KR102177339B1 - 경구용 유전자 전달체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 경구 투여용 유전자 전달체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 면역글로불린 Fc 영역에 음이온성 유전자를 응집할 수 있는 양이온성 프로타민(protamine)이 SMCC 링커로 연결된 경구 투여용 유전자 전달체에 관한 것이다. 본 발명의 경구 투여용 유전자 전달체는 양이온성 성질을 지니는 단백질인 프로타민을 Fc 영역에 결합시켜 음이온성 성질을 지닌 유전자와 응축시킴으로써 체내에서 유전자 발현을 효과적으로 유도할 수 있으며, 경구 투여 시 위산 및 백혈구의 면역작용으로 인한 분해 작용으로부터 유전자를 보호하여 소장까지 유전자 전달이 가능할 뿐만 아니라, 상기 소장에서 유전자가 발현되면 반감기가 상대적으로 길어 장기간의 치료 효과에 대한 가능성을 확인하였는바, 본 발명에 따른 유전자 전달체는 다양한 유전자의 경구 투여용 전달체로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

경구용 유전자 전달체 및 이의 용도 {Oral Gene Delivery and Uses Thereof}
본 발명은 경구 투여용 유전자 전달체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 면역글로불린 Fc 영역에 음이온성 유전자를 응집할 수 있는 양이온성 프로타민(protamine)이 SMCC 링커로 연결된 경구 투여용 유전자 전달체에 관한 것이다.
항체의 Fc 부위는 면역 백혈구 또는 혈청 보체 분자를 소집하여, 암세포 또는 감염된 세포와 같은 손상된 세포들이 제거될 수 있도록 역할을 한다. Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생(neonatal) 수용체 FcRn과의 상호작용을 매개하며, 그의 결합은 엔도솜(endosome)으로부터 혈류(bloodstream)로 세포내 이입된 항체를 재순환시킨다. 이 과정은 전체 길이 분자의 거대한 크기에 기인하여 신장 여과(kidney filtration)의 저지와 연관되어 1주 내지 3주 범위의 유리한 항체 혈청 반감기(antibody serum half-life)를 갖는다. 또한, FcRn에 대한 Fc의 결합은 항체 운반에 있어서도 중요한 역할을 담당한다. 따라서 Fc 부위는 세포 내 수송(intracellular trafficking) 및 리사이클 기작을 통하여 항체가 순환되어 연장된 혈청 지속성(prolonged serum persistence)을 유지하는데 필수적인 역할을 한다.
한편, 경구용 유전자 치료에 대한 개념은 이미 증명되었지만 장내 구간을 통한 비 바이러스성 유전자 전달은 낮은 발현도의 문제가 있어 많은 난항을 겪고 있다. 또한 장내 효소 및 미생물 그리고 소화액에 의한 분해를 효과적으로 제어해야 한다는 난관이 존재한다. 그러나 Fc 수용체(FcRn)에 의한 운반체제는 장내 상피세포를 통과할 수 있는 능력이 있어 위와 같은 흡수효율에 따른 문제를 해결할 수 있다. 특히 Fc 수용체를 이용한 순환은 여타 다른 순환 방법에 비해 가장 긴 시간 동안 순환할 수 있는 능력을 가지고 있으며, Human 조건에서 7일 내지 21일 사이의 반감기를 가지기 때문에 다른 IgG 종류보다 뛰어난 효과를 가질 수 있다.
이에 따라, 현재 진행되고 있는 많은 임상연구에서 항체의 반감기를 증가시키기 위해 Fc 부위에 돌연변이를 도입하거나 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 효과를 극대화시키기 위해 변이를 도입한 Fc 도메인을 통해 차세대 항암 항체 치료제나 항암 단백질 치료제 개발에 많은 노력을 쏟고 있다(한국공개특허 10-2017-0106258). 그러나 아직까지 그 결과는 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 유전자를 체내 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 전달체에 대하여 예의 연구한 결과, 음이온 성질을 띠는 유전자를 효과적으로 응축시키기 위해 양이온성 성질을 지니는 프로타민(protamine)을 면역글로불린 Fc 영역에 SMCC로 연결시킨 유전자 전달체가 pH 및 체내 효소에 대한 안정성이 있음을 확인하고, 경구 투여용 유전자 전달체로서 사용 가능성을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 목적 유전자와 결합하는 프로타민 (Protamine);
면역글로불린 Fc 영역; 및
상기 프로타민 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커를 포함하는, 경구 투여용 유전자 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체 및 상기 전달체와 결합된 GLP-1 유전자를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
목적 유전자와 결합하는 프로타민(Protamine);
면역글로불린 Fc 영역; 및
상기 프로타민 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커를 포함하는, 경구 투여용 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 링커는 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 목적 유전자와 유전자 전달체는 1:5 - 1:50의 중량%(w/w) 비율로 혼합되어 제조되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate) 용액에 프로타민(protamine) 용액을 첨가하여 프로타민-SMCC 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 프로타민-SMCC 용액에 Cys-Fc 용액을 첨가하고 배양하여 프로타민-SMCC-Fc 용액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조된 프로타민-SMCC-Fc 용액을 동결건조하여 유전자 전달체를 수득하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체 및 상기 전달체와 결합된 GLP-1(Glucagon Like Peptide-1) 유전자를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 GLP-1 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 당뇨병 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명의 경구 투여용 유전자 전달체는 양이온성 성질을 지니는 단백질인 프로타민을 Fc 영역에 결합시켜 음이온성 성질을 지닌 유전자와 응축시킴으로써 체내에서 유전자 발현을 효과적으로 유도할 수 있으며, 경구 투여 시 위산 및 백혈구의 면역작용으로 인한 분해 작용으로부터 유전자를 보호하여 소장까지 유전자 전달이 가능할 뿐만 아니라, 상기 소장에서 유전자가 발현되면 반감기가 상대적으로 길어 장기간의 치료 효과에 대한 가능성을 확인하였는바, 본 발명에 따른 유전자 전달체는 다양한 유전자의 경구 투여용 전달체로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 프로타민-SMCC-Fc의 물리적 특성을 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 도 1a는 프로타민-SMCC-Fc의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 1c는 SDS-PAGE를 이용해 프로타민-SMCC와 Fc 영역 간의 접합 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 프로타민-SMCC-Fc의 크기를 확인한 결과로서, 도 2a는 프로타민-SMCC-Fc의 입자크기를 확인하기 위한 동적광산란법(DLS) 분석 결과이고, 도 2b는 SEM 이미징 결과를 나타낸 것이며, 도 2c는 DNA와 프로타민-SMCC-Fc를 다양한 중량%(w/w) 비율로 혼합하여 제조한 각각의 복합체에 대하여 크기(DLS 분석) 및 제타 전위를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 pH 조건(pH 7.4, 5.6, 1.2)하에서 GLP-1 및 프로타민-SMCC-Fc 복합체(DNA + Protamine-SMCC-Fc)의 산 안정성 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 DNA/프로타민-SMCC-Fc(DNA + Protamine-SMCC-Fc) 복합체를 이미징한 결과로서, 도 4a는 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 4b는 AFM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 DNA/프로타민-SMCC-Fc 복합체의 접합을 확인하기 위해 GLP-1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc를 다양한 비율로 제조한 복합체에 대하여 아가로오즈 겔 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 프로타민-SMCC-Fc 유전자 전달체의 혈청 및 효소 분해에 의한 유전자 보호 능력을 확인하기 위해 혈청 안정성 및 DNase 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 FcRn 양성 세포(HT29) 및 음성 세포(KB) 각각에서 본 발명에 따른 프로타민-SMCC-Fc 유전자 전달체의 프로타민-SMCC-Fc의 FcRn 매개 cellular uptake 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HT-29 세포에서 프로타민-SMCC-Fc 유전자 전달체를 농도별로 처리한 후 세포 생존능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 프로타민-SMCC-Fc 유전자 전달체의 세포 투과성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 GLP-1/프로타민-SMCC-Fc 복합체에 대한 GLP-1 응축을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 GLP-1-프로타민-SMCC-Fc 복합체를 동물 모델에 4일 간격으로 경구 투여하면서 비공복혈당 수치를 측정한 in vivo 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 유전자를 체내 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 전달체에 대해서 예의 연구한 결과, 음이온 성질을 띠는 유전자를 효과적으로 응축시키기 위해 양이온성 성질을 지니는 단백질인 프로타민을 Fc 영역에 결합시킨 유전자 전달체로부터 pH 및 체내 효소에 대한 안정성이 있음을 확인하여 경구 투여용 유전자 전달체로서 사용 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 목적 유전자와 결합하는 프로타민(Protamine);
면역글로불린 Fc 영역; 및
상기 프로타민 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커를 포함하는, 경구 투여용 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “프로타민(protamine)”은 아르기닌이 풍부한 천연의 양이온성 단백질로서, 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상적으로 어류의 정자핵으로부터 추출되는 프로타민의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명에서 사용된 프로타민이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “면역글로불린 Fc 영역”이란 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 또는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아픽 등 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역은 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 이때, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
본 발명에서는 음이온 성질을 띠는 유전자를 효과적으로 응축시키기 위해 양이온성 성질을 지니는 프로타민을 면역글로불린 Fc 영역에 결합시켰으며, 이 때, 상기 프로타민 및 Fc 영역을 결합시키기 위한 링커는 sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate)일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 아민기 및 티올기 모두와 선택적으로 반응하는 성질을 가지는 링커이면 어떠한 것도 제한 없이 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate) 용액에 프로타민(protamine) 용액을 첨가하여 프로타민-SMCC 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 프로타민-SMCC 용액에 Cys-Fc 용액을 첨가하고 배양하여 프로타민-SMCC-Fc 용액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조된 프로타민-SMCC-Fc 용액을 동결건조하여 유전자 전달체를 수득하는 단계.
본 발명의 실시예에서는 상기 방법으로 제조한 유전자 전달체의 특성을 확인하고 이용 가능성 검증하기 위해 in vitro 및 in vivo 분석을 실시하였다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 링커인 SMCC를 이용하여 면역글로불린 Fc 영역 및 프로타민이 연결된 프로타민-SMCC-Fc의 유전자 전달체를 합성하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 프로타민-SMCC-Fc의 유전자 전달체의 물리적 특성을 확인하고자 NMR 및 FT-IR 실험을 진행하였고, TNBSA 분석을 통하여 최적의 접합 비율을 확인하였으며, 프로타민-SMCC-Fc의 SDS-PAGE 전기영동을 통해 접합 여부를 구체적으로 확인하였다 (실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 상기 프로타민-SMCC-Fc와 DNA와의 접합 상태를 구체적으로 확인하였고, DNA와 상기 프로타민-SMCC-Fc의 중량% 비율이 1:10 이상에서 콤펙트하게 접합되어 복합체를 형성함을 확인하였고 상기 복합체가 다양한 pH 조건에서 안정함을 확인하였다(실시예 3 참조). 또한, 유전자의 효율적인 체내 전달 효과를 확인하고자, 먼저 혈청에 대한 안정성 및 세포 독성을 확인하였고, celluar uptake를 확인함으로써 FcRn 양성 세포인 HT-29 세포에서의 현저히 높은 흡수 효과를 확인하였다.
또한, 유전자 전달체의 세포 투과성을 HT-29 monolayer의 세포막 투과성 실험을 진행하여 세포 투과 능력을 확인하고, 마지막으로 유전자 응축효과를 구체적으로 확인하였다(실시예 4 참조).
아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 in vivo 실험을 통해 GLP-1-프로타민-SMCC-Fc 복합체를 동물모델에 4일 간격으로 경구 투여하고 비공복혈당을 측정한 결과, 대조군과 달리 혈당이 정상수준으로 회복되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명자들은 상기 결과들을 통해 본 발명에 따른 경구용 유전자 전달체의 pH 및 효소 안정성을 확인하였고, 상기 전달체가 다양한 기관에 흡수되며 창자 기관에 흡수율이 높으므로, 프로타민-SMCC-Fc가 여러 장기와의 결합력이 우수하기에 이를 바탕으로 유전자 전달체로 사용될 시 효율적인 능력을 나타낼 것으로 예상된다. 또한 추후 다양한 유전자의 전달체로 적용 가능할 수 있음을 시사한다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 전달체 및 상기 전달체와 결합된 GLP-1(Glucagon Like Peptide-1) 유전자를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 GLP-1은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 이때, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 유전자 전달체 및 GLP-1 유전자를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 당뇨병 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 유전자 전달체 제조
1-1. 프로타민 (protamine)-SMCC의 합성
dH2O (5 mg/mL)에 프로타민(5.1kD) (1mole)을 녹이고 30분 동안 저어준 뒤, NH2 그룹을 활성화시키기 위해 pH를 7.5로 조정하였다. 한편, DMSO 300 uL와 dH2O 700 uL를 혼합한 용액 (5mg / mL)에 Sulfo-SMCC (2mole)를 녹인 다음, Sulfo-SMCC 용액을 상기에서 제조한 프로타민 용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하였으며, 이때 실온에서 24시간 동안 꾸준히 교반하였다. 이후 2일 동안 증류수에 대하여 반응 혼합물을 투석하고 (MWCO: 3.5-5 kD), 동결건조를 진행하여 프로타민-SMCC를 수득하였다.
1-2. 프로타민-SMCC-Fc 제조
먼저, pH 6.5-7.4에서 PBS에 프로타민-SMCC를 용해시키고 30분 동안 저어주면서 3 mg/mL의 농도로 만든 다음, 별도로 PBS (1 mole)에 Cys-Fc를 용해시켜 16 ㎎/㎖ 농도의 용액을 만든 후 실온에서 1시간 동안 교반하면서 상기 프로타민-SMCC 용액에 한방울씩 떨어뜨리는 방법으로 첨가하였다. 이후 별도의 교반 없이 4℃에서 밤새(12시간) 배양한 다음, 24시간 동안 dH20로 투석하고, 동결건조를 진행하여 프로타민-SMCC-Fc를 수득하였다.
실시예 2. 프로타민-SMCC-Fc의 물리적 특성 확인
2-1. NMR 및 FT-IR 분석
상기 실시예 1로부터 수득한 프로타민-SMCC-Fc의 물리적 특성을 확인하기 위해서, NMR 및 FT-IR 실험을 진행하였으며, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 1a은 각각 프로타민(1번), SMCC(2번), 프로타민-SMCC(3번), 프로타민-SMCC-Fc(4번)의 NMR 분석 스펙트럼 결과이며, 도 1b는 각각 프로타민(a), 프로타민-SMCC(b) 및 프로타민-SMCC-Fc(c)의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
2-2. TNBSA 분석
프로타민과 SMCC의 최적화된 접합 비율을 확인하기 위해 TNBSA(2,4,6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid) 분석을 진행하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 0.4 nm SMCC를 1 nm 프로타민에 접합시킨 비율이 최적의 비율임을 확인하였으며, 구체적으로 프로타민-SMCC의 공급 몰비가 1:2와 1:3일 때 접합 비율의 차이가 없는바, 몰비를 1:2로 최적화하였다.
Feed mole ratio(Protamine: SMCC) Conjugation ratio
1:2 1:0.4
1:3 1:0.4
2-3. SDS-PAGE 전기영동
또한, 12%의 아크릴아마이드 겔을 이용한 SDS-PAGE를 통해 프로타민-SMCC-Fc의 접합 여부를 검증한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, Fc 단독 샘플의 분자량(60 kDa)에 비해 프로타민-SMCC-Fc 샘플의 분자량(75 kDa)이 더 크게 나타난 것을 확인하였다.
2-4. 입자 크기 분석
본 발명에 따른 Protamine-SMCC-Fc의 입자크기를 확인하기 위하여 동적광산란법(Dynamic Light Scattering; DLS) 분석 및 주사전자현미경(SEM) 이미지 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 2a의 DLS 분석 결과에 나타낸 바와 같이 프로타민-SMCC 입자의 크기는 105.3 nm인 반면에 프로타민-SMCC-Fc의 크기는 161.1 nm로써 Fc 접합에 의해 입자 크기가 커진 것을 확인하였다. 또한, SEM 이미징 분석 결과 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 프로타민-SMCC-Fc 입자가 단분산 형태를 나타내며, 입자 크기가 DLS 분석 결과와 유사하게 측정된 것을 확인하였다. 상기 DLS 및 SEM 분석 결과 측정된 프로타민-SMCC-Fc 입자 크기는 하기 표 2에 정리하여 나타내었다.
name DLS size SEM size
프로타민-SMCC 105.3 nm 90 nm
프로타민-SMCC-Fc 161.1 nm 120 nm
실시예 3. 정전기적 상호작용 분석(Electrostatic interaction study)
3-1. 입자 크기 및 제타 전위 측정
GLP1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체를 다양한 비율(1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:25)로 혼합한 복합체에 대하여 DLS 분석을 통해 입자 크기를 측정하고 제타전위(Zeta potential) 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 GLP1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체의 비율이 1:15 이상에서는 제타 전위가 유사하더라도 입자 크기가 감소하지 않기 때문에 1:15의 비율에서 상기 DNA와 전달체가 완전히 밀집되어 복합체를 형성하는 것임을 확인하였다.
3-2. pH 안정성 분석
다음으로, 약물을 경구투여할 경우 체내 장기마다 pH가 상이하므로 다양한 pH 환경에 대한 GLP1 및 프로타민-SMCC-Fc 복합체의 안정성을 검증하고자 하였다. 이를 위해, GLP1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체를 다양한 비율로 혼합한 각각의 복합체를 pH 7.4, 5.6 및 1.2의 조건에 두고 시간별로(0, 3, 6, 24시간) DLS 분석을 통해 입자 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 복합체가 pH 7.4, 5.5 및 1.2에서 모두 안정한 것으로 나타났으며, 입자 크기는 1:15 비율까지 감소하였고 1:25 비율의 복합체는 크기가 유사하게 나타난 것으로 보아 GLP1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체의 최적화 비율이 1:15인 것을 다시 한 번 확인하였다.
3-3. SEM 및 AFM 분석
먼저, GLP-1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체가 혼합된 복합체의 형태를 확인하기 위해 상기 복합체를 각각 1:10 및 1:15의 비율로 제조한 후 SEM 이미지 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다.
또한, 원자현미경(Atomic Force Microscope; AFM) 분석 결과, 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 naked DNA의 경우와 비교하여 DNA:프로타민-SMCC-Fc를 1:15 비율로 제조한 복합체의 경우 구형 사슬과 유사한 결합 형태를 보였으며, 상기 비율이 최적의 결합 비율임을 다시 한 번 확인하였다.
3-4. 아가로즈 겔 전기영동
GLP-1 DNA와 프로타민-SMCC-Fc 전달체가 다양한 비율로 혼합된 복합체에 대하여 아가로오즈 겔 전기영동을 실시하여 복합체 형성 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해, GLP-1 DNA 단독, 다양한 비율(1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:12, 1:15, 1:25, 1:30)로 제조된 복합체 및 Fc+GLP-1 DNA 샘플을 이용해 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 GLP-1:프로타민-SMCC-Fc 비율이 1:10에서부터 밴드가 사라지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 GLP-1이 프로타민-SMCC-Fc와 콤팩트하게 결합하여 복합체를 형성하는 것을 확인하였다.
실시예 4. in vitro 연구
4-1. 혈청 안정성 시험 및 DNase 분석
본 발명에 따른 경구형 유전자 전달체의 혈청 및 효소 분해에 대한 유전자 보호 능력을 검증하기 위해 혈청 안정성 및 DNase 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, GLP-1 유전자 단독의 경우에는 혈청에서 8시간 후에 분해가 진행되기 시작한 반면, GLP-1+프로타민-SMCC-Fc의 경우에는 24시간까지 프로타민-SMCC-Fc가 유전자를 혈청 분해로부터 보호하는 것을 확인하였다.
4-2. FcRn 매개 cellular uptake 연구
FcRn과 Fc 사이의 상호 작용 및 FcRn 양성 세포에서의 흡수를 확인하기 위하여, 공초점 현미경 관찰을 통해 HT-29 (FcRn+) 및 KB (FcRn-) 세포에서 프로타민-SMCC-Fc의 cellular uptake 연구를 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, KB세포에 비하여 FcRn 양성인 HT-29 세포에서 프라타민-SMCC-Fc가 현저히 높은 cellular uptake를 나타내는 것을 확인하였다.
4-3. 세포 독성 확인
다음으로, 프로타민-SMCC-Fc에 의한 세포 독성 여부를 검증하기 위하여, HT-29 세포에 프로타민-SMCC-Fc를 다양한 농도(5, 10, 25, 50, 100 ug/ml)로 처리하고 각각 24시간 및 72시간 후에 MTT assay로 세포 생존능을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군(control)과 비교하여 72시간까지 상기 농도 모두에서 세포 생존능이 높게 유지되는 것을 확인하였는바, 본 발명에 따른 유전자 전달체가 세포 내에서 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
4-4. Fc의 상피 수송 확인
본 발명에 따른 유전자 전달체의 세포 투과성을 확인하기 위하여, HT-29 세포 3x105 cells/well/5.5 mL를 7일 동안 배양하여 회수하고, 배지를 HBSS + 0.05% BSA + 10 mM MES pH 6.0 (정단 챔버) 및 10 mM HEPES, pH 7.4 (기저 외측 챔버)로 각각 대체하였다. 기저 외측 부분은 형광 분석을 위해 서로 다른 시간 간격으로 다른 샘플로 처리한 후에 회수하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 24 시간 후 DNA 단독에 비하여 유전자 전달체에서 cellular uptake가 5배 증가하는 것을 확인하였다.
4-5. GLP-1 응축 분석
본 발명에 따른 GLP-1/프로타민-SMCC-Fc 복합체에 대한 GLP-1 응축을 확인하기 위해 EtBr displacement assay를 실시하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 GLP-1 단독은 서로 다른 비율의 GLP-1/프로타민-SMCC-Fc 복합체와 비교하여 더 높은 형광을 나타내는 것을 확인하였는데, 이것은 GLP-1이 프로타민-SMCC-Fc에 의해 완전히 응축되었음을 보여주는 결과이다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 유전자 전달체는 다양한 기관에 흡수됨을 확인하였고, 창자 기관에 흡수율이 높으므로 프로타민-SMCC-Fc가 여러 장기와의 결합력이 우수하기에 이를 바탕으로 유전자 전달체로 사용될 시에 효율적인 능력을 나타낼 것으로 예상된다. 또한 추후 다양한 유전자 전달체로 적용 가능함을 확인하였다.
실시예 5. in vivo 연구
상기 실시예 4의 결과에 더하여, in vivo 실험을 통해 본 발명에 따른 GLP-1/프로타민-SMCC-Fc 복합체의 당뇨병 치료효과를 검증하고자 하였다. 이를 위해, 제2형 당뇨병 모델인 BKS.Cg+/+Lepr db/db 마우스 모델을 이용하였는데, 상기 마우스는 유전자 조작 마우스로써 출생 후 10~14일부터 인슐린 수치가 증가하기 시작하며, 4~5주 후부터 비만이 되기 시작하고 고지혈증이 나타나며 10주 후부터는 당뇨(glucosuria) 양성률이 100%로 나타나는 특징을 갖는 모델이다. 실험을 위해, 상기 복합체를 상기 마우스 모델에 4일 간격으로 경구 투여하였으며 대조군은 PBS를 투여하고 시간 경과에 따라 32일까지 매일 비공복혈당 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 GLP-1-프로타민-SMCC-Fc를 투여한 경우 대조군과 달리 비공복혈당 수치가 정상 범위로 떨어진 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 복합체의 경구 투여가 혈당을 정상 수준으로 조절해주는 효과가 있음을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KB BIOMED <120> Oral Gene Delivery and Uses Thereof <130> PD17-187-P1 <150> KR 10-2017-0177676 <151> 2017-12-22 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> hIgG1-Fc <400> 1 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Met Phe Trp Cys Gly Gly His Asp Leu Arg Leu Pro Arg Lys Lys Glu 20 25 30 Met Ser Phe Glu Trp His Leu Phe Ser Ser Thr Val Val Pro Leu Gln 35 40 45 Lys Ser Thr Arg His Tyr Val Leu Arg Asp Val Leu Val Met Cys Val 50 55 60 Phe Ser Glu Arg Asp Arg Gly Pro Phe 65 70 <210> 2 <211> 219 <212> DNA <213> hIgG1-Fc <400> 2 atgaagtggg tgaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctactccat gttctggtgc 60 ggagggcacg acctgaggct gccgaggaag aaggagatgt cgttcgagtg gcacctgttc 120 tcgtccaccg tcgtcccctt gcagaagagt acgaggcact acgtactccg agacgtgttg 180 gtgatgtgcg tcttctcgga gagggacaga ggcccattt 219 <210> 3 <211> 114 <212> DNA <213> GLP-1 <400> 3 atgcgtcaac gtcgtcatgc tgaagggacc tttaccagtg atgtaagttc ttatttggaa 60 ggccaagctg ccaaggaatt cattgcttgg ctggtgaaag gccgatagtc taga 114

Claims (11)

  1. 목적 유전자와 결합하는 프로타민(Protamine);
    면역글로불린 Fc 영역; 및
    상기 프로타민 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커를 포함하는, 경구 투여용 유전자 전달체로서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate)인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 목적 유전자와 프로타민-SMCC-Fc 유전자 전달체는 1:5 - 1:50의 중량%(w/w) 비율로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
  8. (a) SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate) 용액에 프로타민(protamine) 용액을 첨가하여 프로타민-SMCC 용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 프로타민-SMCC 용액에 Cys-Fc 용액을 첨가하고 배양하여 프로타민-SMCC-Fc 용액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제조된 프로타민-SMCC-Fc 용액을 동결건조하여 유전자 전달체를 수득하는 단계를 포함하는, 제1항의 유전자 전달체의 제조방법으로서,
    상기 Fc는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  9. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전자 전달체 및 상기 전달체와 결합된 GLP-1(Glucagon Like Peptide-1) 유전자를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 GLP-1 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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KR101825048B1 (ko) * 2014-12-31 2018-02-05 주식회사 제넥신 GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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