CN102089320B - 溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法 - Google Patents

溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102089320B
CN102089320B CN200980111383.7A CN200980111383A CN102089320B CN 102089320 B CN102089320 B CN 102089320B CN 200980111383 A CN200980111383 A CN 200980111383A CN 102089320 B CN102089320 B CN 102089320B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion constructs
cell
hormone
purposes
tumour
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980111383.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102089320A (zh
Inventor
卡罗拉·勒施奈
赫克托·阿里拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Esperance Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Esperance Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40671139&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102089320(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College, Esperance Pharmaceuticals Inc filed Critical Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Publication of CN102089320A publication Critical patent/CN102089320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102089320B publication Critical patent/CN102089320B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C07K14/592—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH] at least 1 amino acid in D-form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

本发明涉及融合构建体，使用融合构建体的方法以及治疗不良的或异常的细胞增殖或高度增殖疾病(例如肿瘤、癌症、赘生瘤(neoplasia)和恶性肿瘤)的方法。

Description

溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法
相关申请
本申请主张2008年1月24日递交的中请61/023,377的优先权，其全文在此明确引入作为参考。
技术领域
本发明涉及融合构建体，使用融合构建体的方法以及治疗不良的或异常的细胞增殖或高度增殖疾病(例如非转移性和转移性赘生瘤(neoplasias)、癌症、肿瘤和恶性肿瘤)的方法。
背景技术
当考虑癌症患者的五年存活率时，会发现开发治疗原发肿瘤和转移肿瘤的新型疗法的需求是显而易见的：当诊断出远距离转移性疾病时，仅有10-40％的患有肺、结肠直肠、乳腺和前列腺癌的患者能存活。
发明内容
本发明至少部分基于融合或连接至结合部分的溶解结构域(在此称为融合构建体)。细胞与溶解结构域的接触被认为会引起细胞膜的破坏，从而导致细胞死亡。该结合部分靶向被该溶解结构域破坏的细胞，包括不良的或异常的增殖细胞或高度增殖细胞，例如非转移性和转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性肿瘤。一些非转移性和转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞过量表达受体或配体。例如，许多非转移性和转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性肿瘤表达可用作该融合构建体的结合部分的激素(例如，促黄体激素/绒毛膜促性腺激素(LH/CG)或促黄体激素释放激素(LHRH)等)、生长因子、细胞因子、抗体等的受体.
融合构建体可被设计为靶向表达该结合部分的结合位点的任意细胞或细胞群。结合部分如配体、抗体及其片段、生长因子、细胞因子等可被连接至溶解结构域靶向杀死表达或包含受体、抗原、抗体、配体等的细胞，从而减少或抑制细胞增殖或生长。
融合构建体不需要细胞分裂以杀死靶细胞。进一步地，融合构建体不太可能具有免疫原性，因为它们可被制备为具有相对较小的大小。此外，融合构建体可杀死多重耐药细胞。
此外，融合构建体就抗细胞增殖活性或杀伤活性和低溶血活性(HA50)而言具有更大的细胞毒活性(低IC50)，从而使IC50∶HA50的比例(IC50/HA50)低于具有该活性的其它化合物。例如，融合构建体通过更低的IC50值确定具有比Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala更高的抗细胞增殖活性；具有比Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala更低的IC50/HA50比例；或者具有小于约0.02、0.01或0.005的IC50/HA50比例。
根据本发明，提供了包含第一和第二结构域的融合构建体。在一个实施方式中，融合构建体包含由包含选自例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列的12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28残基L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域以及包含靶向或结合部分或由其组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。在另一实施方式中，融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域和包含靶向或结合部分或者由其组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。在进一步的实施方式中，融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域和由不同于所述第一结构域的1-25L-或D-氨基酸序列(例如，靶向或结合部分)组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。
根据本发明，还提供了包含第一结构域或由其组成的分离或纯化的肽。在不同的实施方式中，分离或纯化的肽为KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF或KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA。在附加的实施方式中，分离或纯化的肽为KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF，KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK，KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA，其中一个或多个K残基被F或L残基的任意一个所替换，一个或多个F残基被K、A或L残基的任意一个所替换，或者一个或多个A残基被K、F或L残基的任意一个所替换。
融合构建体包含结合受体、配体或抗原的结合部分。结合部分还可包括配体、抗原或抗体。配体包括结合受体的分子(如受体激动剂或拮抗剂)，或由其组成。结合部分可包括线性或环状结构，或由其组成。
结合部分的特定的非限制性范例包括一个或多个氨基酸(例如，肽、多肽、蛋白)、核酸和碳水化合物。结合部分的特定的非限制性类别包括结合受体的激素、激素类似物以及激素和激素类似物的片段、生长因子、细胞因子、抗体等。激素的特定非限制性范例包括促性腺激素-释放激素或其类似物、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、乳铁蛋白、多巴胺、生长激素抑制素或其类似物、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、雄性激素、黄体酮、甲状腺刺激激素(TSH)、胰岛素、儿茶酚胺、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧缩素、抗利尿素、降血钙素、缩胆囊肽、蛙皮素、促肾上腺皮质激素-释放激素、促胃液素、饥饿激素、胰高血糖素、生长激素释放激素及其类似物、抑制素、食欲素、KiSS肽(GPR54)、kisspeptin、泌乳刺激素、泌乳刺激素释放激素、生长激素、Her2/neu、叶酸、维生素H、铁蛋白、副甲状腺激素、松弛激素、分泌素、促甲状腺素释放激素、内皮素、肾素、促脂解素、褪黑素等。生长激素的特定非限制性范例为表皮生长因子(EGF)、胰岛素-样生长因子-1和2(IGF-1、IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α和β(TGFα、TGFβ、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血浆铜蓝蛋白等。细胞因子或配体的非限制性类别为白细胞介素(例如白介素2、白介素17、CD154、Fas配体等)、肿瘤坏死因子(TNFs)、干扰素等。
结合部分可任选地在细胞上表达。可表达结合部分(例如，受体、配体、抗原、抗体)或者可根据本发明的方法靶向的细胞包括高度增殖细胞。表达受体、配体或抗原或者可根据本发明的方法靶向的细胞还包括乳腺、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、睾丸、胰腺、皮肤、血液细胞、肾上腺、脑垂体和子宫内膜细胞。在细胞上表达的结合部分的特定的非限制性类别为激素、细胞因子、生长因子(例如EGF受体、Her2/neu、ROR1)、铁蛋白、铁传递蛋白受体、细胞粘附分子等的受体。在可被抗体或其片段靶向的增殖细胞上表达的抗原的特定非限制性范例为CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、类免疫球蛋白受体等。其它的抗原包括，例如，前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌症抗原125(CA-125)以及结合此处披露的配体的其它受体分子。
第一和第二结构域可以包括氨基酸或氨基酸序列，或由其组成。在特定的方面，第一或第二结构域具有约1-10、10-20、15-20(i.e.、15、16、17、18、19或20氨基酸)、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100或更多的氨基酸残基。
在特定的方面，第一结构域包括两亲α-螺旋结构，或由其组成。在其它特定的方面，第二结构域包括如SYAVALSAQAALARR或QHWSYGLRPG所列的氨基酸序列，或由其组成。
第一和第二结构域可定位在相对彼此的NH-末端或C-末端。因此，在一个实施方式中，该第一(溶解肽)结构域定位在相对于第二(结合部分或配体)结构域的NH-末端，而在另一实施方式中，该第二(结合部分或配体)结构域定位在相对于该第一(溶解肽)结构域的C-末端。
第一和第二结构域可包括一个或多个D-氨基酸，或由其组成。在特定的方面，第一结构域例如在K、F或A残基任意一个上具有D-氨基酸。
第一和第二结构域可通过共价键连接。例如，第一和第二结构域可通过肽或非肽接头连接。在特定的方面，第一和第二结构域通过具有约1-25个氨基酸残基或具有线性碳链的肽序列连接。在更特定的方面，第一和第二结构域通过包括一个或多个A、S或G氨基酸残基或由其组成的肽序列连接。在其它特定的方面，第一和第二结构域通过肽序列连接，第一和第二结构域通过包含GSGGS、ASAAS或CCCCCC或由其组成的肽序列连接。
第一和第二结构域可进一步包括额外的结构域或由其组成。因此，在不同的方面，融合构建体包含第三、第四、第五、第六、第七结构域等。
融合构建体包含分离或纯化的形式或由其组成。融合构建体还包含混合物或由其组成。该种混合物包括组合物，例如融合构建体和适于施用至对象或与对象体内接触的药学可接受的载体或赋形剂的混合物，或者融合构建体和抗细胞增殖或免疫刺激剂的混合物。
融合构建体包含单位剂型或由其组成。在一个实施方式中，融合构建体是其数量可有效治疗患有不良细胞增殖或高度增殖紊乱的对象的单位剂型。在另一实施方式中，融合构建体是其数量可有效治疗患有赘生瘤、肿瘤或癌症的对象的单位剂型。在额外的实施方式中，融合构建体是其数量可有效减少对象生育力的单位剂型。
融合构建体可包括在试剂盒内，该试剂盒可选地具有实施方法的说明。在一个实施方式中，试剂盒包含融合构建体以及说明书，其用于减少或抑制细胞增殖、减少或抑制高度增殖细胞的增殖、减少或抑制赘生瘤、肿瘤或癌症细胞的增殖、治疗患有高度增殖紊乱的对象、治疗患有赘生瘤、肿瘤或癌症的对象或者减少动物的生育力。
根据本发明，还提供了编码融合构建体的核酸。在一个实施方式中，核酸编码融合构建体，该融合构建体包含由包含选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列的12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28残基L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域以及包含靶向或结合部分或由其组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。在另一实施方式中，核酸编码融合构建体，该融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域和包含靶向或结合部分或者由其组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。在进一步的实施方式中，核酸编码融合构建体，该融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域和由不同于所述第一结构域的1-25L-或D-氨基酸序列(例如，靶向或结合部分)组成的第二结构域。
核酸可被包含在载体中，例如在细胞中表达时编码融合构建体的表达载体。宿主细胞可被载体中的核酸转化，从而使该细胞表达由该核酸编码的融合构建体。
融合构建体可用于，例如，减少或抑制细胞的增殖、减少或抑制细胞增殖、减少或抑制高度增殖细胞的增殖、减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖以及治疗不良或异常细胞增殖(例如高度增殖细胞或高度增殖紊乱)。高度增殖紊乱的非限制性范例包括良性增生、非转移性和转移性赘生瘤、癌症和恶性肿瘤(例如，实体或液态瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、癌、肉瘤、黑素瘤、神经的、网状内皮的和造血的瘤)。
根据本发明，进一步提供了减少或抑制细胞的增殖的方法；减少或抑制细胞增殖的方法；减少或抑制高度增殖细胞的增殖的方法；以及减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞增殖的方法。在不同的实施方式中，一种方法包括了将细胞与数量上足以减少或抑制细胞的增殖的融合构建体相接触；将细胞与数量上足以减少或抑制细胞增殖的融合构建体相接触；将细胞与数量上足以减少或抑制高度增殖细胞的增殖的融合构建体相接触；以及将细胞与数量上足以减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的融合构建体相接触。
根据本发明，此外提供了选择性减少或抑制表达受体或抗原的细胞的增殖的方法；选择性减少或抑制表达受体或抗原的高度增殖细胞的增值的方法；以及选择性减少或抑制表达受体或抗原的赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的方法。在不同的实施方式中，一种方法包括将细胞与数量上足以减少或抑制细胞的增值的融合构建体相接触，其中所述肽的结合部分结合该细胞所表达的受体、配体或抗原；将细胞与数量上足以减少或抑制高度增殖细胞的增殖的融合构建体相接触，其中所述肽的结合部分结合高度增殖细胞表达的受体、配体和抗原；以及将细胞与数量上足以减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的融合构建体相接触，其中所述融合构建体的结合部分结合该细胞表达的受体、配体或抗原。
根据本发明的方法靶向的细胞包括表达受体或抗原(例如激素受体，例如，性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体)的细胞。根据本发明的方法靶向的细胞还包括表达受体的细胞，其中该受体结合促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、泌乳刺激素、泌乳刺激素释放激素、抗利尿素、血管紧缩素、儿茶酚胺、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子-1和2(IGF-1、IGF-2)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、副甲状腺激素(PTH)、内皮素、蛙皮素、肾素、促脂解素、褪黑素激素、松弛激素、分泌素、生长激素、血管内皮生长因子(VEGF)、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如，α-5β3或α-5β1整合素)、神经生长因子、转化生长因子α和β(TGF-α和β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌抗原125(CA-125)、白介素17、CD154、可溶性白介素-2(IL-2)受体、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白、ILF3、叶酸或其衍生物、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、TNF-α、TNF-β(淋巴细胞毒素、LT)、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、单糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或乙酰神经氨酸。
除了别的以外，实施的方法包括，接触需要抑制、减少或预防细胞(例如，高度增殖细胞或不良增殖细胞)的增殖、存活、分化、死亡或活性的对象。示范性的对象包括患有或可能罹患不良或异常细胞增殖的对象；患有或可能罹患良性增生的对象；或者非转移性或转移性赘生瘤、癌症、重量或恶性肿瘤(例如，实体或液态瘤，骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、癌、肉瘤、黑素瘤、神经的、网状肉皮的和造血的赘生瘤)。
根据本发明，额外提供了治疗患有高度增殖紊乱的对象的方法和治疗患有赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤(转移性、非转移性或良性)的对象的方法。在不同的实施方式中，一种方法包括，向对象施用数量上足以治疗高度增殖紊乱的融合构建体；以及向对象施用数量上足以减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的增殖的融合构建体。
这些方法包括治疗患有或可能罹患转移瘤的对象。例如，可有效减少或抑制肿瘤、癌症或赘生瘤扩散或散播至对象体内的其它位点、局部或区域的一定量的融合构建体。在不同的实施方式中，一种方法减少或抑制原发肿瘤或癌症转移至一个或多个其它位点、转移瘤在一个或多个其它位点、局部或区域形成或确立(establishment)，从而减少或抑制肿瘤或癌症复发或者肿瘤或癌症的进展。在进一步的实施方式中，一种方法减少或抑制潜在或者已经形成转移的肿瘤或癌症细胞(例如，散播肿瘤细胞)的生长、增殖、迁移或侵染；减少或抑制由原发肿瘤或癌症产生的转移瘤在不同于该原发肿瘤或癌症的位点、局部或区域的形成或确立；减少或抑制转移瘤形成或确立之后该转移瘤在不同于该原发肿瘤或癌症的一个或多个其它位点、局部或区域的生长或增殖；或者减少或抑制该转移瘤形成或确立之后其它转移瘤的形成或确立。在仍然另一实施方式中，一种方法减少或抑制了赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的复发或进展。
根据本发明，还进一步提供了减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞转移至其它位点或者转移性赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤在远离原发赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的其它位点的形成或确立的方法。在不同的实施方式中，一种方法包括向对象施用足以减少或抑制赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞转移至其它位点或者转移性赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤在远离原发赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤的其它位点的形成或确立的一定量的融合构建体。
可根据本发明治疗的赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性肿瘤包括实体细胞量、造血细胞或癌、肉瘤(例如，淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤或纤维肉瘤)、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、黑素瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、间皮瘤、网状内皮的、淋巴的或造血的(例如，骨髓瘤、淋巴瘤或白血病)赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性肿瘤。
可根据本发明治疗的赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性肿瘤包括可存在于或感染肺(小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、甲状腺、头或颈、鼻咽、喉、鼻或窦、脑、脊柱、乳腺、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴腺、胃肠的(嘴、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴腺、血液、肌肉、皮肤或干细胞赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性肿瘤。
这些方法可与其它的治疗或疗法(例如，手术切除、放射疗法、电离或化学放射疗法、化学疗法、免疫疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种)一起实施。该种治疗或疗法可在施用融合构建体之前、同时(单独或在混合物中)或之后施用。在一个实施方式中，一种方法包括施用抗细胞增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌症或免疫增强治疗或疗法。在进一步的实施方式中，一种方法包括施用烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷酸或核苷酸类似物；环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、、5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物、博来霉素、放射菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、环己亚硝脲、司莫司汀、链脲菌素、羟脲、顺式铂氨、卡铂、草酸铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉酚、长春花碱、长春新碱、阿霉素或二溴甘露醇、拓扑异构酶抑制剂、(依立替康、托泊替康、依托泊甙、替尼泊甙)、吉西他滨、培美曲塞等。细胞或免疫疗法包括淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树状细胞、T-细胞、NK细胞或B-细胞；抗体、细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子或趋化因子(范例为白细胞介素IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒细胞亲合素、嗜酸粒细胞亲合素-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1或淋巴细胞趋化因子)等。
其它适用于融合构建体的药剂为靶向药物或者生物药剂如抗体或小分子。单克隆抗体的非限制性范例包括利妥昔单抗曲妥单抗(Herceptin)、贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗(Erbitux)、阿仑单抗(Campath)、帕木单抗(Vectibix)、替伊莫单抗(Zevalin)、托西莫单抗(Bexxar)等，其可特别与本发明的融合构建体联用。适合与该融合构建体联用的其它靶向药物为伊马替尼(Gleevec)、吉非替尼(Iressa)、硼替佐米(Velcade)、拉帕替尼(Tykerb)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nevaxar)、尼罗替尼(Tasigna)等。
本发明的方法包括向对象提供益处。在特定的实施方式中，一种治疗方法导致了赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞量、体积、大小或细胞数量的破坏，刺激、诱导或增加赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞坏死、溶解或凋亡，减少赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积大小、细胞量，抑制或防止赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积、量、大小或细胞数量的进展或增加，或者延长寿命；导致与该赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤相关或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率的减少或下降；导致疼痛、不适、恶心、虚弱或嗜睡的减少或下降；或者导致更高的精力、食欲、改善的灵活性或心理状态。
根据本发明，还额外提供了减少动物生育力的方法；治疗或减少子宫内膜异位、两性前列腺增生、纤维瘤或息肉的方法。在不同的实施方式中，一种方法包括向动物(例如，哺乳动物，如人)施用足以减少生育力的一定量的融合构建体；向动物(例如，哺乳动物，如人)施用足以治疗或减少子宫内膜异位的一定量的融合构建体；向动物(例如，哺乳动物，如人)施用足以治疗或减少良性前列腺增生的一定量的融合构建体；以及向动物(例如，哺乳动物，如人)施用足以治疗或减少纤维瘤或息肉的一定量的融合构建体。
可根据该方法治疗的对象包括哺乳动物。在特定的实施方式中，该对象为人。
附图说明
图1显示了LHRH-Phor21比Phor21-βCG-ala更快杀死癌症细胞。人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S.luc，不同传代次数)与Phor21-βCG-ala或LHRH-Phor21进行孵育。
图2显示了与Phor21-βCG-ala相比，在溶解结构域具有21(Phor21)、18(Phor18(338983)＝CLIP71)和15(Phor15)个氨基酸的融合构建体对细胞的细胞毒性。
图3显示了βCG-ala和LHRH融合构建体对MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性(微摩尔IC50)。融合构建体比图右所列的Phor21-βCG-ala对MDA-MB-435S.luc细胞更具毒性。
图4显示了LHRH融合构建体对MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性(微摩尔IC50)。该融合构建体为：323033＝Phor21-βCG-ala、337479＝LHRH-Phor21、337480＝Phor21-LHRH、338611＝D-ala-Phor21-LHRH、338612＝Phor18-ASAAS-LHRH、338613＝Phor18-LHRH、339385＝D-ala-Phor18-LHRH和339347＝Phor18-柳菩林。
图5显示了相比Phor21-βCG-ala，βCG-ala和LHRH融合构建体对人红细胞的急性溶血活性(微摩尔HA50)。除了LHRH-Phor21、Phor21-LHRH和Phor18-柳菩林(QHWSY(D-Leu)LRPNEt＝柳菩林)，所有的融合构建体具有明显低于Phor21-βCG-ala的溶血活性。
图6显示了细胞毒性和溶血活性的比较。箭头所指的肽比Phor21-βCG-ala对细胞更具毒性。
图7是一个治疗计划纲要。
图8A-8J是以3个βCG结合物相比未结合的Phor21、未结合的Phor18(338983)＝(CLIP71)以及(KKKFAFA)3结合物(338984)在治疗过程中和研究终点的肿瘤状态综述。融合构建体代码33＝Phor21β-CG-ala；76＝Phor18-βCG-ala；81＝D-ala-Phor21-βCG-ala；85＝D-ala-Phor18-LHRH；47＝Phor18-柳菩林；13＝Phor18-LHRH；11＝D-ala-Phor21-LHRH；12＝Phor18-ASAAS-LHRH；71＝Phor15-βCG-ala；以及74＝Phor15-C6-βCG-ala，代码之后是本研究中所用的构建体的量。
图9A-9H显示了在最多30天的指定时间段内A)Phor21-βCG-ala(33)；B)D-ala-Phor21-LHRH(11)；C)Phor18-柳菩林(47)；D)Phor18-ASAAS-LHRH(12)；E)Phor18-LHRH(13)；F)(KKKFAFA)3-LHRH；G)D-ala-Phor18-LHRH(85)相对盐水和基线值以及H)相对于基线的治疗组肿瘤体积。
图10A-10E显示了采用5种LHRH结合物相比Phor21-βCG-ala在研究终点对A)肿瘤重量、B)相比基线的肿瘤重量变化、C)活肿瘤细胞总数、D)相比基线的活肿瘤细胞总数变化以及E)体重的肿瘤状态的综述。338614＝(KKKFAFA)3LHRH、338612＝Phor18-ASAAS-LHRH、338613＝Phor18-LHRH和339385＝D-ala-Phor18-LHRH。
图11显示了与上升浓度的Phor21-βCG-ala在指定量的阿霉素存在下孵育的具有多重耐药性的卵巢癌细胞(OVCAR3)以及在最高阿霉素浓度下由该组合得到的因子为200的细胞杀死增毒作用。
图12显示了LHRH和Phor21以及βCG和Phor21融合构建体对CHO(中国仓鼠卵巢)和TM4细胞的细胞毒性，与对MDA-MB-435S.luc细胞的细胞毒性相比。TM4细胞为LHRH受体阴性，CHO细胞为CG受体阴性，MDA-MB-435S.luc细胞表达LHRH和CG受体。
发明详述
本发明至少部分基于融合构建体，该融合构建体包括连接或融合至第二结构域结合部分的第一结构域溶解部分。在一个典型的结构中，融合构建体第一结构域包括溶解部分，其直接或间接对细胞具有毒性，从而可以减少细胞增殖或存活或者刺激、诱导、增加或促进细胞死亡、杀死或凋亡；而融合构建体第二结构域包括靶向细胞的部分，称为结合部分实体。
根据本发明，提供了融合构建体，其包括第一“溶解”结构域或由其组成，且包括了第二“靶向”或“结合”结构域或由其组成。在一个实施方式中，融合构建体包含由包含选自例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列(选自氨基酸，例如赖氨酸＝K、苯丙氨酸＝F，丙氨酸＝A)的12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28残基L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域以及包含靶向或结合部分或由其组成的第二结构域。在另一实施方式中，融合构建体包含第一结构域和第二结构域，第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，第二结构域包含靶向或结合部分或者由其组成。在进一步的实施方式中，融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成的第一结构域和由不同于所述第一结构域的1-25L-或D-氨基酸序列(例如，靶向或结合部分)组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。
此处所用的术语“融合”或“嵌合”及其语法上的变体在指代构建体时表示该构建体包含从彼此不同且在自然界中一般不同时存在的两个分子实体所衍生、获得、分离、基于其获得或者构造的部分。即，例如，融合构建体的一个部分包含溶解部分或由其组成，且该融合构建体的第二部分包含靶向部分(例如具有结合能力的部分)或由其组成，第一和第二结构域的每个结构上不同。融合构建体还可被称为“结合物”，其中结合物包含第一结构域溶解部分和第二结构域靶向或结合部分，或者由其组成。
融合构建体的第一结构域和第二结构域包括氨基酸序列(肽、多肽、蛋白、凝集素)、核酸(DNA、RNA)和碳水化合物(糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸等)，或由其组成。术语“氨基酸序列”、“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用，表示通过酰胺键或同等方式共价连接的两个或多个氨基酸或“残基”。可通过非天然和非酰胺化学键连接的氨基酸序列包括，例如，以戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺或N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)形成的氨基酸序列。非酰胺键包括，例如，南五味子酮、氨基亚甲基、烯烃、醚、硫醚等(参见，例如SpatolainChemistryand BiochemistryofAminoAcids，PerptidesandProteins，Vpl.7，pp267-357(1983)，“PeptideandBackboneModifications，”MarcelDecker，NY)。
融合构建体或嵌合体的第一和第二结构域包括L-氨基酸序列、D-氨基酸序列和具有L-氨基酸和D-氨基酸混合物的氨基酸序列。第一和第二结构域的氨基酸序列可具有线性或环状结构，结合至不同的部分(例如，第三、第四、第五、第六、第七等结构域)，形成分子内或分子间二硫键，且还可形成具有相同或不同氨基酸序列或其它分子的更高的多聚体或低聚体。
示范性的融合构建体的长度为从约5至15，20至25，25至50，50至100，100至150，150至200或200至300或更多个氨基酸残基。在特定的实施方式中，第一和第二结构域包含约1-10、10-20、15-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100或更多残基的氨基酸序列，或由其组成。在更特定的实施方式中，第一结构域由15、16、17、18、19、20、28或更多个残基的氨基酸序列组成。
融合构建体第一结构域单独地或与第二结构域联合形成两亲α-螺旋。两亲α-螺旋在该α-螺旋一侧主要包含亲水氨基酸，而在另一侧主要包含疏水氨基酸。由于α-螺旋中每3.6个残基形成一个完全的旋转，两亲α-螺旋的氨基酸序列每3-4个残基进行亲水和疏水残基的交替。PNNPNNP重复模式或基序预计形成两亲α-螺旋，其中P代表带正电氨基酸残基，而N代表中性氨基酸残基。PNNPNNP重复模式为溶解肽结合至带负电荷细胞膜提供了阳离子结合位点，并为膜相互作用/穿透提供了疏水位点。融合构建体从而包含可形成两亲α-螺旋的具有一个或多个未中断PNNPNNP重复模式或基序或者一个或多个中断的PNNPNNP重复模式或基序的第一结构域。例如，具有未中断和中断的PNNPNNP重复基序的15或18残基氨基酸序列(如KFAKFAKKFAKFAKK和KFAKFAKKFAKFAKKFAK)。
融合构建体第二结构域，例如靶向或结合部分，包括配体、抗体(或其抗原结合片段)、抗原、整合素、整合素受体(例如，包含“RGD”序列基序的蛋白或肽，以及胞外基质(ECM)中的成分，例如单糖、二糖或寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸)、生长因子、细胞因子、趋化因子以及能结合受体、抗体、抗原、整合素、整合素受体(例如，包含“RGD”序列基序的蛋白或肽，以及胞外基质(ECM)中的成分，例如单糖、二糖或寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸)、生长因子受体、细胞因子受体以及趋化因子受体的靶向和结合部分，或由其组成。
“受体”通常存在于细胞上(例如，膜受体)或细胞内。受体可以结合在细胞膜表面上或者跨域细胞膜。例如，受体蛋白可具有跨细胞膜的跨膜结构域，可选地具有细胞质部分或胞外部分或者两者。因此受体包括具有包含胞外、跨膜或细胞质部分的全长完整天然受体，及其截短形式或片段(例如，单独的胞外、跨膜或细胞质部分或受体子序列或其组合)。例如，可溶性受体通常缺失跨膜部分，且可选地还可缺失所有或部分的天然胞外或细胞质区域(如存在于天然受体)。该种截短的受体形式和片段可至少保留部分对配体的结合。
特别或非特别地，融合结构域的靶向和结合部分结构域包含结合至受体的任意实体(称为受体配体)，或由其组成。靶向或结合部分的非限制性范例因而包括激素、激素类似物、结合至激素受体的激素或激素类似物片段、生长因子，生长因子类似物、结合至受体的生长因子或生长因子类似物片段、结合至激素或激素受体的激素受体或配体，以及结合至激素、激素类似物、结合至激素受体的激素或激素类似物片段、结合至激素或激素受体的激素受体或配体、生长因子，生长因子类似物、结合至受体的生长因子或生长因子类似物片段、结合至生长因子或生长因子受体的生长因子受体或配体的靶向和结合部分。
可用作结合部分的示范性激素包括促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素(LH)、绒毛膜促性腺激素(CG)、绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-或β-CG)、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素及其衍生物。可用作结合部分的示范性激素受体包括促性腺激素释放激素I受体、促性腺激素释放激素II受体、八目鳗III促黄体激素释放激素受体、促黄体激素受体、绒毛膜促性腺激素受体、促黑色素细胞激素受体、雌二醇受体、多巴胺受体、生长激素抑制素受体、促卵泡成熟激素(FSH)受体、表皮生长因子(EGF)受体、生长激素(GH)受体、Her2-neu受体、糖皮质激素激素受体、雌激素受体、睾丸激素受体、黄体酮受体和雄性激素受体。
示范性生长因子包括表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)和Her2-neu。示范性生长因子受体包括表皮生长因子(EGF)受体、生长激素(GH)受体和Her2-neu受体、IGF-1。
靶向或结合部分的特定非限制性范例包括LHRH、LHRH功能性(结合)片段、LHRH类似物以及βCG、βCG功能性(结合)片段和βCG类似物。LHRH是一种全功能配体，并可通过配体受体相互作用产生药理作用，例如信号转导途径的活化。βCG-ala是能够结合至细胞膜而不会导致任何药理作用的hCG片段。靶向或结合部分的特定非限制性范例包括如下包含或列举的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成：SYAVALSAQAALARR；SYAVALSAQAALARRA，其为βCG的片段，以及QHWSYGLRPG，其为LHRH序列。
靶向和结合部分进一步包括特别或优先在赘生瘤、肿瘤或癌症细胞或者与赘生瘤、肿瘤或癌症细胞相关的淋巴管或血管中表达的配体的抗原。该种抗原可被统称为“肿瘤相关抗原”或“TAA”，并包括癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA-125(残留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、类泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白以及ILF3、IGF-1等等。可被靶向的其它抗原为CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、类免疫球蛋白受体等。
靶向和结合部分还包括铁传递蛋白、叶酸及其衍生物(例如，叶酸)以及肿瘤坏死因子(TNF)家族成员和TNF受体，例如TNF-α、TNF-β(淋巴细胞毒素、LT)、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB。
第二结构域包含靶向或结合结构域或由其组成的融合构建体可以结合至生成或表达能结合该第二结构域的抗原、受体或配体、整合素、抗体或抗原或者TAA的细胞。细胞的非限制性范例包括高度增殖细胞和显示异常或不良高度增殖的细胞。在特定的非限制性范例中，该种细胞包括非转移性和转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞，以及散播的赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞以及休眠的赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞。以相对于正常或者非高度增殖细胞的升高水平表达抗原、受体、配体、整合素、TAA等的细胞为该种细胞提供了选择性。因此，靶向或结合部分可结合至在高度增殖细胞(例如，非转移性或转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性肿瘤，以及散播和休眠的赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞)中表达或由该高度增殖细胞生成的，但在正常或非高度增殖细胞中不可测表达或者以相对更低的水平生成或表达的抗原、受体、配体、整合素或TAA，从而优选靶向高度增殖细胞。表达抗原、受体、配体、整合素或TAA的非限制性示范细胞和组织类型包括乳腺、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、睾丸、肾上腺、脑垂体、胰腺、肝脏、胃肠的、皮肤、肌肉或子宫内膜细胞。
结合部分的其它范例包括抗体和抗体片段。“抗体”指任意单克隆或多克隆免疫球蛋白分子，例如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及任意其亚类。IgG的示范性亚类为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。抗体包括由细胞(例如B细胞)生成或表达的抗体。抗体片段或子序列指相对于全长抗体至少保留部分抗原结合能力的全长抗体的部分。示范性的抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL、VH、三特异性(Fab3)、双特异性(Fab2)、双特异抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三特异抗体(三价)、四特异抗体(四价)、微抗体((scFV-CH3)2)、双特异性单链Fv(Bis-scFv)、IgGdeltaCH2、scFv-Fc、(scFv)2-Fc或完整免疫球蛋白的其它抗原结合片段。
融合构建体包括在氨基末端具有第一结构域和在羧基末端具有第二结构域的那些。融合构建体还包括在羧基末端具有第一结构域和在氨基末端具有第二结构域的那些。当存在额外的结构域(例如，第三、第四、第五、第六、第七等结构域)时，第一结构域相对于第二结构域定位在NH2-末端，或者第二结构域相对于第一结构域定位在NH2-末端。
还包括此处列举的各种氨基酸序列，例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK或结合部分的子序列和氨基酸替换。在特定的实施方式中，第一或第二结构域的子序列具有至少5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或更多个氨基酸残基。
因此，本发明包括了修饰或替换，例如对第一或第二结构域或者第一和第二结构域两者的替换、添加或删除。因而，包含肽序列第一或第二结构域的融合构建体可结合任意数量的保守或非保守氨基酸替换，只要该种替换不破坏第一或第二结构域的活性(溶解或结合)。因此，例如，修饰的溶解部分(第一结构域)可保留未修饰第一结构域的至少部分溶解活性，例如细胞杀死或凋亡，而修饰的结合部分或其类似物可保留未修饰结合部分的至少部分结合活性。
“保守替换”是一个氨基酸被生物、化学或结构类似的残基所替换。生物类似表示该替换与生物活性(例如，溶解活性)相容。结构类似表示该氨基酸具有类似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或者具有类似的大小，或者保留了第一、第二或附加结构域的结构(例如两亲α螺旋)。化学类似表示该残基具有相同的电荷或均为亲水或疏水。特定的范例包括用一个疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)替换另一个疏水残基，或者用一个极性残基替换另一个极性残基，例如用精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，或者用谷氨酰胺替换天冬酰胺，丝氨酸替换苏氨酸等。常规测定可用于确定融合构建体变体是否具有活性，例如，溶解活性或结合活性。
特定的范例包括肽第一或第二结构域中一个或多个氨基酸(例如，1-3、3-5、5-10、10-20或更多个)残基的替换或删除。修饰的融合构建体可具有与参考序列(例如，第一结构域，例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA或KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK或者第二结构域如结合部分)具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或更高一致性的肽序列。
在特定的实施方式中，融合构建体包含肽第一结构域，该肽第一结构域包含了具有选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA以及KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽的12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28个残基的L-或D-氨基酸序列或由其组成，其中一个或多个K残基被F或L残基的任意一个所替换，一个或多个F残基被K、A或L残基的任意一个所替换，或者一个或多个A残基被K、F或L残基的任意一个所替换。在另一特定的实施方式中，融合构建体包含肽第一结构域，该肽第一结构域由具有选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，其中一个或多个K残基被F或L残基的任意一个所替换，一个或多个F残基被K、A或L残基的任意一个所替换，或者一个或多个A残基被K、F或L残基的任意一个所替换；该融合构建体还包含具有结合部分或由其组成的肽第二结构域。在进一步的特定实施方式中，融合构建体包含肽第一结构域，该肽第一结构域由具有选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列组成，其中一个或多个K残基被F或L残基的任意一个所替换，一个或多个F残基被K、A或L残基的任意一个所替换，或者一个或多个A残基被K、F或L残基的任意一个所替换；该融合构建体还包含具有不同于该第一结构域的1-25个L-或D-氨基酸序列(例如，结合部分)组成的肽第二结构域，或者该融合构建体由该肽第一结构域和肽第二结构域组成。
术语“一致性”和“同源性”及其语法变化指两个或多个所指的实体相同。因此，当两个氨基酸序列为一致时，它们具有相同的氨基酸序列。“一致的范围、区域或结构域”表示两个或多个所指实体中的部分相同。因此，当一个或多个序列区域的两个氨基酸序列一致或同源时，它们在这些区域具有一致性。术语”互补性”在指核酸序列时表示参考区域具有100％互补性，即，显示了没有错配的100％碱基配对。
由于在结构和功能相关蛋白之间序列保留数量的变化，保留功能或活性所需的序列一致性的数量依赖于该蛋白、区域和该区域的功能或活性(例如，溶解或结合)。例如，对于溶解肽序列，可存在多个PNNPNNP序列重复模式或基序，但不需要存在一个或多个中断或未中断PNNPNNP序列重复模式或基序
两个序列之间的一致性程度可通过本领域已知的计算机程序和数学算法得以确定。该种计算序列一致性(同源性)百分比的算法通常可说明比较区域的序列间隙和错配。例如，BLAST(例如，BLAST2.0)检索算法(例如，参见Altschul等人，J.MoI.Biol.215：403(1990)，可从NCBI上公开获取)具有如下示范性检索参数：错配2；间隙开口5；间隙延伸2。对于多肽序列比对，BLASTP算法通常组合使用计分矩阵，例如PAM100、PAM250、BLOSUM62或BLOSUM50。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比对程序同样用于对一致性程度的定量(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sd.USA85：2444(1988)；Pearson，MethodsMoIBiol.132：185(2000)；以及Smith等人，J.MoI.Biol.147：195(1981))。采用基于Delaunay的拓扑映射的蛋白结构相似性定量程序已被开发(Bostick等人，BiochemBiophysResCommun.304：320(2003))。
单独的残基和第一、第二和附加结构域可通过共价或非共价键连接。共价键的非限制性范例为酰胺键、非天然和非酰胺化学键(其包括，例如，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC))。替代酰胺键的连接基团包括，例如，南五味子酮(例如，-C(＝O)-CH2-或-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、亚乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、反酰胺(retroamide)、硫酰胺或酯(例如，参见Spatola(1983)于ChemistryandBiochemistry ofAminoAcids，PeptidesandProteins.第7卷，第267-357页，″PeptideandBackboneModifications，″MarcelDecker，NY)。
第一和第二结构域可通过共价或非共价键直接融合或结合在一起。第一和第二结构域可通过位于第一和第二结构域之间的居间序列(例如铰链、间隔子或接头)分隔。在一个实施方式中，第一和第二结构域通过碳链连接。多碳链包括羧酸(例如二羧酸)如戊二酸、琥珀酸和己二酸。
在另一实施方式中，第一和第二结构域通过该第一和第二结构域之间的氨基酸、肽或非肽铰链、间隔子或接头连接。肽铰链、间隔子或接头序列可具有任意长度，但通常在约1-10、10-20、20-30、30-40或40-50氨基酸范围内。在特定的实施方式中，第一和第二结构域之间的肽铰链、间隔子或接头具有1-25个L-或D-氨基酸残基或1-6个L-或D-氨基酸残基。包含在该第一和第二结构域之间的序列中的特定氨基酸残基包括C、A、S或G氨基酸残基中的一个或多个。该第一和第二结构域之间的肽的特定非限制性范例包括如下列举或包含的序列：GSGGS、ASAAS或CCCCCC。氨基酸和肽的衍生物可位于该第一和第二结构域之间。氨基酸衍生物的特定非限制性范例为赖氨酸衍生物或6碳接头如α-氨基-己酸。
具有或不具有铰链、间隔子或接头或者第三、第四、第五、第六、第七等结构域的融合构建体可完全由合成、非天然氨基酸或氨基酸类似物组成或者可包含衍生形式。在不同的实施方式中，融合构建体的第一或第二结构域中包含一个或多个替换L-氨基酸的D-氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸混合物或完全由D-氨基酸残基组成的序列。
融合构建体可包含非天然结构成分的任意组合，其通常来自三个结构基团：a)非天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)代替天然存在氨基酸残基的非天然残基；或者c)诱导二级结构拟态即，诱导或稳定化二级结构例如，α螺旋构型的残基。融合构建体包含环状结构例如分子的氨基和羧基末端之间的端至端酰胺键或者分子内或分子间二硫键。融合构建体可被体外或体内修饰，例如，通过翻译后修饰以包含，例如，糖或碳水化合物残基、磷酸基团、脂肪酸、脂质等。
添加的特定范例包括第三、第四、第五、第六或第七结构域。具有第一和第二结构域的融合构建体因而包含与其共价连接的一个或多个附加结构域(第三、第四、第五、第六、第七等)，从而赋予不同的或者补充的功能或活性。示范性的附加结构域包括有助分离的结构域，其包括，例如，金属鳌合肽(例如可支持在固定化金属上纯化的聚组氨酸束和组氨酸-色氨酸模块，可支持在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A区域，以及可在FLAGS伸展/亲和纯化系统使用的区域(ImmunexCorp，SeattleWA))。在纯化结构域和融合构建体间可选地包含裂解序列如Xa因子或肠激酶以用于帮助纯化。例如，表达载体可包含连接至六组氨酸残基的编码融合构建体的核酸序列，后接硫氧还蛋白和肠激酶裂解位点。组氨酸残基促进融合构建体的检测和纯化，而肠激酶裂解位点提供从蛋白的剩余部分纯化该构建体的手段(例如，参见Kroll，DNACell.Biol.12：441(1993))。
融合构建体活性被各种因素影响，因此，融合构建体可通过考虑一种或多种这些因素进行设计或优化。该种因素包括，例如，融合构建体的长度，这可影响对细胞的毒性。具体而言，Phor21-βCG-ala和Phor21相比Phor14-βCG-ala可观察到更高的细胞毒性。形成溶解肽结构域的α螺旋的细胞杀死活性还可依赖于该螺旋的稳定性。铰链和间隔子可影响第一结构域和肽溶解结构域的螺旋结构的膜相互作用。例如，更短的融合构建体，例如可选地包含间隔子或铰链的小于21个氨基酸的结构域，可由于更高的螺旋稳定性而显示更高的细胞毒性。具体而言，间隔子如ASAAS和6氨基己酸可能会提高更短融合结构域的毒性。溶解肽结构域的电荷(部分通过该结构域中存在的特定氨基酸进行确定)同样影响细胞杀死能力。
该结合部分相对于该溶解结构域的位置(N-或C-末端)也会影响融合构建体的细胞杀死活性。例如，相对于溶解结构域处在C-末端的结合部分比相对溶解结构域处在N-末端时具有更大的细胞杀死活性。
融合构建体体内半衰期可通过以一个或多个非天然存在的氨基酸或衍生物构建融合构建体肽结构域以得到提高。例如，具有D-氨基酸的融合构建体(例如，所有残基中高达30％或更多的残基为D-对应异构体)耐受血清蛋白水解，因此可被激活更长时间，从而提高体内效力。此外，用一个或多个非天然存在氨基酸或衍生物构建融合构建体肽结构域可以减少溶血活性。该种具有D-对应异构体的融合构建体还更容易在溶液中成为单体，它们不会明显聚集。
根据本发明，提供了通过更低的IC50值(其代表了实现对细胞的细胞毒性所需的融合构建体的量)确定的比Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala的一种或多种具有更大抗细胞增殖活性的融合构建体。根据本发明，还提供了比Phor21-βCG-ala、Phor21-GSGGS-βCG-ala、Phor21-ASAAS-βCG-ala或Phor14-βCG-ala具有以IC50/HA50(溶血活性)比例表示的更小溶血活性的融合构建体。根据本发明，进一步提供了以IC50/HA50(溶血活性)比例表示小于约0.02、0.01或0.005的溶血活性的融合构建体。实施例1中列举了测定细胞毒性和溶血活性的代表性测定条件。
肽和类肽物(peptidomimetics)可采用本领域已知的方法生成和分离。肽可通过本领域已知的化学方法完全或部分合成(例如，参见Caruthers(1980)NucleicAcidsRes.Symp.Ser.215；Hom(1980)；andBanga，A.K.，TherapeuticPeptidesandProteins，Formulation ProcessingandDeliverySystems(1995)TechnomicPublishingCo.，Lancaster，PA)。肽合成可通过多种固相技术实施(例如，参见RobergeScience269：202(1995)；Merrifield，MethodsEnzymol.289：3(1997))，而自动合成可通过如ABI431A肽合成仪(PerkinElmer)根据生产商说明得以实现。肽和肽模拟物还可采用组合方法合成。合成的残基和多肽结合类似物可通过本领域已知的多种步骤和方法合成(例如，参见OrganicSynthesesCollectiveVolumes，Gilman，等人(Eds)JohnWiley&Sons，Inc.，NY)。修饰的肽可通过化学修饰方法生成(例如，参见Belousov，NucleicAcidsRes.25：3440(1997)；Frenkel，FreeRadic.Biol.Med.19：373(1995)；andBlommers，Biochemistry33：7886(1994)。
本发明进一步提供了编码本发明的融合构建体的核酸以及包含编码融合构建体的核酸的载体。在特定的实施方式中，核酸编码融合构建体，其由第一和第二结构域组成，该第一结构域由包含选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的肽序列的12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27或28残基氨基酸序列组成，第二结构域包含靶向或结合部分或由其组成。在另一实施方式中，核酸编码融合构建体，融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的氨基酸序列组成的第一结构域和包含靶向或结合部分或者由其组成的第二结构域。在进一步的实施方式中，核酸编码融合构建体，该融合构建体包含由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF，KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的氨基酸序列组成的第一结构域和由不同于所述第一结构域的1-25氨基酸序列(例如，靶向或结合部分)组成的第二结构域，或由该第一和第二结构域组成。
核酸，在此也可称为基因、多聚核苷酸、核苷酸序列、引物、寡聚核苷酸或探针，表示天然或修饰的任意长度的含嘌呤和嘧啶聚合物，指多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸或者混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸及其α-异构形式。两个或多个含嘌呤和嘧啶聚合物通常通过磷酸酯键或其类似物进行连接。这些术语可互换使用以表示所有形式的核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链、双链或三链，呈线性或环状。核酸包括遗传DNA、cDNA和反义。RNA核酸可以是剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反义。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸类似物和衍生物。
作为遗传密码简并的结果，核酸包括针对编码本发明的融合构建体的序列简并的序列。因此，提供了编码融合构建体的简并核酸序列。
核酸可通过多种已知的标准克隆和化学合成方法生成，并可通过定点突变或本领域技术人员已知的其它重组技术进行有义的修饰。多聚核苷酸的纯度可通过测序、凝胶电泳、UV光谱测定进行检测。
核酸可被插入核酸构建体，其中该核酸的表达受到表达控制元件”(在此称为“表达盒”)的影响或调节。术语“表达控制元件”指调节或影响与之可操作连接的核酸序列表达的一种或多种核酸序列元件。表达控制元件可在蛋白编码基因前适当地包括启动子、增强子、转录终止子、基因沉默、起始密码子(例如，ATG)等。
可操作地连接至核酸序列的表达控制元件控制核酸序列转录，并适当地翻译核酸序列。术语“可操作地连接”指一种毗邻(juxtaposition)，其中涉及的成分所处的关系允许它们以其预期的方式作用。通常表达控制元件毗邻在基因的5′或3′端，但也可以是内含子。
表达控制元件包括可诱导(即，需要外部信号进行激活)或可脱阻抑(即，需要信号关闭激活；当该信号不再存在时，转录被激活或“脱阻抑”)的组成性激活转录的元件。本发明的表达盒中还包含了足以赋予基因表达针对特定细胞类型或组织的可控性的控制元件(即，组织特异性控制元件)。该种元件通常位于编码序列的上游或下游(即，5′和3′)。启动子通常位于编码序列的5′。通过重组DNA或合成技术生成的启动子可用于提供本发明的多聚核苷酸的转录。“启动子”表示足以引导转录的最小序列元件。
核酸可被插入质粒以增殖进入宿主细胞和进行所需的后续遗传操作。质粒是能在宿主细胞中稳定增殖的核酸；质粒可以可选地包含表达控制元件，以驱动该核酸的表达。此处所用的载体与质粒同义，并可包含针对在宿主细胞中表达的表达控制元件。质粒和载体通常包含至少用以在细胞内增殖的复制起始区和启动子。因此质粒和载体可用于融合构建体编码核酸的遗传操作，生成融合构建体或反义核酸，以及在宿主细胞或有机体中表达该融合构建体。
细菌系统启动子包括T7和可诱导启动子，如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)以及四环素应答启动子。昆虫细胞系统启动子包括组成的或是可诱导的启动子(例如，蜕化素)。哺乳动物细胞组成型启动子包括SV40、RSV、牛乳头瘤病毒(BPV)和其它病毒启动子，或者由哺乳动物细胞(例如，金属硫蛋白HA启动子；热休克启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；可诱导的小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复)的基因组获得的可诱导启动子。替代性地，逆转录病毒基因组可被遗传修饰，以导入适当的宿主细胞并引导融合构建体的表达。
表达系统进一步包括经设计在体内使用的载体。特定的非限制性范例包括腺病毒载体(美国专利5,700,470和5,731,172)，腺病毒相关载体(美国专利5,604,090)，单纯疱疹病毒载体(美国专利5,501,979)，逆转录病毒载体(美国专利5,624,820，5,693,508和5,674,703)，BPV载体(美国专利5,719,054)以及CMV载体(美国专利5,561,063)。
酵母载体包含组成型和可诱导启动子(例如，参见Ausubel等人，In：CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.2，Ch.13，ed.，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience，1988；Grant等人MethodsinEnzymology，153：516(1987)，eds.Wu&Grossman；BitterMethodsinEnzymology，152：673(1987)，eds.Berger&Kimmel，Acad.Press，N.Y.以及Strathera等人，TheMolecularBioloeyoftheYeast Saccharomyces(1982)eds.ColdSpringHarborPress，第I和II卷)。可使用组成型酵母启动子如ADHesive或LEU2，或使用可诱导启动子如GAL(R.RothsteinIn：DNAClonina，APracticalApproach，Vol.11，Ch.3，ed.D.M.Glover，IRLPress，Wash.，D.C.，1986)。通过同源性重组等方式促进外源核酸序列整合进入酵母染色体的载体已为本领域所知。当插入的多聚核苷酸对于常规载体而言过大时(例如，大于约12Kb)，常可使用酵母人工染色体(YAC)。
表达载体还可包含赋予对选择性压力的耐受性或可鉴定标记(例如，beta-半乳糖苷酶)的选择性标记，从而允许细胞具有待选择、生长和扩增的载体。替代性地，选择性标记可位于伴随含有编码融合构建体的核酸的第一载体共转染进入宿主细胞的第二载体上。
选择系统包括但不限于可分别应用于tk-，hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.SciUSA48：2026(1962))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.，Cell22：8171980)基因。此外，抗代谢产物耐受可作为对可赋予对氨甲喋呤的耐受性的dhfr(O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527(1981))；可赋予对霉酚酸耐受性的gpt基因(Mulligan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072(1981))；可赋予对氨基糖苷G-418的耐受性的新霉素基因(Colberre-Garapin等人，J.MoI.Biol.150：1(1981))；嘌呤霉素；以及可赋予对潮霉素耐受性的潮霉素基因(Santerre等人，Gene30：147(1984)选择性的基础。其它的选择性基因包括trpB，其允许细胞取代色氨酸利用吲哚；hisD，其允许细胞取代组氨酸利用histinol(Hartman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：8047(1988))；以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的耐受性(McConlogue(1987)In：CurrentCommunicationsinMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratory)。
还提供了表达融合构建体的宿主细胞，用编码融合构建体的核酸转化的宿主细胞以及包含了编码融合构建体的核酸的载体。在一个实施方式中，宿主细胞为原核细胞。在另一实施方式中，宿主细胞为真核细胞。在不同的方面，该真核细胞为酵母或哺乳动物(例如，人，灵长动物等)细胞。
此处所用的“宿主细胞”是导入了核酸且能被增殖、表达转录或编码核酸构建体的细胞。该术语还包括该宿主细胞的任意子代或亚克隆。宿主细胞包括表达融合构建体的细胞以及不表达融合构建体的细胞。不表达融合构建体的宿主细胞被用于增殖包含了编码融合构建体或反义的核酸或载体。
宿主细胞包括但不限于微生物(如细菌和酵母)，以及植物、昆虫和哺乳动物细胞。例如，以重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；以重组酵母表达载体转化的酵母；以重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或以重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；以重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，以重组病毒表达系统(例如，逆转录病毒，腺病毒，牛痘病毒)感染的动物细胞系统，或经过工程改造可瞬时或稳定增殖或表达的转化动物细胞系统。
融合构建体、编码融合构建体的核酸、表达融合构建体或者以编码融合构建体编码的核酸转化的载体和宿主细胞以及反义包括分离和纯化的形式。术语“分离的”在修饰本发明的组合物时表示该组合物通过人工制备或者基本完全或至少部分从天然存在的体内环境中分离。一般而言，分离的组合物基本不含一种或多种通常与之天然伴随的物质，例如，一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。术语“分离的”不排除该组合物的替代物理形式，例如多聚体/低聚体、变体、修饰或衍生形式或由人工生成的宿主细胞中表达的形式。术语“分离的”还不排除其组合中的任意一个由人工制备的形式(例如，药物制剂和组合物)。
当不含部分、大量、基本所有通常与之天然相伴的物质时，“分离的”组合物也可以是”纯化的”。因此，基本纯的分离的融合构建体不包含数百万种其它序列的多肽或多聚核苷酸，例如在蛋白库中的蛋白或在基因组或cDNA库中的核酸。“纯化的”组合物可结合一种或多种其它分子。
根据本发明，提供了融合构建体的混合物或组合物。在一个实施方式中，混合物包含一种或多种融合构建体以及药学可接受的载体或赋形剂。在另一实施方式中，混合物包含一种或多种融合构建体和抗细胞增殖、抗肿瘤、抗癌或抗赘生瘤的治疗或药剂。在进一步的实施方式中，混合物包含一种或多种融合构建体和免疫增强剂。还提供了例如一种或多种融合构建体在药学可接受的载体或赋形剂中与一种或多种抗细胞增殖、抗肿瘤、抗癌或抗赘生瘤的治疗或药剂以及免疫增强的治疗或药剂的组合。
本发明的融合构建体(例如包含具有第一溶解结构域和第二结合部分结构域的氨基酸序列的多肽)可用于靶细胞的溶解、细胞死亡或凋亡。该种细胞可被选择性靶向。例如，表达受体、配体、抗原或抗体的细胞可被融合构建体靶向，从而相对于表达更少受体、配体、抗体或抗体的细胞更优先被杀死。
根据本发明，提供了减少或抑制细胞的增殖的方法，以及减少或抑制细胞增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将细胞与数量上足以减少或抑制该细胞的增殖的融合构建体相接触。在另一实施方式中，一种方法包括将细胞与数量上足以减少或抑制细胞增殖的融合构建体相接触。
还提供了减少或抑制高度增殖细胞的增殖的方法，以及减少或抑制高度增殖细胞的增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将高度增殖细胞(一种或多种)与数量上足以减少或抑制增殖的融合构建体相接触。
进一步提供了减少或抑制非转移性或转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将赘生瘤、癌症、肿瘤或恶性细胞与数量上足以减少或抑制该细胞的增殖的融合构建体相接触。
还进一步提供了减少或抑制休眠或非分裂非转移性或转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将休眠或非分裂赘生瘤、癌症、肿瘤或恶性细胞与数量上足以减少或抑制该休眠或非分裂细胞的增殖的融合构建体相接触。
此外提供了选择性减少或抑制表达受体、配体、抗体或抗原的细胞(例如，高度增殖细胞)的增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将细胞与数量上足以减少或抑制该细胞(例如，高度增殖细胞)的增殖的融合构建体相接触，其中所述肽的结合部分结合至由该细胞表达的受体、配体、抗体或抗原。
还额外提供了选择性减少或抑制表达受体、配体、抗体或抗原的赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的方法。在一个实施方式中，一种方法包括将细胞与数量上足以减少或抑制该赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的融合构建体相接触，其中所述融合构建体的结合部分结合至由该细胞表达的受体、配体、抗体或抗原。
术语“接触”表示两个或更多个实体之间(例如，融合构建体和细胞之间)的直接或间接结合或相互作用。此处所用的接触包括在溶液中、固相中、体外、间接体内、细胞中以及体内接触。体内接触可被称为施用。
被靶向以非选择性或选择性减少或抑制增殖的细胞包括表达任意被该融合结构域的结合部分结合的分子的细胞。示范性的细胞包括表达受体(例如，激素受体、生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体)、配体(例如，激素、生长因子、细胞因子、趋化因子)或者抗体或抗原或整合素或整合素受体(含“RGD”序列基序的肽)或存在于胞外介质(ECM)中的成分如单糖、二糖或寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸、含“RGD”序列基序的肽等的细胞。
靶细胞包括表达性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体的细胞。靶细胞还包括表达受体的细胞，其中该受体结合至促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、Her2/neu、维生素H、叶酸或其衍生物(例如，叶酸)、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如，α-5β3或α-5β1整合素)、神经生长因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、类免疫球蛋白受体、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素-样生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素、血浆铜蓝蛋白或HIV-tat。
靶细胞进一步包括表达结合性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体的受体的细胞。靶细胞还包括表达受体的细胞，所述受体结合至促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、Her2/neu、维生素H、叶酸或其衍生物(例如，叶酸)、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素(例如，α-5β3orα-5β1整合素)、神经生长因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、类免疫球蛋白受体、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat或其类似物(例如，米非司酮、氟他胺、柳菩林、zxoladex、醋酸组氨瑞林、synatel曲普瑞林、布舍瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、安肽、替维瑞克或地加瑞克(Fe200486))。
被靶向以非选择性或选择性减少或抑制增殖的细胞额外包括表达“肿瘤相关抗原”如癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA125(残留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、类泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白和ILF3的细胞。被靶向以非选择性或选择性减少或抑制增殖的细胞还额外包括表达铁传递蛋白、叶酸及其衍生物(例如，叶酸)和肿瘤坏死因子(TNF)家族成员例如TNF-α、TNF-β(淋巴细胞毒素、LT)、TRAIL、Fas、LIGHT和41BB以及受体的细胞。
本发明的融合构建体和方法还可适用于治疗不良或异常的细胞增殖和高度增殖紊乱。因此，根据本发明，提供了治疗不良或异常细胞增殖和高度增殖紊乱的方法。在一个实施方式中，一种方法包括向(需要治疗的)对象施用数量上足以治疗不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱的融合构建体。
术语“高度增殖紊乱”指任意不良的、异常的细胞存活(例如，未进行程序性细胞死亡或凋亡)、生长和增殖。该种疾病包括增生、非转移性和转移性赘生瘤、癌症、肿瘤和恶性肿瘤。不良的、异常细胞增殖和高度增殖紊乱可影响对象中的任意细胞、组织、器官。不良的或异常的细胞增殖和高度增殖紊乱可局部、区域或系统地存在于对象中。高度增殖紊乱可由多个组织或器官发生，该组织或器官包括但不限于乳腺、肺(例如，小细胞或非小细胞)、甲状腺、头和颈、脑、鼻咽、喉、鼻或窦、淋巴、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴腺、胃肠的(嘴、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴腺、血液、肌肉、皮肤和干细胞，其可以或不可以转移至其它次级位点、区域或位置。
本发明的融合构建体和方法还适用于任意细胞、器官或组织来源的转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤。该种紊乱可实际上影响任意细胞或组织类型，例如，癌，肉瘤，黑素瘤，神经的和网状内皮的或造血的赘生紊乱(例如，骨髓瘤，淋巴瘤或白血病)。
术语“赘生瘤”和“肿瘤”表示生长、增殖或存活大于普通的对应细胞的生长、增殖或存活的细胞或细胞群体，例如，细胞增殖或分化疾紊乱。肿瘤是形成了明显胞块和生长的赘生瘤。“癌症”和“恶性肿瘤”指可侵入临近空间、组织或器官的赘生瘤或肿瘤。“转移瘤”指从其原发位点散播或扩散至对象体内一个或多个次级位点、位置或区域的赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性肿瘤，其中该位点、位置或区域不同于原发肿瘤或癌症。
(转移性或非转移性)赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性细胞包括休眠或残留赘生瘤、肿瘤、癌症和恶性细胞。该种细胞通常由未分裂(G0-G1停滞)的残余肿瘤细胞组成。这些细胞可存留在原发位点或作为散播的赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞成为微小残留疾病。这些休眠的赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞保持为顿挫型(unsymptomatic)，但当这些休眠细胞增殖时可形成严重的症状和死亡。本发明可用于减少或抑制休眠赘生瘤、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖，这可进而抑制或减少肿瘤或癌症的方法或者肿瘤或癌症的转移或进展。
根据本发明，提供了治疗具有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的方法。在一个实施方式中，一种方法包括向(有治疗需要的)对象施用数量上足以治疗(例如，减少或抑制增殖)转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的融合构建体。
该转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤可处于任意阶段，例如，早期或晚期，例如I、II、III、IV或V阶段肿瘤。该转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤可经过预先处理或被稳定化(非进展)或缓解。
就转移性而言，本发明的方法可用于减少或抑制原发肿瘤或癌症转移至其它位点或者转移性肿瘤或癌症在远离原发性肿瘤或癌症的其它位点的形成或确立，从而抑制或减少肿瘤或癌症方法或者肿瘤或癌症进展。因此，除了其它作用，本发明的方法可1)减少或抑制潜在或者已经形成转移的肿瘤或癌症细胞(例如，散播肿瘤细胞，DTC)的生长、增殖、迁移或侵染；2)减少或抑制由原发肿瘤或癌症产生的转移瘤在不同于该原发肿瘤或癌症的位点、局部或区域的形成或确立；3)减少或抑制转移瘤形成或确立之后该转移瘤在不同于该原发肿瘤或癌症的一个或多个其它位点、局部或区域的生长或增殖；以及4)者减少或抑制该转移瘤形成或确立之后其它转移瘤的形成或确立。
转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的细胞可聚集在“实体”细胞块中或者可被分散或扩散。“实体”肿瘤指通常具体在一起并形成胞块的癌症、赘生瘤或恶性肿瘤。特定的非限制性范例包括内脏肿瘤如黑素瘤、乳腺、胰腺、子宫和卵巢癌、睾丸癌(包括精细胞瘤)、胃结肠癌、肝癌、肾上腺、直肠和膀胱癌、肺、头和颈癌以及脑肿瘤/癌症。
癌(其指上皮或内分泌腺组织的恶性肿瘤)包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示范性的癌包括由子宫、子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠、胰腺、睾丸、肾上腺、肾、食道、胃、肝和卵巢形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，例如，包括由癌和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。腺癌包括腺组织的癌，或者肿瘤形成腺状结构的癌。
肉瘤指间质细胞来源的恶性肿瘤。示范性的肉瘤包括，例如，淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤。
神经赘生瘤包括神经胶质瘤、恶性胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤和少枝胶质细胞瘤。
“液态瘤”表示具有分散或扩散性质的赘生瘤，因为它们通常不形成固体团块。特定的范例包括网状内皮组织或造血系统的赘生瘤，如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病的非限制性范例包括急性和慢性成淋巴细胞、成髓细胞白血病以及多发性骨髓瘤。通常而言，该种疾病源自于分化较差的急性白血病，例如，成红细胞白血病和急性成巨核细胞白血病。特定的骨髓疾病包括，但不限于，急性早幼粒白血病(APML)，急性骨髓性白血病(AML)以及慢性骨髓性白血病(CML)。淋巴恶性肿瘤包括，但不限于，急性成淋巴细胞白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)以及特发性巨球蛋白血症(WM)。特定的恶性淋巴瘤包括，非Hodgkin淋巴瘤及变体、周边T细胞淋巴瘤、成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、Hodgkin疾病和Reed-Sternberg疾病。
此处所披露的不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱可发生于子宫、乳腺、阴道、子宫颈和输卵管。子宫内膜异位发生于子宫的细胞生长于子宫外并进入气体区域(例如，卵巢、膀胱或肠)时。纤维瘤和息肉可影响子宫、乳腺、阴道、子宫颈和输卵管。
因此，根据本发明，提供了治疗子宫内膜异位和纤维瘤或息肉的方法。在一个实施方式中，一种方法包括向对象施用数量上足以治疗子宫内膜异位的融合构建体。在另一实施方式中，一种方法包括向对象施用数量上足以治疗纤维瘤或息肉的融合构建体。
靶细胞包括参与生殖或生育力或者生殖或生育力所需的细胞。因此，根据本发明，提供了减少动物生育力的方法。在一个实施方式中，一种方法包括向对象施用数量上足以减少生育力或减少受孕可能性或者减少雄性哺乳动物精子生成的融合构建体。
同样如此处披露，不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱可发生于前列腺。因此，根据本发明，提供了治疗良性前列腺增生或转移性前列腺赘生瘤的方法。在一个实施方式中，一种方法包括向对象施用数量上足以治疗良性前列腺增生或转移性前列腺赘生瘤的融合构建体。
任意具有抗细胞增殖活性或效果的组合物、治疗、方案、疗法或用药法可与融合构建体联用或者与本发明的方法联用。本发明的融合构建体和方法因此包括抗增殖、抗肿瘤、抗癌症、抗赘生瘤以及抗转移瘤的治疗、方案、疗法，其包括任意其它抑制、减少、阻碍、减缓、降低或防止高度增殖紊乱(例如肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的生长、进展、转移、增殖或存活或者在体外或体内恶化的组合物、治疗、方案或治疗方案。抗增殖(例如，肿瘤)疗法的特定非限制性范例包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法(电离或化学)、局部热(高热)疗法、手术切除和疫苗接种。融合构建体可施用于该抗细胞增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌、抗转移瘤或免疫增强治疗或疗法施用之前、施用同时或施用之后。融合构建体可作为与抗细胞增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌症、抗转移瘤或免疫增强治疗或疗法的组合施用，以治疗转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤。
抗增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌症和抗转移瘤组合物、疗法、计划、或治疗包括能够防止、破坏、中断、抑制或延缓细胞周期进展或细胞增殖；刺激或增强凋亡或细胞死亡，抑制核酸或蛋白合成或代谢，抑制细胞分化或减少、降低或抑制细胞存活，或必要的细胞存活因子、生长因子或信号转导途径(胞外或胞内)的生成和利用的组合物、疗法、计划或治疗。具有抗细胞增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌症和抗转移瘤活性的化学剂类别的非限制性范例包括烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷酸和核苷酸类似物。具有抗细胞增殖、抗赘生瘤、抗肿瘤、抗癌症和抗转移瘤活性的药物的特定范例包括环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物如如地西他滨(5-氮杂-2′脱氧胞苷)、阿糖胞苷、1-β-D-阿拉伯呋喃糖-5-氮胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷、博来霉素、放射菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、环己亚硝脲、司莫司汀、链脲菌素、羟脲、顺式铂氨、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉酚、长春花碱、长春新碱、阿霉素和二溴甘露醇等。
适用于融合构建体和方法的其它药剂已为本领域所知且可被采用。例如，生物制品如抗体、细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子和趋化因子可被施用。单克隆抗体的非限制性范例包括利妥昔单抗曲妥单抗(Herceptin)、贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗(Erbitux)、阿仑单抗(Campath)、帕木单抗(Vectibix)、替伊莫单抗(Zevalin)、托西莫单抗(Bexxar)等，其可特别与本发明的融合构建体联用。适于与该融合构建体联用的其它靶向药物为伊马替尼(Gleevec)、吉非替尼(Iressa)、硼替佐米(Velcade)、拉帕替尼(Tykerb)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nevaxar)、尼罗替尼(Tasigna)等。细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子、细胞因子和趋化因子的非限制性范例包括IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒细胞亲合素、嗜酸粒细胞亲合素-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1和淋巴细胞趋化因子。
额外的非限制性范例包括免疫增强治疗和疗法，其包括基于细胞的疗法。具体而言，免疫增强治疗和疗法包括施用淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树状细胞、NK细胞和B-细胞。
提供了治疗转移性或非转移性肿瘤、癌症、赘生瘤或恶性肿瘤的方法，由于患有或易患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤而有此需要的对象的治疗方法，以及提高抗增殖、抗肿瘤、抗癌症、抗赘生瘤或抗恶性肿瘤的疗法的效力或对其改进的方法。在各自的实施方式中，一种方法包括向患有或易患转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的对象施用数量上足以治疗该转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的融合构建体；向对象施用数量上足以治疗该对象的融合构建体；以及向正经历或已经经历转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤疗法的对象施用数量上足以提高该抗增殖、抗肿瘤、抗癌症、抗赘生瘤或抗恶性肿瘤疗法的效果的融合构建体。
本发明的方法可在不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱、疾病或病症开始的证据(例如，一种或多种症状)出现之前(即，预防)、同时或之后进行施用。在不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱的症状形成之前、同时或之后立即施用融合构建体可减少该对象的不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱、疾病或病症的一种或多种症状的发生、频率、严重性、进展或持续时间。此外，在不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱的一种或多种症状形成之前、同时或之后立即施用融合构建体可抑制、减少或防止高度增殖细胞(例如，转移瘤)扩散或散播至对象体内其它位点、区域、组织或器官或者高度增殖细胞(例如，转移瘤)在对象体内其它位点、区域、组织中形成。
本发明的融合构建体和方法(例如治疗方法)可向对象提供可检测或可测量治疗效果或改进。治疗效果或改进是任意可测量或可检测的、客观的或主观的、瞬时的、临时的、或者更长期的对对象的效果或对对象的组织、器官、细胞或细胞群中任意程度的状况、紊乱或疾病、有害症状、后果或基本病因的改进。治疗效果和改进包括，但不限于，减少或降低与紊乱、疾病或病症相关的一种或多种症状或并发症的发作、频率、严重性、进展或期限，或者减少或降低紊乱、疾病或病症的发病原因或后续作用。本发明的融合构建体和方法因而包括向对象提供治疗效果和改进。
在治疗效果和改进作为期望的结果的本发明的一种方法中，本发明的融合构建体可以充分量或有效量施用至需要的对象。“充分量”或“有效量”指以单独或多重剂量、单用或与一种或多种其它组合物(治疗剂，例如化疗或免疫刺激药物)、治疗、计划或治疗方案联用时，可向对象提供任意时间长度(长期或短期)的可测应答、任意可测量或可检测程度的或是任意时间长度(例如，持续小时、天、月、年或治愈)的预期结果或效果的数量。用于治疗(例如，提供治疗效果或改进)的剂量或“充分量”或“有效量”通常能够以可测量的程度有效改善紊乱、疾病或病症，或者该紊乱、疾病或病症的一种、多种或所有的有害症状、后果或并发症，尽管减少或阻止该紊乱、疾病或病症或症状的进展或恶化被认为是理想结果。
术语“改善”表示对于对象病症的可检测的客观或主观改进。可检测的改进包括由紊乱、疾病或病症引起或与之相关的症状的发作、频率、严重性、进展或期限的主观或客观上的减少，对疾病、疾病或病症的发病原因或后果的改进，或者紊乱、疾病或病症的取消。
因此治疗可导致紊乱、疾病或病症，或者相关的症状或后果，或者发病原因的抑制、减少或防止；紊乱、疾病、病症、症状或后果的进展或恶化，或者该紊乱的一种或多种其它症状、疾病状况或症状的进一步恶化或发作的抑制、减少或防止。因此，成功的治疗结果导致“治疗作用”或“效果”或者抑制、减少或防止对对象体内一种或多种症状的发作、频率、严重性、进展或期限，或者病症、紊乱、疾病或症状的发病原因或后果。因此，可影响该病症、紊乱、疾病或症状的一种或多种发病原因的治疗方法被认为是有益的。对紊乱或病症的进展或恶化的稳定或抑制同样是成功的治疗结果。
因此治疗效果或改进不需要完全消除与病症、紊乱或疾病相关的任意一种、多数或所有症状、并发症、后果或发病原因。因此，当对于对象的症状有了改进，或者在较短或较长的时间期限内(小时、天、周、月等)一种或多种相关有害症状或并发症或后果或发病原因的发作、频率、严重性、进展或期限有了部分减少，或者该紊乱或疾病的一种或多种生理、生化或细胞表现或特征的恶化或进展有了部分减少(例如，稳定该病症、紊乱或疾病的一种或多种症状或并发症)时，便达到了令人满意的终点。
在特定的实施方式中，治疗方法导致转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤细胞量、体积、大小或细胞数量的部分或完全破坏；导致刺激、诱导或提高转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤细胞坏死、溶解或凋亡；导致减少转移性和非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤体积大小、细胞量；导致抑制或防止高度增殖细胞(例如转移瘤)扩散或散播至对象体内其它(次级)位点、区域、组织或器官或者高度增殖细胞(例如，转移瘤)在对象体内其它(次级)位点、区域、组织或器官的确立；或导致延长对象寿命。除了特定的实施方式之外，一种治疗方法导致减少或降低了与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤相关或由其因引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率。
充分量或有效量不需要在单次施用中提供，并且可以(但非必须)单用或与另一组合物(例如，化疗或免疫增强或刺激药剂)、治疗、计划或治疗方案联用。例如，该数量可根据该对象、紊乱的状态、所治疗的疾病或病症或者待治疗的副作用的需求相应增加。此外，如果在没有第二组合物(例如，化疗或免疫刺激药剂)、治疗、计划或治疗方案时以单剂量或多剂量给用时，充分量或有效量不需要充分或有效，因为还可在该剂量之外采用附加的剂量、数量或期限，或者可包含附加组合物(例如，化疗或免疫刺激药剂)、治疗、计划或治疗方案以达到对给定对象的充分和有效。认为充分的数量还包括导致另一治疗、治疗方案或计划的使用减少的数量。
充分量或有效量无需对每一个治疗对象有预防或治疗效果，或对给定组或群内大部分治疗对象有效。在治疗方法中常见的是，部分对象对给定的治疗、治疗方案或计划显示出更大或更小的应答。充分量或有效量指对特定对象充分或有效，而非对组或一般群充分或有效。该种数量将部分依赖于待治疗的病症，例如不良的或异常的细胞增殖或高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的类型和阶段，预期的治疗效果，以及个体对象(例如，该对象的生物利用度、性别、年龄等)。
不良或异常细胞增殖如高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的治疗效果或改进的特定非限制性范例包括细胞大小、量或体积的减小，细胞大小、量或体积的抑制，恶化或进展的减缓或抑制，刺激细胞坏死、溶解或凋亡，减少或抑制赘生瘤或重量、恶性肿瘤或转移瘤，减少死亡率，以及延长对象寿命。因此，尽管没有形成对转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的完全消除，但抑制或减缓大小、量、体积或转移的上升(稳定化)可增加寿命(减少死亡率)，即使只有数天、数周或数月。可以减少或降低的与高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)相关的不良症状或并发症包括，例如，疼痛、恶心、不适、食欲不振、嗜睡和虚弱。对不良的或异常的细胞增殖，例如高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的症状的发作、频率、严重性、进展或持续时间的减少，例如，对主管感受的改进(例如，精神、食欲的改善，恶心的减少，活动能力或心理健康的改善等)均为治疗效果或改进的范例。
例如，如果施用可导致对不良或异常细胞增殖如高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的治疗所需的化学治疗药物、放射或免疫疗法更少，融合构建体的重复或有效量被认为具有治疗效果。
术语“对象”指动物，通常为哺乳动物，例如人，非人灵长动物(猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)，驯养动物(狗和猫)，畜牧动物(马、牛、山羊、绵羊、猪)，实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。对象包括动物疾病模型，例如，用于体内融合构建体分析的不良的或异常的细胞增殖如高度增殖紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的动物模型。
适于治疗的对象包括具有或者易具有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤细胞，正经历或者曾经历抗增殖(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)疗法的对象，包括缓解中的对象。“易患”对象通常具有与不良或异常细胞增殖、增生的形成(例如，肿瘤)相关的风险因素。
具有风险或候选对象的特定范例包括具有表达融合构建体可结合的受体、配体、抗原或抗体的细胞的对象，特别地靶向坏死、溶解、杀死或破坏的细胞比非靶细胞表达更高数量或量的受体、配体、抗原或抗体。该种细胞可选择性或优选地靶向坏死、溶解或杀死。
具有风险的对象还包括候选进行或正进行手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的对象。本发明因而适用于治疗易患转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤或者与转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤相关的并发症(例如，由于转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤在一个稳定或缓解时期后重新出现或者重新生长)的对象。
风险因素包括年龄、生活习惯(饮食，吸烟)、职业(医疗和临床人员，农业和畜业工作者)、环境因素(致癌物质暴露)、家族史(自身免疫疾病，糖尿病等)、遗传倾向等。例如，易患黑色素瘤的对象的风险因素包括过量日光照射(紫外辐射)、白皮肤、痣数量过多(发育不良痣)、患者显型、家族史或之前的黑色素瘤史。因此，易患癌症的对象可通过生物习惯、职业、环境因素、家族史以及肿瘤相关基因、基因删除或基因突变的筛选得以鉴别。例如，易患乳腺癌的对象缺失Brcal。易患结肠癌的对象具有幼年或高频率的鼻息肉形成，或者删除或突变的肿瘤抑制基因，例如腺瘤性结肠息肉病(APC)基因。
对象还包括被其它治疗排除的对象。例如，特定的对象可以不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的良好候选者。因此，根据本发明的治疗的候选对象包括并非手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种候选者的对象。
融合构建体可配制为单位剂量或单位剂型。在特定的实施方式中，融合构建体的数量可有效治疗患有不良或异常细胞增殖或高度增殖紊乱的对象。在附加的特定实施方式中，融合构建体的量可有效治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的对象。在进一步特定的实施方式中，融合构建体的量可有效减少对象生育力。示范性的单位剂量的范围为25-250、250-500、500-1000、1000-2500or2500-5000、5000-25,000、5000-50,000ng；andfromabout25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg。
本发明的组合物和方法可在体外、间接体外或体内接触或提供。组合物可作为单独或多重剂量(例如，以有效或充分量)施用以提供目标作用。在连续数天、隔天或间歇性施用的示范性剂量的范围为约25-250、250-500、500-1000、1000-2500或2500-5000、5000-25,000、5000-50,000pg/kg；从约50-500、500-5000、5000-25,000或25,000-50,000ng/kg；以及从约25-250、250-500、500-1000、1000-2500or2500-5000、5000-25,000、5000-50,000μg/kg。单独或多重剂量可连续数天、隔天或间歇地施用。
可通过全身、区域或局部施用等任何途径施用该组合物和实施该方法。例如，融合构建体可全身、区域或局部、静脉、口服(例如，摄取或吸入)、肌肉、腹膜、皮内、皮下、腔内、颅内、透皮(局部)、肠胃外(例如经粘膜或经直肠)施用。本发明的组合物和方法包括可通过(微)胶囊化传递系统施用或装填进入移植物进行施用的药物制剂。
本发明进一步提供了融合构建体和方法，其中该融合构建体包含在药物组合物中。药物组合物指“药学可接受的”和“生理可接受”的载体、稀释剂或赋形剂。此处所用的术语“药学可接受的”和“生理可接受的”在涉及载体、稀释剂或赋形剂时包括与药物施用以及与该制剂中其它成分相容的溶剂(水性或非水性)、清洁剂、溶液、乳液、分散介质、涂层、等张剂和吸收促进或延缓剂。该种制剂可包含在片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬或软)、微粒、乳剂、粉末、颗粒、晶体、悬浮剂、糖浆或酏剂。
药物组合物可制成与特定施用途径相容的剂型。用于肠胃外、皮内或皮下施用的组合物可包含无菌稀释剂，例如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂。该制剂可包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长(例如，苯甲醇或羟苯甲酸甲酯等抗菌剂；抗坏血酸或重亚硫酸钠等抗氧化剂；乙二铵四醋酸等螯合剂；醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐等缓冲液以及氯化钠或右旋糖等调节张力的试剂)。
适于注射的药物组合物包括无菌水溶液(具有水溶性时)或分散体以及用于临时制备无菌水溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。该载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如，丙三醇、丙二醇、以及聚乙二醇)及其适当的混合物。可通过，例如，采用卵磷脂等涂层或使用表面活性剂来保持流动性。抗菌剂和抗真菌剂包括，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。包括延缓吸收的药剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可延长可注射组合物的吸收。
其它药物制剂和传递系统已为本领域所知并适用于本发明的方法(参见，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences(1990)18thed.，MackPublishingCo.，Easton，PA；TheMerckIndex(1996)12thed.，MerckPublishingGroup，Whitehouse，NJ；PharmaceuticalPrinciplesof SolidDosageForms，TechnonicPublishingCo.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993)；andPoznansky,等人，DrugDeliverySystems，R.L.Juliano，ed.，Oxford，N.Y.(1980)，pp.253-315)。
本发明提供了包括本发明融合构建体，其联合组合物以及药物制剂并用适当包装材料进行包装的试剂盒。试剂盒可选择性包含带有成分描述或者对其中成分的体外、体内或间接体内的使用的说明的标签或包装插页。示范性的说明书包括对以下方法的说明：减少或抑制细胞的增殖，减少或抑制不良或异常细胞(例如高度增殖细胞)的增殖，减少或抑制转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤细胞的增殖，治疗患有高度增殖紊乱的对象，治疗患有转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤的对象或者减少动物的生育力。
试剂盒可包含该种成分的集合，例如，两种或多种单独的融合构建体或与其它治疗用途组合物(例如，抗增殖或免疫增强药物)的组合。
术语“包装材料”指包容该试剂盒的成分的物理结构。该包装材料可维持该成分无菌，并可用常用于该种目的的材料(例如，纸，波纹纤维，玻璃，塑料，箔，安瓿，小瓶，管等)制作。
本发明的试剂盒可包含标签或插页。标签或插页包括“印刷品”，例如，单独或粘帖至成分、试剂盒或包装材料(例如，箱子)，或贴在包含试剂盒成分的安瓿、管子或小瓶的纸张或纸板。标签或插页可进一步包括计算机可读介质，例如磁碟(例如，软盘，硬盘，ZIP盘)，如CD-或DVD-ROM/RAM，DVD，MP3等光碟，磁带，或RAM和ROM等电子存储介质或其复合体，如磁/光存储介质，FLASH介质或记忆类型卡。
标签或插页还可包括其中一种或多种成分的鉴别信息，剂量，活性成分的临床药理学(包括作用机制，药代动力学和药效学)。标签或插页可包括生产商信息，批次，生产商地址以及日期的识别信息。
标签和插页可包含有关试剂盒成分可能针对的病症、紊乱或疾病或症状的信息。标签和插页可包含针对临床医师或对象在方法、治疗计划或治疗方案中使用一种或多种试剂盒成分的说明。说明可包括剂量、频率或期限，以及实施此处所述的任意方法、治疗计划或治疗方案的说明。示范性的说明包括对治疗不良或异常细胞增殖、高度增殖细胞和紊乱(例如，转移性或非转移性肿瘤、癌症、恶性肿瘤或赘生瘤)的说明。因此本发明的试剂盒可进一步包括针对实施本发明所述的任意方法(包括治疗方法)的标签或说明。
标签或插页可包括试剂盒成分可能提供的任意效果(例如，预防性或治疗性效果)的信息。标签或插页可包括有关潜在有害副作用的信息，例如对临床医生或对象有关不适于使用特定组合物的情形的警示。不良副作用还可能在该对象曾经，将要或正在采用一种或多种可能与该组合物不相容的其它药物时出现，或在该对象曾经，将要或正在接受与该组合物不相容的其它治疗方案时出现，因此，该说明可包括有关该种不相容性的信息。
本发明的试剂盒可进一步包含其它成分。该试剂盒的各个成分可封入单独的容器中，且所有不同的容器包含在单个包装中。本发明的试剂盒可冷冻保存。本发明的试剂盒可进一步设计为包含表达本发明的融合构建体或包含编码融合构建体的宿主细胞。该试剂盒中的该细胞可保存在适当的贮存条件下，直至该细胞即将被使用。例如，含有一种或多种细胞的试剂盒可包含适当的细胞贮存培养基，从而使该细胞可被融解和生长。
除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用于对本发明的实施或测试，此处描述了适用的方法和材料。
此处引用的所有应用，出版物，专利及其它参考文献，GenBank引文以及ATCC引文均在此全文引用作为参考。在产生冲突的情况下，将受本说明书包括定义所支配。
除非上下文另行明确指出，此处所用的单数形式的“一种”、“一个”和“该”包括复数含义。因此，例如，“融合构建体”或“溶解结构域”包括了复数个该种融合构建体或溶解结构域，以此类推。
除非上下文另行明确指出，此处所用的所有数值或数值范围包括该范围内的整数以及该值或该范围内整数的分数。因此，例如，90-100％的范围包括91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等，并依次类推。
此处一般披露的本发明采用肯定性的语言描述多个实施方式。本发明还特别包括了完全或部分排除特定对象(例如，物质或材料、方法步骤和条件、计划、步骤、测定或分析)的实施方式。因此，尽管本发明一般不以本发明包括什么来进行表示，本发明未明确排除的方面仍然在此披露。
本发明的一系列实施方式已得到描述。然而，应当理解：可在不脱离本发明的精神和范围的基础上进行各种改动。相应地，下列实施例目的在于阐述，而非限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
初始的研究包括体外筛选28种溶解结构域肽，其在溶解肽部分和配体之间包含不同的铰链序列；其包含30％的D氨基酸(D-对映异构体)，溶解肽部分为18和15个氨基酸的长度，且包含铰链序列或其D-对映异构体。研究了在21、18和15氨基酸Phor21类似物上引入作为间隔子的α-氨基己酸。为进行研究所选择的配体包括βCG-ala(来自绒毛膜促性腺激素的β链的结合部分的15个氨基酸片段)和LHRH(代表全功能配体的十肽)。
实施例2
本实施例描述了采用人乳腺癌细胞系筛选细胞毒性(IC50)和溶血活性。
对十八种βCG-ala和八种LHRH结合的融合构建体进行了研究，并与Phor21-βCG-ala和未结合的Phor21和Phor18(338913)＝CLIP71肽进行比较。过量表达绒毛膜促性腺激素(CG)和促黄体激素-释放激素(LHRH)受体的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435S.luc在传代数248-252时被用于筛选。该MDA-MB-435S.luc细胞系可从由美国菌种保藏中心获得的MDA-MB-435S细胞系通过以包含美洲萤火虫萤光素酶基因和抗体耐受基因的PRC/CMV-luc质粒通过脂质转染法稳定转化构建得到。稳定转染的细胞系可采用G418进行选择，对具有最高荧光素酶基因表达的克隆测试LH和LHRH受体表达。
MDA-MB-435S.luc细胞生长于Leibovitz’sL15培养基，10％胎牛血清，0.01mg/ml牛胰岛素，100IU/ml盘尼西林，100微克/ml链霉素。该细胞培养于密闭烧瓶中。孵育以10,000细胞/微孔采用96孔板进行。细胞通常被接种至96孔板，并在孵育48小时后替换培养基。每次测定在0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10和100微摩尔剂量的溶解肽-结合结构域结合物的升高浓度下进行。每种溶解肽-结合结构域结合物以冻干形式提供，新鲜溶解于盐水中并添加至细胞。孵育的时间通常为24小时，通过甲簪(formazan)转化测定(MTT测定)进行细胞活性测定。分别包含盐水或0.1％triton的对照作为0和100％细胞死亡的参考。
数据采用GraphPadPrizm4TM软件(GraphPadPrizm，Inc)进行处理和分析。通过双尾学生T-检验确定统计学分析的显著性。进行每个研究以使N至少为8。
增加融合构建体长度的作用被确定(Javadpour等人，JMedChem39：3107(1996)；Javadpour和Barkeley，Biochemistry36：9540(1997)；Leuschner和Hansel，CurrentPharmaceuticalDesign，10：2299(2004)；以及Leuschner和Hansel，BiolReprod73：255(2005))。在C末端结合至βCG-ala的溶解肽随着构建体长度的增加毒性增强。各种长度的肽的IC50为：14氨基酸(Phor14)5.74，15氨基酸(Phor15)1.92，18氨基酸(Phor18＝CLIP71)1.09，21氨基酸(Phor21)2.31和28氨基酸(Phor28)1.36μM(表3)。
结合部分的位置(N-或C-末端)的作用被确定。简言之，对Phor21-βCG-ala(C-末端)、βCG-alaPhor21(N-末端)、LHRH-Phor21(N-末端)和Phor21-LHRH(C-末端)融合构建体进行了研究。这些肽的IC50为：Phor21-βCG-ala2.3μM，βCG-ala-Phor214.7μM，LHRH-Phor212.65μM，Phor21-LHRH1.71μM。数据显示βCG-ala和LHRH结合部分的C-末端定位比结合部分的N-末端定位显示了更大的毒性。
LHRH-受体存在于许多人癌症中(参见表1)。对LHRH作为结合部分和βCG-ala作为结合部分的活性进行了比较。
在人MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞体外孵育2或24小时对LHRH-Phor21和Phor21-βCG-ala的毒性进行了比较。数据表示LHRH-Phor21比Phor21-βCG-ala更快杀死细胞，LHRH-Phor21在2小时内诱发细胞杀死(图1)。
表1：人癌症的LH和LHRH受体
癌症类型 LH受体 LHRH-受体
乳腺 72％ 52％
前列腺 100％ 86％
卵巢 40％ 80％
子宫内膜 17％ 80％
胰腺 未测得 68％
肺 是 未测得
黑素瘤 68％ 是
脑 未测得 是
结肠 未测得 是
口腔 未测得 是
在溶解结构域和结合部分之间引入铰链、间隔子或接头序列可导致比Phor21-βCG-ala在细胞杀死方面更具效力的肽。(图2，表2)。然而在Phor21-βCG-ala融合构建体中引入铰链序列或间隔子不明显改变细胞杀死活性，作为铰链序列的ASAAS明显增加了βCG-结合物的具有15个氨基酸的溶解肽；这种作用在βCG和LHRH结合的肽Phor18-LHRH和Phor18-ASAAS-LHRH的情况下不存在，其在体外同等有效(图2，表4)。当铰链序列被6碳间隔子α氨基己酸所取代时，可观察到类似的作用(表2)。在第二铰链序列(GSGGS)中以甘氨酸替换丙氨酸可导致明显更低的活性，提示甘氨酸可能具有螺旋松解作用。(图2，表2)。
表2：βCG-ala结合肽的肽长度的作用
LHRH-结合肽
为了确定D-氨基酸替换的作用，融合构建体Phor21-βCG-ala被合成为D-对映异构体(下文称为D-ala-Phor21-βCG-ala)。该融合构建体在体外对MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞显示了相当的毒性(Phor21-βCG-ala2.31μM，D-ala-Phor21-βCG-ala2.15μM(表3)；D-ala-Phor18-βCG-ala的效力是Phor21-βCG-ala(IC501.6μM)的1.4倍，该LHRH对应物在作为D-对映异构体(Phor21-LHRH(IC501.31μM))时比D-ala-Phor21-LHRH(IC500.75μM)，D-Phor18-LHRH(IC501.42μM)和Phor18-柳菩林(IC501.95μM)更具效力。
βCG-ala和LHRH-结合的溶解肽在MDA-MB-435S.luc乳腺癌细胞中的IC50值总结于表3和图3。简言之，比Phor21-βCG-ala(2.31±0.16)具有明显更低IC50的肽为：Phor28-βCG-ala(1.36±0.09μM；p＜0.0001)，Phor15-ASAAS-βCG-ala(1.48±0.24μM；p＜0.005)，Phor15-C6-βCG-ala(1.31±0.17μM；p＜0.004)(C6＝6氨基己酸)，Phor18-βCG-ala(1.09±0.17μM；p＜0.0001)，Phor21-LHRH(1.31±0.1μM；p＜0.0001)，D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.1μM；p＜0.0001)，Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.12μM；p＜0.0001)，Phor18-LHRH(0.87±0.11μM；p＜0.0001)，(KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21μM；p＜0.0004)和D-ala-Phor18-LHRH(1.42±0.08μM；p＜0.004)。
LHRH融合构建体总体而言比βCG-ala融合构建体更具效力(毒性更大和作用更快，图1)。简言之，Phor21-LHRH、D-ala-Phor21-LHRH、Phor18-ASAAS-LHRH、Phor18-LHRH和肽对照338614((KKKFAFA)3＝无活性肽)比Phor21-βCG-ala对人乳腺癌细胞明显更具毒性(p＜0.003)。所有的LHRH融合构建体大约同等有效，除了在结合部分相对溶解部分处于C末端时效力明显更低的LHRH-Phor21。D-ala-Phor18-LHRH与Phor21-LHRH相比同等有效；Phor18-柳菩林毒性更低，但与Phor21-βCG-ala相当(图4，表3；柳菩林为QHWSY(D-Leu)LRPNEt)。
比Phor21-LHRH(1.34±0.1μM)具有明显更低IC50值的融合构建体为：D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.12μM；p＜0.002)、Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.11μM；p＜0.0001)、Phor18-LHRH(0.87±0.12μM；p＜0.004)以及(KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21μM；p＜0.04)。当相同的融合构建体在βCG-ala和LHRH结合部分之间进行比较时，在所有情况下LHRH融合构建体比它们的βCG-ala对应物明显更具毒性。
表3：细胞溶解肽和肽结合物-MDA-MB-435S.luc细胞中的IC50和HA50特征综述
与Phor21-βCG-ala(323033)相比的显著性***p＜0.0005，**p＜0.005，*p＜0.05
对包括Phor18-柳菩林和D-ala-Phor18-LHRH的21种融合构建体的急性溶血活性进行了研究。结果总结于图5和6以及表3。
采用暴露至0.5％人RBC的系列稀释的肽在96孔板中测定溶血活性。对照为盐水(无RBC死亡)和0.1％TritonX100(100％RBC溶解)。肽浓度在0-100μM范围内。孵育进行2小时。
为了确定各种融合构建体相比顺铂在不同人癌细胞系上的IC50，在表3中评估融合构建体的IC50。结果显示如下：
在人癌细胞系中相比顺铂的IC50[μM]
细胞系顺铂Phor18-LHD-ala-Phor1Phor18-βC3D-ala-Phor
RH8-LHRH18βCG-ala
MDA-MB未测定0.86±0.161.42±0.081.35±0.151.6±0.16
-435S.luc
MDA-MBHCT5.5±1.233.7±6.76.1±0.620.5±7.2
-231
AN3-CA11.85±0.13.8±0.0840.6±0.1522.15±0.1636.8±0.16
6
OVCAR-3184±0.163±0.513.8±0.38.8±0.411.6±0.3
SKOV-3321±1011.8±0.319.2±0.210.9±0.618.9±0.4
LNCaP19.9±1.41.55±0.085.0±01510.05±0.1615.5±0.16
乳腺癌细胞系：MDA-MB-435S.luc，MDA-MB-231
卵巢癌细胞系：OVCAR-3，SKOV-3
前列腺癌细胞系：LNCaP
子宫内膜癌细胞系：AN3-CA
除了Phor21-LHRH、LHRH-Phor21和Phor18-柳菩林之外，该数据总体显示了对所研究融合构建体极低的溶血活性。在类似的条件下，如下融合构建体不显示任何溶血活性(见图5)：Phor15-氨基己酸-β-CG-ala(337474)，D-ala-Phor21β-CG-ala(337481)＞150,000μM，Phor21，未结合的Phor18＝CLIP71，(KKKFAFA)3-βCG-ala，Phor21(338982)，Phor18＝CLIP71(338983)，D-ala-Phor18-LHRH(339385)以及(KKKFAFA)3-LHRH(338984)。D-氨基酸对映异构体没有可测得的溶血活性。
溶血活性＜50μM的融合构建体如下：Phor21-LHRH(25μM)，LHRH-Phor21(33μM)和Phor18-柳菩林(21μM)。
溶血活性＞100μM的融合构建体如下：Phor18-β-CG-ala(337476)和Phor18-LHRH(338613)。
溶血活性介于50-100μM的融合构建体如下：(KKKFAFA)3-LHRH(95μM)、Phor21-βCG-ala和Phor21-ASAAS-βCG-ala具有类似的HA50(70μM)。
溶血活性介于400-1300μM的融合构建体如下：Phor14-βCG-ala(337464)，Phor18GSGGSβ-CG-ala(337467)，Phor18ASAASβ-CG-ala，(337470)，Phor15ASAASβ-CG-ala(337471)，D-ala-Phor21-LHRH(338611)和Phor18-ASAAS-LHRH(338612)。
临床上的一个重要标准是细胞毒性(IC50)和溶血活性(HA50)的比例或者IC50/HA50(图6，表3)。采用10μM融合构建体的最大浓度进行体内研究，该浓度比大多数融合构建体测得的HA50值低数倍。
D-ala-Phor21、Phor18-ASAAS、D-ala-Phor18和Phor18的LHRH-结合物具有0.001-0.006的极低IC50/HA50比例(与Phor21-βCG-ala的0.03相比)。对MDA-MB-435S.luc细胞的毒性明显高于Phor21-βCG-ala：D-ala)Phor21-LHRH的毒性比Phor21-βCG-ala高3倍，Phor18-LHRH和Phor18-ASAAS-LHRH的效力高2倍，D-ala-Phor18-LHRH的效力高1.5倍。
综上，通过更高毒性和更低溶血活性(IC50/HA50比例)的标准评估的融合构建体为：Phor18-βCG-ala，Phor18-ASAAS-βCG-ala，Phor15-ASAAS-βCG-ala，Phor15-C6-βCG-ala，D-ala-Phor21-LHRH，Phor18-LHRH，Phor18-ASAAS-LHRH和D-ala-Phor18-LHRH。
实施例3
本实施例描述了以不同类型和剂量的βCG-和LHRH-融合构建体对小鼠乳腺癌异种移植模型的体内研究。
用MDA-MB-435S.luc/MatrigelHC悬浮液(1x106细胞)对雌性Nu/Nu小鼠皮下注射。治疗计划显示于图7。简言之，治疗开始于肿瘤注射后13天，并在第19天和25天继续。治疗为：盐水对照，Phor21(5mg/kg)，Phor18(5mg/kg)，(KKKFAFA)3肽-βCG-ala(5mg/kg)，Phor21-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，Phor18-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，D-ala-Phor21-βCG-ala(0.01、1和5mg/kg)，基线每组8-12小鼠，14组。每周注射的剂量为5、1和0.01mg/kg体重，通过单次弹丸注射给药。
所有组的小鼠对注射耐受良好。每次以5mg/kg的剂量注射337476时，仅有一只小鼠死亡。死亡为急性事件。在其它治疗组的所有小鼠均存活。在注射后10分钟，没有小鼠因注射而死亡。
细胞溶解肽对原发性肿瘤的作用显示于图8。简言之，图8A-8C显示了对每种单独的肽的研究过程中的肿瘤体积。图8D-8G显示了尸检时的肿瘤特征：肿瘤体积(D)、肿瘤重量(E)、活肿瘤细胞(F)、肿瘤状态(G)。
治疗效力计算为在治疗开始的测量值相比研究末期的测量值之间的差异(图8H-8I)。图8J显示了尸检时的小鼠体重。肿瘤中细胞的成活力可通过研究末期对肿瘤测量萤光素酶活性时进行测定。
在所有以含βCG作为配体(II，A)的肽治疗的动物中肿瘤体积与基线相比明显下降(除了0.01mg/kg323033和(KKKFAFA)3-βCG-ala、Phor21和未结合的Phor18＝CLIP71对照)(p＜0.05)。除了对于减少异种移植物体积无效的(KKKFAFA)3-βCG-ala、Phor21和Phor18，所有治疗组中的肿瘤体积相比盐水对照明显减少。
与采用盐水或(KKKFAFA)3肽治疗的动物相比，所有采用βCG结合肽的治疗组的肿瘤重量也明显下降(p＜0.001)。通过萤光素酶活性测量的肿瘤细胞成活力与所观察到的肿瘤重量和肿瘤体积的变化密切关联。
以肿瘤重量或活肿瘤细胞相对于基线值的减少表示的治疗效力显示了对323033和337476的浓度依赖性治疗响应。337481在0.01、1和5mg/kg剂量下显示了对肿瘤负荷和活肿瘤细胞的持续减少。323033在1mg/kg剂量下相比5mg/kg最有效(我们已在之前的实验中观察到这一点)，但仅在应用最低剂量时明显不同于盐水对照。融合构建体337476和337481在5和0.01mg/kg下相比323033(p＜0.0001)可明显更有效地减少肿瘤负荷和活肿瘤细胞(p＜0.004)至基线值以下。融合构建体337481未显示浓度依赖性，并且是所有测试构建体中最为有效的。
在以融合构建体337476和337481治疗的小鼠中发现了囊性瘤，其发生率为80-90％，但在1mg/kg323033治疗组仅有30％。(在该异种移植模型中未见囊形成。这些囊由液体填充的包膜组成)。尽管尚不明确，已经推断囊性瘤出现于快速生长肿瘤中细胞被迅速杀死时。囊存在于用Phor21治疗的前列腺中异种移植物中。
治疗组的血液化学和完全血液计数揭示未有治疗影响肝、肾、心脏功能。血小板计数、WBC和RBC计数在正常范围内，表明该治疗剂量特异性杀死肿瘤细胞，且未在所给浓度下导致贫血，也未影响任意其它可观察的重要身体功能。该融合构建体耐受良好，没有长期副作用。
基于前述体内肿瘤效力数据，Phor18-βCG-ala(337476)和D-ala-Phor21-βCG-ala(337481)在相对基线值减少肿瘤重量(p＜0.0001)和破坏活肿瘤细胞(p＜0.004)方面比参考Phor21-βCG-ala(323033)明显更具效力。两种融合构建体在所用的最高剂量(5mg/kg)下均未在体内引起溶血，且未显示持续副作用。有可能Phor18-βCG-ala的肿瘤效力通过多次注射(即使在最低剂量)时会更大。
对于LHRH融合构建体，采用了小鼠乳腺癌异种移植模型。简言之，用MDA-MB-435S.luc/Matrigel悬浮液(1x106细胞)皮下注射远亲杂交品系的5周大雌性小鼠(CharlesRiver)。治疗起始于肿瘤细胞注射后21天，并在第26和29天继续。每周注射的融合构建体剂量为2、0.2和0.02mg/kg体重，通过单次弹丸注射给药。所有小鼠在肿瘤细胞注射后34天进行尸检-肿瘤重量的基线值可通过在治疗起始处死8只小鼠获得。采集原代肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾，并于福尔马林中准备进行组织学评估。在尸检时记录肿瘤重量，将肿瘤的一部分在-80℃下冷冻以供萤光素酶测定。
治疗组包括盐水对照，Phor21-βCG-ala-323033(0.02、0.2和2mg/kg)，D-ala-Phor21-LHRH-338611(0.02、0.2和2mg/kg)，(KKKFAFA)3LHRH-338614(5mg/kg)，Phor18-LHRH-338613(0.02，0.2和2mg/kg)，Phor18-ASAAS-LHRH-338612(0.02、0.2和2mg/kg)，D-ala-Phor18-LHRH-339385(0.02、0.2和2mg/kg)，andPhor18-柳菩林-339347(0.02、0.2和2mg/kg)，基线12小鼠/组。
所有组对注射耐受良好。在第二和第三次以2mg/kg剂量的Phor18-ASAAS-LHRH注射期间仅有两只小鼠死亡(这两支小鼠来自同一笼子)。死亡为急性事件。在其它治疗组的所有小鼠均存活。在注射后10分钟，没有小鼠因注射而死亡。
图9概括了在每个单独的构建体的研究过程中测定的体积体现的融合构建体注射对原发肿瘤的作用。除了以(KKKFAFA)3-LHRH结合物或以盐水对照(观察到指数肿瘤生长)治疗的小鼠以外，所有组中肿瘤体积均在治疗过程中减少。所有构建体在治疗后30天记录的肿瘤体积显示了相对基线的减少(p＜0.01)，其中在Phor18-ASAAS-LHRH和Phor18-LHRH的治疗组中记录了最小肿瘤体积。
尸检时的肿瘤特征综述于图10：(A)肿瘤重量，(B)肿瘤重量相对基线的变化，(C)活肿瘤细胞总数，(D)总活肿瘤细胞相对于基线的变化，以及(E)基线和尸检时的体重。肿瘤细胞的成活力可通过研究末期对肿瘤测量萤光素酶活性时进行测定。治疗效力计算为在治疗开始的测量值相比研究末期的测量值之间的差异(图10B和10D)。
所有治疗组的所有动物的肿瘤重量和活肿瘤细胞总数均相对生理盐水对照和(KKKFAFA)3-LHRH结合肽明显下降(p＜0.0001)，即使以最低剂量0.02mg/kgLHRH结合物给药也是如此。在所有以2mg/kg含LHRH肽以及0.02、0.2和2mg/kg的D-ala-Phor18-LHRH(A)治疗的动物中总肿瘤重量均相对基线明显下降(p＜0.05)。
如下浓度导致与基线类似的肿瘤重量：Phor21-βCG-ala-323033)(0.02mg/kg(p＜0.07)和0.2(p＜0.06))；Phor18-柳菩林(0.2和0.02mg/kg剂量)，Phor18-LHRH(0.2mg/kg)以及D-ala-Phor21-LHRH(0.2mg/kg)。在与0.02mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala比较总肿瘤重量时，Phor18-ASAAS-LHRH和D-alaPhor18-LHRH在0.02mg/kg的剂量下更优(p＜0.05)。
测定活肿瘤细胞数量，并作为活肿瘤细胞总数绘于图10C中，且作为相对基线的活肿瘤细胞变化绘于图10D中。通过萤光素酶活性测量的细胞成活力与观察到的肿瘤重量和肿瘤体积相关，除了观察到活肿瘤细胞减少的Phor18-ASAAS-LHRH和Phor18-LHRH。用D-ala-Phor18-LHRH(339385)和Phor18-ASAAS-LHRH(338612)治疗优于2mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala(p＜0.04)。
以与基线相比肿瘤重量或活肿瘤细胞减少表示的治疗效力显示了对所有融合构建体的浓度依赖性治疗响应，除了D-ala-Phor21-LHRH在肿瘤重量和活肿瘤细胞上有所不同。D-ala-Phor18-LHRH在0.02、2和2mg/kg剂量下显示了肿瘤重量和活肿瘤细胞的持续减少。在本实验中在减少活肿瘤细胞数量和肿瘤重量上最有效的融合构建体为2mg/kg的Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)。Phor18-ASAAS-LHRH和D-ala-Phor18-LHRH相对于2和0.02mg/kg剂量的Phor21-βCG-ala更佳(p＜0.05)。Phor18-柳菩林在减少肿瘤重量和活肿瘤细胞方面的效果最差。
治疗组的血液化学和完全血液计数揭示未有治疗影响肝、肾、心脏功能。血小板计数、WBC和RBC计数在正常范围内，表明该治疗剂量特异性破坏肿瘤，且未在所给浓度下导致贫血，也未影响任意其它可观察的重要身体功能。在用Phor18-柳菩林、Phor18-LHRH和D-ala-Phor21-LHRH注射的小鼠中观察到钾浓度相对盐水对照提高1.5倍。该融合构建体耐受良好，没有长期副作用。
基于前述体内肿瘤效力数据，Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)在相对基线值减少肿瘤重量(p＜0.05)和破坏活肿瘤细胞(p＜0.04)方面比参考Phor21-βCG-ala明显更具效力。与Phor21-βCG-ala具有同等效力的是D-ala-Phor21-LHRH和Phor18-LHRH。两种融合构建体均未引起体内溶血或其它副作用。有可能Phor18-ASAAS-LHRH(338612)和D-ala-Phor18-LHRH(339385)的效力通过多次注射(即使在最低剂量)时会更大。
实施例4
本实施例描述了体外和体内受体表达和特异性研究。
将分析治疗前和治疗后的LH受体表达密度，以确定治疗是否导致受体表达的下调。免疫细胞化学比较Western印迹测定和RIA以进行定量。通过采用室形薄片的IHC和Western印迹技术测定MDA-MB-435S.luc细胞、CHO和TM4细胞中的LH和LHRH。将对每种细胞测试相同的传代数以得到对溶解肽CG和溶解肽LHRH的敏感性。
在MDA-MB-435S.luc(LHRH和CG受体两者)、TM4(无LHRH受体)和CHO(无CG受体)细胞中分析LH受体融合构建体的特异性。IC50数据显示TM4细胞对LHRH-Phor21(10.9μM)的敏感性明显下降，而CHO细胞显示了相比MDA-MD-435S.luc细胞(2.3μM)对Phor21-βCG-ala(24.6μM)更低的敏感性(图12)。
测定了与融合构建体治疗有关的体内受体表达。在融合构建体治疗开始和末尾测量体内受体表达。
实施例5
本实施例描述了融合构建体和化疗剂的联合治疗。
将卵巢癌细胞系(OVCAR-3细胞，多重耐药性)与Phor21-βCG-ala和阿霉素孵育48小时进行初步研究。通过甲簪减少测定细胞成活力。同时与Phor21-βCG-ala孵育时提高阿霉素可降低IC50。阿霉素浓度为0、0.5、2和10μg/ml时该降低为10μM至0.9至0.3至0.05μM。(图11)。用Phor21-βCG-ala治疗强化了对阿霉素的响应。该数据显示在与阿霉素共孵育时，Phor21-βCG-ala更为有效(13倍)。
用阿霉素或顺铂预先处理癌细胞，然后在LH或LHRH存在和缺失下用LH或LHRH融合构建体处理，将显示该构建体对细胞的细胞毒性是否改变。
在异种移植肿瘤模型(MDA-MB-435S)中测试联合治疗的体内效力。用融合构建体和化疗药物联合治疗小鼠，并与合适的对照比较。小鼠可参照该药物所用的标准计划进行治疗，并用该融合构建体在3周内每周治疗一次。
考虑溶血活性、相比抗肿瘤有效剂量(0.02或0.01mg/kg)的最大耐受剂量(MTD)(最高16-25mg/kg)等参数，融合结合物具有很高的安全限度。Phor21-βCG-ala的安全限度为16，而Phor18-βCG-ala和Phor18-LHRH可达到800的值。相比而言，Phor18-柳菩林的安全限度仅为8。
下文表6是根据各种标准对结合物的综述。
评级代码：
分配的分数：123
体外活性1x2x3x
HA50＜5050-100＞100
IC50/HA50＜0.03＜0.006＜0.004
体内效力
与33相当
MTD比较
与33相当
1)33的IC50为2.31μM，该值表示为33的IC50/IC50肽。
2)溶血活性表示为HA50[μM]。
3)体内表现指相对基线的肿瘤重量减少和活肿瘤细胞减少与肽33的相同参数相比的显著性。
4)注射剂量导致66.6％存活(急性和注射后8-14天)。
肽状码：
33＝Phor21βCG-ala
76＝Phor18-βCG-ala
81＝DalaPhor21-βCG-ala
85＝DalaPhor18-LHRH
47＝Phor18-柳菩林
13＝Phor18-LHRH
11＝DalaPhor21-LHRH
12＝Phor18-ASAAS-LHRH
71＝Phor15-βCG-ala
74＝Phor15-C6-βCG-ala
实施例6
本实施例描述了肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))在多种癌细胞系中的体外动力学研究。
标准的化疗药物通过DNA嵌入、微管相互作用进行作用或者是信号转导途径的抑制剂。因此，它们的作用机制决定了破坏靶细胞所需的时间量。已报道阿霉素体外破坏人乳腺癌细胞(如MDA-MB-435S)的动力学可快达4小时，其它标准的护理治疗可能需要更久。破坏癌细胞的最常见作用机制是凋亡。作为一个可逆的过程，且由于多重耐药性(MDR)的出现，在MDR癌细胞中输出药物分子的PgP泵的作用，标准护理治疗可能是无效的。
与化疗药物相反，直接的膜作用可在数分钟内破坏癌细胞。膜活性化合物例如阳离子溶解肽包括Phor18-LHRH(338613)(KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG)。
为了确定细胞毒性动力学，在表达不同水平的LHRH靶向受体的不同细胞系中采用Phor18-LHRH(338613)相比未靶向的溶解肽部分Phor18＝CLIP71(338983)进行详细的时间过程研究。非癌细胞系的膜为中性，并耐受细胞溶解肽，这与在外部膜中具有高磷脂酸含量的癌细胞系不同。
所研究的乳腺癌细胞系为MDA-MB-435S(雌激素受体α阴性)，MCF-7和T47D(雌激素受体α阳性)，卵巢癌细胞系(OVCAR-3和SKOV-3)，前列腺癌(LNCaP)，非恶性乳腺上皮细胞系MCF-10A以及小鼠成纤维细胞系NIH:3T3。还评估了LHRH受体靶向对于Phor18-LHRH(338613)效力的作用。
将细胞以10,000细胞/微孔的密度接种至96孔板。在48小时后通过添加浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10、50和100μM的Phor18-LHRH(338613)(APC338613，Lot#P080401)或Phor18＝CLIP71(APC338983，Lot#W08033C1)启动处理。对照分别包含USP盐水或0.1％TritonX-100TM作为0和100％细胞死亡的参考。通过2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、24小时和48小时后去除培养基终止孵育。通过甲簪(formazan)转化测定(MTT测定(CellTiter96AqueousOne，Promega#G3582))进行细胞成活力测定甲簪转化可采用BioRadBenchmarkPlus微板分光光度计在490/630nm的双波长和室温下测定。
数据计算为吸收的分数，其中含TritonX-100TM的微孔表示100％细胞死亡，含盐水的微孔表示0％细胞死亡。细胞毒性采用针对Windows的GraphPadPrismversion5.01(GraphPadSoftware，SanDiegoCaliforniaUSA)，根据采用0和100％的限制值为可变斜度的反曲剂量应答的程序测定IC50。对两个96孔板中每个单独组的4个微孔进行比较和分析。通过双尾学生T-检验确定统计学分析的显著性。
在MDA-MB435S细胞(p250)中，Phor18-LHRH(338613)在1小时孵育后显示最大效力，而CLIP71孵育导致随孵育时间上升得到100、109、171、145、148、86、54.5、55.1(24小时)和3[μM](48小时)(p＜0.005)的IC50值。与未结合的溶解肽CLIP71(＞100μM)相比，Phor18-LHRH(338613)是一种快速作用药剂(1.2μM0.5小时和0.6μM1小时后)。
在MCF-7细胞(p152)中，Phor18-LHRH(338613)在1小时孵育后显示最大效力，而CLIP71孵育导致随孵育时间上升得到92、95、50和22[μM](p＜0.005)的IC50值。与未结合的溶解肽CLIP71相比，Phor18-LHRH(338613)是一种快速作用药剂(3.4-1.8μM)。
在OVCAR-3细胞(p47)中，Phor18-LHRH(338613)在1小时孵育后显示最大效力，而未结合的Phor18＝CLIP71(33孵育导致随孵育时间上升得到337、126、85.5、52.5、22.9和23.1[μM](p＜0.005)的IC50值。Phor18-LHRH(338613)是一种快速作用药剂，随孵育时间上升具有6.7、5.6、5.3、1.6、1.5、0.5和0.5[μM](p＜0.005)的IC50值。该快速动力学数据提示Phor18-LHRH(338613)和CLIP71通过不同的作用机制杀死细胞，并提高了药物的效力。
在SKOV-3细胞(p40)中，Phor18-LHRH(338613)在24小时孵育后显示最大效力(11.5μM)，而CLIP71孵育导致随孵育时间上升得到86、96、53和50[μM](p＜0.005)的IC50值。Phor18-LHRH(338613)不是SKOV-3细胞的合适靶标，因为这些细胞不存在功能性LHRH受体。
所有用Phor18-LHRH(338613)处理的存在功能性LHRH受体的细胞系如乳腺癌细胞(MDA-MB-435和MCF-7)和OVCAR-3在孵育0.5-1小时内显示了最大作用(IC50，μM)。相反地，CLIP71的最大作用需要24小时孵育。从存在功能性LHRH受体的细胞系如T47D、LNCaP中可得到类似的结果。在不存在功能性LHRH受体的细胞系中(SKOV-3和HEK1A)，Phor18-LHRH(338613)和Clip71显示了相似的毒性，24小时孵育后的IC50值分别为10.3和11.8μM。非癌细胞系3T3对Phor18-LHRH(338613)和CLIP71高度耐受，对CLIP-71的IC50值为＞40μM，对Phor18-LHRH(338613)为＞10μM。
这些结果表明LHRH靶向增强了CLIP71的效力，且非癌细胞系耐受细胞溶解阳离子肽的破坏。Phor18-LHRH(338613)显示了在小于1小时内通过受体靶向机制破坏癌细胞的显著潜力。Phor18-LHRH(338613)在数分钟内有效，且相对于依赖胞内摄取并干扰代谢途径和增殖机构以产生效力的标准化学疗法具有优势。此外，Phor18-LHRH(338613)能够作用于多重耐药癌细胞。
实施例7
本实施例包括了表明肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))对乳腺癌细胞体外作用的可能机制的数据。
为了证明可能的体外作用机制，在过量表达LHRH受体的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435中进行了荧光显微研究。简言之，人乳腺癌细胞(MDA-MB-435，传代#252)被接种至培养皿。在添加EP100前引入如下标记物：DRAQ5TM(AlexisCorporation)-蓝，其用于对核染色，以及RedCMXRos(M7512)(MolecularProbes，Inc.OR)，其用于对完整线粒体显色。细胞膜采用小麦胚阿糖胞苷氟氯结合物(MolecularProbes，Inc.OR)染色。
细胞首先用Mitotracker染料根据生产商的推荐进行加载。将盐水中复原的Phor18-LHRH(338613)添加至终浓度为10μM，并孵育5-10分钟。用仅含盐水的培养皿作为对照。移除上清液，剩余的细胞准备进行荧光显微成像。
对暴露至Phor18-LHRH(338613)后的体外存在功能性LHRH受体的乳腺癌细胞MDA-MB-435的荧光显微评估揭示细胞质膜在暴露至Phor18-LHRH(338613)(10μM)5分钟后分解。这些观察提示Phor18-LHRH(338613)破坏细胞质膜，导致细胞在数分钟内死亡。
SKOV-3(p41)和MDA-MB-435S(p250)细胞与2μMPhor18-LHRH(338613)FITC孵育30分钟的荧光显微评估揭示SKOV-3细胞没有胞内摄取，未出现膜起泡，保留了线粒体染料。相反地，在30分钟内可见MDA-MB-435S细胞胞内摄取Phor18-LHRH(338613)FITC，大量的膜起泡导致了外膜的囊形成以及线粒体染料的褪色。这些观察揭示细胞死亡发生于数分钟内。
在数分钟内，Phor18-LHRH(338613)破坏存在功能性LHRH受体的细胞。Phor18-LHRH(338613)通过分解外细胞质膜破坏癌细胞以导致坏死。这种作用机制强烈提示Phor18-LHRH(338613)与存在功能性靶标的细胞的细胞质膜之间的快速相互作用。LHRH受体阴性的细胞不成为靶标，并保持完整。
这些数据显示Phor18-LHRH(338613)作为抗癌药物的高度特异性和效力。Phor18-LHRH(338613)在数分钟内有效，且相对于需要胞内摄取并干扰代谢途径和增殖机构以产生效力的标准化学疗法具有巨大的优势。此外，Phor18-LHRH(338613)能够作用于多重耐药癌细胞。
实施例8
本实施例包括了证明肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))在异种移植模型中对癌症有效的研究。
在携带了人乳腺癌异种移植物(MDA-MB-435S.luc(s.c.)，MCF-7(雌激素受体α阳性))、人卵巢癌异种移植物(OVCAR-3，(s.c.))、人前列腺癌异种移植物(PC-3(雄性激素受体阴性))的裸鼠中进行作为单一疗法或与标准护理治疗的联合疗法进行体内效力研究。在3周内每周注射一次或两次溶解于盐水中的Phor18-LHRH(338613)(0.02、0.2和2mg/kg)，其通过单独的弹丸注射进入侧部尾静脉中。
在MCF-7乳腺癌异种移植模型中进行PHOR18-LHRH(338613)联合疗法。
在最后注射后一周处死小鼠，采集血液以进行化学分析，记录肿瘤重量和体重。将肿瘤的部分固定在PBS缓冲的10％福尔马林中以进行组织学评估。体内异种移植研究的各方面综述于表7中。
表7：异种移植研究
异种移植模型治疗方案和中位肿瘤重中位肿瘤重备注
时间量与基线比量与盐水比
较p＜0.05较
P＜0.05
OVCAR-31x3wk，200.2mg/kg0.2，2mg/kg处理的肿瘤
d中有坏死，
LHRH受体
减少
MDA-MB-435S.l1x3wk，220.02，0.02，0.2和
ucd2mg/kg2mg/kg
MDA-MB-435S.l1x3wk，22d0.002mg/kg0.0002坏死和
ucmg/kgLHRH受体
减少
PC-31x3wk，210.20.002，0.02，
d0.2mg/kg
MCF-72x3wk，190.02mg/kg处理的重量
d生长迟缓中有坏死，
0.02和0.2
为了确定在单剂量方案中减少MDA-MB-435S异种移植物重量的最小有效剂量，用MDA-MB-435S(传代#249)/Matrigel悬浮液(2.4x106细胞/小鼠)肩胛间注射(s.c.)远亲杂交品系的5周龄Nu/Nu雌性小鼠(CharlesRiver)[Leuschner2006]。在给药前将Phor18-LHRH(338613)(ID：338613lot#P080401)(0.00002、0.0002、0.002、0.02、0.2和1mg/kg)以及未结合的Phor18＝CLIP71(APC338983，Lot#W08033C1)plusLHRH(0.2/0.122mg/kg，([D-Trp6]-LHRH；SigmaL9761，lot#037K1103)在USP盐水中复原。该剂量在3周中每周一次通过侧尾静脉作为单独的弹丸静脉注射给药。
每组由16只小鼠组成，其在3周内每周注射一次。一个16只小鼠的组在治疗开始前处死以作为基线。盐水注射作为对照组。在整个研究中，每周记录两次肿瘤体积。
治疗起始于肿瘤细胞注射后16天肿瘤确立之时，并在第23和30天继续。所有剩余的小鼠在肿瘤细胞注射后37天进行尸检。
通过尸检时的肿瘤重量和肿瘤重量变化与盐水对照以及未靶向CLIP71治疗的比较确定治疗响应。采集原发肿瘤，称重，并以10％PBS缓冲的福尔马林固定以准备组织学评估。在GraphPadPriam4中进行数据组的统计学评估，通过Wilcoxon符号秩检测计算显著性。
盐水对照和以clip71加LHRH治疗的小鼠中，肿瘤体积和肿瘤重量升高。以0.0002mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的小鼠相比盐水对照的肿瘤体积和肿瘤重量显著下降。用低至0.002mg/kg的剂量的Phor18-LHRH(338613)治疗可相对基线明显减小肿瘤体积和肿瘤重量(p＜0.0002)。
来自治疗小鼠的用苏木精/曙红染色的MDA-MB-435S异种移植小鼠的肿瘤切片的组织学评估显示了盐水对照和用CLIP71/LHRH治疗的小鼠中的活肿瘤细胞。相反地，在以低至0.0002mg/kg的剂量的Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠的肿瘤中可看到明显的坏死。未靶向阳离子溶解肽CLIP71未能减少肿瘤重量或破坏肿瘤组织。
低至0.002mg/kg的Phor18-LHRH(338613)对减少MDA-MB-435S异种移植物肿瘤重量非常有效，从而导致处理肿瘤组织的坏死。用细胞溶解肽进行的非靶向治疗无效。
为了确定在多剂量方案中减少MDA-MB-435S异种移植物重量的最小有效剂量，按照上文所述用MDA-MB-435S(传代#253)/Matrigel悬浮液(2.x106细胞/小鼠)肩胛间注射(s.c.)远亲杂交品系的8周大Nu/Nu雌性小鼠(CharlesRiver)。于给药前在USP盐水中复原Phor18-LHRH(338613)(ID：338613lot#P080401)(0.002和0.2mg/kg)。该剂量在肿瘤细胞接种后15、16、17、20、21、22、23、27、28、29、30、33、34、35、36、37、38、40、41、42天经侧尾静脉作为单独弹丸静脉注射给药。盐水注射作为对照组。
每个治疗组由16只小鼠组成。在整个研究中，每周记录两次肿瘤体积。在肿瘤细胞注射后45天进行最终的尸检。在多数小鼠中由于尾静脉的阻塞而重新注射。在研究终点，测定体重、肿瘤重量，并固定在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中。
采用hor18-LHRH(338613)通过多重静脉注射进行的治疗导致两个剂量水平下的肿瘤退行。在接受0.002mg/kg的组中6/23和在0.2mg/kg组中1/20观察到无肿瘤小鼠。残留物质通常由基质胶组成。在0.2mg/kg组中一只小鼠未响应治疗。
在尾部未观察到坏死，不存在尾部的变红。在整个研究阶段体重未受治疗影响。
治疗小鼠100％存活。相反，在盐水对照组中有8只小鼠在肿瘤细胞注射30天(研究终点前)由于肿瘤体积超过2,500mm3而被处死。
在多次注射方案中从0.002和0.2mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的小鼠的H&E染色肿瘤的组织学检验显示了治疗小鼠的肿瘤细胞的根除。相反地，活肿瘤细胞存在于盐水对照小鼠中。
Phor18-LHRH(338613)明显破坏并减少了肿瘤重量并延长了治疗小鼠的寿命。该治疗对于体重或器官检查没有任何可见的影响。
实施例9
本实施例包括在乳腺、卵巢和前列腺癌异种移植模型中的肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))效力研究的描述。
此处描述的体外研究证明了Phor18-LHRH(338613)是一种快速作用药剂，可在接触数分钟内杀死癌细胞。为了测定Phor18-LHRH(338613)对乳腺癌异种移植物在靶向治疗初期的效力，研究了单次Phor18-LHRH(338613)注射后乳腺癌异种移植模型中通过Phor18-LHRH(338613)进行的细胞破坏的动力学。
简言之，按照实施例10所述用MDA-MB-435S(传代#249)/Matrigel悬浮液(2.4x106细胞/小鼠)肩胛区域注射(s.c.)远亲杂交品系的8周大Nu/Nu雌性小鼠(CharlesRiver)。于给药前在USP盐水中复原Phor18-LHRH(338613)(ID：338613lot#P080401)(.2和2mg/kg)。该剂量经侧尾静脉作为单次弹丸静脉注射给药。
在用Phor18-LHRH(338613)或盐水治疗后1、2和16小时处死小鼠。在研究终点，测定体重、肿瘤重量，并将肿瘤固定在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中。
从肿瘤的H&E染色切片进行的组织学评估显示了在盐水治疗小鼠中具有多重有丝分裂像的活肿瘤细胞。在0.2和2mg/kg剂量下用Phor18-LHRH(338613)治疗显示了来自MDA-MB-435S异种移植物的肿瘤在迅速至注射后1小时的破坏。
Phor18-LHRH(338613)可在早至给药后1小时破坏肿瘤，提示通过坏死引起细胞死亡的快速作用机制。这些数据确认Phor18-LHRH(338613)通过它的膜接触至呈现LHRH受体的肿瘤细胞。
为了测定Phor18-LHRH(338613)对模拟人类疾病的卵巢癌异种移植物的效力，可进行单次或多次剂量研究。呈现功能性LHRH受体的OVCAR-3人卵巢癌细胞系的异种移植模型被用于本研究。OVCAR-3代表了缓慢生长的异种移植模型并分泌肿瘤标记物(癌抗原125或CA125)。其分泌可被用作治疗响应，并且是药物活性的量度。
该异种移植研究的目的在于在卵巢癌模型中测试Phor18-LHRH(338613)，以确定Phor18-LHRH(338613)在多重耐药、缓慢生长肿瘤模型体内每周单次注射是否有效。简言之，用NIH：OVCAR-3细胞/Matrigel悬浮液(4.6x106细胞/小鼠)皮下注射远亲杂交品系的5周大Nu/Nu雌性小鼠(Harlan-SpragueDawley)。治疗起始于肿瘤细胞注射后33天该肿瘤确立之时，并在41和47继续。3次每周注射的剂量为0.02、0.2和2mg/kg体重，在第33、41和47天于三周内每周一次经侧尾静脉单次弹丸静脉注射给药。在第52天进行尸检。数据表示为平均SEM。箭头显示给药。
治疗组包括盐水对照(N＝10)，Phor18-LHRH(338613)(338613，V09108X1)(0.02(N＝10)、0.2(N＝10)和2mg/kg(N＝9)，)以及未结合的Phor18＝CLIP71(APC338983，Lot#V04004X1)(2mg/kg(N＝10))，含于盐水的顺铂/CP(Calbiochem，Cat232120，D0005495，)(10mg/kg，3qd(N＝10)，)，基线(N＝9)。
在第33天处死一组中9只携带肿瘤的小鼠，并用作基线组。所有的小鼠在肿瘤细胞注射后51-52天进行尸检。在研究过程中每周两次记录肿瘤体积和体重，并进行小鼠的总体兽医检查。
采集原代肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾，固定于福尔马林中以准备进行组织学评估。在尸检时记录肿瘤重量，将肿瘤的部分在-80℃下冷冻以供LH/CG和LHRH受体测定。
通过酶联免疫测定在来自尸检中每个单独小鼠的血清中定量测定卵巢癌抗原(其作为药物活性的生物标记)(AssaykitGenway，Biotech，Inc.SanDiego，CA，Catalog#40-052-115009，#BC-1013根据生厂商说明使用)。
从福尔马林固定的肿瘤评估LHRH受体水平。采用附加了与互动式显微镜(AxioImager)功能性连接的计算机辅助图像分析系统的Ventana图像分析系统(VIAS)进行定量的免疫过氧化物酶图像分析。采用包括了形态测定和比色分析的Her2/neu受体定量程序进行定量分析。受体状态结果报道为在如下条件下LHRH受体显示阳性染色的百分比：0非免疫活性，1+：1-25％阳性，2+：26-50％阳性，3+：51-75％阳性细胞。
所有小鼠组对注射耐受良好。一只小鼠在2mg/kg剂量的Phor18-LHRH(338613)首次注射过程中死亡。死亡为急性事件，且为过程中的，与治疗并不相关。在其它治疗组的所有小鼠均存活。在注射后10分钟，没有小鼠因注射而死亡。
在用Phor18-LHRH(338613)治疗过程中肿瘤体积下降。相反地，对于用CLIP71、顺铂或盐水对照治疗的小鼠，观察到肿瘤生长。在肿瘤细胞注射后42天记录的肿瘤体积显示Phor18-LHRH(338613)在低至0.2mg/kg体重的浓度下相对基线减少了肿瘤体积(p＜0.001)。
测定了尸检时的肿瘤特征(中位肿瘤重量和相对于基线的中位肿瘤重量)。在2和0.2mg/kg剂量的Phor18-LHRH(338613)组中可获得相对盐水对照和未结合Phor18＝CLIP71(p＜0.05)减少的肿瘤重量。在0.2和2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)组中发现无肿瘤小鼠。以相对治疗起始时的肿瘤退化表示的治疗响应在用0.2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)治疗时最大(相比基线p＜0.03)。顺铂和未结合Phor18＝CLIP71对于减少肿瘤重量无效。
盐水对照、CLIP71和顺铂治疗小鼠显示了稳定的肿瘤生长。CA125的血清水平与肿瘤重量对应(r2＝0.66)。CA125分泌在Phor18-LHRH(338613)治疗小鼠中减少，且用0.2和2mg/kg的Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠相对盐水对照获得最大分泌(p＜0.0002)。
从0.02mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗后的OVCAR-3异种移植物携带小鼠切除的肿瘤大小相对于盐水对照减小且坏死。治疗后的肿瘤的LHRH受体水平下降1-2评分。在用0.02mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的组中，用苏木精/曙红染色的肿瘤切片显示了明显的坏死。用顺铂或CLIP71治疗的异种移植物携带小鼠在组织学评估后未显示肿瘤体积和LHRH受体水平减少，并显示了活肿瘤细胞。
用Phor18-LHRH(338613)治疗引起了卵巢异种移植模型中肿瘤退化，血清中CA125肿瘤标记物的减少，LHRH受体水平的下降以及坏死。因此，Phor18-LHRH(338613)可有效破坏多重耐药卵巢癌异种移植物。
为了测定Phor18-LHRH(338613)对前列腺癌异种移植物的效力，研究了快速侵略性生长异种移植模型中Phor18-LHRH(338613)的体内作用。PC-3异种移植物由于小鼠显著的体重下降而未被治疗。
简言之，用PC-3/Matrigel悬浮液(1x106细胞/小鼠)皮下注射远亲杂交品系的6周龄雄性小鼠(CharlesRiver)。治疗起始于肿瘤细胞注射后15天肿瘤确立之时，并在第22和29天继续。三周内每周注射的剂量为2、0.2和0.02mg/kg体重，通过单次弹丸静脉注射经侧尾静脉给药。治疗组包括盐水对照(N＝12)，Phor18-LHRH(338613)(APC338613Lot#V09108X1)(0.002(N＝12)，0.02(N＝12)，0.2(N＝12)和2mg/kg(N＝12)，)以及未结合的Phor18＝CLIP71(338983，Lot#V04004X1)(5mg/kg(N＝12)，基线(N＝12)。
在第15天处死一组中12只携带肿瘤的小鼠，并用作基线组。所有的小鼠在肿瘤细胞注射后35和36天进行尸检。在研究过程中每周两次记录肿瘤体积和体重，并进行小鼠的总体兽医检查。
采集原代肿瘤、肝、肾、胰腺、心脏、肺和脾，固定于福尔马林中以准备进行组织学评估。在尸检时记录肿瘤重量，将肿瘤的部分在-80℃下冷冻以供LH/CG和LHRH受体测定。
所有组对注射耐受良好，且治疗组中的所有小鼠存活。没有小鼠因注射而死亡。
用0.002、0.02、0.2和2mg/kg剂量的PHor18-LHRH(338613)治疗过程中肿瘤体积下降。对于用CLIP71或盐水对照治疗的小鼠，观察到肿瘤生长。在肿瘤细胞注射后22天记录的肿瘤体积显示在Phor18-LHRH(338613)低至0.002mg/kg体重的浓度下相对盐水对照和CLIP71减少了肿瘤体积(p＜0.001)。肿瘤重量相对于盐水对照和CLIP71治疗组显著下降(在所有Phor18-LHRH(338613)治疗组中为0.001)。
PC-3异种移植物已知会引起裸鼠的体重下降。在Phor18-LHRH(338613)治疗的小鼠中，以0.002、0.02、0.2和2mg/kgPhor18-LHRH(338613)治疗的组中相对于盐水对照和CLIP71注射肿瘤体积下降。尸检时的中位肿瘤重量相对于盐水对照和CLIP71显著下降(p＜0.001)。对照组的小鼠非常瘦弱，且相对于治疗组小鼠体重下降超过10g。
Phor18-LHRH(338613)可有效阻止PC-3异种移植物中的肿瘤生长，并防止由于携带肿瘤导致的严重体重下降。未结合的Phor18-LHRH(338613)没有作用。
综上所述，前述的研究表明肽KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))可在体内有效破坏乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌异种移植物。Phor18-LHRH(338613)引起了治疗小鼠的肿瘤坏死，且该种坏死早在注射后1小时便可看到。Phor18-LHRH(338613)作为每周一次的治疗方案是有效的，包括可以诱导坏死和引起肿瘤重量下降。作为每周多次的方案，可更明显看到肿瘤的根除，包括残留肿瘤细胞的破坏。Phor18-LHRH(338613)引起了治疗后LHRH受体水平的下降，这与靶细胞的破坏一致。

Claims (117)

1.融合构建体，其包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域由选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的氨基酸序列组成；且所述第二结构域包含结合部分。
2.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分结合至受体、配体或抗原。
3.如权利要求2所述的融合构建体，其中所述配体包括受体激动剂和拮抗剂。
4.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分结合至在细胞上表达的受体、配体或抗原。
5.如权利要求4所述的融合构建体，其中所述细胞为高度增殖细胞。
6.如权利要求4所述的融合构建体，其中所述细胞为乳腺、卵巢、子宫、前列腺、睾丸、肾上腺、脑垂体。
7.如权利要求4所述的融合构建体，其中所述细胞为子宫颈或子宫内膜细胞。
8.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分包括配体、受体或抗体。
9.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分包括肽、蛋白、核酸或碳水化合物。
10.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分为激素、激素类似物、与激素受体结合的激素或激素类似物的片段、激素受体或者与激素或激素受体结合的药剂。
11.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分具有线性或环状结构。
12.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述结合部分结合至激素或激素受体。
13.如权利要求12所述的融合构建体，其中所述激素选自促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮或雄性激素。
14.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第二结构域由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第二结构域由1-10、10-20、15-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100或更多的氨基酸序列所组成或包含该氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由15、17、18、19或20个氨基酸序列所组成。
17.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由15个氨基酸序列所组成。
18.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由17个氨基酸序列所组成。
19.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由18个氨基酸序列所组成。
20.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由19个氨基酸序列所组成。
21.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域由20个氨基酸序列所组成。
22.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第二结构域由如下列举的氨基酸序列所组成或包含该氨基酸序列：SYAVALSAQAALARR。
23.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第二结构域由如下列举的氨基酸序列所组成或包含该氨基酸序列：QHWSYGLRPG。
24.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域定位于相对所述第二结构域的NH2-末端处。
25.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第二结构域定位于相对所述第一结构域的NH2-末端处。
26.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域或所述第二结构域具有一个或多个D-氨基酸。
27.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域在K、F或A残基具有D-氨基酸。
28.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一结构域形成两亲α-螺旋。
29.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一和第二结构域通过共价键连接。
30.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一和第二结构域通过肽或非肽接头连接。
31.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一和第二结构域通过具有1-25个氨基酸残基的肽序列或通过线性碳链连接。
32.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一和第二结构域通过包含一个或多个A、S或G氨基酸残基的肽序列连接。
33.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述第一和第二结构域通过包含GSGGS、ASAAS或CCCCCC或者由其组成的肽序列连接。
34.如权利要求1所述的融合构建体，进一步包含第三、第四、第五、第六或第七结构域。
35.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体被分离或纯化。
36.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体包含混合物。
37.包含如权利要求1所述的融合构建体的组合物。
38.包含如权利要求1所述的融合构建体的药物组合物。
39.包含如权利要求1所述的融合构建体的单位剂型，该融合构建体的量可有效治疗具有不良细胞增殖或高度增殖紊乱的对象。
40.包含如权利要求1所述的融合构建体的单位剂型，该融合构建体的量可有效治疗具有赘生物、肿瘤或癌症的对象。
41.包含如权利要求1所述的融合构建体的单位剂型，该融合构建体的量可有效降低对象的生育力。
42.包含如权利要求1所述的融合构建体以及说明书的试剂盒，其用于减少或抑制细胞增殖、减少或抑制赘生物、肿瘤或癌症细胞的增殖、治疗患有高度增殖紊乱的对象、治疗患有赘生物、肿瘤或癌症的对象或者减少动物的生育力。
43.包含如权利要求1所述的融合构建体以及说明书的试剂盒，其用于减少或抑制高度增殖细胞的增殖。
44.包含如权利要求1所述的融合构建体以及抗细胞增殖剂或免疫刺激剂的组合物。
45.编码如权利要求9所述的融合构建体的核酸分子。
46.包含权利要求45所述的核酸分子的载体。
47.用权利要求46所述载体转化的宿主细胞。
48.表达如权利要求1所述的融合构建体的细胞。
49.减少或抑制细胞增殖的体外方法，其包括将细胞与数量上足以减少或抑制该细胞增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触。
50.减少或抑制高度增殖细胞的增殖的体外方法，其包括将细胞与数量上足以减少或抑制该高度增殖细胞的增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触。
51.减少或抑制赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的体外方法，其包括将细胞与数量上足以减少或抑制该赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触。
52.如权利要求49-51任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体、配体或抗原。
53.如权利要求49-51任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达激素或激素受体。
54.如权利要求49-51任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体。
55.如权利要求49-51任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体，该受体结合促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素、神经生长因子、CD-8、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSAM)、CA125、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白、ILF3、叶酸或其衍生物、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、TNF-α、TNF-β、淋巴细胞毒素、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、单糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或乙酰神经氨酸。
56.如权利要求55所述的体外方法，其中该整合素选自α-5β3或α-5β1整合素。
57.如权利要求49-51任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体，该受体结合促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素、神经生长因子、CD-8、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA125、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、类泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白和ILF3。
58.如权利要求57所述的体外方法，其中该类似物选自米非司酮、氟他胺、柳菩林、诺雷德、醋酸组氨瑞林、synatel曲普瑞林、布舍瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、安肽、替维瑞克和地加瑞克。
59.选择性减少或抑制表达受体或抗原的细胞的增殖的体外方法，其包括将该细胞与数量上足以减少或抑制该细胞增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触，其中所述肽的结合部分结合由该细胞表达的受体、配体或抗原。
60.选择性减少或抑制表达受体或抗原的高度增殖细胞的增殖的体外方法，其包括将该细胞与数量上足以减少或抑制该高度增殖细胞增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触，其中所述肽的结合部分结合由该高度增殖细胞表达的受体、配体或抗原。
61.选择性减少或抑制表达受体或抗原的赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞的增殖的体外方法，其包括将该细胞与数量上足以减少或抑制该赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞增殖的如权利要求1所述的融合构建体相接触，其中所述融合构建体的结合部分结合由该细胞表达的受体、配体或抗原。
62.如权利要求59-61任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体或抗原。
63.如权利要求59-61任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达激素或激素受体。
64.如权利要求59-61任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达性或性腺类固醇激素或者性或性腺类固醇激素受体。
65.如权利要求59-61任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体，该受体结合促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素、神经生长因子、CD-8、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSAM)、CA125、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白、ILF3、叶酸或其衍生物、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、TNF-α、TNF-β、淋巴细胞毒素、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、单糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或乙酰神经氨酸。
66.如权利要求59-61任意一项所述的体外方法，其中该细胞表达受体，该受体结合促性腺激素释放激素I、促性腺激素释放激素II、八目鳗III促黄体激素释放激素、促黄体激素β链、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素β-亚单位、促黑色素细胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生长激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮质激素、雌激素、睾丸激素、雄烯二酮、二氢睾丸激素、脱氢表雄酮、黄体酮、雄性激素、表皮生长因子(EGF)、生长激素(GH)、Her2/neu、维生素H、叶酸、铁传递蛋白、甲状腺刺激激素(TSH)、内皮素、蛙皮素、生长激素、血管活性肠肽、乳铁蛋白、整合素、神经生长因子、CD-8、CD-33、CD19、CD20、CD40、ROR1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、α-胎儿球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA125、可溶性白介素-2(IL-2)受体、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、PRAME、MUM-1、ZFP161、泛素-1、HOX-B6、YB-1、骨粘连蛋白、ILF3、叶酸或其衍生物、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、TNF-α、TNF-β、淋巴细胞毒素、TRAIL、Fas、LIGHT、41BB、转化生长因子α、转化生长因子β、胰岛素、血浆铜蓝蛋白、HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、单糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰神经氨酸或其类似物。
67.如权利要求1所述的融合构建体用以制备用于治疗高度增殖紊乱的药物的用途。
68.如权利要求1所述的融合构建体用以制备用于治疗赘生物的用途。
69.如权利要求1所述的融合构建体用以制备用于治疗肿瘤的药物的用途。
70.如权利要求1所述的融合构建体用以制备用于治疗恶性肿瘤的药物的用途。
71.如权利要求1所述的融合构建体用以制备用于减少或抑制赘生物转移至其它位点或者在远离原发赘生物的其它位点形成或建立转移性赘生物的药物的用途。
72.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物为转移性、非转移性或良性的。
73.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物包含实体细胞物质。
74.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物包含造血细胞。
75.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、黑素瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、间皮瘤、网状内皮的、淋巴的或造血的赘生物。
76.如权利要求68或71所述的用途，其中该肉瘤包括淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤或纤维肉瘤。
77.如权利要求74所述的用途，其中该造血的赘生物包括骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
78.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物包括肺、甲状腺、头或颈、鼻咽、喉、鼻或窦、脑、脊柱、乳腺、肾上腺、脑垂体腺、甲状腺、淋巴腺、胃肠的(嘴、食道、胃、十二指肠、回肠、空肠(小肠)、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、子宫颈、子宫内膜、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴腺、血液、肌肉或皮肤赘生物。
79.如权利要求78所述的用途，其中该肺赘生物包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
80.如权利要求68或71所述的用途，其中该赘生物包括干细胞赘生物。
81.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物抑制或减少该赘生物的复发或进展。
82.如权利要求67或68的用途，其进一步包括施用抗细胞增殖、抗赘生物、抗肿瘤、抗癌症或免疫增强治疗或疗法。
83.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括手术切除、放射疗法、电离或化学放射疗法、化学疗法、免疫疗法、局部或区域热疗法或疫苗接种。
84.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷或核苷酸类似物。
85.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、强的松龙、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相关化合物、博来霉素、放射菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、环己亚硝脲、司莫司汀、链脲菌素、羟脲、顺式铂氨、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉酚、长春花碱、长春新碱、阿霉素或二溴甘露醇。
86.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用淋巴细胞。
87.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用浆细胞、巨噬细胞、树状细胞、NK细胞或B-细胞。
88.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用抗体、细胞因子或趋化因子。
89.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用细胞生长因子、细胞存活因子、细胞分化因子。
90.如权利要求82所述的用途，其中该治疗或疗法包括施用IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNFβ、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒细胞亲合素、嗜酸粒细胞亲合素-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3α、PARC、TARC、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、GROα、GROβ、ENA-78、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1或淋巴细胞趋化因子。
91.如权利要求82所述的用途，其中该药物在该抗细胞增殖、抗赘生物或免疫增强治疗或疗法施用之前、施用同时或施用之后施用。
92.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物用于已经历了手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热疗法或疫苗接种的对象。
93.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物用于手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的候选者的对象。
94.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物用于不是手术切除、化学疗法、免疫疗法、电离或化学放射疗法、局部或区域热(高热)疗法或疫苗接种的候选者的对象。
95.如权利要求68或71所述的用途，其中该治疗导致该赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞量、体积、大小或细胞数量的部分或完全破坏，刺激、诱导或提高赘生物、肿瘤、癌症或恶性细胞坏死、溶解或凋亡，减少赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积大小、细胞量，抑制或防止赘生物、肿瘤、癌症或恶性肿瘤体积、量、大小或细胞数量的进展或提高或者延长寿命。
96.如权利要求68或71所述的用途，其中该治疗导致与该赘生物相关或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率的减少或下降。
97.如权利要求68或71所述的用途，其中该治疗导致疼痛、不适、恶心、虚弱或嗜睡的减少或下降。
98.如权利要求68或71所述的用途，其中该治疗导致更高的精力、食欲、改善的灵活性或心理状态。
99.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物施用的对象为哺乳动物。
100.如权利要求68或71所述的用途，其中该药物施用的对象为人。
101.如权利要求1所述的融合构建体用于制备降低动物生育力的药物的用途。
102.如权利要求101所述的用途，其中该动物为哺乳动物。
103.如权利要求101所述的用途，其中该动物为人。
104.如权利要求1所述的融合构建体用于制备减少或治疗动物子宫内膜异位的药物的用途。
105.如权利要求1所述的融合构建体用于制备减少或治疗良性前列腺增生的药物的用途。
106.如权利要求1所述的融合构建体用于制备减少或治疗纤维瘤或息肉的药物的用途。
107.如权利要求106所述的用途，其中该纤维瘤或息肉存在于乳腺、子宫、阴道、子宫颈或输卵管。
108.如权利要求106所述的用途，其中该纤维瘤或息肉存在于子宫颈。
109.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体通过更低的IC50值确定具有比KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-βCG-ala、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-GSGGS-βCG-ala、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-ASAAS-βCG-ala或KFAKFAKKFAKFAK-βCG-ala更高的抗细胞增殖活性。
110.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体具有比KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-βCG-ala、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-GSGGS-βCG-ala、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK-ASAAS-βCG-ala或KFAKFAKKFAKFAK-βCG-ala更小的IC50/HA50比例。
111.如权利要求1所述的融合构建体，其中所述融合构建体具有小于0.02、0.01或0.005的IC50/HA50比例。
112.选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF,KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK,KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的分离或纯化的肽。
113.选自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF,KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK,KFAKFAKKFAKFAKKFAKF和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的分离或纯化的肽。
114.编码如权利要求112或113所述的肽的核酸。
115.包含编码如权利要求112或113所述的肽的核酸的载体。
116.以包含编码如权利要求112或113所述的肽的核酸的载体转化的宿主细胞。
117.表达如权利要求112或113所述的肽的细胞。
CN200980111383.7A 2008-01-24 2009-01-26 溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法 Active CN102089320B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2337708P 2008-01-24 2008-01-24
US61/023,377 2008-01-24
PCT/US2009/031999 WO2009094634A1 (en) 2008-01-24 2009-01-26 Lytic domain fusion constructs and methods of making and using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102089320A CN102089320A (zh) 2011-06-08
CN102089320B true CN102089320B (zh) 2015-11-25

Family

ID=40671139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980111383.7A Active CN102089320B (zh) 2008-01-24 2009-01-26 溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (4) US8318899B2 (zh)
EP (1) EP2252627B1 (zh)
JP (1) JP5616233B2 (zh)
KR (2) KR101749310B1 (zh)
CN (1) CN102089320B (zh)
AU (1) AU2009206212B2 (zh)
BR (1) BRPI0906404B8 (zh)
CA (1) CA2713126C (zh)
DK (1) DK2252627T3 (zh)
ES (1) ES2633453T3 (zh)
IL (2) IL207181A (zh)
PT (1) PT2252627T (zh)
WO (1) WO2009094634A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112225821A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 徐州医科大学 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011031477A2 (en) * 2009-08-25 2011-03-17 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Nucleolin-binding peptides, nucleolin-binding lytic peptides, fusion constructs and methods of making and using same
US10093961B2 (en) * 2009-12-22 2018-10-09 Esperance Pharmaceuticals Methods for diagnosis of and predicting treatment efficacy of hormone receptor expressing tumors, cancers and neoplasias
CN104177501A (zh) * 2010-02-09 2014-12-03 沈阳药科大学 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法
CN103097417B (zh) 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
US9586996B2 (en) 2010-04-30 2017-03-07 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Lytic-peptide-Her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) ligand conjugates and methods of use
WO2012050892A2 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Methods for stimulating, increasing or enhancing killing of a cell that expresses luteinizing hormone releasing hormone (lhrh) receptors
US8461118B2 (en) * 2011-07-07 2013-06-11 Tuskegee University Lytic peptides having anti-proliferative activity against prostate cancer cells
PL2771364T3 (pl) 2011-10-27 2020-01-31 Genmab A/S Wytwarzanie heterodimerycznych białek
PL397167A1 (pl) * 2011-11-28 2013-06-10 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
PL223487B1 (pl) * 2011-12-28 2016-10-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
CN105753939A (zh) * 2012-04-12 2016-07-13 康德生物医疗技术公司 芳香族阳离子肽及其用途
EP2910948B1 (en) 2012-10-17 2018-07-11 Public University Corporation Nara Medical University Novel cancer marker and utilization thereof
CN105121472A (zh) * 2012-10-30 2015-12-02 埃斯佩兰斯医药公司 抗体/药物缀合物及其使用方法
EP2920212A4 (en) * 2012-11-15 2016-07-27 Esperance Pharmaceuticals Inc FUSION CONSTRUCTS FROM FOLLICULAR STIMULATING HORMONE (FSH) AND A LYTIC DOMAIN AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
SI3200815T1 (sl) 2014-10-02 2021-11-30 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Postopki in sestavki za zdravljenje raka
GB2543550A (en) * 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
KR20180123027A (ko) * 2016-02-12 2018-11-14 보드 오브 슈퍼바이저스 오브 루이지애나 스테이트 유니버시티 앤드 애그리컬추얼 앤드 메카니컬 컬리지 암 치료 조합 조성물, 방법 및 용도
CN105963687A (zh) * 2016-04-27 2016-09-28 张金凤 一种用于治疗慢性盆腔疼痛的复方制剂及其制备方法
CN107955061B (zh) * 2017-11-15 2021-07-30 连云港恒运药业有限公司 地加瑞克关键中间体的制备方法
CN115768455A (zh) * 2020-03-26 2023-03-07 A28治疗公司 溶解结构域融合构建体、检查点抑制剂、以及制造和使用它们的方法

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1327311C (en) 1987-07-06 1994-03-01 Jesse M. Jaynes Therapeutic antimicrobial polypeptides, their use and methods for preparation
KR970006154B1 (ko) 1987-07-06 1997-04-24 루이지아나 스테이트 유니버시티 아그리컬춰럴 앤드 메카니칼 컬리지 용해성 펩티드에 의한 진핵 병원체와 신생물의 억제 및 섬유아세포와 임파구의 자극
US5861478A (en) 1987-07-06 1999-01-19 Helix Biomedix, Inc. Lytic peptides
US5459237A (en) 1990-02-08 1995-10-17 Magainin Pharmaceuticals Inc. Peptide compositions and uses therefor
JPH07504152A (ja) 1990-02-08 1995-05-11 マゲイニン　ファーマスーティカルズ，　インコーポレーテッド 生物活性ペプチドおよび標的細胞、ウイルス、あるいはウイルス感染細胞の成長を抑制する方法
US5792831A (en) 1990-02-08 1998-08-11 Magainin Pharmaceuticals Inc. Analogues of magainin peptides containing D-amino acids
CA2111214A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 W. Lee Maloy Composition and treatment with biologically active peptides having c-terminal substitutions
CA2125494A1 (en) 1991-12-09 1993-06-24 Barry Berkowitz Composition and treatment with biologically active peptides and chelating agents
US6348445B1 (en) 1992-06-01 2002-02-19 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Biologically active peptides with reduced toxicity in animals and a method for preparing same
EP0644769A4 (en) 1992-06-01 1995-08-09 Magainin Pharma BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES WITH N-TERMINAL SUBSTITUTIONS.
AU5081193A (en) 1992-08-31 1994-03-29 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gynecological malignancies with biologically active peptides
EP0671939A1 (en) 1992-12-03 1995-09-20 Magainin Pharmaceuticals Inc. Treatment of dermatological malignancies with biologically active peptides
CA2151046A1 (en) 1992-12-07 1994-06-23 Mukta Hendi Treatment of septic shock with conjugated biologically active peptides
WO1994019369A1 (en) 1993-02-26 1994-09-01 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancerous growths with biologically active peptides and protease inhibitors
JPH09500102A (ja) 1993-04-28 1997-01-07 ウォーセスター ファウンデーション フォー エクスペリメンタル バイオロジー 細胞指向性溶解孔形成剤
US5561107A (en) 1993-06-04 1996-10-01 Demeter Biotechnologies, Ltd. Method of enhancing wound healing by stimulating fibroblast and keratinocyte growth in vivo, utilizing amphipathic peptides
AU7050294A (en) 1993-06-04 1995-01-03 Demeter Biotechnologies, Ltd. Method of treating pulmonary disease states with non-naturally occurring amphipathic peptides
US5968904A (en) 1993-06-04 1999-10-19 Demegen, Inc. Modified arginine containing lytic peptides and method of making the same by glyoxylation
US5773413A (en) 1993-06-04 1998-06-30 Demeter Biotechnologies, Ltd. Method of combating mammalian neoplasias, and lytic peptides therefor
US5955573A (en) 1993-06-04 1999-09-21 Demegen, Inc. Ubiquitin-lytic peptide fusion gene constructs, protein products deriving therefrom, and methods of making and using same
AU1086595A (en) 1993-11-08 1995-05-29 Demeter Biotechnologies, Ltd. Methylated lysine-rich lytic peptides and method of making same by reductive alkylation
US5789542A (en) * 1994-04-22 1998-08-04 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Amphipathic peptides
IL114697A0 (en) 1994-07-22 1995-11-27 Demeter Biotech Ltd Polypeptides comprising ubiquitin-lytic peptide fusion protein products deriving therefrom their preparation and use
CA2267683A1 (en) 1996-10-04 1998-04-09 Demeter Biotechnologies, Ltd. Method for treatment of immunodeficiency virus infection
WO2000053755A2 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor
US6566334B1 (en) 1997-02-06 2003-05-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Short amphipathic peptides with activity against bacteria and intracellular pathogens
US6635740B1 (en) 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
AU6587998A (en) * 1997-03-27 1998-10-20 Demeter Biotechnologies, Ltd. Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
GB9711115D0 (en) * 1997-05-29 1997-07-23 Inst Of Child Health Integrin-targeting vectors having enhanced transfection activity
CA2294518A1 (en) 1997-07-15 1999-01-28 Magainin Pharmaceuticals Inc. Biologically active peptides with reduced toxicity in animals and a method for preparing same
US6680058B1 (en) 1997-09-03 2004-01-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals
US6461813B2 (en) * 1998-09-21 2002-10-08 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Multiparameter FACS assays to detect alterations in cell cycle regulation
EP2327451B1 (en) * 1998-05-08 2013-10-23 The Regents of the University of California Method for detecting and inhibiting angiogenesis
US6656906B1 (en) * 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
GB0005702D0 (en) 2000-03-09 2000-05-03 Alpharma As Method
TR200200738T2 (tr) 1999-09-23 2002-08-21 Zentaris Ag Endometriyal dokunun rahim dışında çoğalması, kronik alt karın ağrısı ve fallop tüpü tıkanıklığının terapötik olarak giderilmesi.
IL151647A0 (en) 2000-03-14 2003-04-10 Zentaris Ag Novel lhrh-antagonists, production and use thereof as medicament
EP1285081A2 (en) * 2000-05-30 2003-02-26 ICH Productions Limited Improved methods of transfection
US6875744B2 (en) 2001-03-28 2005-04-05 Helix Biomedix, Inc. Short bioactive peptides
EP1443966B1 (en) 2001-11-15 2007-03-14 Pantarhei Bioscience B.V. Method of preventing or treating benign gynaecological disorders
EP1501935B1 (en) 2002-04-22 2009-09-23 Dow Global Technologies Inc. Low-cost production of peptides
PL208073B1 (pl) 2002-09-27 2011-03-31 Aeterna Zentaris Gmbh Żelowy preparat farmaceutyczny oraz sposób jego otrzymywania i zestaw do jego wytwarzania
BR0316290A (pt) * 2002-11-15 2005-10-11 Sangstat Medical Corp Método de tratar cistite intersticial
US7091185B2 (en) 2003-02-24 2006-08-15 Dow Global Technologies Inc. Periodic antimicrobial peptides
EP1599499A2 (en) 2003-02-24 2005-11-30 Dow Global Technologies Inc. Periodic antimicrobial peptides
GB0307777D0 (en) 2003-04-04 2003-05-07 Medical Res Council Conjugate compounds
NO20031818D0 (no) 2003-04-23 2003-04-23 Uni I Tromsoe Fremgangsmåte av bioaktiv peptid forberedelse
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
GB0320806D0 (en) 2003-09-05 2003-10-08 Astrazeneca Ab Therapeutic treatment
US8071364B2 (en) 2003-12-24 2011-12-06 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
GB0506759D0 (en) 2005-04-02 2005-05-11 Medical Res Council Combination treatment methods
US20090061006A1 (en) * 2006-03-31 2009-03-05 Carola Leuschner Layered Nanoparticles for Sustained Release of Small Molecules
US7288622B1 (en) 2006-09-19 2007-10-30 Issar Pharmaceuticals Pvt Ltd Composition for treatment of burns and wounds
US7803755B2 (en) 2006-12-21 2010-09-28 Jesse Jaynes Molecules for the treatment and prevention of fungal diseases

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A NOVEL APPROACH OF TARGETED ABLATION OF MAMMARY CARCINNOMA CELLS THROUGH LUTEINIZING HORMONE RECEPTORS USING HECATE-CGBETA CONJUGATE.;BODE GABRIEL. ET AL;《BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT》;20030531;第79卷(第1期);5 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112225821A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 徐州医科大学 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
IL207181A (en) 2016-09-29
BRPI0906404B1 (pt) 2021-04-06
EP2252627A1 (en) 2010-11-24
US20090233861A1 (en) 2009-09-17
PT2252627T (pt) 2017-07-24
US20090233860A1 (en) 2009-09-17
CN102089320A (zh) 2011-06-08
KR20160106191A (ko) 2016-09-09
JP2011517550A (ja) 2011-06-16
AU2009206212B2 (en) 2014-01-16
IL243446B (en) 2021-08-31
BRPI0906404B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0906404A2 (pt) 2015-11-24
KR101863136B1 (ko) 2018-05-31
DK2252627T3 (en) 2017-08-14
US9255134B2 (en) 2016-02-09
AU2009206212A1 (en) 2009-07-30
EP2252627B1 (en) 2017-04-19
CA2713126A1 (en) 2009-07-30
KR101749310B1 (ko) 2017-06-21
KR20100127212A (ko) 2010-12-03
JP5616233B2 (ja) 2014-10-29
CA2713126C (en) 2017-08-15
US8318899B2 (en) 2012-11-27
WO2009094634A1 (en) 2009-07-30
US8546535B2 (en) 2013-10-01
IL243446A0 (en) 2016-02-29
US20140255513A1 (en) 2014-09-11
ES2633453T3 (es) 2017-09-21
IL207181A0 (en) 2010-12-30
US20090269341A1 (en) 2009-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102089320B (zh) 溶解结构域融合构建体及其制备和使用方法
CN105073779A (zh) 促卵泡激素(fsh)/裂解结构域融合构建体与其制备和使用的方法
CN105121472A (zh) 抗体/药物缀合物及其使用方法
CN103930134B (zh) 长效促黄体激素(lh)化合物
JP2017043620A (ja) 溶解性ペプチド−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子レセプター２）リガンド結合体およびその使用方法
KR20200107842A (ko) 트레일 트라이머와 암표적 펩타이드를 멀티디스플레이하는 페리틴 나노케이지 및 이의 항암제로서의 용도
JP2023518977A (ja) 溶解性ドメイン融合構築物、チェックポイント阻害剤、およびそれらを作出し、使用する方法
KR102177339B1 (ko) 경구용 유전자 전달체 및 이의 용도
WO2023097111A2 (en) Methods and compositions for treating calcinosis associated conditions
MX2014000698A (es) Compuesto de hormona luteinizante (lh) de accion prolongada.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant