイン（cysteine）残基の側鎖のいずれか１つを介して結合している、請求項１に記載のタンパク質結合体。
13. 非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール‐プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、脂肪酸、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択された１種以上である、請求項１に記載のタンパク質結合体。
14. 非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体である、請求項１３に記載のタンパク質結合体。
15. 生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
16. 前記生理活性ポリペプチドが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、オキシントモジュリン（oxyntomodulin）、エキセンジン３（ｅｘｅｎｄｉｎ‐３）、エキセンジン４（ｅｘｅｎｄｉｎ‐４）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、Ｇタンパク質関連受容体（G-Protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体アンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxyt℃in）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Motilin）、血管作用性腸ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide; ANP）、バリンナトリウム利尿ペプチド（Barin natriuretic peptide; BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide; CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid beta‐protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Oste℃alcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅセレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）、フューゼオン（Fuzeon）及びそれらのアナログからなる群から選ばれる、請求項１５に記載のタンパク質結合体。
17. 生理活性ポリペプチドが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、オキシントモジュリン（oxyntomodulin）、エキセンジン３（ｅｘｅｎｄｉｎ‐３）、エキセンジン４（ｅｘｅｎｄｉｎ‐４）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、ヒト成長ホルモン、インターフェロン‐アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、Ｆａｂ’抗体断片及びそれぞれのアナログからなる群から選択される、
    請求項１６に記載のタンパク質結合体。
18. 前記Ｆｃ領域またはその一部の２つのポリペプチド鎖のそれぞれに非ペプチド性重合体を介して連結された生理活性ポリペプチドが、異なる種類である、請求項１に記載のタンパク質結合体。
19. 前記タンパク質結合体が、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる種類の生理活性ポリペプチドの２単位がそれぞれ非ペプチド性重合体を介して連結された、請求項１に記載のタンパク質結合体。
20. 前記タンパク質結合体が、異なる種類の生理活性ポリペプチドがそれぞれ非ペプチド性重合体を介して１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に連結されて、
    前記異なる種類の生理活性ポリペプチドが、互いに異なる割合で存在する、請求項１に記載のタンパク質結合体。
21. 非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に共有結合で連結された生理活性ポリペプチドが、非ペプチド性重合体が連結された部位ではなく他の部位に追加の生理活性ポリペプチドがさらに連結されている、請求項１に記載のタンパク質結合体。
22. 前記タンパク質結合体が、１単位の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に対して異なる種類の生理活性ポリペプチドの３単位以上がそれぞれ非ペプチド性重合体を介して連結された、請求項１に記載のタンパク質結合体。
23. １単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部に対して、同一の生理活性を示す３単位以上の生理活性ポリペプチドのそれぞれが非ペプチド性重合体を介して共有結合で連結された、生理活性ポリペプチドの同種多量体（homomultimer）結合体。
24. （ａ）生理活性ポリペプチドが一方の末端に連結されて、他方の末端に残りの反応基を有する非ペプチド性重合体と、（ｂ）１単位の免疫グロブリンＦｃ領域または前記Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合能を保有するＦｃ領域の一部に１つ以上の生理活性ポリペプチドのそれぞれが非ペプチド性重合体を介して連結されており、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部に残りの反応基を有する生理活性ポリペプチド結合体を提供する段階；及び
    前記（ａ）の生理活性ポリペプチドに連結された非ペプチド性重合体の残りの反応基と前記（ｂ）の生理活性ポリペプチド結合体の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基を共有結合で連結させる段階を含む、
    請求項１〜２２のいずれか一項に記載の生理活性ポリペプチドのタンパク質結合体を製造する方法。
25. 前記（ａ）の非ペプチド性重合体が、アルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択された、残りの反応基を有する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記（ｂ）の免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部の残りの反応基が、免疫グロブリンＦｃ領域またはその一部のアミノ末端、リジン（lysine）残基の側鎖、またはアルギニン（arginine）残基の側鎖のいずれか１つに位置する、請求項２４に記載の方法。
27. 前記（ａ）の生理活性ポリペプチドが、（ｂ）の生理活性ポリペプチドと互いに同一の種類であるか、互いに異なる種類である、請求項２４に記載の方法。
28. 前記（ａ）の生理活性ポリペプチドと前記（ｂ）の生理活性ポリペプチドが、シングル単位（single unit）である、 請求項２４に記載の方法。