KR101811050B1 - 항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 별명으로, 보다 상세하게는 인간 유래 페리틴 모노머의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번 째 헬리스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편의 N말단 및/또는 C말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드 및 이의 염증성 질환 예방 및 치료 용도에 관한 발명이다.
이상 살펴본 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드는 서로 다른 기전으로 작용하는 두 종류의 항염증성 폴리펩티드를 하나의 나노 케이지에 융합하여 투여할 수 있어 패혈증을 포함한 염증성 질환의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Fusion-polypeptide of anti-inflammatory polypeptide and ferritin monomer fragment and Pharmaceutical Composition comprising the same}
본 발명은 항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 별명으로, 보다 상세하게는 인간 유래 페리틴 모노머의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번 째 헬리스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편의 N말단 및/또는 C말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드 및 이의 염증성 질환 예방 및 치료 용도에 관한 발명이다.
감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알러지나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 단핵구, 호중구, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.
염증 부위에서 발현되는 염증 매개인자, 즉, 싸이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 활성산소중간생성물, 싸이클로옥시게나아제-2(cycloxygenase-2, COX-2), 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase, 5-LOX), 매트릭스 매탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase, MMP) 등은 염증반응의 발생 및 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 염증 매개인자들의 발현은 전사인자인 NF-κB(nuclear factor κB), STAT3(signal transducer and activator of transcription 3), AP-1(activator protein1), HIF-1a(hypoxia-inducible factor 1a) 등에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다.
한편, 패혈증(sepsis)은 감염된 미생물에 대항하는 신체의 비정상적인 방어작용에 의해 발생하는 전신성 염증반응이다. 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 이로 인해 전신에 심각한 염증 반응이 나타난다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상, 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 또는 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라하고, 이러한 전신성염증반응증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 잠재적으로 패혈증성 쇼크(septic shock)를 유발할 수 있다. 패혈증이 심해지면 신체의 여러 기관(심장, 신장, 간, 뇌, 폐 등)의 기능이 나빠지고 더욱 심해지면 쇼크 상태가 되는 것이다. 다양한 종류의 병원체로 인해 패혈증이 발병할 수 있는데, 가장 발생률이 높은 것은 박테리아에 의한 것이지만 그 외에도 바이러스나 곰팡이에의해서도 일어날 수 있다. 폐에 감염을 일으키는 폐렴, 방광과 신장에 감염을 일으키는 요도감염, 피부에 일어나는 봉소염, 복부에 일어나는 충수염 또는 뇌에 일어나는 뇌막염 등이 있으며, 예를 들면 폐렴을 앓고 있는 환자가 패혈증에 걸리게 되면 뇌, 심장, 간, 폐 또는 신장에 손상이 일어나며 중증으로 진전되는 경우 환자의 약 20 ~ 50%는 패혈증성 쇼크에 의해 사망한다. 또한, 수술 후 감염에 의해 패혈증이 발생하기도 한다. 감염 또는 수술 후 감염에 의한 초급성 염증반응으로서 패혈증에 걸리게 되면 40 ~ 90%가 사망에 이르게 된다.
상기 패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증사이토카인(proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성 단백질 C(activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다.
따라서, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증 쇼크를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 치료제에 대한 필요성이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 인간 유래 페리틴 모노머의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편(short ferritin, sFt)의 N 말단 및/또는 C 말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 제작하였고, 상기 융합폴리펩티드는 N 말단 또는 C 말단에 서로 다른 폴리펩티드 약물의 융합이 가능하며, 융합된 이후에도 자가조립(self-assembly)에 의해 나노 케이지를 형성하여 약물을 효과적으로 전달할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C말단, N말단 또는 C말단 및 N말단에 트롬빈 수용체 활성화 펩티드(thrombin receptor agonist peptide, TRAP), 단백질 C Gla 도메인(PC-Gla) 폴리펩티드, 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein), C1 저해제, 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC), 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP) 및 이의 단편들로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지로서, 상기 단백질 케이지의 외부로 항염증성 폴리펩티드가 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 케이지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C말단, N말단 또는 C말단 및 N말단에 트롬빈 수용체 활성화 펩티드(thrombin receptor agonist peptide, TRAP), 단백질 C Gla 도메인(PC-Gla) 폴리펩티드, 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein), C1 저해제, 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC), 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP) 및 이의 단편들로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지로서, 상기 단백질 케이지의 외부로 항염증성 폴리펩티드가 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 케이지를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C말단, N말단 또는 C말단 및 N말단에 트롬빈 수용체 활성화 펩티드(thrombin receptor agonist peptide, TRAP), 단백질 C Gla 도메인(PC-Gla) 폴리펩티드, 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein), C1 저해제, 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC), 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP) 및 이의 단편들로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 제공한다.
서열번호 1 (인간유래 페리틴 heavy chain 모노머 단편):
MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG A
페리틴(ferritin) 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.
본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 heavy chain 모노머의 1 내지 161번째 아미노산으로 이루어진 것이며, 이는 페리틴 heavy chain 모노머의 네 번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스가 제거되어 짧아진 형태의 페리틴 모노머 단편(short ferritin, sFt)이라고 할 수 있다. 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 2 (인간유래 페리틴 heavy chain 모노머)
MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG APESGLAEYL FDKHTLGDSD NES
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편은 야생형 페리틴 모노머에서 일부 폴리펩타이드가 제거되어 변형된 형태이지만, 자가조립(self-assembly)에 의해 단백질 케이지를 형성하는 페리틴 고유의 특징은 그대로 나타내면서, 입체적인 장애가 상당히 완화되어 C 말단에 융합할 수 있는 펩티드 또는 단백질의 크기에 대한 제약이 해소되었고, 본 발명에서는 상기 페리틴 모노머 단편의 N 말단 뿐만 아니라 C 말단에도 항염증 활성을 나타내는 폴리펩티드를 융합함으로써 치료효과가 현저히 향상된 항염증성 융합폴리펩티드를 제작하였다.
본 발명에서 상기 융합폴리펩티드는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단 또는 C 말단 각각에 동일한 종류 또는 서로 다른 종류의 항염증성 폴리펩티드가 융합될 수 있으며, 이는 치료하고자 하는 염증성 질환의 종류 및 융합되는 폴리펩티드의 약리기전에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 상기 융합폴리펩티드는 당해 분야의 숙련가가 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 융합폴리펩티드는, 흔히 보다 큰 폴리펩티드의 일부로서 본 발명의 융합폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 원핵 또는 진핵 세포에서 생성시킬 수 있다.
다른 방법으로는, 이러한 융합폴리펩티드는 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 재조합 숙주내의 이종성 단백질의 발현, 폴리펩티드의 화학적 합성 및 시험관내 전사를 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌(참조 문헌: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Sprin Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing)에 추가로 기재되어 있다.
본 발명에서 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합될 수 있는 항염증성 폴리펩티드는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당업계에서 항염증 활성을 나타낸다고 알려져 있는 공지의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 장래에 규명될 신규한 항염증성 폴리펩티드도 이에 포함될 수 있다. 상기 항염증성 폴리펩티드는 그 크기가 특별히 제한되지 않아 짧은 펩티드 단편일 수 있으며, 단백질일 수도 있다.
상기 항염증성 폴리펩티드의 비제한적인 예시로는, 트롬빈 수용체 활성화 펩티드(thrombin receptor agonist peptide, TRAP), 단백질 C Gla 도메인(PC-Gla) 폴리펩티드, 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein), C1 저해제, 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC), 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP)를 들 수 있으며, 이와 동일한 생리학적 활성을 나타내는 펩티드 단편들도 이에 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 TRAP은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(TFLLRN)
본 발명에서 상기 PC-Gla 폴리펩티드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(ANSFLEELRHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHV)
본 발명에서 상기 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3)은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(MRIHYLLFAL LFLFLVPVPG HGGIINTLQK YYCRVRGGRC AVLSCLPKEE QIGKCSTRGR KCCRRKK),
본 발명에서 상기 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra)는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRI WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKM CLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAA CPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE),
본 발명에서 상기 인터루킨-4(IL-4)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(mgltsqllpp lffllacagn fvhghkcdit lqeiiktlns lteqknttek etfcraatvl rqfyshhekd trclgataqq fhrhkqlirf lkrldrnlwg laglnscpvk eanqstlenf lerlktimre kyskcss),
본 발명에서 상기 인터루킨-11(IL-11)은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(mncvcrlvlv vlslwpdtav apgpppgppr vspdpraeld stvlltrsll adtrqlaaql rdkfpadgdh nldslptlam sagalgalql pgvltrlrad llsylrhvqw lrraggsslk tlepelgtlq arldrllrrl qllmsrlalp qpppdppapp lappssawgg iraahailgg lhltldwavr gllllktrl),
본 발명에서 상기 인터루킨-13(IL-13)은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(malllttvia ltclggfasp gpvppstalr elieelvnit qnqkrplcng smvwsinlta gmycaalesl invsgcsaie ktqrmlsgfc phkvsagfss lhvrdtkiev aqfvkdlllh lkklfregrf n),
본 발명에서 상기 TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein)는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(miiliylfll lwedtqgwgf kdgifhnsiw leraagvyhr earsgkyklt yaeakavcef egghlatykq leaarkigfh vcaagwmakg rvgypivkpg pncgfgktgi idygirlnrs erwdaycynp hakecggvft dpkqifkspg fpneyednqi cywhirlkyg qrihlsfldf dleddpgcla dyveiydsyd dvhgfvgryc gdelpddiis tgnvmtlkfl sdasvtaggf qikyvamdpv skssqgknts ttstgnknfl agrfshl),
본 발명에서 상기 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC)는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
( mwqltslllf vatwgisgtp apldsvfsss erahqvlrir kransfleel rhsslereci eeicdfeeak eifqnvddtl afwskhvdgd qclvlplehp caslccghgt cidgigsfsc dcrsgwegrf cqrevsflnc sldnggcthy cleevgwrrc scapgyklgd dllqchpavk fpcgrpwkrm ekkrshlkrd tedqedqvdp rlidgkmtrr gdspwqvvll dskkklacga vlihpswvlt aahcmdeskk llvrlgeydl rrwekweldl dikevfvhpn ysksttdndi allhlaqpat lsqtivpicl pdsglaerel nqagqetlvt gwgyhssrek eakrnrtfvl nfikipvvph necsevmsnm vsenmlcagi lgdrqdaceg dsggpmvasf hgtwflvglv swgegcgllh nygvytkvsr yldwihghir dkeapqkswa p)
본 발명에서 상기 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:
(mlqlwklvll cgvltgtses lldnlgndls nvvdklepvl hegletvdnt lkgileklkv dlgvlqkssa wqlakqkaqe aekllnnvis kllptntdif glkisnslil dvkaepiddg kglnlsfpvt anvtvagpii gqiinlkasl dlltavtiet dpqthqpvav lrecasdpts islslldkhs qiinkfvnsv intlkstvss llqkeicpli rifihsldvn viqqvvdnpq hktqlqtli)
또한, 트롬빈 수용체 활성화 펩티드(thrombin receptor agonist peptide, TRAP), 단백질 C Gla 도메인(PC-Gla) 폴리펩티드, 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD3), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-13(IL-13), TSG-6(TNF-α-stimulated gene 6 protein), C1 저해제, 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC) 및 귀밑샘 분비 단백질(parotid secreted protein, PSP)의 기능적 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 3 내지 12의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서 상기 폴리펩티드들과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 펩타이드를 말한다.
본 발명은 상기 항염증성 폴리펩티드는 링커를 통해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편에 융합된 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 링커는 MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제, matrix metalloproteinase)의 기질인 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드 제공한다.
본 발명에서 상기 MMP 기질은 바람직하게는 MMP1 기질, MMP2 기질, MMP3 기질, MMP7 기질, MMP8 기질, MMP9 기질, MMP12 기질, MMP13 기질 및 공통(consensus) 기질로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 MMP2의 기질일 수 있다.
MMP기질이란 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP, matrix metalloproteinase) 에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다. 이러한 MMP는 약 19종류의 다양한 효소로 구성되며 크게 콜라게나제(collagenase), 젤라티나제(gelatinase), 스트로멜라이신(stromelysin), 막성 MMP(membrane type MMP; MT-MMP)의 4가지로 구분되며 콜라게나제-1(MMP-1), 콜라게나제-2(MMP-8), 콜라게나제-3(MMP-13)이 원형 콜라겐을 파괴시키는 주요 콜라게나제로 알려져 있다.
염증성 질환에 관여하는 MMP의 종류는 질환에 따라 다양한 종류가 있다. 급성 염증성 질환 내독소 쇼크에서는 MMP-9이 관여되며, 만성 염증성 질환 다발성 경화증에서는 MMP-2와 MMP-9, 뇌졸중과 심근 경색증을 포함하는 죽상동맥 경화증에서는 MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 승모판막 재협착증에서는 MMP-2와 MMP-9, 치주염와 임플란트 주위염에서는 MMP-8과 MMP-9, 만성폐쇄폐병에서는 MMP-12, 천식에서는 MMP-2, MMP-8, MMP-9, 폐섬유증에서는 MMP-7과 MMP-12, 간염에서는 MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, 췌장염과 수막염에서는 MMP-2, MMP-8, MMP-9 등이 관여한다. (Jialiang Hu. et al., Nat. Rev. Drug. Discov. 6:480-498, 2007) 따라서 질병의 종류에 따라 효과를 나타내는 MMP 기질은 서로 다를 수 있다.
본 발명의 MMP 기질이란 MMP에 의해 분해되는 짧은 펩타이드를 말하며, 구체적으로 MMP1 기질, MMP2 기질, MMP3 기질, MMP7 기질, MMP8 기질, MMP9 기질, MMP12 기질, MMP13 기질, MMP 공통 기질 등을 말한다. 상기 MMP1 기질은 MMP-1에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다. MMP2 기질은 MMP-2에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP3 기질은 MMP-3에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP7 기질은 MMP-7에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP8 기질은 MMP-8에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP9 기질은 MMP-9에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP12 기질은 MMP-12에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬, MMP13 기질은 MMP-13에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다. MMP 공통(consensus) 기질은 MMP-1, MMP-2 및 MMP-3에 의하여 분해되는 짧은 아미노산 사슬을 말한다.
본 발명에서 상기 MMP의 기질이 될 수 있는 링커는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 서열번호 13의 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 13(MMP2 절단부위를 포함하는 링커)
GPLGLAG
본 발명은 또한 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드를 제공한다.
상기 서열번호 14 및 15의 아미노산 서열은 다음과 같다 :
서열번호 14
MGGTTFLLRNASGHMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGGSEFVDGGGSGTSANSFLEELRHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHVLEHHHHHH
서열번호 15:
MGGTTFLLRNASGHMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGGSEFVDGGGSGTSGPLGLAGANSFLEELRHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHVLEHHHHHH
본 발명은 상기 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 융합폴리펩티드를 암호화하는 것이면 어떠한 염기서열의 것도 가능하다.
한편 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 그 종류는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 발현벡터는 통상의 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
한편 본 발명은 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 발현벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 한다. 상기 발현벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지로서, 상기 단백질 케이지의 외부로 항염증성 폴리펩티드가 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 케이지를 제공한다.
단백질 케이지(Protein cage)는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합폴리펩티드를 상기 단백질 케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 “자가조립(self-assembly)”란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도없이, 스스로 알아서 특정한 나노구조를 형성하는 성질을 의미한다.
본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합폴리펩티드의 결합에 의해 만들어지는 것으로 일반적으로 생체 내에서 구형의 케이지 형태를 하고 있다.
본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합폴리펩티드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 융합폴리펩티드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열을 통해 형성된 것일 수 있다. 한편, 본 발명의 융합폴리펩티드가 자가조립에 의해 단백질 케이지를 형성할 경우, 페리틴 모노머 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 항염증성 폴리펩티드는 케이지 단백질의 외부 표면으로 돌출이 되어 타겟으로 하는 수용체 또는 단백질과 용이하게 결합하여 생리학적 활성을 나타낼 수 있으며, 또는 염증성 병변을 나타내는 생체 조직 내에서 MMP에 의해 그 링커가 절단되어 항염증성 폴리펩티드가 단백질 케이지로부터 해리되어 독자적으로 생리학적 활성을 나타낼 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합 펩타이드를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg(TFG 100nM = 134.33 ㎍/kg, TFMG 100nM = 137.015 ㎍/kg)일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 염증성 질환은 패혈증일 수 있다.
본 발명자는 상기 염증성 질환 중 특히 패혈증의 치료와 관련하여 본 발명의 융합폴리펩티드의 유용성을 실험적으로 확인하였다.
패혈증의 치료제로 사용되었던 활성화된 단백질 C(activated protein C, APC)는 혈액응고방지, 항 염증성, 방어장벽, 섬유성의 특성을 가지고 있고, 패혈성 쇼크와 심각한 천식의 치료에 대해 2001년 FDA와 2002년 EMA 승인을 받았다. 2011년 10월에 APC는 PROWESS와 패혈성 쇼크 (PROWESS-SHOCK) 시험에서 28일 째 사망의 바람직한 효과의 부족과 부작용 때문에 시장으로부터 물러났다. APC와 관련된 가장 흔한 부작용은 APC의 항혈전성 활성과 일치하는 procoagulant 요소 Ⅴa와 Ⅷa의 분해에 의해 야기된 출혈이다. 이에, 현재 중증 패혈증을 위한 효과적인 예방이나 치료 방법이 없는 실정이다.
한편, APC의 활성은 내피 단백질 C 수용체 (endothelial protein C receptor. EPCR)와 PC/APC의 γ-carboxyglutamic acid (Gla) 도메인 사이 상호작용에 의해 발생하게 된다. PC/APC의 γ-carboxyglutamic acid (Gla) 도메인(PC-Gla)은 응혈요소를 분해하는 작용은 없지만 protease-activated receptor-1 (PAR-1)에 결합 할 수 있는 단백질 분해효소를 제공할 수는 있다. PC-Gla가 EPCR에 결합하면 PAR-1을 절단하고, 결과적으로 방벽보호 및 항염증과 같은 세포 보호 신호 반응을 이끌어 낼 수 있게 된다.
트롬빈은 APC보다 높은 촉매 효율 규모의 최소 3가지 방법으로 PAR-1과 결합할 수 있다. 트롬빈 수용체 활성화 펩티드 (thrombin receptor agonist peptide, TRAP)에 의한 PAR-1의 활성은 사람 내피 세포에서 트롬빈의 효과를 모방한다. 종래 연구에 따르면, PC가 EPCR과 결합할 때, 트롬빈 또는 TRAP에 의한 PAR-1 의존 신호는 내피세포의 pro-inflammatory 신호에서 세포 보호성 반응으로 전환되게 된다( Blood 2007, 110, 3909, Thromb Haemost 2008, 100, 101). 이는 세포 보호 과정에서 EPCR의 사용이 PAR-1을 모집하는 것을 나타낸다.
종합적으로, 본 발명자들은 하나의 약물 전달체를 통해 EPCR과 PAR-1에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 융합하여 상기 EPCR과 PAR-1을 동시에 타겟할 수 있다면 출혈과 같은 문제점을 야기하지 않고 패혈증에 대해 극대화된 효과를 나타낼 수 있을 것이라는 가설을 세우고, 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단에 PAR-1을 활성화 시키는 펩티드인 TRAP을 융합하여 하였고, 이와 동시에 페리틴 모노머의 C 말단에 EPCR을 타겟팅하는 펩티드인 PC-Gla를 융합한 융합폴리펩티드(TFG)를 제작하여 상기 TRAP과 PC-Gla가 페리틴 케이지의 외부로 돌출이 되도록 하였다(실시예 1).
또한, 본 발명자들은 인간 페리틴 모노머 N 말단 또는 C 말단에 융합된 TRAP 및 PC-Gla가 각각의 생리활성을 나타냄에 있어서 상호 간섭하는 효과를 방지하기 위하여, 인간 페리틴 모노머 단편의 C 말단과 PC-Gla 사이에 MMP-2에 의해 절단이 가능한 아미노산 서열을 갖는 링커를 결합한 융합폴리펩티드(TFMG)도 제작하여 MMP가 활성화된 병리부위에서 상기 링커가 절단되고, 결과적으로 PC-Gla가 페리틴 케이지로부터 방출되어 유리될 수 있도록 하였다(실시예 1).
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, LPS 또는 CLP에 의해 HUVEC 세포에서 MMP-2가 분비되는 것을 확인하였으며, TFMG 내의 링커가 MMP-2에 의해 절단되어 PC-Gla가 지속적으로 방출이 되는 것을 확인하였다(실시예 2). 즉, 인간 페리틴 모노머 단편의 C 말단에 MMP의 기질이 될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 항염증성 폴리펩티드를 융합할 경우, 페리틴 케이지가 형성된 이후에도 상기 링커가 MMP에 노출이 되어 절단이 가능하여, 융합된 폴리펩티드가 병리부위로 방출이 될 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 상기 TFG 또는 TFMG 융합폴리펩티드가 EPCR에 어느 정도의 결합력으로 결합할 수 있는지를 평가하였고, 그 결과 PC-Gla가 EPCR에 결합하는 것과 동등한 정도의 결합력으로 TFG 및 TFMG가 결합하는 것을 확인하여 PC-Gla가 인간 페리틴 모노머 단편에 융합된 이후에도 EPCR과 용이하게 결합하여 생리학적 활성을 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 3).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는, 상기 TFG 또는 TFMG 융합폴리펩티드가 PAR-1을 활성화시킬 수 있는지 여부를 평가하였고, 그 결과 TRAP 펩타이드가 PAR-1을 활성화 시키는 것과 동등한 정도로 TFG 및 TFMG도 PAR-1을 활성화 시키는 것을 확인하여, TRAP이 인간 페리틴 모노머 단편에 융합된 이후에도 PAR-1을 활성화시키는 생리학적 활성이 그대로 유지되고 있음을 알 수 있었다(실시예 3).
본 발명의 다른 일실시예에서는, CLP에 의해 유도된 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 PC-Gla와 TRAP을 병용하여 투여하여 패혈증 치료 효과를 평가한 결과, 동물의 사망률, 염증성 세포들의 조직 내 침투정도, 폐 조직의 괴사 정도, 간 독성, 신장 독성, 조직 손상의 지표인 LDH 수치, 염증성 사이토카인의 분비량, 혈관 장벽의 붕괴 및 류코사이트(leukocyte)의 이주를 촉진하는 내피세포 내 부착인자들의 발현량 평가 항목에 있어서 TFMG 또는 TFG 투여군이 PC-GLA 및 TRAP 병용투여군과 비교해 현저히 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4).
본 발명은 상기 융합폴리펩티드는 염증 유발 매개체인 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
이상 살펴본 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드는 서로 다른 기전으로 작용하는 두 종류의 항염증성 폴리펩티드를 하나의 나노 케이지에 융합하여 투여할 수 있어 패혈증을 포함한 염증성 질환의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 TFG 및 TFMG 융합폴리펩티드의 융합 모식도를 나타낸 것이다(A: TFG 및 TFMG의 융합 모식도, B: 융합폴리펩티드 및 페리틴 나노 케이지의 3D 모식도)
도 2는 TFG 및 TFMG의 분자량을 MALDI-ToF 질량 스펙트로미터로 측정한 결과이다(A: TFG, B: TFMG).
도 3은 TFG 및 TFMG가 자가조립(self-assembly)에 의해 페리틴 케이지를 형성하는 것을 TEM 이미징으로 관찰한 결과이다(A: TFG, B: TFMG).
도 4는 TFG 및 TFMG가 형성하는 페리틴 케이지의 직경을 측정한 결과이다.
도 5는 HUVEC 세포에서 CLP 또는 LPS 자극에 의해 MMP-2가 분비되는 것을 관찰한 결과이다(A: 웨스턴-블롯 결과, B: zymography 결과).
도 6은 AMPA에 의해 활성화된 MMP-2에 의해 TFMG에서 링커가 절단되어 PC-Gla가 방출되는지 여부를 관찰한 결과이다.
도 7은 MMP-2에 의해 TFMG의 링커가 절단되어 방출된 PC-Gla를 HPLC를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 MMP-2에 의해 TFMG의 링커가 절단되어 방출된 PC-Gla를 MALDI-ToF를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 soluble EPCR에 대한 단백질 C(PC), PC-Gla 도메인, TFG 및 TFMG의 결합력을 solid-phase ELISA를 통해 평가한 결과이다.
도 10은 HUVEC 세포에 대한 PC-Gla, TFG 및 TFMG의 결합력을 평가한 결과이다.
도 11은 PC-Gla, TFG 및 TFME의 결합력을 in vivo 면역조직염색을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 PC-Gla, TFG 및 TFMG가 내피세포에 결합하는 정도를 in vitro(HUVEC) 또는 in vivo(마우스 동물 모델)에서 평가한 결과이다(A: in vitro, B: in vivo).
도 13은 TRAP 펩티드, TFG 및 TFMG가 PAR-1을 활성화 시키는 정도를 평가한 결과이다.
도 14는 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 동물의 생존률을 관찰한 결과이다.
도 15는 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 동물의 조직 내 염증성 세포의 침투여부 및 폐 조직의 손상 여부를 관찰한 결과이다.
도 16은 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 동물의 폐 손상 정도를 점수화 한 결과이다.
도 17은 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 ALT 또는 AST(A), 크레아티닌(B), BUN(C) 및 LDH 수치(D)를 평가한 결과이다.
도 18은 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 혈중 염증성 사이토카인의 수치를 평가한 결과이다(A: IL-6, IL-10, B: TNF-α).
도 19는 LPS로 자극된 HUVEC 세포에 TFG, TFMG 또는 TRAP 및 PC-Gla를 처리한 후 permeability를 측정한 결과이다.
도 20은 18은 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 혈관 투과성을 평가한 결과이다.
도 21은 LPS로 자극된 HUVEC 세포에 TFG, TFMG 또는 TRAP 및 PC-Gla를 처리한 후 혈관 세포 부착인자-1(VCAM-1)의 발현량(A) 및 leukocyte의 부착량을 평가한 결과이다.
도 22는 CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 TRAP, PC-Gla를 병용투여한 후 leukocyte의 이동량을 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 시약의 준비
PC-Gla 와 TRAP는 펩트론 Inc. (대한민국, 대전)과 애니젠 Inc. (대한민국, 광주)에서 합성되었다. 펩타이드는 6 NHS ester 또는 FNI-675 NHS ester 형광 염색약으로 표기되었다 (대한민국, 인천, Bioacts Inc.). 균 지질당류 (bacterial lipopolysaccharide, LPS, serotype : 0111 : B4, L5293), 항체 (페니실린 G와 스트렙토마이신), α-시아노-4-하이드록시신남산 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA), 시나픽산 (sinapic acid), 그리고 p-aminophenylmercuric acetate는 시그마에서 구입했다 (St. Louis, MO). MMP-2 항체 (MAB13434)는 밀리포어에서 구입했고, anti-mouse CD31 (553369)는 BD 팔콘에서 구입했고, Anti-EPCR 항체 (FL-238, sc-28978)는 산타크루즈에서 구입했다.
2. TFG(TRAP-페리틴 모노머 단편-PC-Gla 융합폴리펩티드)와 TFMG(TRAP-페리틴 모노머 단편-링커-PC-Gla 융합폴리펩티드)의 발현과 정제
페리틴 light chain으로부터 삭제한 짧은 E-heilx에 의한 짧은 페리틴 (short ferritin, sFn)의 발현을 위한 플라스미드를 구성했다. 5’-과 3’-ends에서 SpeΙ과 XhoΙ, 제한 부위와 sFn의 N-teruminus에 TRAP (TFLLRN) 펩타이드 서열 유입에 의해 TFG와 TFMG의 DNA 플라스미드를 구성했다. 그리고 5’-과 3’-ends에서, SpeΙ과 XhoΙ, 제한 부위와 sFn의 C-terminus에 PC-Gla 도메인의 앞에서 PC-Gla 도메인 (ANSFLEELRHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHV) 서열 또는 MMP-2 분할 부위 (GPLGLAG)를 구성했다. PC-Gla 도메인의 앞에 MMP-2 분할 부위를 위한 프라이머는 다음과 같이 디자인했다: (+) 5′ CAC TTT TCT TCT TCG GAA CG 3′ and (-) 5′ CTA GCG TTC CGA AGA AGA AAA GTG GTA C 3′ for TRAP; (+) 5′ GAA ACT AGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG G 3′ and (-) 5′ GAA CTC GAG GAC GTG CTT GGA CCA G 3′ for PC-Gla domain; (+) 5′ GAA ACT AGT GGT CCT CTA GGT CTA GCC GGT GCC AAC TCC TTC CTG G 3′ and (-) 5′ GAA CTC GAG GAC GTG CTT GGA CCA G 3′. TFG와 TMFG 플라스미드는 BL21 (DE3) 발현계통의 대장균(Escherichia coli, E.coli)에 transform시켰다. 세포는 37℃에서 50㎍/ml 카나마이신을 포함한 LB 배지에서 OD600값이 0.5가 될 때까지 자랐고, 단백질 발현은 5시간동안 37℃에서 0.1M IPTG처리에 의해 유도되었다. 유도 후, 세포는 원심분리로 수확했고, 펠렛(pellet)은 lysis buffer(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1mM DTT 1:1000 희석한 단백질분해효소 억제제 혼합물) 로 풀어주었고, 초음파 균질기(ultrasonic processor)로 균질화 했다. 세포 분해물로부터 inclusion bodies는 1시간동안 실온에서 8M 요소를 포함하고 있는 binding buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)에서 배양함으로 용해되었다. 그 후에, 변성된 단백질은 8M 요소를 포함하는 washing buffer(20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole )로 헹군 니켈 이온 킬레이트 친화 column에 넣었다. 단백질은 elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 300 mM imidazole)로 녹였고, 요소의 변화도 투석에 의해 refold 되었다.
3. TFMG 및 TFG의 분석
각각 monomer 구성의 질량 스펙트럼은 flight의 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 시간에 의해 확인되었다 (MALDI-ToF). MALDI-ToF MS는 337nm 질소 레이저로 Bruker Daltonics Microflex MALDI-ToF 질량 분광계 (Bremen, Germany)를 사용하여 수행했다. 질량 스펙트럼은 20kV의 가속 전압으로 선형과 양이온 모드로 관찰되었다. 0.1% 트리플루오로아세트산의 최종 농도를 포함하는, cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)의 포화 용액 또는 50% 아세토니트릴에서 sinapic 산은 매트릭스 용액으로 사용되었다. CHCA 매트릭스는 온전한 단백질을 위해 효소 분해 후 단편 또는 sinapic 산의 분석을 위해 선택되었다. 분석물 매트릭스 용액은 1:2 (analyte:matrix, v/v)의 비율로 준비했다. 완전하게 혼합된 각 혼합물, 그리고 분석물 매트리스 용액의 1㎕는 샘플 플레이트에 두었고 진공 증발로 건조했다. 분광계는 bradykinin을 사용하여 보정했다; 사이토크롬 C와 소 혈청 알부민은 가까운 외부 표준으로 사용된다. 투과 전자현미경 (Transmission electron microscopy , TEM) 사진은 FEI Tecnai (Korea Basic Science Institute, KBSI)를 사용하여 기록했다. TFG와 TFMG nanocage의 크기는 DelsaMax Pro light scattering analyzer (Beckman Coulter)를 사용하여 측정했다.
4. 세포배양
primary HUVEC는 Cambrex Bio Science (Charles City, IA)로부터 얻었고, 전에 말했던 것처럼 유지했다. 모든 실험들은 passage 3-5의 HUVEC를 사용하여 수행했다. 사람 호중구는 다섯 명의 건강한 지원자로부터 정맥천자로 얻은 전체 혈액 (15ml)에서 신선하게 분리되었고, 전에 말한 것처럼 유지했다.
5. 동물 관리
수컷 C57BL/6 마우스 (6-7주령, 18-20g)는 오리엔트 바이오 회사 (한국, 경기도 성남)에서 구입했고 12일의 적응기간 후에 사용했다. 동물들은 조절된 온도 (20-25℃)와 습도 (40%-45%), 12:12시간 낮/밤 사이클에서 한 케이지당 5마리씩 키웠고, 평범한 rodent pellet 을 먹였고, libitum 첨가한 물을 주었다. 모든 동물들은 경북대학교에서 발행된 실험 동물의 관리와 사용을 위한 지침서에 따라 다루었다.
6. Cecal ligation and puncture (CLP) 패혈증 동물 모델의 준비
염증을 유도하기 위해, 수컷 쥐들을 먼저 안면마스크를 통하고는 호흡 chamber에서 작은 설치류 가스 마취 기계 (RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)를 통해 운반된 산소에 2% 아이소플루레인 (한국, JW 제약, Forane)으로 마취 시켰다. 수술하는 동안 자발적으로 호흡하는 것이 허용되었다. CLP 유도된 염증 모델은 미리 언급된 대로 준비되었다. 간단히 말해서, 2cm 가운데 절개는 맹장과 인접한 창자를 드러내기 위해 만들었다. 맹장은 높은 단계 염증의 유도를 위해 22-gauge 바늘을 사용하여 cecal tip과 punctured 로부터 5.0mm에서 3.0-silk 구조로 단단히 묶었다. 구멍 위치로부터 적은 양의 배설물을 밀어내기 위해 부드럽게 짜냈고, 복막강에서 다시 시작했다. 개복한 부위는 4.0-silk로 봉합했다. 허위 대조군 동물들에서, 맹장은 묶이거나 punctured 되지 않았지만 드러났고, 그 후 복강으로 되돌아갔다. 이 실험법은 연구의 구성ㅇ에 앞서 경북대학교에서 동물 관리 위원회에 의해 찬성되었다 (IRP No, KNU 2012-13)
7. 젤라틴 자이모그래피(zymography)
배지와 플라즈마에서 MMP-2와 MMP-9 효소활성은 SDS-PAGE 젤라틴 자이모그래피에 의해 결정되었다. 단백질의 겔 염색 후 명확한 밴드로 드러나는 플라즈마의 젤라틴분해효소는 젤라틴 매트릭스를 분해한다. 요약하면, LPS 시간 의존적으로 처리된 HUVECs 배지와 알부민 파생된 염증 쥐 플라즈마 (표준화된 같은 양의 단백질 [20㎍])는 환원제의 부재와 0.1%(w/v) 젤라틴을 포함하는 10% SDS-PAGE를 사용한 전기영동에서 변성되었다. 겔은 2시간 동안 실온에서 2.5% Triton X-100가 있는 것에서 incubate 했고, 그 뒤에 10 mM CaCl2, 0.15 M NaCl, and 50 mM Tris (pH 7.5)로 구성하는 버퍼 안에서 37℃에 밤새 incubate했다. 그 후에 겔은 0.25% 쿠마시 블루로 염색했고, 단백질 가수분해는 파란 배경에 상반되는 흰 밴드로 검출되었다.
8. MMP-2에 의한 nanocaged TFMG의 절단
TFMG가 MMP-2에 의해 선택적으로 절단될 수 있는지 평가하기 위해, PBS에서 APMA-간접 활성화된 MMP-2와 TFMG를 37℃에서 3시간동안 배양했다. TFMG의 절단된 단편은 MALDI-ToF에 의해 발견되었다.
9. EPCR(endothelial protein C receptor) 결합력 평가를 위한 ELISA
Wild-type PC, PC-Gla 펩타이드, TFG 그리고 EPCR과 TFMG의 상호작용을 확인하기 위해, 96-well flat microtiter plates는 0.02% sodium azaide를 포함하는 20mM carbonate-bicarbonate 버퍼 (pH 9.6)에 EPCR을 녹인 용액으로 4℃에서 밤새 코팅했다. Plate를 0.05% tween 20을 포함하는 TBS 버퍼 (0.1 M NaCl, 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4)에서 세 번 헹군 이후, 플레이트는 wild-type PC, PC-Gla peptides, TFG, and TFMG (7?1000 nM) 가 희석된 버퍼에서 1시간 동안 배양되었다. 다시 플레이트를 헹군 후, goat anti-protein C polyclonal 항체 (1:1000)로 1시간 반응했다. 그 후에, 플레이트를 헹구고 1시간 동안 rabbit anti-goat IgG (KPL, MD, 1:1000)으로 반응했다. 헹군 다음, 플레이트는 2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfate) (ABTS; KPL, gaithersburg, MD)로 incubate했다. 비색분석은 405nm에서 흡광도 측정으로 수행했다.
10. 마우스에서 내피세포의 분리
내피세포를 anti-CD31 항체와 결합된 Dynabeads와 Dynal Magnetic holder를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 분리했다. 요약하면, 내피세포를 분리하기 위해, 4-6마리 쥐를 (6-10주령) 마취한 뒤, 복강을 노출했다. 잘라낸 폐와 심장을 RPMI 배지에 넣고, 폐와 심장으로부터 다른 조직을 제거한 뒤에, PBS로 한번 헹군다. 폐와 심장을 50ml 튜브 안의 콜라겐분해효소 A의 1.0mg/ml로 1시간동안 약 37℃에서 배양한다. 배양하는 동안 5분마다, 튜브를 몇 초간 부드럽게 움직여 준 다음, 70㎛ tissue sieve(BD falcon)를 통과함으로 새 50ml 튜브로 부유물을 이동한다. 걸러진 세포 부유물을 1000rpm에서 10분동안 원심분리한다. 상층액을 제거한 후에, 세포 pellet을 새 15ml 튜브에서 차가운 PBS로 한번 헹군다. Dynabead 연결된 anti-mouse CD31 항체를 준비하기 위해, Dynabeads (60㎕)를 magnetic holder (Invitrogen)에서 MACS 버퍼 (PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)로 헹군다. Dynabeasds는 MACS 버퍼 (600㎕)로 resuspend 되었고, anti-mouse CD31 (5㎍ of per 10㎕ of beads)을 첨가했고, 혼합물은 4℃에서 12시간 동안 incubate 한다. 세포는 Dynabead 결합 anti-mouse CD31 항체와 10분동안 실온에서 배양했고, magnetic holder에 위치했다. 15ml tube의 벽에 피펫을 대고 세포 부유물을 천천히 첨가했다. 5분동안 배양 후에, PBS를 aspiration으로 조심히 제거했다. Dynabead-coupled anti-mouse CD31 항체를 차가운 PBS로 3번 헹군 뒤, EBM-2 성장배지로 pellet을 resuspend 하였고, 얼음에서 단백질 분해효소 억제제 혼합물을 구성하는 RIPA buffer에서 수확하고 분해했다.
11. PC-Gla 도메인, TFG, TFMG 형광발색
PC-Gla, TFG, TFMG는 1:3의 분자비에서 생체 외 실험을 위한 FNG-456 NHS ester 또는 생체 내 실험을 위한 FNI-675 NHS ester로 표시되었다. 간단하게, 각 분자 (10 μM)는 PBS (1.5ml)에 녹였고, FNG-456 NHS ester (30 μM) 혹은 FNI-675 NHS ester (30μM)은 DNSO (0.2 mL). 각 분자와 형광 염색약은 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응 생성물은 0.2-μm 필터링 단위를 통과하여 지나갔고, . 2mM sodium azide와 PBS에서 규형을 유지하기 전에 반응하지 않은 염색약은 PD midi TrapTM G-25 (GE Healthcare, UK)에 분리되었다. 이 과정은 각 나노입자의 2.17μM 이상 단백질당 염색약의 1.5 비율 이상으로 생산했다.
12. HUVEC 세포에의 결합력 평가
직접적인 세포 결합 분석은 HUVEC세포와 형광 표기된 PC-Cla, TFG, TFMG를 사용한 체내 실험으로 수행되었다. 분석은 HUVEC에 처리된 PC-Gla, TFG 또는 TFMG와 정맥 주사로 감염된 마우스와 분리된 마우스 내피세포로 시행되었다. 확실히 결합된 PC-Gla, TFG와 TFMG로, HUVEC 또는 내피세포의 형광수치를 측정하였다. PC-Gla, TFG, TFMG의 농도는 단백질당 형광 염색의 나노입자 비율을 사용하여 측정하였다.
13. PAR-1 절단 어세이
24웰 플레이트 안의 90% confluence 에서 HUVEC는 일시적으로 제조사 방법에 따라 리포펙타민 (Invitrogen)을 사용하여 항생제 없는 Opti-MEM 배지에서 ALP-PAR-1-TF cDNA를 구성하는 pRC/RSV로 transfect 되었다. 다음날, 세포들을 헹군 뒤 5시간동안 무혈청배지에서 배양했다. 세포를 트롬빈, TRAP, TFG 또는 TFMG로 추가 시간 동안 배양했다. 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 조건 배지를 모아서 원심분리 하였다. 상층액을 모았고, ALP(alkaline phosphatase)활성은 EnzoLyteTM p-nitrophenyl phosphate alkaline phosphatase assay kit (AnaSpec, San Jose, CA)을 사용하여, 제조사 방법에 따라 측정했다.
14. H&E 염색과 병리조직학적 시험
수컷 C57BL/6 마우스는 CLP를 겪었고, CLP (n=5) 후 6시간 지나서 정맥주사로 TRAP, TFG 또는 TFMG (200 nM)과 PC-Gla를 투여했다. 마우스는 CLP 한 다음 96시간 후 안락사 시켰다. 마우스에서 페의 표현형 변화를 분석하기 위해, 폐 샘플을 각 마우스로부터 제거했고, 남아있는 피를 제거하기 위해 PBS (pH 7.4)로 3번 씻었고, 4℃에서 20분 동안 pH 7.4 PBS의 4% 포름알데하이드 (Junsei) 용액으로 고정했다. 고정 후, 샘플을 에탄올 연쇄를 통해 탈수화 시켰고, 파라핀 내장했고, 4-μm 분할로 분할했고, 슬라이드에 놓았다. 슬라이드는 60℃ 오븐에서 파라핀을 제거했고, 다시 수화했고, hematoxylin (sigma)으로 염색했다. 남은 염색은 제거한 뒤, 슬라이드를 0.3% acid alcohol에 3번 빠르게 담그고, eosin (sigma)으로 대비염색을 하였다. 에탄올 시리즈와 자일렌으로 헹군 뒤, 커버 슬립으로 덮는다. 폐 샘플의 광학현미경 분석은 폐의 구조, 조직 부종, 염증세포의 침윤을 평가하기 위해 blinded 관찰로 시행하였다. 그 결과는 4 단계로 분류되었다. 1 단계는 정상 조직병리학을 대표한다; 2단계는 최소 호중성 류코사이트 침윤을 나타낸다; 3 단계는 보통 호중성 류코사이트 침윤, 혈관주위 부종 형성, 폐 구조의 부분 파손을 대표하고; 4 단계는 밀집한 호중성 류코사이트 침윤, 농양형성, 폐 구조의 완전 파손을 포함한다.
15. 면역형광염색법
HUVEC는 10% FBS를 포함한 완전배지에서 0.05% poly L-lysine으로 코팅된 유리 커버 슬립에서 융합하여 자랐고, 48시간동안 유지했다. 그 후 세포는 6시간동안 LPS(100 ㎍/㎖)로 자극했고, 뒤이어 6시간동안 TRAP, TFG 또는 TFMG와 PC-Gla를 처리했다. 세포 골격(cytoskeletal) 염색에 따라 세포는 실온에서 15분 동안 TBS(v/v)에서 4% 포름알데하이드로 고정했고, 15분동안 TBS에 0.05% Triton X-100으로 투과했고, 4℃에서 밤새 blocking buffer(5% bovine serum albumin (BSA) in TBS)로 블로킹하였다. 그 후, 세포들을 rabbit anti-EPCR polyclonal 항체로 반응했다. EPCR은 Alex Fluor 647 결합된 2차 항체(Molecular Probes, donkey anti-rabbit IgG)를 사용하여 시각화 했고, 630X 배율에서 confocal 현미경으로 관찰했다 (TCS-Sp5, Leica Mycrosistems, Germany).
16. EPCR 결합여부에 대한 조직학적 분석 in vivo
CLP 수술 24시간 전에, 형광 표기된 PC-Gla, TFG, TFMG (200nM/mouse)를 정맥주사로 마우스에 투입했다. 24시간 후, 마우스 대정맥을 적출했고, 24시간동안 visikol에서 고정했다. 그 후, 대정맥을 -80℃에서 optimum cutting temperature (OCT) compound (Tissue Tek)에 끼워 넣었다. 연속적 섹션을 anti-EPCR 항체 (Santa cruz), anti-rabbit Alexa 488 (green), anti-CD31 항체, 그리고 anti-rabbit Alexa 350 (blue)로 배양했고, 63X 배율로 confocal현미경으로 관찰했다 (TCS-Sp5, Leica Mycrosistems, Germany).
17. 패혈증 동물모델의 혈청 성분 분석
신선한 혈청을 생화학 키트 (Mybiosource)를 사용한 aspartate transaminase (ALT), alanine transaminase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), 크레아티닌과 LDH 분석에 사용하였다. IL-6, IL-10, TNF-α의 농도를 결정하기 위해 통상적으로 이용하는 ELISA 키트를 제조사 실험방법 (R&D Systems) 에 따라 사용했다. ELISA plate reader를 사용하여 값을 측정했다 (Tecan, Austria).
18. in vitro permeability 평가
각 분자의 상승하는 농도의 반응에서 내피 세포 삼투성의 분광 광도 정량화 (spectrophotometric quantification)를 위해, 기능적 세포 단일층을 가로지르는 Evans blue-bound albumin의 흐름을 이전에 묘사된 것으로서 한정된 2개 비교 chamber 모델을 사용하여 측정했다. HUVEC는 3일 동안 3㎛의 구멍 사이즈인 12mm 지름 트렌스웰에 배양했다 (5 X 104/cell). TRAP, TFG 또는 TFMG (up to 100nM)와 PC-Gla를 받기 전에 HUVEC의 융합 단일층은 4시간 동안 LPS (100ng/㎖)에 노출되었다. 트렌스웰 삽입은 TBS (pH 7.4)로 헹군 후 이고, 뒤이어 Evan blue (0.5mL; 0.67㎎/㎖)의 첨가는 4% BSA를 포함하는 성장 배지에 녹였다. 신선한 성장 배지는 아래 공간에 추가되었고, 위 공간의 배지는 Evans blue/BSA로 대체했다. 10분 후, 아래 공간에서 샘플의 시각적인 농도는 650nm로 측정했다.
19. in vivo permeability 분석 및 leukocyte의 이동 평가
CLP 수술받은 마우스는 정맥주사로 TRAP, TFG 또는 TFMG와 함께 PC-Gla로 감염되었다. 6시간 후, 정상 살린의 1% Evan blue 염색 용액을 각 마우스에 정맥주사로 투여했다. 30분 후, 마우스들을 죽였고, 정상 살린 (5mL)으로 헹군 후 복막 분비물을 모았고, 200x g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액의 흠광도를 650nm에서 측정했다. 혈관 투과성을 사전에 언급된 것으로서, Evan blue 염색의 표준 곡선을 따라 복강에 새어 들어간 염 색의 단위 (μg/mouse)로 표현한다.
총 류코사이트 이동의 평가를 위해, CLP 조절 마우스는 CLP 수술 6시간 후 각 나노입자(100 nNM)로 처리했다. 희생된 후에 정상 살린 5 mL로 복상을 씻었다. 복막액 (20 ㎕)는 Turk’s 용액 (0.38 mL; 0.01% crytal violet in 3% acetic acid)와 혼합했고, 류코사이스트의 수는 광학현미경으로 측정했다. 결과는 복강당 호중구 X 106으로 나타났다.
20. 세포 부착인자(CAM) 발현 분석
HUVEC 에서 혈관 세포 부착 분자-1 (VCAM-1), 세포 내 부착 분자-1 (ICAM-1) 그리고 E-selectin의 발현은 언급하였듯이 전체 세포 ELISA에 의해 결정된다. 간단하게, HUVEC의 융합 단일 층은 6시간 동안 TRAP, TFG 또는 TFMG와 함께 PC-Gla를 처리했고, 뒤이어 16시간 (VCAM-1 그리고 ICAM-1) 또는 24시간 (E-selectin)동안 LPS (100 ng/mL)를 처리했다. 헹군 뒤, mouse anti-human monoclonal VCAM-1 (100μM; clone; 6C7.1), ICAM-1 (clone; P2A4) 그리고 E-Selectin (clone; P3H3) 항체들 (Millipore corporation, 1:50 each)을 첨가했다. 1시간 후 (37℃, 5% CO2), 세포를 3번 헹군 뒤, 1:2000 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체 (100 ㎕; Sigma)를 1시간 추가했다. 세포를 다시 3번 헹구고, o-phenylenediamine substrate (Sigma)를 사용하여 발달시켰다. 비색분석은 490nm에서 흡광도 측정에 의해 시행되었다. 모든 측정은 3개 웰에서 시행했다.
21. 세포-세포 부착능 평가
사전에 기록된 것으로서, 내피 세포에 단핵구의 부착은 단핵구의 형광 표기에 의해 평가된다. 간단하게, 단핵구는 5% FBS를 포함하는 phenol red-free RPMI안에 37 ℃에서 20분 동안 5μM Vybrant DiD로 표기된다. 헹군 후에, 세포(1.5 X 106 cells/mL. 200μL/well)를 접착 배지 (2% FBS와 20mM HEPES를 포함하는 RPMI)로 재분산 시킨다. 96 웰 플레이트에 HUVEC의 융합 단일층을 더한다. 세포의 추가 이전에, HUVEC에 6시간 동안 TRAP, TFG, TFMG와 PC-Gla를 처리했고, 뒤이어 LPS를 처리했다 (100 ng/mL, 4 h). 세포 부착의 농도는 전에 기록된 것으로 알아냈다.
22. 통계학적 분석
모든 실험은 최소 3회씩 각각 시행되었으며, 데이터 값은 평균 ± SEM 으로 표현됐다. 실험군 별 차이의 통계적 중요성은 Windows, version 16.0 의 SPSS (SPSS, Chicago, IL)를 이용하여 평가되었다. 통계적 관계는 분산분석 (ANOVA) 와 Tukey의 사후검증법으로 진행되었다. 또한, 0.05 이하의 P값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 패혈증을 유발하는 CLP의 생존분석은 Kaplan?Meier 분석을 이용하여 수행되었다.
<실험결과>
<실시예 1>
융합폴리펩티드의 제작 및 특성 분석
더 많이 처리할 수 있는 유전자 조작을 만들어 ferritin light chain에서 짧은 helix E와 루프를 제거함으로 짧은 ferriitin (sFn)을 만들었다. TRAP-ferritin-PC-Gla (TFG) protein을 만들기 위해 C-terminus에 EPCR ligand 삽입하고, N-terminus에 PAR-1 활성 (TRAP peptide)을 삽입하여 sFn을 유전적으로 만들었다 (도 1A, 1B). 각 수용체에 동시 중복 결합하는 동안 남은 TRAP-ferritin의 간섭으로부터 PC-Gla를 막기 위해, sFn과 PC-Gla 도메인 (TFMG) 사이에 matrix metalloproteinase (MMP)-2 결합 부위를 삽입했다. 그래서 PC-Gla는 MMP 활성 부위에 도달했을 때 nanocage에서 방출될 수 있다.
순수한 TFG와 TFMG 단일층의 분자 무게는 각각, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 이동시보 질량 분석법에 의해 결정된 것으로서 26,866 Da와 27,403.6 Da이다 (도 2A, 2B). 음성 염색한 TFG와 TFMG의 TEM 사진에서 large aggregate의 부족은 이 케이지 구조를 확실하게 한다(도 3). TFG와 TFMG 나노 케이지의 외부 지름의 평균은 각각 15.5nm, 16.3nm이다 (도 4). 각 구조의 크기는 sFn의 C-terminus와 PC-Gla 구역 사이에 MMP-2 결합 위치 추가로 증가하는 것으로 판단된다.
<실시예 2>
MMP-2에 의한 TFMG의 링커 절단 및 PC-Gla 분비능 평가
LPS 혹은 CLP에 의해 유도된 MMP-2가 활성화된 HEVEC 에서 분비되는 것을 웨스턴 블롯과 자이모그래피를 사용하여 확인하였다(도 5). PC-Gla가 MMP-2에 의해 TFMG에서 선택적으로 절단되어 분비될 수 있는지, TFMG에서 PC-Gla의 분비가 조절될 수 있는지 평가하기 위해 p-aminophenylmercuric acetate (AMPA)-활성화된 MMP-2와 함께 TFMG를 incubation 했다. TFMG는 지속적으로 PC-Gla를 분비했고 (도 6), MMP-2에 의해 TFMG에서 PC-Gla가 절단되어 분비되었고, 그 PC-Gla의 질량은 계산된 것과 일치하는 것으로 확인되었다 (5,518.6 Da by MALDI-ToF)(도 7 및 도 8).
<실시예 3>
EPCR과의 결합능 및 PAR-1 분해능 평가
TFG 또는 TFMG가 EPCR 및 PAR-1에 결합하는지 여부와 관련하여, 본 발명자는 페리틴 스캐폴드에 다양한 리간드를 부착하는 것이 in vitro 또는 in vivo 상으로 EPCR 또는 PAR-1 과의 결합능에 미치는 영향을 평가해 보고자 하였다.
우선, PC-Gla의 수용체인 EPCR에 대한 TFG 또는 TFMG의 결합 능력을 측정하기 위해 고체상 ELISA를 사용했다. 이 방법에서, soluble EPCR (sEPCR)에 결합하는 능력을 비교했다. 도 9에서 보여주는 것과 같이, 이전에 보고된 수용액에서 sEPCR (29nM)에 PC결합 능력과 유사하게 wild type PC가 ~31.3nM의 Kd(app)로 sEPCR에 결합했다. sEPCR과 PC-Gla 펩타이드, TFG, TFMG 사이의 결합능은 각각 32.0, 31.5, 30.7nM의 Kd(app) 로 평가되었다. 이 데이터로부터 TFG 및 TFMG 각 구조가 wild-type PC만큼 강하게 EPCR과 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명자들은 그 다음으로, PC-Gla, TFG 및 TFMG가 HUVEC과 결합하는 정도를 평가하였고, TFG 및 TFMG는 PC-Gla가 HUVEC에 결합하는 것과 동등한 정도로 강한 결합력을 보인다는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 이는 HUVEC과의 결합이 PAR-1이 결합하는 TRAP에 의해 향상되었다는 것을 의미한다고 할 수 있다.
TFG 및 TFMG의 in vivo 상 결합능은 면역조직염색학적 방법을 통해 평가하였고, 그 결과 주입된 TFG 및 TFMG는 마우스 대정맥의 EPCR 및 CD31에 밀집되어 분포하는 것으로 확인되었다. 게다가, 그 결합 정도는 PC-Gla와 비교해 훨씬 우세한 것으로 판단되었다(도 11).
그 다음으로 본 발명자들은 TFG 및 TFMG가 in vivo 또는 in vitro 상에서 내피세포와 결합하는 정도를 PC-Gla의 결합능과 비교하였다. 그 결과 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, in vivo 및 in vitro 모두에서 TFG 및 TFMG는 PC-Gla와 비교해 더 강하게, 더 지속적으로 내피세포에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 또한 TRAP 펩티드, TFG 및 TFMG의 PAR-1에 대한 활성을 평가하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, TRAP 펩티드, TFG 및 TFMG는 동등한 정도의 활성으로 PAR-1을 절단하는 것으로 확인되었다.
<실시예 4>
CLP-유도 패혈증 동물모델에서의 효능평가
상기한 실험 일련의 실험결과들을 토대로, 본 발명자들은 TFG 및 TFMG는 CLP-유도 패혈증 동물모델에서 우수한 효능을 나타낼 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 또한, TFG 및 TFMG는 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여한 것보다 더 좋은 효과를 나타낼 것이라고 예상하였다.
(1) 생존률 평가
CLP-유도 패혈증 동물모델에 TFG 투여, TFMG 투여 또는 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여한 결과 도 14에 나타난 바와 같이, TFG 투여 또는 TFMG 투여군에서 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여한 동물군과 비교해 생존률이 훨씬 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 조직부종 및 폐 조직 손상정도의 평가
한편, 도 15에 나타낸 바와 같이 CLP-유발 패혈증 동물모델에서는 염증성 세포가 조직 간극 및 폐포 간극으로 상당한 양이 침투하여 조직 간극 부종이 관찰되었고, 폐 조직의 구조가 상당히 손상되는 것으로 확인되었다. 그러나, 이러한 병리현상은 TFG 투여 또는 TFMG 투여군에서 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여에 의해 상당히 감소가 되었으며, 이 중 TFG 투여 또는 TFMG 투여군이 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여군과 비교해 그 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 TFG 투여 또는 TFMG 투여군이 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여군과 비교해 폐 손상 정도를 병리조직학적 점수화한 결과에서도 훨씬 우수한 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(도 16).
(3) 일반장기 독성지표의 평가
패혈증의 전신성 염증반응이 진행되는 동안에 다양한 장기에서의 병변이 관찰되며, 그 중에서도 간 및 신장이 주요한 병리조직으로 보고되고 있다.
도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, CLP-유도 패혈증 동물모델에서 간 독성의 지표인 ALT 및 AST의 수치가 상당히 증가한 것을 관찰할 수 있었고, 신장 동성의 지표인 creatinin 및 BUN 수치도 상당히 증가한 것으로 관찰되었다. 또한, 일반 장기들의 독성을 반영해주는 지표인 LDH 수치 또한 패혈증 동물모델에서 상당히 증가한 것으로 나타났다. 이러한 간, 신장 및 일반장기 독성 지표들은 TFG 투여, TFMG 투여 또는 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여에 의해 상당히 완화되는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 특히 TFG 투여군, TFMG 투여군에서 그 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
(4) 염증성 사이토카인 분비량 평가
본 발명자들은 패혈증의 진행과정에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-10 및 TNF-α의 분비량을 평가하였다. IL-10 및 TNF-α는 패혈증 유발 혈관 염증에 있어서 필수적인 매개체인 것으로 보이며, 항체를 이용한 IL-6의 중화는 패혈증에서 사망률을 낮추는 중요한 방어기작임이 보고된 바 있다.
도 18에 나타낸 바와 같이, CLP-유발 패혈증 동물모델에서 IL-6, IL-10 및 TNF-α가 현저히 증가하였으나, 이러한 현상은 TFG 투여, TFMG 투여 또는 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여에 의해 완화되는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 특히 TFG 투여군, TFMG 투여군에서 그 효과가 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다.
상기한 결과들을 종합적으로 고려해 봤을 때, TFG 투여군, TFMG 투여군에서 PC-Gla 및 TRAP을 병용투여한 동물군과 비교해 패혈증 치료 효과가 현저히 우수한 것으로 나타났으며, 그 중에서도 TFMG 투여군이 TFG 투여군과 비교했을 때 그 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
상기한 결과는 TFMG가 염증성 병리부위에서 MMP-2에 의해 링커가 절단되어 PC-Gla를 방출하게 되고, 이렇게 방출된 유리 PC-Gla는 독자적으로 그 생리학적 활성을 나타내며, PC-Gla를 방출한 TFMG는 입체적인 장애가 줄어들어 TFG보다 우수한 TRAP 활성을 나타낼 수 있었기 때문으로 판단된다.
<실시예 5>
내피세포 permeability 평가
심각한 혈관 염증 반응 동안, 염증 사이토카인/케모카인의 과발현은 혈관의 온전한 상태로 되돌릴 수 없는 손상을 입힐 것이고, 과도한 순환 체액 손실을 야기할 수 있다. 이는 지속적인 조직 hypoperfusion과 기관 기능장애와 궁극적으로 사망에 이르게 할 수 있다. 그러므로, 혈관 투과성은 심각한 혈관 염증 질병에서 중심이 되는 역할을 한다.
TFG 처리, TFMG 처리 또는 PC-Gla 및 TRAP 병용처리에 따른 in vitro 및 in vivo 내피세포 permeability를 평가한 결과, 도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, LPS의 처리 또는 CLP 유발에 의해 HUVEC 세포 또는 마우스에서 상당한 투과성 증가를 나타내었으며, 이러한 현상은 TFG 처리, TFMG 처리 또는 PC-Gla 및 TRAP 병용처리에 의해 완화되는 것으로 확인되었다.
<실시예 6>
세포 부착인자(CAM) 발현 평가 및 류코사이트의 이주
혈관 염증 반응은 내피세포의 표면에서 ICAM-1, VCAM-1 그리고 E-selection과 같은 CAMs의 증가한 발현에 의해 조절되는 것으로 알려져 있으며, 결과적으로 내피를 가로질러 염증 부위로의 류코사이트의 부착과 이주를 촉진하게 된다. 혈관 내피에서 순환 류코사이트의 transendothelial 이주는 혈관 염증 질환의 발병의 본질적인 단계이다.
TFMG 및 TFG는 LPS에 의해 유발된 CAMs의 발현증가(도 21A), 류코사이트의 부착(도 21B) 및 CLP에 의해 유발된 류코사이트의 이주(도 22)를 억제하는 것으로 나타났다. 상기한 결과들은 TFMG 및 TFG가 혈관 염증성 질병에 치료효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.
이상 살펴본 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 항염증성 폴리펩티드가 융합된 융합폴리펩티드는 서로 다른 기전으로 작용하는 두 종류의 항염증성 폴리펩티드를 하나의 나노 케이지에 융합하여 투여할 수 있어 패혈증을 포함한 염증성 질환의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Fusion-polypeptide of anti-inflammatory polypeptide and ferritin monomer fragment and Pharmaceutical Composition comprising the same <130> np15-0084 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain monomer fragment <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain monomer <400> 2 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin receptor agonist peptide (TRAP) <400> 3 Thr Phe Leu Leu Arg Asn 1 5 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C-Gla domain <400> 4 Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln 20 25 30 Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val 35 40 45 <210> 5 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta defensin-3 <400> 5 Met Arg Ile His Tyr Leu Leu Phe Ala Leu Leu Phe Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Pro Val Pro Gly His Gly Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr 20 25 30 Cys Arg Val Arg Gly Gly Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys 35 40 45 Glu Glu Gln Ile Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg 50 55 60 Arg Lys Lys 65 <210> 6 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-1 receptor antagonist <400> 6 Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Leu Phe His Ser Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser 20 25 30 Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe 35 40 45 Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn 50 55 60 Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys 85 90 95 Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp 100 105 110 Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser 115 120 125 Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp 130 135 140 Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn 145 150 155 160 Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp 165 170 175 Glu <210> 7 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-4 <400> 7 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr 35 40 45 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 50 55 60 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 65 70 75 80 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 85 90 95 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 100 105 110 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 115 120 125 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 130 135 <210> 8 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-11 <400> 8 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro 145 150 155 160 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala 165 170 175 Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu 180 185 190 Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 195 <210> 9 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-13 <400> 9 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Arg Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln 100 105 110 Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Asn 130 <210> 10 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha stimulated gene 6 protein <400> 10 Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp 100 105 110 Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr 115 120 125 Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile 145 150 155 160 Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser 165 170 175 Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr 180 185 190 Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg 195 200 205 Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val 210 215 220 Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe 225 230 235 240 Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly 245 250 255 Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly 260 265 270 Arg Phe Ser His Leu 275 <210> 11 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activated protein C <400> 11 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro 85 90 95 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val 195 200 205 Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro 210 215 220 Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala 225 230 235 240 Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp 245 250 255 Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg 260 265 270 Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His 275 280 285 Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His 290 295 300 Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu 305 310 315 320 Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu 325 330 335 Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala 340 345 350 Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val 355 360 365 Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn 370 375 380 Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly 385 390 395 400 Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu 405 410 415 Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr 420 425 430 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His 435 440 445 Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455 460 <210> 12 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Parotid secreted protein <400> 12 Met Leu Gln Leu Trp Lys Leu Val Leu Leu Cys Gly Val Leu Thr Gly 1 5 10 15 Thr Ser Glu Ser Leu Leu Asp Asn Leu Gly Asn Asp Leu Ser Asn Val 20 25 30 Val Asp Lys Leu Glu Pro Val Leu His Glu Gly Leu Glu Thr Val Asp 35 40 45 Asn Thr Leu Lys Gly Ile Leu Glu Lys Leu Lys Val Asp Leu Gly Val 50 55 60 Leu Gln Lys Ser Ser Ala Trp Gln Leu Ala Lys Gln Lys Ala Gln Glu 65 70 75 80 Ala Glu Lys Leu Leu Asn Asn Val Ile Ser Lys Leu Leu Pro Thr Asn 85 90 95 Thr Asp Ile Phe Gly Leu Lys Ile Ser Asn Ser Leu Ile Leu Asp Val 100 105 110 Lys Ala Glu Pro Ile Asp Asp Gly Lys Gly Leu Asn Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Val Thr Ala Asn Val Thr Val Ala Gly Pro Ile Ile Gly Gln Ile Ile 130 135 140 Asn Leu Lys Ala Ser Leu Asp Leu Leu Thr Ala Val Thr Ile Glu Thr 145 150 155 160 Asp Pro Gln Thr His Gln Pro Val Ala Val Leu Arg Glu Cys Ala Ser 165 170 175 Asp Pro Thr Ser Ile Ser Leu Ser Leu Leu Asp Lys His Ser Gln Ile 180 185 190 Ile Asn Lys Phe Val Asn Ser Val Ile Asn Thr Leu Lys Ser Thr Val 195 200 205 Ser Ser Leu Leu Gln Lys Glu Ile Cys Pro Leu Ile Arg Ile Phe Ile 210 215 220 His Ser Leu Asp Val Asn Val Ile Gln Gln Val Val Asp Asn Pro Gln 225 230 235 240 His Lys Thr Gln Leu Gln Thr Leu Ile 245 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker comprising MMP-2 cleavage site <400> 13 Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly 1 5 <210> 14 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion polypeptide (1) <400> 14 Met Gly Gly Thr Thr Phe Leu Leu Arg Asn Ala Ser Gly His Met Ser 1 5 10 15 Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn 20 25 30 Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu 35 40 45 Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His 50 55 60 Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu 65 70 75 80 Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile 85 90 95 Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys 100 105 110 Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu 115 120 125 His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu 130 135 140 Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly 145 150 155 160 Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Phe Val 165 170 175 Asp Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu 180 185 190 Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe 195 200 205 Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe 210 215 220 Trp Ser Lys His Val Leu Glu His His His His His His 225 230 235 <210> 15 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion polypeptide (2) <400> 15 Met Gly Gly Thr Thr Phe Leu Leu Arg Asn Ala Ser Gly His Met Ser 1 5 10 15 Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn 20 25 30 Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu 35 40 45 Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His 50 55 60 Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu 65 70 75 80 Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile 85 90 95 Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys 100 105 110 Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu 115 120 125 His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu 130 135 140 Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly 145 150 155 160 Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Phe Val 165 170 175 Asp Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala 180 185 190 Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys 195 200 205 Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn 210 215 220 Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Leu Glu His His 225 230 235 240 His His His His

Claims (13)

  1. 서열번호 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항염증성 융합폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항의 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  10. 제9항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  11. 제1항의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지로서, 상기 단백질 케이지의 외부로 항염증성 폴리펩티드가 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 케이지.
  12. 제1항의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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