KR20220088329A

KR20220088329A - Pd-l1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR20220088329A
Application number: KR1020210178399A
Authority: KR
Inventors: 김소연; 김민성; 이병헌; 유재도
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-06-27

Abstract

본 발명은 PD-L1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도에 관한 것으로서, 유방암, 대장암, 신장암, 교모세포종 등과 같은 다수의 암에 과발현되는 면역 체크포인트 수용체 PD-L1에 결합하는 펩타이드 2(PD-L1pep2: CVRARTR)를 인간 페리틴 모노머에 융합하여 케이지를 형성시 24개의 PD-L1pep2가 디스플레이되는 나노케이지를 제조하였다. 본 발명의 나노케이지는 대장암 조직에 효과적으로 타겟팅하여 항암효과를 보였으며, 나노케이지 내부에 항암제 독소루비신을 탑재하면, 동량의 PD-L1 항체보다 우수한 항암 효과를 보였다. 이에, 항체를 이용한 면역 체크포인트 블록킹 치료요법의 한계를 극복하는 차세대 약물로서 기대된다.

Description

PD-L1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도{The immunotherapeutic nanocage displaying PD-L1 binding peptide 2 and use in anti-cancer immunotherapeutic agent thereof}

본 발명은 PD-L1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도에 대한 것으로서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지의 면역 체크포인트 제어 및 약물전달 복합 항암 면역치료 용도에 관한 것이다.

케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수십에서 수백 배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 자연계에서 바이러스 캡시드(capsid) 단백질, 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein), Dps 단백질이 이에 해당되며, 케이지(cage)를 구성하는 각각의 단일체들은 인접 단일체들과 매우 규칙적이고 정밀한 상호작용을 이루고 있고 케이지(cage)의 내부는 비어있는 구조이다. 상기와 같은 케이지 단백질의 용기(container)와 같은 성질에 의해 내부와 외부가 격리되는 특징을 가지고 있어, 약물 전달체로 의학분야에서 활용 빈도가 높다.

케이지 단백질 응용 물질 수송 분야는 바이러스성 수송체 (viral vector)와 비 바이러스성 수송체 (non-viral vector)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 바이러스성 수송체로는 아데노바이러스 (adenovirus) 등이 많이 연구되고 있고, 비 바이러스성 수송체로는 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein) 등에 관하여 연구되고 있다. 그러나 기존의 바이러스성 수송체일 경우에는 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되어 왔다.

페리틴 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 subunit으로 구성되며, subunit은 그 구조에 따라 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)로 구분된다.

한편, 암 면역치료의 발달은 암 치료의 역사에서 중요한 변곡점에 도달했다. 면역 체크포인트 분자의 하나인 프로그램된 세포사멸(Programmed cell death; PD-1)은 여러 암에서 매력적인 치료 표적이 되었다. PD-1은 활성화시 T 세포에서 상향 조절되고, 종양-침윤 림프구에서 일반적으로 나타나는 소진된 T 세포에 많이 존재한다. PD-1과 이의 리간드인 PD-L1의 상호작용을 차단하면, 일부 환자에게서는 우수한 항종양 반응 및 임상 효과를 확인할 수 있었다.

이에, PD-L1에 결합하여, PD-1 및 PD-L1의 상호작용을 차단하는 펩타이드의 면역관문억제 기능 증대 및 안정성을 높이고, 암조직에 효과적으로 수송할 수 있는 약물전달 플랫폼의 개발이 필요한 상황이다.

한국등록특허 제10-1811050호 (2017.12.14 등록)

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드 및 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드 및 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

도 1은 PD-L1 결합 펩타이드 2(PD-L1pep2)을 N-말단과 C-말단의 접합점에 각각 삽입한 융합단백질(Pp2NF, Pp2CF)을 디자인하고, 제조하여 구조, 생물리적 특성 및 결합력의 차이를 규명한 결과를 나타낸다. A) Pp2NF, Pp2CF에 대한 유전자 서열 모식도를 나타낸다. B) 대장균에서 Pp2NF, Pp2CF의 안정적인 발현 및 정제를 검증한 결과를 나타낸다. C) Pp2NF, Pp2CF의 3차 구조모델링 결과를 나타낸다.
도 2는 제조된 각각의 Pp2NF, Pp2CF 융합단백질을 TEM과 DLS로 케이지 형성 여부 및 파티클 크기를 관찰한 결과를 나타낸다. A) 투과전자현미경(TEM) 분석 결과를 나타낸다. B) 동적 광 산란(DLS) 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 제조된 Pp2NF 융합단백질에 대한 결합력 비교 분석 결과를 나타낸다. (A) 배양세포 결합 분석 결과를 나타낸다. (B) 표면플라즈몬공명장치를 통한 단백질 결합 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 In vitro에서의 Pp2NF 면역관문저해기능을 확인한 결과를 나타낸다. A) 암세포와 면역세포를 동시에 배양한 후 Pp2NF의 활성을 관찰하기 위한 모식도를 나타낸다. B) Pp2NF의 면역관문억제 효과를 확인하기 위해, 효소결합면역흡착검사법을 이용하여 분리한 T 세포에서 분비되는 인터페론 감마의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 Pp2NF의 대장암 타켓팅 효과를 나타낸다.
도 6은 Pp2NF의 교모세포종(Glioblastoma) 타켓팅 효과를 나타낸다.
도 7은 Pp2NF의 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과를 나타낸다.
도 8은 혈액 및 혈청 분석을 통한 Pp2NF의 생독성 확인 결과를 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

바람직하게는, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 인간 페리틴 중쇄 단편 및 상기 PD-L1 결합 펩타이드 사이에 링커가 추가로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 3 (GG) 또는 서열번호 4 (GGGSGGGGSG)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공한다. 상세하게는, 상기 페리틴 나노케이지는 페리틴 외부 표면에 PD-L1 결합 펩타이드가 융합된 형태일 수 있다.

본 발명에 있어서, ‘페리틴(ferritin)’은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)로 구분된다. 본 발명에서 상기 페리틴 단백질은 이들 각각이 단위체로써 케이지(cage) 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명에서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)을 사용하였다.

본 발명에 있어서, ‘PD-L1 결합 펩타이드’는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(CVRARTR)로 이루어진 펩타이드로서, 본 명세서 내에서는 "PD-L1 결합 펩타이드 2" 또는 "PD-L1pep2"로 표시하였다.

본 발명에 있어서, "나노케이지(nanocage)"는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 캡시드(capsid) 단백질, 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein), Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 나노케이지(nanocage)는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 상기 나노케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 “자가조립(self-assembly)”이란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도없이, 스스로 알아서 특정한 나노구조를 형성하는 성질을 의미한다.

본 발명의 나노케이지는 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 융합 폴리펩타이드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열하여 형성된 것일 수 있다.

상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

바람직하게는, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 약학조성물은 PD-1 및 PD-L1의 결합을 억제하고, 면역관문을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1 ng/kg~10 g/kg 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 페리틴 나노케이지는 약물을 암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 페리틴 나노케이지에 종래 공지의 약물을 탑재하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 페리틴 나노케이지에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 페리틴 나노케이지에 탑재될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> PD-L1 결합 펩타이드 2를 융합한 면역 체크포인트 ( Pp2NF , Pp2CF) 단백질 디자인 및 정제

1. 실험방법

(1) Pp2NF, Pp2CF DNA 제작

인간의 mRNA에서 역전사한 cDNA library에서 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161) 유전자 서열 혹은 인간 페리틴 중쇄(1-183) 유전자 서열을 PCR로 증폭하여 얻었으며, 유전자 재조합 공법을 이용하여 pET-28a 플라스미드에 삽입하였다. PD-L1에 결합하는 펩타이드2의 유전자 서열은 화학적으로 합성하였고, 제한효소 KpnI과 NheI을 사용하여 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)의 질소말단에 삽입하거나 제한효소 EcoRI과 XhoI을 사용하여 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)의 탄소말단에 삽입하였다. 펩타이드를 페리틴의 질소말단에 삽입할 때에는 그 사이에 GG서열의 펩타이드를 삽입하여 자유도의 증가를 꾀했으며, 페리틴의 탄소말단에 펩타이드를 삽입할 때에는 좀 더 긴 flexible linker(GGGSGGGGSG)를 삽입하여 자유도의 증가와 함께 펩타이드가 페리틴의 내부로 숨겨지는 것을 방지하였다. 페리틴의 질소말단에 펩타이드를 삽입한 컨스트럭트(construct)는 Pp2NF, 페리틴의 탄소말단에 펩타이드를 삽입한 컨스트럭트(construct)는 Pp2CF로 명명하였다.

(2) Pp2NF, Pp2CF 단백질 정제

Pp2NF, Pp2CF의 DNA 서열이 삽입된 각각의 플라스미드로 형질전환된 대장균(BL21)을 LB 배지에 접종한 뒤 진탕배양기에서 37℃에서 배양했다. OD₆₀₀ 값이 0.5가 되었을 때, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 단백질이 과발현되도록 하였다. 배양을 끝낸 대장균에 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가하고 초음파로 분쇄하였다. 원심분리 후 상층액(용균액)을 모아 Ni-NTA bead와 4℃에서 1시간 동안 섞었다. 크로마토그래피 컬럼으로 비드(bead)와 결합하지 않은 용균액은 걸러내고, 이미다졸이 30 mM 첨가된 세척 완충액(wash buffer)으로 비드(bead)를 씻었다. 0.1% Triton X-114가 포함된 세척 완충액(wash buffer)으로 대장균의 내독소를 제거하고 세척 완충액(wash buffer)으로 Triton X-114를 제거하였다. 이미다졸이 각각 100 mM, 200 mM, 500 mM 포함된 용출 완충액(elution buffer)으로 각각 단백질을 용출, 정제하였다. Pp2NF, Pp2CF 각각의 단백질을 SDS-PAGE로 95% 균질한 정제 단백질을 회수하였다.

또한 인간 페리틴 중쇄(1-183) 유전자의 4번, 5번 나선에 해당하는 유전자 사이에 제한효소 BamHI과 ApaI을 이용하여서 PD-L1 결합 펩타이드 2의 유전자 서열을 삽입하여 Pp2LF 컨스트럭트를 클로닝하였으나 대장균에서 발현에 실패함을 확인하고 더 이상의 실험에서 제외하였다.

2. 실험결과

인간의 페리틴 중쇄(heavy chain) 단편은 24개의 단량체가 중합하여 케이지를 형성할 때 표면에 펩타이드 표지가 가능한 세 가지 접합점이 N-말단, 4번, 5번 헬릭스(helix)를 연결하는 루프(loop), C-말단에 존재한다. 본 발명을 통해 PD-L1 결합 펩타이드 2(PD-L1pep2)를 이 중 N-말단과 C-말단의 접합점에 각각 삽입한 융합단백질 (Pp2NF, Pp2CF)을 디자인하고, 제조하여 구조, 생물리적 특성 및 결합력의 차이를 규명하였다(도 1).

Pp2NF, Pp2CF에 대한 유전자 서열 모식도는 도 1A와 같다.

SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 Pp2NF 및 Pp2CF 단백질의 전기영동을 수행하고, 쿠마시 브릴라이언트 블루로 젤을 염색하여 단백질 밴드를 확인하였을 때, 각 단백질의 이론적인 단량체 크기와 같은 위치에서 단백질 밴드를 확인함으로써 대장균에서의 안정적인 발현 및 정제를 검증하였다(도 1B).

모델링 프로그램으로 MODELLAR v12를 사용한 Pp2NF, Pp2CF의 3차 구조모델을 통해, Pp2NF는 펩타이드가 자유롭게 표면에 디스플레이 되는 반면 Pp2CF는 Pp2NF에는 못 미치는 것을 확인하였다(도 1C).

< 실시예 2> 제조된 각각의 융합단백질을 TEM과 DLS로 케이지 형성 여부 및 입자 크기 관찰

Pp2NF, Pp2CF 두 단백질이 과발현된 대장균에서 Ni-NTA bead를 이용하여 각각의 단백질을 정제하고, 이 융합 단백질들이 페리틴 나노케이지를 이루는지 확인하기 위하여 투과전자현미경(TEM) 분석을 수행하였다(도 2A). 각각의 단백질이 나노케이지를 이루는 것을 확인하였고, 동적 광 산란(DLS) 분석을 통해 각각의 나노케이지 크기가 Pp2NF는 28.4nm, Pp2CF는 37.5nm인 것을 확인하였다(도 2B).

< 실시예 3> 제조된 각각의 융합단백질 결합력 비교 분석

1. 배양세포 결합 분석

(1) 실험방법

공초점 레이저 주사 현미경 촬영(Confocal)을 수행하였다. 삼중음성 유방암 세포(MDA-MB 231) 혹은 대장암 세포를(CT26) 배양 후, Interferon-γ를 25 ng/ml의 농도로 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹을 37℃에서 48시간 배양하였다. 이 세포들은 PD-L1 수용체를 발현하는 암세포들로서 Interferon-γ 처리시 그 발현이 증가하는 것이 알려져 있다. PD-L1이 발현되지 않는 유방암 세포인 MCF-7을 대조군으로 관찰하였다.

(2) 실험결과

Pp2NF가 PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231과 CT26 세포에서 Pp2CF보다 강하게 결합함을 검증하였다. PD-L1을 발현하지 않는 MCF-7 세포에서는 Pp2NF와 Pp2CF가 결합하지 않았으므로, 이 결합이 PD-L1에 의한 결합이라는 것을 알 수 있었다(도 3A).

2. 표면플라즈몬공명장치를 통한 단백질 결합 분석

(1) 실험방법

PD-L1 단백질을 EDC-NHS로 활성화된 표면플라즈몬공명용 금센서칩 표면에 부착시키고, 에탄올라민(Ethanolamine; pH 8.5)으로 차단하였다. 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM DTT 용액에 녹아있는 Pp2NF 단백질을 각각 PD-L1 단백질이 결합된 금센서칩에 흘려서 결합 kinetics를 분석하였다. PD-L1 단백질이 붙어있지 않은 오른쪽 채널을 대조군(reference)으로 사용하여 공명 측정값을 보정하였다.

(2) 실험결과

Pp2NF와 PD-L1과의 결합을 직접적으로 측정한 결과, 결합력(Kd)은 5.67±1.13×10^-8M이었다(도 3B).

< 실시예 4> In vitro에서의 Pp2NF 면역관문저해기능 확인을 위해, 암세포와 면역세포를 동시에 배양한 후 Pp2NF의 활성 관찰

BALB/C 생쥐를 희생하여 얻은 비장에서, CD8⁺ T 세포를 추출하였다. 추출한 CD8⁺ T 세포에 인터루킨-2와 항CD-3 항체/항CD-28 항체를 각각 1시간씩 처리하여 활성화하였다. 활성화된 CD8⁺ T 세포와 종양세포(CT26, 생쥐 결장암)를 공생배양하기에 앞서, 종양세포에 항PD-L1 항체(10 μg/ml) 또는 Pp2NF(25 nM)를 각각 전처리하여 종양세포의 PD-L1과 활성화된 CD8⁺ T 세포의 PD-1의 상호작용을 저해하였다. 48시간 동안 공생배양한 후, CD8⁺ T 세포를 분리하였다(도 4A). 효소결합면역흡착검사법을 이용하여 분리한 T 세포에서 분비되는 인터페론 감마의 양을 측정하였다(도 4B).

쥐에서 분리한 CD8⁺ T cell을 활성화시키고 (IL-2 처리와 anti-CD3/anti-CD28 처리), CT26 대장암 세포와 함께 배양하였다. 이때 암세포의 PD-L1과 T-cell의 PD-1이 결합하여 면역억제효과를 보였다. Pp2NF 혹은 PD-L1 항체를 처리하면 PD-1/PD-L1 결합을 저해함으로써 면역활성효과 즉, T-cell 증식(proliferation)과 IFN-γ 증대가 나타났다.

이를 통해 PpNF가 면역관문억제 효과가 있음을 검증하였고, PD-L1 항체보다 Pp2NF 의 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> Pp2NF의 종양 타겟팅 효과 확인

1. Pp2NF의 대장암 타켓팅 효과

PBS 100㎕에 담긴 CT26 대장암 세포 1×10⁶개를 6주령이 된 BLAB/c 생쥐의 오른쪽 허벅지에 피하주사 하였다. 종양의 크기가 200㎣ 가량 되었을 때, 형광으로 표지되어 Saline에 녹아 있는 Pp2NF(10 mg/kg), Ferritin wildtype (wFTH, 10 mg/kg) 단백질을 각각 200㎕씩 각각의 생쥐에 꼬리정맥으로 주사하였다.

IVIS 형광 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 1, 3, 6, 24시간의 단백질의 생체 내 분포를 조사하였다. 그리고 24시간 후에 생쥐를 희생시키고 종양, 심장, 폐, 간, 신장, 비장을 꺼내어 기관 내 단백질이 얼마나 남아있는지를 조사하였다.

Pp2NF가 wild type Ferritin (EPR 효과에 의한 종양표적) 보다 종양표적 능력이 증가하였음을 알 수 있었다(도 5).

2. Pp2NF의 교모세포종( Glioblastoma ) 타켓팅 효과

C57BL/6 마우스 뇌 좌측에 교모세포종(Glioblastoma) 세포주인 CT-2A을 주입하여 orthotopic GBM model을 만들고 형광 표지한 PpNF와 Pp2NF을 꼬리정맥으로 주사하였다(대조군: saline). 24시간 후 뇌에서 형광 시그널이 관찰되었으며, PpNF와 Pp2NF가 뇌 좌측의 tumor site에 암크기에 비례하여 타겟팅됨을 관찰하였고, Pp2NF의 타겟팅 효과가 우수함을 관찰하였다(도 6).

< 실시예 6> Pp2NF의 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과 확인

(1) 실험방법

CT26 세포를 BALB/c 야생형 생쥐의 오른쪽 허벅지에 위쪽에 피하주사하였다. 종양의 크기가 100㎣ 가량 되었을 때, 무작위로 4그룹으로 나누었다. Saline, Saline에 녹아있는 Pp2NF (10㎎/㎏), wt Ferritin (10㎎/㎏), 그리고 치료용 항PD-L1 항체를 각각의 생쥐에 꼬리정맥으로 주사하였다(도 7A). 이틀에 한 번씩 총 10회(항PD-L1 항체는 4일에 한 번씩 6회) 주사하면서 종양의 크기와 생쥐의 몸무게를 측정하였다(도 7B 및 도 7D). 3주가 지난 후 생쥐를 희생하여 종양을 적출하고 종양의 무게를 측정하였고(도 7C), 항암치료효과 후의 쥐의 생존률을 측정하였다(도 7E). 적출한 종양의 세포외기질을 콜라게나아제로 분해하여 단일 세포로 만들고, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 의 표지 단백질에 대한 항체를 각각 처리하고 유세포 분석기로 각각의 T 세포가 종양에서 얼마나 존재하는지 분석하였다(도 7F).

(2) 실험결과

Pp2NF 단독으로도 대조군에 비하여 종양의 유의하게 성장이 저해되었고(p<0.01), 항PD-L1 항체를 투여한 그룹보다 항암 효과가 우수하였고(도 7B), 3주 후의 종양의 무게도 가장 작았으며(도 7C), Pp2NF를 투여한 그룹의 생존률이 가장 높았다(도 7E). 종양 내에서의 CD8+ T 세포와 조절 T 세포(Treg)의 비율이 대조군에 비해 유의하게 증가하였지만 항PD-L1 항체 그룹에는 미치지 못하였다(도 7F). Pp2NF, wt Ferritin 모두 대조군 생쥐에 비해 몸무게의 변화는 없었다(도 7D). 이 결과를 통하여 Pp2NF가 생체 내에서 면역 관문을 억제효과가 있으며, 항PD-L1 항체 보다 종양의 성장을 저해하는 효과가 크다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 7> 혈액 및 혈청 분석을 통한 Pp2NF의 생독성 확인

항종양 동물실험 이후 생쥐를 희생할 때 각 그룹에서 혈액과 혈청을 채취하고, 혈액에 있는 적혈구와 헤모글로빈, 헤마토크릿, 백혈구, 중성구 등과 혈청에 있는 혈액요소질소, 크레아티닌, 알라닌아미노전달효소, 아스파르테이트아미노전달효소의 양을 측정하여 비교하였다.

Pp2NF를 처리한 생쥐그룹에서 간독성이나 신장독성은 관측되지 아니하였고, 혈액학적으로도 큰 변화는 대조군 (Saline, wFTH)과 비교시 없었다(도 8).

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> The immunotherapeutic nanocage displaying PD-L1 binding peptide 2 and use in anti-cancer immunotherapeutic agent thereof <130> ADP-2021-0829 <150> KR 10-2020-0178563 <151> 2020-12-18 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1 binding peptide 2 <400> 2 Cys Val Arg Ala Arg Thr Arg 1 5 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Gly Gly 1 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 4 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 인간 페리틴 중쇄 단편 및 상기 PD-L1 결합 펩타이드 사이에 링커가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage).
제4항에 있어서, 상기 페리틴 나노케이지는 페리틴 외부 표면에 PD-L1 결합 펩타이드가 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 페리틴 나노케이지(nanocage).
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터.
제7항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함).
제4항의 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제9항에 있어서, 상기 약학조성물은 PD-1 및 PD-L1의 결합을 억제하고, 면역관문을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제4항의 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제12항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제12항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제4항의 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.