KR20090118626A

KR20090118626A - 알지디-폴리에틸렌 글리콜이 수식된 트레일, 이의제조방법, 및 용도

Info

Publication number: KR20090118626A
Application number: KR1020080044527A
Authority: KR
Inventors: 이강춘; 채수영; 손소희; 김성호
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2009-11-18

Abstract

본 발명은 천연 트레일과 동등 또는 유사한 약리활성을 나타내며 약물의 표적성, 체내 반감기 및 안정성을 증가시킨 트레일 유도체에 관한 것이다. 이러한 수용성 고분자 및 표적인자가 수식된 트레일은 천연 트레일에 비하여 약물의 표적성, 우수한 용해도 및 용액 안정성, 그리고 매우 향상된 형태의 약물 동력학적 거동을 보이며, 다양한 종류의 암 및 과다면역 반응에 의하여 생기는 관절염 등의 다양한 질병의 치료 및 병증완화에 유용하게 사용될 수 있다.

트레일, RGD, PEG, 수용성고분자, 항암 효능, 항염증 효과, 면역질환

Description

알지디-폴리에틸렌 글리콜이 수식된 트레일, 이의 제조방법, 및 용도{RGD-Polyethylene glycol-modified TRAIL, methods for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 트레일(TRAIL: Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand, 또는 Apo2 리간드(Apo2L))의 N-말단에 특이적으로 알지디-폴리에틸렌 글리콜(RGD-PEG: RGD-Polyethylene Glycol) 또는 RGD-PEG 유도체를 결합시킨 RGD-PEG-트레일 결합체에 관한 것이다. 이러한 RGD-PEG-트레일 결합체의 경우 천연 트레일에 비하여 표적화, 우수한 용해도 및 용액 안정성, 그리고 매우 향상된 형태의 약물 동력학적 거동을 보이며, 따라서 트레일의 항암 및 항염증 효과를 향상시킬 수 있는 유용한 조성물이다.

트레일은 종양괴사인자(TNF: Tumor Necrosis Factor)의 일종으로 세포의 자가소멸(apoptosis)에 관여하는 세포막 단백질이다. 전체적으로 281개의 아미노산으로 이루어진 단백질 중에서 한국 특허출원번호 제1997-7009578호의 114번 알지닌 (arginine)으로부터 281번 글라이신(glysine)까지의 세포외 부분이 세포의 자가 소멸에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(M.H. Kim, et al. BBRC 2004, 321, 930-935). 또한 세 개의 트레일 분자가 구조적으로 결합된 삼량체 구조를 나타내며, 이러한 삼량체 구조의 트레일이 세포의 죽음에 관여하는 리셉터와 결합하여 세포소멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(F.C. Kimberley, et al. Cell Research 2004, 14, 359-372).

다른 TNF 수퍼패밀리(superfamily)인 TNF 및 CD95L 등과 트레일의 가장 현격한 차이점으로는 일반 조직세포의 사멸을 유도하지 않는다는 것이다. TNF 및 CD95L 등의 단백질도 세포의 사멸을 유도하기 때문에 다양한 의, 약학적 응용이 시도되어 왔다. 이러한 TNF와 CD95L 등의 단백질들은 암세포 및 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하는 동시에 일반 세포에도 영향을 나타내기 때문에 제한적인 응용만이 가능한 것으로 생각되고 있다. 반면에 트레일의 경우 다양한 종류의 암세포 및 과다 활성화된 면역세포의 자가사멸을 유도하는 동시에 일반 세포에는 영향을 주지 않는 것으로 알려진다. 이는 각각의 세포들에 있어서 트레일 리셉터의 발현차이에 기인하는 것으로 알려진다. 트레일의 리셉터로는 현재까지 5가지의 종류가 보고되고 있고, 대표적 세포사멸 관련 리셉터로는 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)가 있다. 이러한 리셉터에 트레일이 결합되면 세포내 죽음 관련 도메인의 활성화 및 다양한 신호전달 체계를 거쳐 세포의 자가사멸이 이루어진다. 그 외에도 3개의 리셉터인 DcR1, DcR2, 및 OPG(osteoprotegerin) 등이 있으며, 이 3종류의 리셉터들은 세포의 죽음에 관여하지 않는 것으로 알려진다. 일반 세포와 암세포에 있어서 세포 사멸에 관여하는 DR4 및 DR5의 발현 정도의 차이는 미미한 것으로 알려진다. 반면에 세포 사멸과 관련이 없는 나머지 3종류의 리셉터는 일반 세포에서는 잘 발현되어 있는 반면 암세포에는 발현 정도가 낮거나 발현이 되지 않는 것으로 밝혀지고 있다. 따라서 트레일의 경우 일반 세포에서는 죽음 관련 도메인과 결합되지 않는 DcR1, DcR2 및 OPG와의 결합이 지배적으로 일어나 세포의 사멸을 유도하지 않는 반면 암세포 및 과다 활성화된 면역세포에서는 죽음 도메인과 결합되어 있는 DR4 및 DR5와의 결합에 의한 세포의 자가사멸이 유도되는 것으로 알려진다. 이러한 선택적 세포사멸은 트레일의 의, 약학적 응용에 있어서 매우 유용한 특성으로 생각된다.

트레일에 의한 세포사멸이 관찰되는 암세포들로는 대장암세포, 신경교종암세포(glioma cancer), 폐암세포, 전립선암세포, 뇌종양 및 다발성 골수종(multiple myeloma) 등이 보고되고 있으며, 동물실험에서 매우 우수한 항암활성을 나타내는 것으로 보고된다. 또한 트레일 단독사용 뿐만 아니라 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신 (doxorubicin) 등의 다른 항암제 및 방사선 치료 등과 병행하여 투입하는 경우 보다 우수한 항암 효능을 보이는 것으로 알려지고 있다. 따라서 이러한 트레일의 우수한 항암효능을 이용한 고형암에 대한 임상실험이 진행 중인 것으로 알려진다 (Genentech/Amgen). 암 뿐만 아니라 자가면역 질환의 일종인 관절염 등에 있어서도 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하여 병증의 완화 및 치료를 위하여 트레일을 이용한 다양한 접근이 시도되고 있다. 또한 단백질 치료 외에도 트레일 유전자의 전달을 통한 유전자 치료 등도 다양하게 시도되고 있다. 따라서 트레일은 위에서 언급한 다양한 암종의 치료뿐만 아니라 실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis), 류마티스 관절염 및 제 1형 당뇨병 등의 T-세포 기인성 자가면역 질환의 치료 등에도 유용하게 이용될 수 있다.

그러나 천연 트레일의 경우 성공적인 응용을 위하여 해결해야 할 몇 가지의 문제점들이 존재한다.

가장 대표적인 문제점으로는 천연 트레일의 낮은 삼량체 형성 비율을 들 수 있다. 트레일 단량체의 경우 위에서 언급한 트레일 리셉터와의 결합을 하지 못하기 때문에 세포의 자가사멸을 유도하지 못하는 것으로 알려진다. 따라서 트레일의 삼량체의 구조 및 삼량체 형성비를 향상시키기 위한 다양한 연구가 보고되고 있다. 천연 트레일에 있어서 삼량체의 형성에는 아연 이온이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(S.H. Hymowitz, et al. Biochemistry 2000, 39, 633-640). 또한 컴퓨터를 이용한 구조해석 및 이를 이용한 변형 트레일의 개발 등의 접근 방법 또한 시도되고 있다(A.M. van der Sloot, et al. Protein Engineering, Design & Selection 2004, 17, 673-680). 직접적인 삼량체 형성을 돕기 위한 새로운 아미노산 배열의 도입은 트레일 삼량체 형성에 있어서 가장 유용한 방법으로 생각되어 지며 루이신 지퍼 배열 및 아이소루이신 지퍼 배열 등이 보고되고 있다. Henning Walczak 등은 1999년 루이신 지퍼 배열을 천연 트레일의 N 말단에 도입한 삼량체 형태의 트레일 유도체에 의한 항암효능 등에 관한 내용을 발표한 바가 있다 (H. Walczak, et al. Nature Medicine 1999, 5, 157-163). 그 외에도 Dai-Wu Seol 등에 의해 새로운 아이소루이신 지퍼 배열이 포함된 트레일 유도체 및 그 유전자를 이용한 우수한 활성에 관한 보고 등이 활발히 발표되고 있다(MH Kim, et al. BBRC 2004, 321, 930-935).

트레일의 임상 응용에 있어서 또 다른 문제점으로는 일부 조직의 일반 세포에서 나타나는 세포독성을 들 수 있다. 대부분의 일반 세포에서는 위에서 언급한 바와 같은 다양한 트레일 리셉터의 발현에 따른 세포독성이 발현되지 않으나, 일부 간세포(hepatocytes) 및 케라틴세포(keratinocytes) 등에서는 트레일에 의한 세포 독성이 보고되고 있다(H. Yagita, et al. Cancer Sci. 2004, 95, 777-783; M. Jo et al. Nature Medicine 2000, 6, 564-567; S.J. Zheng, et al. J. Clin. Invest. 2004, 113, 58-64).

트레일에 의한 일반 세포독성 이외에도 생체내 트레일의 짧은 반감기 또한 트레일의 성공적 임상 적용을 위해서는 해결해야 할 문제점으로 생각된다. 트레일의 경우 실험에 사용된 동물의 종에 따라 서로 다른 반감기를 보이며, 설취류의 경우 수분 그리고 유인원에서는 대략 30분 이내의 반감기를 보이는 것으로 보고되고 있다(H. Xiang, et al. Drug Metabolism and Disposition 2004, 32, 1230-1238). 특히 대부분의 트레일이 신장을 통하여 빠른 속도로 배출되는 것으로 알려진다. 이러한 짧은 반감기는 트레일에 의한 약리작용의 단점으로 생각되며, 보다 긴 반감기를 갖는 트레일 및 트레일 유도체의 필요성을 단적으로 설명하고 있다.

그 외에도 트레일의 낮은 용해도 및 용액 안정성 또한 개선해야 할 문제점으로 생각된다.

알지디(RGD: arginine-glycine-aspartic acid)는 3개의 아미노산, 즉 아르기닌(arginine), 글리신(glycine) 및 아스파르트산(aspartic acid)으로 구성된 물질 로써, 최초 파이브로넥틴(fibronectin)의 세포 부착부위에서 발견되었다. 이들은 종양혈관의 내피세포층에 주로 발현되고 있는 알파v베타3 인테그린 리셉터 (integrin receptor)에 강한 친화력을 갖고 있기 때문에 약물 표적형 치료와 진단 시약과 같은 연구에 보편적인 수단으로 많이 쓰이고 있다. 예컨대, 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 5-플루러유러실(5-Fluorouracil) 등과 같은 항암제에 RGD를 결합시켰을 경우 단독 항암제를 사용한 경우보다 훨씬 우수한 항암 효능을 보이는 것으로 알려져 있다(K. Temming, et al, Drug Resistance Updates, 2005, 8, 381-402).

그 외에도 알지디 접합체는 아래와 같은 장점들이 있다.

(1) 펩티드, 단백질, 핵산 등을 포함한 많은 약물에 응용할 수 있다. (2) 강한 친화력(affinity)과 내화성(internalization)에 의해 다가의 RGC-리간드 (ligand) 제조에 용이하다. (3) 증가된 분자량에 의해 신장여과를 감소시킨다. (4) 혈액 순환에서 수용체나 효소에 의한 약물 감소를 최소화한다. (5) EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 관여한다.

반면에 상기와 같은 장점에도 불구하고 RGD는 인테그린과의 직접적인 상호작용을 제외하고 아스파르트산 잔기의 양쪽 측면이 펩티드의 접힘(folding)에 영향을 미치는 구조적인 단점이 있다. 게다가 선형 RGD-펩티드 리간드들은 화학적 소실 (chemical degradation)에 많이 취약한 것으로 알려졌다.

따라서 이러한 단점들을 극복하기 위해 RGD의 구조적 변형에 대한 시도가 다양하게 이루어지고 있다. 대표적인 예로는 환화(cyclization)가 있다. 이런 환화된 RGD(cRGD) 는 구조적으로 안정할 뿐만아니라 알파v베타3 인테그린에 대한 특이성과 결합능력도 많이 향상되어 있다. 실제로 대부분 RGD-펩티드 리간드(ligand)들은 하나 혹은 그 이상의 환(ring)구조를 가지고 있다. 현재 많이 쓰이고 있는 cRGD 유도체로는 cRGDyK, cRGDfK, c(RGDf-n(Me)-V), RGD4C, RGD10, 및 RGD-미메틱(RGD-mimetic) 등이 알려져 있다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG: Polyethylene glycol)은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 결합된 단백질의 분자량을 증가시키는 것에 의해, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000 내지 100,000으로, PEG 분자량이 1,000이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. PEG의 분자량 범위가 1,000 내지 6,000인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되면, 특히 분자량 40,000의 분지 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다.

비경구(parenteral) 경로를 통해 투여되는 의학적, 약리학적으로 유용한 단백질들은 항원성을 가지며, 대체로 수용성이 낮고 체내 잔존기간이 짧다는 단점이 있어 이를 극복하고자 하는 연구가 수행되고 있다. 미국 등록특허 4179337호에서는, PEG와 결합된 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우, PEG가 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간 증가 등의 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다. 이 특허 이후, 생리활성 단백질을 PEG와 결합시켜 그 단점을 극복하고자 하는 시도가 이루어지고 있는데, 예컨대, 리보뉴클레아제(ribonuclease)와 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 PEG와 결합시키고 있다 (Veronese et al., 1985). 또한, US 4766106호와 US 4917888호에서 단백질들에 PEG를 포함한 폴리머(polymer, 중합체)를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시킨 내용을 개시하고 있으며, 미국 등록특허 4902502호에서 PEG나 다른 중합체들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존 기간을 증가시키고 있다.

반면에 PEG와 단백질의 결합에는 이와 같은 장점 외에 결점도 존재한다. 즉 PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 라이신(lysine, Lys) 잔기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이 때 단백질의 표면 부위 중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위로 일어나게 되므로 결합 위치에 따라 많은 종류의 PEG-단백질 배합체(conjugate)들이 혼합물로 존재하게 되고, 따라서 원하는 배합체를 순수 분리하는 과정이 복잡하고 어려워지게 된다.

트레일의 경우에도 위에서 언급한 바와 유사한 PEG 결합에 따른 문제점을 내포하고 있다. 천연 트레일의 경우 11개의 라이신 잔기를 갖고 있으며, 이들 중 상당부분이 트레일과 리셉터간의 상호작용에 관여하거나 활성부위에 존재하는 것으로 알려진다 (S.G. Hymowitz, et al. Molecular Cell 1999, 4, 563-571). 따라서 라이 신 잔기와의 반응을 통한 PEG 분자의 도입은 트레일의 생리활성에 매우 중요한 저해요인으로 작용할 수 있다. 트레일 superfamily인 TNF의 경우에도 라이신 잔기와의 PEG 분자간의 결합을 통한 활성화 저해에 관한 여러 연구들이 보고되고 있다 (Y. Yamamoto, et al. Nature Biotechnology 2003, 21, 546-552; H. Shibata et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 8293-8300).

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하기 위해 인간 트레일에 하나의 PEG 분자를 아미노 말단에 결합시켰을 뿐만 아니라, 그 PEG 분자의 말단에 RGD 펩타이드가 결합된 RGD-PEG-트레일을 제조 및 분리하였으며, 제조과정의 최적화 및 최종 산물의 효능 분석을 통하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 트레일의 N-말단에만 선택적으로 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체를 결합시킴으로써, 약물의 표적성을 증가시키고 간세포 및 간의 망상내피세포계 (Reticuloendothelial system)에 의한 약물의 흡수 및 제거율을 낮추어 트레일에 의한 간독성을 감소시키고 용해도 및 안정성을 획기적으로 증가시켜 다양한 형태의 장기간 보존이 가능하면서도 약물의 약물동력학적 거동(pharmacokinetic profiles)을 개선시켜 약물의 투여 횟수가 감소되고 지속적인 약효 발현이 가능한 RGD-PEG-트레일 결합체를 제조하고 이를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에는, 트레일의 N-말단에만 선택적으로 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체가 공유 결합된 트레일 유도체를 제공한다.

여기에서 트레일은 천연형 또는 유전자 변형으로 얻어지는 재조합 트레일일 수 있으며, 트레일의 삼량체 형성을 유도하는 지퍼(zipper) 아미노산 배열 또는/및 분리 정제를 용이케 하는 말단기가 포함된 트레일일 수 있다.

상기 RGD 또는 RGD 유도체는 직선형(linear) 또는 환형(cyclic)에서 선택될 수 있으며 이런 형태는 하나 혹은 2이상의 환 구조일 수 있다. 또한 cRGD 또는 cRGD 유도체는 cRGDyK, cRGDfK, c(RGDf-n(Me)-V), RGD4C, RGD10, 및 RGD-미메틱 등을 포함하며 바람직하게는 cRGDyK이다. 그러나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 PEG 또는 PEG 유도체는 직선형(linear) 또는 가지형(branched)에서 선택될 수 있으며 가지의 형태는 2 이상의 다중 가지일 수 있다. PEG 또는 PEG 유도체의 분자량 범위는 1000 내지 40000이며 바람직하게는 2000 내지 10000이다. 또한, PEG 유도체는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석신이미딜 프로피오네이트(methoxyPEG succinimidyl propionate, mPEG-SPA), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시석신이미드(methoxyPEG N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드(methoxyPEG aldehyde, mPEG-ALD), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(methoxyPEG maleimide, mPEG-MAL) 및 다중가지형 PEG 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

적정 pH의 완충액에 용해된 RGD에 분자량 1000 내지 40000, 바람직하게는 분자량 5000 내지 40000의 PEG 또는 PEG 유도체를 사용하고 환원제 NaCNBH3를 이용하여 RGD-PEG-ALD 결합체를 합성하며, 이 때 RGD/PEG의 반응 몰비는 2.5내지 20, 더욱 바람직하게는 5 내지 10이다. 또한, RGD/PEG의 반응 시간은 1시간 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 6시간 내지 12시간이다.

본 발명에서는, 트레일의 N-말단만 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체를 결합시킴으로써 트레일 자체의 생리활성은 유지한 채 약물의 표적성을 증가시키고, 용액상태에서의 안정성을 향상시키며, RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체가 결합된 트레일의 신장배출 저해를 통한 향상된 약동학적 거동을 가지며, 간세포에 의한 흡수 감소에 따른 간독성이 완화된 형태의 트레일을 제공할 수 있다.

즉, 단백질의 2, 3차 구조상의 라이신 잔기의 곁사슬(side chain)에 존재하 는 입실론-아미노기와 반응하지 않는 N-말단 특이적으로 수식된 트레일을 제조함으로써, 트레일 자체의 생리활성도에 영향을 미치지 않으면서 간세포 및 간의 망상내피세포계에 의한 약물의 흡수 및 제거율을 낮추어 트레일의 부작용인 간독성을 획기적으로 줄일 수다.

또한, 본 발명은 트레일의 N-말단에만 특이적으로 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체를 결합시키는 방법에 관한 것이다.

적정 pH의 완충액에 용해된 트레일에 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체를 사용하고 환원제 NaCNBH3를 이용하여 RGD-PEG-트레일 결합체를 합성하며, 이 때 RGD-PEG/트레일의 반응 몰비는 2.5 내지 10, 더욱 바람직하게는 5 내지 7.5이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체가 결합된 트레일을 유효성분으로 하는 항암 또는 항염증 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효량의 본 발명의 RGD-PEG 또는 RGD-PEG 유도체가 결합된 트레일 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체로 구성될 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 약제조성물은 통상의 방법으로 주사제, 캅셀제, 정제, 액제, 환제, 연고제, 안연고제, 점안제, 경피흡수제, 페이스트제, 카타플라스마제, 첩부제, 에어로솔제 등의 형태로 제제화 할 수 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 약제조성물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로는 1주 내지 2주에 1회 투여로도 유효투여량의 투여가 가능하다. 그리고 1일 유효투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 유효성분으로 하여 항암 또는 항염증 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

상기에서 언급된 항암 또는 항염증 질환은 본 발명이 속하는 기술 분야의 전문가에게 알려진 트레일에 의해 치료되는 질환을 의미하며, 보다 구체적으로는 대장암세포, 신경교종암세포(glioma cancer), 폐암세포, 전립선암세포, 뇌종양, 및 다발성 골수종 암종 또는 실험적 자가면역 뇌수막염, 류마티스 관절염 및 제 1형 당뇨병 등의 T-세포 기인성 자가면역 질환 등을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 cRGDyK-PEG-트레일의 경우 cRGDyK-PEG화 되지 않은 천연 트레일에 비하여 약물의 표적성이 향상되고, 매우 우수한 용해도 및 안정성을 유지하며, 천연 트레일과 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서 약물의 체내 반감기를 획기적으로 증가시켜 트레일에 의한 항암 및 항염증 효과를 극대화시켜 다양한 종류의 암, 관절염 등의 질병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 일부 실험방법과 조성을 나타낸 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> cRGDyK-PEG-ALD의 합성

본 실시예에서 사용한 cRGDyK와 PEG 프로피온 알데히드(propionaldehyde-PEG-propionaldehyde, ALD-PEG-ALD, MW 3400, Shearwater사, 미국)의 화학 구조 및 반응식은 도 1과 같다. 500 μl의 cRGDyK (1 mg/ml in PB, pH 7.5) 용액을 ALD-PEG-ALD 용액에 첨가한 후 잘 섞어 준다. 이 때, 환원제로 NaCNBH3 (Sigma사, 미국)를 최종 20 mM이 되도록 첨가하여 준다. 반응은 4 ℃에서 약 4 ~ 12시간 동안 진행하였다. mPEG-ALD에 대한 cRGDyK의 첨가량은 2.5배에서 10배의 다양한 범위에서 반응을 진행하였다.

<실시예 2> cRGDyK-PEG-ALD의 분리 및 정제

실시예 1을 통해 제조된 cRGDyK-PEG-ALD는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC: high performance liquid chromatography)를 이용하여 분리 및 정제하였다. 칼럼은 Jupiter RP-18 (250 × 10 mm, 5 μm, Phenomenex, USA)과 Capcell-pak RP-18 (250 × 4 mm, 5 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였으며, 이동상 조건은 20 ~ 50 % 용매 B(0.1% TFA가 첨가된 아세토나이트릴)와 80 ~ 50 % 용매 A (0.1% TFA가 첨가된 증류수)로 1 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. 각각의 피크는 UV흡광계 215 nm를 이용하여 정량하였다.

도 2는 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응비에 따라 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 기타 부산물들을 각각 분리한 역상 크로마토그래피이다. 도 3은 도 2를 바탕으 로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응비에 따른 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기 변화를 도식화한 것이다. 도 3에서와 같이 반응비에 따라 미반응 cRGDyK의 크기는 점점 감소하고 cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기는 점점 증가하는 것을 알 수 있다. 이 때 가장 적합한 cRGDyK/PEG-ALD의 반응 몰비는 5 ~10이다.

도 4는 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따라 미반응 cRGDyK와 cRGDyK-PEG-ALD를 각각 분리한 역상 크로마토그래피이다. 도 5는 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 미반응 cRGDyK의 크기 변화를 도식화한 것이다. 도 6은 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 cRGDyK-PEG-ALD의 크기 변화를 도식화한 것이다. 도 7은 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기 변화를 도식화한 것이다. 도 7에서와 같이 반응시간에 따라 미반응 cRGDyK의 크기는 점점 감소하고 cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기는 점점 증가하는 것을 알 수 있다. 이 때 가장 적합한 cRGDyK/PEG-ALD의 반응시간은 6시간이다.

<실시예 3> cRGDyK-PEG-ALD-트레일의 합성

새로 분리한 트레일을 200 μg/ml의 농도로 희석한 용액(50 mM 아세테이트 완충용액, pH 5.0)에 cRGDyK-PEG-ALD 용액을 첨가한 후 잘 섞어준다. 이 때, 환원제로 NaCNBH3를 최종 20 mM이 되도록 첨가하여 준다. 반응은 4 ℃에서 약 8 내지 12시간 동안 진행하였다. 트레일에 대한 cRGDyK-PEG-ALD의 첨가량은 2배에서 10배의 다양한 범위에서 반응을 진행하였다.

<실시예 4> cRGDyK-PEG-ALD-트레일의 분리 및 정제

실시예 4를 통해 제조된 cRGD-PEG-트레일은 크기 배재 크로마토그래피(size exclusion chromatography, 용출 용액은 150 mM NaCl이 포함된 pH 6.0의 인산 완충용액)를 이용하여 분리 및 정제하였다.

<실시예 5> PEG-트레일과 cRGDyK-PEG-트레일의 생리활성 비교(세포괴사 실험)

PEG-트레일과 cRGDyK-PEG-트레일의 생리활성, 즉 세포괴사 실험은 인간 대장암 세포인 HCT116 세포주와 인간 제대혈 내피세포인 HUVEC을 이용하여 실시하였다. 세포주의 배양에는 RPMI-1640(HCT 116 세포주) 및 EGM-2(HUVEC)를 사용하였다. 실험을 위하여 각각의 세포주를 96 웰(well) 플레이트의 각 웰에 1 × 104개씩의 세포를 분주한 후 약 24시간의 배양을 통하여 분주된 세포를 안정화 하였다. 상기의 배양과정 후 각각의 세포에 최종 1 ng/mL 내지 1 μg/mL의 농도가 되도록 PEG-트레일과 cRGDyK-PEG-트레일을 투여한 후 약 24시간 동안 배양하였다. 약물처리 후 각각의 웰에 20 μL의 MTS 용액(Promega 사로부터 구입)을 첨가한 후 약 2시간 후에 490 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였으며, 이 값을 이용하여 세포 생존율을 도출하였다.

도 8 에 나타낸 바와 같이 PEG-트레일과 cRGDyK-PEG-트레일은 HCT 116 세포에서 유사한 경향의 농도 의존형 세포 독성을 나타낸다. 그러나 도 9에서와 같이 HUVEC 세포에서는 세포 독성 경향이 거의 나타나지 않았다. 이러한 실험 결과는 PEG-트레일과 cRGDyK-PEG-트레일이 대장암세포에서는 강한 독성을 나타내지만 일반 세포에서는 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.

도 1은 실시예 1에서 사용한 cRGDyK와 PEG-ALD의 화학 구조에 관한 것이다.

도 2는 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응비에 따라 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 기타 부산물들을 각각 분리한 역상 크로마토그래피이다.

도 3은 도 2를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응비에 따른 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기 변화를 도식화한 것이다.

도 4는 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따라 미반응 cRGDyK와 cRGDyK-PEG-ALD를 각각 분리한 역상 크로마토그래피이다.

도 5는 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 미반응 cRGDyK의 크기 변화를 도식화한 것이다.

도 6은 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 cRGDyK-PEG-ALD의 크기 변화를 도식화한 것이다.

도 7은 도 4를 바탕으로 cRGDyK와 PEG-ALD의 반응시간에 따른 미반응 cRGDyK, cRGDyK-PEG-ALD 및 부산물들의 크기 변화를 도식화한 것이다.

도 8은 인간 대장암세포인 HCT 116 세포주를 이용한 세포독성 시험에 있어서 약물 농도에 따른 결과이다.

도 9는 인간 제대혈관 내피세포인 HUVEC을 이용한 세포독성 시험에 있어서 약물 농도에 따른 결과이다.

Claims

N-말단에만 알지디-폴리에틸렌 글리콜(RGD-PEG) 또는 이의 유도체가 결합된 RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, RGD는 cRGDyK, cRGDfK, c(RGDf-n(Me)-V), RGD4C, RGD10 및 RGD-미메틱(mimetic)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, RGD는 cRGDyK 또는 cRGDfK인, RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, PEG는 폴리에틸렌 글리콜 다이알데히드(ALD-PEG-ALD)인 RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, PEG의 분자량이 2000 내지 10000인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체
제1항에 있어서, 트레일은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 트레일인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, 트레일은 서열 1의 아미노산 114 내지 281을 갖는 인간 트레일인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체.
제1항에 있어서, 트레일은 N-말단에 삼량체 형성 유도 지퍼 아미노산 배열을 부착한 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체.
트레일의 N-말단 아민과 RGD-PEG의 알데하이드기를 환원제 하에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, PEG의 분자량이 2000 내지 10000인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, 트레일은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 트레일인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, 트레일은 서열 1의 아미노산 114 내지 281을 갖는 인간 트레일인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, 트레일은 N-말단에 삼량체 형성 유도 아미노산 배열을 부착한 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, RGD-PEG/트레일의 반응 몰비가 2 내지 10인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
제9항에 있어서, 환원제가 NaCNBH3인 것을 특징으로 하는, RGD-PEG-트레일 결합체 제조 방법.
RGD-PEG-트레일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암 또는 항염증 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
RGD-PEG-트레일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 실험적 자가면역 뇌수막염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) 및 제 1형 당뇨병의 T-세포 기인성 자가면역 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.