KR100981531B1 - 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체내 수분대사에 중요한 작용을 하는 신장 집합관 주세포에서 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용하여, 상기 막의 검출 및 수분 대사질환의 진단, 예방, 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 16로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출, 더 나아가 수분 대사 질환의 진단, 영상화 및 표적 약물전달 등에 다양하게 사용될 수 있다.

제2형 수분통로단백, 영상화, 약물전달, 펩타이드

Description

제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides for binding specifically to membrane embedded with aquaporin-2 and uses thereof}

본 발명은 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체내 수분대사에 중요한 작용을 하는 신장 집합관 주세포에서 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용하여, 상기 막의 검출 및 수분 대사질환의 진단, 예방, 치료방법에 관한 것이다.

파지디스플레이 기법은 타깃 (예, 단백질, 세포, 조직, 등)에 선택적인 결합능을 가지는 펩타이드 리간드를 빠르게 쉽게 분리하기 위해 고안된 혁신적인 기술로서 최근에 널리 이용되고 있다(Hoogenboom HR, Methods Mol Biol 178: 1-37, 2002.; Smith GP, Curr Opin Biotechnol 2: 668-673, 1991. ). 파지디스플레이 기술은 광범위한 펩타이드 라이브러리가 표면에 발현되는 박테리오파지를 이용하며, 리간드 펩티도믹스(ligand peptidomics), 단백질 간의 새로운 상호작용 발견, 항체 공학, 치료제 전달방법, 이미징 프로브 개발과 같이 진단과 치료기술 개발 등의 영역에서 선택적인 결합력을 가지는 펩타이드 리간드를 분리하기 위해 사용된다(Lee SM et al., Mol Cancer Res 5: 11-19, 2007.; Pasqualini R and Ruoslahti E. Nature 380: 364-366, 1996.; Petty NK et al., Trends Biotechnol 25: 7-15, 2007.; Rothe A et al., FASEB J 20: 1599-1610, 2006.). 파지 디스플레이는 in vitro에서 높은 특이성 및 결합능을 가지는 광범위한 펩티드 리간드를 발현할 수 있도록 대장균에서 증식이 가능한 박테리오파지를 사용한다. 파지 파티클의 표면에 표시되는 이러한 리간드는 어떠한 목표에 대해서도 선별할 수 있다(Petty NK et al., Trends Biotechnol 25: 7-15, 2007.; Rothe A et al., FASEB J 20: 1599-1610, 2006.).

신장의 집합관 주세포 내강면막 (apical plasma membrane)의 수분투과도 조절은 신장에서 수분배출, 요농축, 그리고 체내 수분 균형 조절에 필수적인 요소이다. 수분통로단백은 생체세포막에서 수분의 선택적인 투과를 담당하는 중요한 단백질이다(Knepper MA et al., Semin Nephrol 14: 302-321, 1994.; Nielsen S et al., Physiol Rev 82: 205-244, 2002.). 이중 제 2형 수분통로단백 (aquaporin-2: AQP2)은 신장의 집합관 주세포 내강면막에서 발현되며 항이뇨호르몬(vasopressin)에 의해 조절되고 있다(Fushimi K et al., Nature 361: 549-552, 1993.). 항이뇨호르몬은 집합관 상피세포의 수분투과도를 빠르게 증가시킨다. 이 반응은 항이뇨 호르몬이 주세포 기저외측막 (basolateral plasma membrane)에 발현하는 V2-수용체와 결 합하여 집합관 주세포의 세포질에서 cAMP에 의존적으로 AQP2가 발현되는 소포체가 내강면막으로 이동됨으로서 매개된다(Knepper MA et al., Semin Nephrol 14: 302-321, 1994.; Nielsen S et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92: 1013-1017, 1995.; Nielsen S et al., Physiol Rev 82: 205-244, 2002.).

이러한 과정을 보다 상세히 설명하면, 바소프레신(vasopressin)으로 불리우는 항이뇨 호르몬(antidiuretic hormone, ADH)은 혈장 삼투질 농도의 증가 또는 혈장량 감소(volume depletion)에 반응하여 뇌하수체 후엽에서 분비된다. 바소프레신 수용체는 V1 수용체와 V2 수용체로 나뉘며 V1 수용체는 혈관 등에 분포하여 혈압 상승 등에 관여하는 반면, V2 수용체는 집합관의 기저외측막에 분포하여 물의 흡수와 소변 농축에 관여한다. 바소프레신이 집합관의 기저외측막의 V2 수용체에 결합하면 세포내 cyclic AMP의 농도가 증가하고 수분통로 AQP2가 인산화(phsophorylation)된다. 인산화된 AQP2-함유 소포(AQP2-containing vesicle)가 내강면막에 삽입되면 수분 통로가 열리고 물이 집합관 세포 내로 들어온 후 다시 기저외측막의 AQP3와 AQP4를 통해 속수질 간질로 흡수된다. 바소프레신의 자극이 없어지면 AQP2 함유 소포는 다시 내강면막 아래의 세포질로 되돌아간다.

비록 이러한 현상은 이미 잘 알려져 있지만, AQP2를 발현하는 소포체와 세포막에서 이러한 AQP2 세포내 수송을 조절하는 조절 단백질이나 관여 단백질의 동정 및 단백질 간의 상호작용은 잘 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 AQP2가 포배된 막에 특이적으로 결합하는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 이에 특이적으로 표적됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 제2형 수분통로단백이 포배된 막을 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 제2형 수분통로단백(aquaporin-2, AQP2)이 포배된(embeded) 막을 특이적으로 표적하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합된 수분 대사 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 수분 대사 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 수분 대사 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 파지디스플레이 기법을 이용하여 실험쥐(Sprague-Dawley rat)의 신장에서 AQP2가 발현하는 집합관 주세포 세포막 혹은 주세포내 소포체막에 선택적으로 결합하는 펩타이드 리간드를 발굴하고자 하였다. 또한 비록 짧은 펩타이드 시퀀스로 인해 무작위 매칭 (random match) 가능성이 높지만, 발굴한 선택적 펩타이드 리간드의 시퀀스를 토대로 시퀀스 상동성 가지는 단백질들을 검색하였다. 이러한 단백질들은 항이뇨호르몬에 의한 AQP2의 세포막으로의 이동과 AQP2의 세포내 단백 발현조절에 단백질간의 상호작용 또는 다른 신호전달 기전을 통해 유기적으로 조절하고 있을 것으로 기대된다.

이러한 목적으로 본 발명자들은 1) 무작위로 광범위한 펩타이드 라이브러리가 표현된 박테리오파지를 이용하여 실험쥐 신장에서 AQP2를 발현하는 세포막과 세포내 소포체막에 결합시켜, 선택적이며 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드 7 종을 발현하는 파지 클론을 발굴하였으며, 2) 다시 이들 파지클론들이 과연 선택적 결합을 이루어지는지를 검증하기 위해, 박테리오파지 표면에 펩타이드 라이브러리가 표현되지 않은 T7 파지와 비교하여 AQP2가 발현하는 세포막 또는 세포내 소포체막에 상대적인 선택 결합력을 비교하였고, 3) 또한 실험 쥐 신장의 집합관에서 주 세포가 아닌 또 다른 세포인 사이세포 (intercalated cell)에만 발현하는 H+-ATPase(B1-subunit)가 발현되는 세포막과 소포체막을 분리하고 결합시켜 결합능을 비교 조사하는 대조군 실험을 실시하였다. 4) 발굴한 펩타이드 리간드의 세포내 위치를 알아보기 위해 형광물질 (FITC)을 결합시킨 인공적인 펩타이드를 합성하고 실험쥐 신장에서 일차배양한 속수질 집합관세포에서 염색해 보았고, 항이뇨호르몬인 dDAVP (10^-8M, 20분)를 단기간 처리하여 염색의 세포내 위치변화가 유도되는지를 살펴보았다. 그리고 5) 발굴한 선택적 펩타이드 리간드 7종에 각각 시퀀스 상동성을 가진 단백질들을 라이브러리 분석을 통해 선별하였다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16, 특히 서열번호 1 내지 서열번호 7로 표시되는 아미노산을 가지는 폴리펩타이드가 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 결합한다는 점에 착안하여 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 가지는, 새로운 서열의 폴리펩타이드와 이의 용도로서 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막 검출용 조성물 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 결합하며, 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 말한다. 상기 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 펩타이드 단편은 모든 종류의 펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

상기에서 제2형 수분통로단백이 포배된 막은 제2형 수분통로단백이 막(membrane)에 관통된 형태로 함유하는 것을 의미한다. 제2형 수분통로단백은 그 구조상 막관통 단백질(transmembrane protein)이므로 수용액상에서 막관통부위가 소수성 물질과 잘 결합하게 되며, 인지질 층과 같은 막구조를 형성하는 구조체의 내부에 포배되어 안정한 형태를 유지하게 된다. 상기 막은 바람직하게는 인지질 층으로 된 생체막이며, 더 바람직하게는 세포막, 원형질막, 세포내막, 세포내 소포체막일 수 있다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 결과적으로 본 발명의 펩타이드를 암호화할 수 있는 어떤 조합의 염기서열도 가능하다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 상기 펩타이드의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩타이드가 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 인식하여 결합한다는 사실을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출용 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 수분 대사 질환의 진단 또는 치료추적용 제제, 또는 별도의 수분 대사 질환 치료용 제제와 더불어 수분 대사 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 등으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 상용의 T7 파지 라이브러리를 이용하여 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는 파지를 각각 스크리닝하였다. 그 결과, 스크리닝을 통해 상기 막과 특이적으로 결합하는 파지를 각각 선별할 수 있었으며, 이의 서열을 분석한 결과 서열번호 1(CPKQRFWPC), 서열번호 2(CKRVTGRPC), 서열번호 3(CKNMRSSAC), 서열번호 4(CLPMRAKCC), 서열번호 5(CSRSRNKTC), 서열번호 6(CSRSKATHC) 및 서열번호 7(CARVKGTHC)의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 주로 선별됨을 알 수 있었다. 아울러, 이들과 유사한 서열로, 서열번호 2에 대해서는 서열번호 8(CSRVTGRPC), 서열번호 9(CKRVTGRAC), 서열번호 10(CKRVIGRNC), 서열번호 3 및 서열번호 4에 대해서는 서열번호 11(CQNMRSSAC), 서열번호 12(CQNMRSKAC), 서열번호 5 내지 서열번호 7에 대해서는 서열번호 13(CGSRSNRAC), 서열번호 14(CRVKATH), 서열번호 15(CVRAKATHC) 및 서열번호 16(CSRSKSVHC)이 선별됨을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 선별된 상기 펩타이드에 FITC를 결합하고, 이를 항이뇨호르몬(dDAVP)의 처리에 따른 속수질 집합관(IMCD) 세포에 결합여부를 확인하였다. 그 결과, 대조군 펩타이드에 비해서 본 발명의 펩타이드가 속수질 집합관의 세포막 또는 세포질내의 막에 잘 결합함을 알 수 있었다.

결론적으로, 본 발명의 펩타이드가 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하여 생체 내에서 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 인식 및 표적을 할 수 있음을 알 수 있었다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오타이드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택 된 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드의 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: ¹⁸F, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.

표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출 방법을 제공한다. 이 때, 본 발명의 폴리펩타이드 및 결합된 본 발명의 폴리펩타이드의 검출 방법은 상기에서 기재한 바 또는 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

또한 본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막에 특이적으로 결합할 수 있으므로 제2형 수분통로단백이 포배된 막을 가지는 세포(예를 들어, 속수질 집합관, 부고환 상피세포, 내이의 내림프낭 세포 (endolymphatic sac of the inner ear))에 대해서 약물을 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

상기 약물 전달용 조성물이 적용되는 질환은 수분 대사 질환일 수 있다. 수분 대사 질환은 바소프레신에 의해 매개되는 소변의 농축과 희석 기전에 장애가 발생한 경우로서 농축 장애인 요붕증(diabetes insipidus, DI) 및 희석 장애인 항이뇨호르몬 과다분비 증후군(syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion, SIADH)이 이에 포함될 수 있다.

요붕증은 다량의 희석된 소변을 배출하는 심각한 질환이다. 이는 원인에 따라 중추성 요붕증 또는 신성 요붕증으로 나뉜다. 그 중, 중추성 요붕증(central DI, CDI)은 시상하부와 뇌하수체에서 바소프레신의 생산 및 분비장애로 인해 수질 집합관 뿐만 아니라 피질 집합관에서 제 2형 수분통로를 통한 수분 재흡수 장애가 초래되며, 소변은 혈액의 삼투질 농도와 동일한 등장뇨보다 더 희석된 다량의 희석뇨를 보게 되는 심각한 질환이다. 또한 신성 요붕증 (nephrogenic DI, NDI)은 시상하부와 뇌하수체에서 바소프레신의 생산과 분비는 정상이나, 콩팥 집합관의 V2 수용체나 제2형 수분통로에 이상이 발생한 경우이다. 원인은 유전적으로 V2 수용체 유전자(Xq28)나 수분 통로 AQP2 유전자(12q13)에 기능상실 돌연변이가 일어난 경우와 후천적으로 만성 세뇨관-간질성 신염(tubulointerstitial nephritis), 다양한 약제 및 체내 전해질 이상 등에 동반되어 이차적으로 발생하는 경우가 있다. 이 또한 피질 및 수질 집합관에서 제2형 수분통로를 통한 수분 재흡수 장애가 초래되며 다량의 희석뇨를 보게 된다.

항이뇨 호르몬 과다분비 증후군은 바소프레신의 과다분비시 수분의 과다섭취시 발생하며, 필요 이상의 물이 우리 몸에 투여되었을 때 소변을 희석시켜서 용질은 그대로 두고 물만 내보내야 하는데 SIADH 때는 소변이 희석되지 않으므로 결국 체액이 희석되어 저나트륨혈증을 보이게 된다.

본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드를 종래 수분 대사 질환제제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 신장 내 수분 대사 조절 세포인 집합관 주세포에 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 수분 대사 질환 제제는 집합관에서 작용할 수 있는 것이면 사용될 수 있다. 예를 들면, 프로스타글란딘; 인도메타신(indomethacin)을 포함하는 프로스타글란딘 억제제; 포스포다이에스테라제 길항제 (phosphodiesterase inhibitior), 안지오텐신 II 수용체 길항제 (angiotensin II receptor blocker), 알도스테론 수용체 길항제 (aldosterone receptor blocker), 칼슘 채널 억제제 (calcium channel blocker), 아밀로리드(amiloride) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 결합은 보다 선택적으로 이들 약물들이 집합관 주세포에 작용할 수 있도록 할 것이다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 제제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 수분 대사 질환 제제를 유효성분으로 수분 대사 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 약학적 조성물에서 수분 질환 제제, 결합 방법 및 수분 대사 질환에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투 여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.

아울러, 본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하므로 수분 대사 질환의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 수분 대사 질환의 영상화 및 진단용 조성물을 제공한다. 이 때, 수분 대사 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

본 발명에서의 도면은 다음과 같은 기재를 참조할 수 있다.

도 1은 AQP2 면역블럿 (A) AQP2, AQP1, H⁺-ATPase 면역블럿 (B)에 관한 것이다. A) 실험쥐 신장의 세포막 (plasma membrane, PM) 또는 세포내 소포체 (intracellular vesicle, ICV)의 비면역분리 집적시료 (non-immunoisolated, WK), AQP2항체로 면역분리한 시료 (AQP2), 그리고 전면역 토끼 IgG로 면역분리한 시료 (Preimmune IgG)를 이용하였다. 쿠마시 블루 염색액으로 염색한 젤은 각 레인의 단백량이 일정함을 보여주었다. 면역블럿결과 AQP2는 실험쥐의 신장에서 면역분리 하지 않은 시료(WK)와 전면역 IgG 풀다운 시료와 비교하여 AQP2 항체로 면역분리한 시료(세포막과 세포내 소포체)에서 현저하게 그 발현량이 증가되었다. B) 실험쥐 신장에서 세포막 (PM) 또는 세포내 소포체의 비면역분리 집적시료(WK), AQP2항체 또는 H⁺-ATPase (B1-subunit)항체로 각각 면역분리한 시료를 이용하였다. 쿠마시 블루 염색액으로 염색한 젤을 통해 각 레인의 단백량이 일정함을 보여주었다. AQP2 항체로 면역분리한 시료에서 AQP2의 발현은 현저한 반면 AQP1 또는 H⁺-ATPase (B1-subunit) 발현량은 아주 적었으며, 이 결과는 AQP2를 발현하는 막 시료의 분리가 매우 선택적으로 이루어 졌음을 나타낸다.

도 2는 T7 파지의 바이오패닝 및 플라크 에세이의 결과이다. (A-B) 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 세포내 소포체막 직접시료의 복합체에 1 × 10¹¹ pfu의 T7 파지 라이브러리를 반응시킴. (C-E) 비 선택적으로 결합한 파지들을 제거하고, (D) 단백 시료에 결합된 파지들을 플라크 분석을 통해 그 수를 측정함 (E). (F) 이러한 파지들은 로그 증폭(log-phase) 상태의 대장균에 감염시켜 증폭시키고, 증폭된 파지들은 새로이 준비한 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 세포내소포체 집적시료의 복합체에 똑같은 방법으로 반응시켰다. 세번에 걸쳐서 이와 똑같 이 파지들을 선별하였다.

도 3은 선별한 파지 클론들을 AQP2를 발현하는 세포막과 세포내 소포체막 집적시료에 다시 반응시켜 선택적 결합력을 확인한 것이다. A) 세번에 걸친 파지 선별 후, 세포막 집적시료에서 80 플라크, 그리고 세포내 소포체막 집적시료에서 80 플라크, 총 160개의 플라크를 LB plates에서 임의로 골라내었다. B) 각각의 파지 클론들의 시퀀스를 PCR을 통해 알아내고, 이 중 높은 빈도로 동일한 시퀀스 혹은 유사한 시퀀스를 나타내는 일곱개의 파지 클론들을 선택하였다. C) 이 일곱개의 파지 클론과 파지 입자의 표면에 펩타이드 리간드를 표현하지 않는 T7 미삽입 파지 클론을 항AQP2항체로 면역분리한 세포막과 세포내 소포체막 시료에 각각 반응시키고, 그 결합력을 측정하였다. (D-E) 복합체에 결합된 파지들은 떼어 내어 (D) 플라크 에세이를 통해 파지 클론의 숫자를 헤아렸다 (E). 따라서 많은 수의 플라크를 보이는 파지 클론은 AQP2항체로 면역분리한 막 시료에 높은 결합력을 가짐을 시사한다.

도 4는 일차배양된 속수질 집합관(IMCD)세포에 FITC가 결합된 펩타이드를 염색한 것이다. A 및 C) 항이뇨호르몬 (dDAVP) 자극을 주지 않은 IMCD세포에 FITC-SRSRNKT 혹은 FITC-KNMRSSA로 염색하였을 때 세포질내 부분 혹은 세포막에서 염색되는 것을 관찰하였다. B 및 D) 단시간 dDAVP (10^-8M, 20 분)를 처리한 경우, FITC- SRSRNKT와 FITC-KNMRSSA의 염색 양상이 변화하지 않았다. E 및 F) FITC-PKQRFWP로 염색하였을때 세포질내 부분과 세포막 모두에서 진하게 염색되었으며 단시간의 dDAVP 처리에 의한 변화는 관찰되지 않았다. G 및 H) FITC가 결합된 대조군 펩타이드 (FITC-NSSVDK)는 일차배양된 IMCD 세포에서 단시간의 dDAVP (10^-8M, 20 분)를 처리하지 않거나 (G), 혹은 처리한 경우 (H) 염색되지 않거나 매우 약하게 염색되는 것을 관찰하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출, 더 나아가 수분 대사 질환의 진단, 영상화 및 표적 약물전달 등에 다양하게 사용될 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

1. 실험쥐 신장의 세포막 혹은 세포내 소포체막이 집적된 시료 준비

Charles River사 (Orient Bio, 성남, 한국)로부터 무균상태의 Sprague-Dawley 숫쥐 (200 g-250 g)를 구입하였다. 실험쥐는 엔플루란(light enflurane) 흡입마취하여, 빠르게 양쪽 신장을 적출하고, 신장은 얼음 위에서 잘라 10ml 해부용 버퍼(dissecting buffer; 0.3 M sucrose, 25 mM imidazole, and 1 mM EDTA, pH 7.2, containing protease inhibitors: 8.5 μM leupeptin and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)에 넣고 균질화 시켰다 (Eppendorf 5810R, Hamburg, Germany). 이 균질액을 4°C에서 4,000g로 15 분간 원심분리 (Beckman OptimaTM L-100XP with Ti-90 rotor)하여 핵, 미토콘드리아, 그리고 세포내 큰 잔여물질 등을 제거하고(Kwon TH et al., Am J Physiol Renal Physiol 285: F152-F165, 2003.; Kwon TH et al., Am J Physiol Renal Physiol 288: F673-F684, 2005.; Marples D et al., Am J Physiol 269: C655-64, 1995.), 그 상층액을 수집하여 저속(Low speed: LS) 세포막 집적시료와 고속 (High speed: HS) 세포내 소포체 집적시료를 분리하였다(Marples D et al., Am J Physiol 269: C655-64, 1995.). LS 펠렛(pellet, 17,000 x g, 30분)은 세포막(Plasma membrane: PM)부분이 대다수 포함된 시료를 말하며, HS 펠렛 (200,000 x g, 1시간)은 세포내 소포체(intracellular vesicle: ICV)가 대다수 포함된 시료를 말한다(Marples D et al., Am J Physiol 269: C655-64, 1995.; Terris J et al., Am J Physiol 269: F775-F785, 1995.). 이러한 펠렛들은 해부용 버퍼에 용해시켰다.

2. 실험쥐 신장에서 AQP2 가 선택적으로 발현되는 세포막 ( PM ) 집적시료 또는 AQP2 가 선택적으로 발현되는 세포내 소포체막 ( ICV ) 집적시료의 면역분리

위에서 기술한 바와 같이 실험쥐 신장으로부터 분리한 세포막 집적시료 (LS) 또는 세포막 소포체 집적시료 (HS) 모두를 마그네틱 비드(magnetic beads, Dynal M-280; Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway, precoated with anti-rabbit IgG) 와 정제된 AQP2 항체 (~ 2 μg/10⁷ beads)(Marples D et al., Am J Physiol 274: F384-F394, 1998.; Nielsen J et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: F438-F449, 2006.)를 넣어 4°C 에서 하루밤 동안 일정한 교반상태에서 반응시켰다. 1) AQP2 면역블럿 분석(immunoblotting)을 위해 시료를 0.1% BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 PBS에 10분간 3번씩 조심스럽게 씻어내고, 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 소포체 집적시료의 복합체를 자석으로 분리한다. 자석으로 분리한 시료는 램리 샘플 버퍼(Laemmli sample buffer; 10 mM Tris, pH 6.8, 1.5% SDS, 6% glycerol)를 넣고, 60°C 에서 15분간 열처리 하여 단백질들을 용해시킨다. 이후 비드를 자석으로 당겨 제거하고, 면역분리한 시료는 면역블럿 분석 (그림 1) 한다. 2) AQP2를 포함하는 막 (세포막과 소포체막) 분리의 특이성을 알아보기 위한 대조군 실험(control experiment)으로 전면역 토끼 IgG 풀 다운 분석(preimmune rabbit IgG pulldown) 시료 (세포막과 소포체막)를 준비하여 AQP2 변역블럿(그림 1A)을 함께 시행하였다. 또한 면역분리한 AQP2를 발현하는 막 시료(세포막과 소포체막)와 함께, H⁺-ATPase (B1-subunit)를 발현하는 막 시료(세포막과 소포체막)을 따로 분리하여 AQP2, AQP1, H⁺-ATPase 면역블럿을 각각 실시하였다 (그림 1B). 3) 파지디스플레이 시행을 위해, 시료를 0.1% BSA in PBS에 10분간 3번씩 결합하지 않은 단백들을 조심스럽게 씻어내었고, 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 소포체 집적시료의 복합체를 자석으로 당겨 얻었다 (아래 T7 파지 바이오패닝 부분에서 상세하게 기술됨).

3. AQP2 , H ⁺ - ATPase , AQP1 의 면역 블럿

각각의 레인(lane)에 동등한 양의 단백을 투여(load)하기 위해 젤을 쿠마시 블루 염색액(Coomassie Blue dye, GelCode Blue Stain Reagent, Pierce)로 염색하고 쿠마시 블루 염색액으로 염색된 젤의 각 레인의 밴드 농도(band density)에 따라 투여량(loading volume)을 조정하였다(Kwon TH et al., Am J Physiol Renal Physiol 285: F152-F165, 2003.; Kwon TH et al., Am J Physiol Renal Physiol 288: F673-F684, 2005.; Nielsen J et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: F438-F449, 2006.). SDS-PAGE는 12% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gels)에서 시행하였다. 하나의 젤은 쿠마시 블루 염색액으로 다시 염색하여 각 레인들에서 투여(loading)가 균일하게 이루어졌음을 확인하고, 다른 젤은 면역블럿을 하였다. 일렉트로일루션(Electroelution)을 통해 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 젤상의 단백질을 옮긴 후에, 블럿(blots)은 PBST 내의 5% 탈지분 유(milk in PBST (80 mM Na₂HPO₄, 20 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)) 용액에서 한 시간 동안 차단시키고, AQP2 항체 (1:500)(Nielsen J et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: F438-F449, 2006.), H⁺-ATPase 항체 (1:1,000)(Kim YH et al., Am J Physiol Renal Physiol 285: F1244-F1257, 2003.), 그리고 AQP1 항체 (1:1,000)(O'Neill H et al., Nephrol Dial Transplant 23: 1546-1555, 2008.)와 반응시켰다. AQP2 항체는 쥐 AQP2(Fushimi K et al.,, Nature 361: 549-552, 1993.)의 카르복시 말단(carboxyl terminus) 부분 (250- 271)에 KLH 부착(KLH conjugation)을 위한 NH₂-말단 시스테인(NH₂-terminal cysteine; NH₂-CEVRRRQSVELHSPQSLPRGSKA-COOH, amino acids 250-271, 서열번호 17)을 합성하고 이를 토끼에 주입하여 생산하였다. 표지(Labeling)는 호오스래디시 퍼옥시다아제 부착(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated) 이차항체 (P448, 1:3,000; DAKO, Glostrup, Denmark)와 ECL(enhanced chemiluminescence) 시스템으로 시각화 하여, 사진용 필름(photographic film; Hyperfilm ECL, RPN3103K, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)에 현상하였다.

4. T7 파지의 바이오패닝

T7 415-1b 파지 벡터의 파지 펩타이드 라이브러리를 사용하였으며, 이 파지는 CX₇C(두개의 Cysteine사이에 임의로 배열된 일곱개의 아미노산 잔기를 포함)가 발현하도록 설계되었다 (Novagen, Madison, WI)(Lee SM et al., Mol Cancer Res 5: 11-19, 2007.). 이 라이브러리는 ~5 × 10⁸ PFU(plaque forming unit)의 다양성을 가졌다. 파지라이브러리의 바이오패닝을 간단히 설명하면 (그림 2, 그림 3)(Hoffman JA et al., edited by Clackson T and Lowman HB. New York: Oxford University Press, 2004, p. 171-192.; Lee SM et al., Mol Cancer Res 5: 11-19, 2007.), 1 × 10¹¹pfu의 T7 파지 라이브러리 (그림 2A)를 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 소포체막 집적시료의 복합체에 4°C에서 밤새도록 일정한 교반상태에서(그림 2B) 결합시킨다. 이것을 시행하기에 앞서 T7 파지 라이브러리를 항-토끼 IgG(anti-rabbit IgG) 항체가 이미 코팅된 마그네틱 비드(Dynal M-280; Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)에 먼저 결합시키는데, 여기에 결합하지 않는 파지 라이브러리만 선택하여 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 소포체막 집적시료의 복합체에 4°C에서 밤새도록 결합시킨다. 다음날, 1 ml 의 M9/LB 배지(10 g bactotryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, 1 g NH₄Cl, 3 g KH₂PO₄, 3 g NaHPO₄.7H₂O/L containing 0.4% glucose and 1 mM MgSO₄)을 이용하여 10번 씻어내어, 비 선택적으로 결합한 파지들를 제거한다 (그림 2C). 복합체에 결합한 파지는 대장균 감염을 통해 떼어내며 (그림 2D), 플라크 분석(plaque assay)을 통해 결합한 파지클론의 수를 헤아린다 (그림 2E). 또한 이 파지는 대장균(E. coli)에 감염시켜 증폭시키고 (그림 2F), 이것은 다시 새로 준비한 마그네틱 비드, AQP2 항체, 세포막 또는 소포체 집적시료의 복합체에 같은 방법으로 반응시킨다(그림 2). 세번 에 걸쳐 같은 방법을 실시하여, 세포막시료에서 80 플라크(plaques), 그리고 소포체막 시료에서 80 플라크를 LB 플레이트(plates)에서 임의로 골라 (그림 3A), 10 μl TBS (Tris 3.0285 g, NaCl 4.3838 g per 500 ml, pH 7.5)에 용해시키고, 이것을 시퀀싱한다 (그림 3B). 시퀀싱 결과 중에 동일한 시퀀스 혹은 유사한 시퀀스가 빈번히 나타난 일곱개의 파지클론을 선별하였다(표 1). 이 일곱개의 파지 클론을 다시 AQP2-면역분리 시료 (세포막과 소포체막 시료 모두)에 결합시키고, 파지입자의 표면에 펩타이드 리간드가 표현되지 않는 T7 미삽입(insertless) 파지클론의 결합능과 비교하여 선택적 결합능을 검증하였다 (그림 3C-E). 또한, 일곱개의 선별된 파지클론이 AQP2를 발현하는 세포막과 소포체막에 선택적 결합력을 가지는지를 다시 알아보기 위해 실험쥐 신장 집합관 사이세포에만 특이적인 H⁺-ATPase (B1-subunit)가 발현되는 세포막과 소포체막 시료를 이용하여 그 결합력을 다시 측정하였다.

5. 플라크의 PCR 증폭 및 라이브러리 분석

TBS에 용해된 파지클론들은 PCR 반응에서 프라이머(서열번호 18, 5-AGCGGACCAGATTATCGCTA-3 및 서열번호 19, 5-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3) (Genotech, Korea)와 함께 주형(template)으로 작용한다. PCR은 Top-TaqTM PreMix (2X) Ver 3.0 (Corebio, Korea)를 이용하여 95°C에서 3분 처리한 후 35 싸이클(cycles; 94°C 에서 50 초, 50°C 에서 1분, 72°C에서 1분)후 72°C에서 6분 동안 마지막 연 장반응(extension)을 시켰다. 4 μl의 반응물을 2% 아가로스 젤(agarose gel)에 내려서 PCR 증폭이 잘 되었는지 확인하였다. 파지 DNA를 PCR로 증폭시킨후, 이 DNA를 정제하고, T7 파지 표면에 표지되어 있던 아미노산 시퀀스를 Koma Biotech Co.(대전, 한국)를 통해 확인하였다.

라이브러리 분석을 통해 펩타이드 리간드 시퀀스와 상동성을 가지는 쥐의 단백질들(표 4-6)을 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)에서 이용할 수 있는 NCBI BLAST 프로그램의 SWISSPROT 데이터베이스를 사용하여 검색하였다. 각각의 펩타이드 시퀀스의 데이터베이스를 검색할 때 Expect (E)-값(random background noise)는 표 4-6에 같이 기술하였다.

6. 실험쥐의 신장 속수질 집합관 세포의 일차배양과 펩타이드 리간드에 형광물질을 결합시킨 펩타이드 염색

신장 속수질 집합관세포 (IMCD 세포)가 집적된 일차배양은 무균상태의 Sprague-Dawley 숫쥐 (200 - 250g, Charles River)에서 신장을 적출하여 시행하였다(Chou CL et al., J Biol Chem 275: 36839-36846, 2000.; Lee YJ et al., Am J Physiol Renal Physiol 292: F340-F350, 2007.). IMCD세포는 인간 피브로넥틴(human fibronectin)이 코팅된 슬라이드 (Lab-Tek™ Chamber Slides™ System, Cat. No.177402, NUNC, Roskilde, Denmark)에서 키웠으며, 매 24 시간마다 신선한 배지로 갈아주었다. 이 세포들은 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 고삼투질 농도 세포배양액 (hypertonic culture medium, 640 mOsm/KgH₂O)에서 자라며, 37°C의 5% CO₂, 95% 대기에서 3일간 키우고, 우태아혈청이 없는 배지에서 하루를 더 키운다. 5일째, IMCD세포는 무처리(vehicle) 또는 dDAVP (10^-8M)를 20 분간 처리한 후 2.5% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; pH 7.4)로 20 분간 실온에서 고정하고, PBS에 두번 씻어 낸 후 0.3% 트리톤 X-100 함유 PBS(0.3% Triton X-100 in PBS)로 실온에서 15분간 처리하여 세포막의 투과도를 증가시켰다. 이후 세포들을 씻어내고 1% BSA 함유 0.01M PBS(1% BSA(bovine serum albumin) in 0.01 M PBS)로 30분간 차단한 다음 형광물질을 결합시킨 펩타이드 (10 μM)로 4°C에서 밤새도록 반응시킨다. 인공적으로 합성한 펩타이드(PKQRFWP, KNMRSSA, and SRSRNKT)들은 형광물질인 FITC와 결합시켰고 (Peptron, Inc., Daejeon, Korea), 또한 FITC 가 결합된 대조군 펩티드(NSSVDK)는 대조군 실험에 사용되었다. 이후 세포들을 씻어내고 안티페이딩 시약(antifading reagent)이 포함된 친수성 마운트액 (cat. no. P36930, Molecular Probes Inc, Eugene, OR)로 마운트하였다. 형광현미경은 CoolSNAP HQ camera (Photometrics, Tucson, AZ)를 갖춘 Leica DM IRB inverted microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하였다.

<실험 결과>

1. AQP2 를 발현하는 세포막과 세포내 소포체막의 면역 분리

실험쥐의 신장에서 세포막 또는 세포내 소포체막이 집적된 막 시료를 AQP2 항체, H⁺-ATPase (B1-subunit) 항체, 그리고 전면역 토끼 IgG를 이용하여 면역분리하였다. 면역블럿 결과, AQP2는 흰쥐 신장의 비면역분리 시료와 전면역(preimmune) IgG로 면역분리한 시료에 비하여 AQP2 항체로 면역분리된 세포막과 소포체막 시료에서 현저하게 많이 발현되었다 (그림 1A). 또한, 실험쥐 신장에서 비면역분리시료, AQP2항체로 면역분리한 시료, H⁺-ATPase항체로 면역분리한 시료 중 오직 AQP2항체로 면역분리한 시료에서만 AQP2 발현이 관찰되는 것을 확인하였다 (그림 1B). AQP1은 AQP2항체로 면역분리한 시료와 H⁺-ATPase항체로 면역분리한 시료에 비하여, 비면역분리 시료에서 우세적으로 발현되었다 (그림 1B). 또한 이와 유사하게, H⁺-ATPase의 발현은 비면역분리 시료와 AQP2항체로 면역분리한 시료에 비해 H⁺-ATPase항체로 면역분리한 시료에서 현저히 발현되었다 (그림 1B). 이러한 결과는 AQP2와 H⁺-ATPase를 발현하는 세포막 및 소포체막 시료 분리의 특이성을 시사한다.

2. 실험쥐 신장에서 AQP2 항체로 면역분리한 세포막과 세포내 소포체막에 선택적으로 높은 결합능을 가진 파지클론 선별

CX₇C 무작위 펩타이드 시퀀스를 발현하는 T7 파지 라이브러리에서 선택적으로 실험쥐 신장에서 AQP2가 발현되는 세포막과 소포체막에 높은 결합능을 가지는 파지들을 집적시켰다. 세번에 걸친 선별작업을 통해, 각 단계에서 세포막과 소포체막 시료 모두에서 파지클론들이 유의하게 집적되는 것을 확인하였다(결과미도시). AQP2가 발현하는 세포막 또는 소포체막 시료로부터 각각 80개씩 임의로 파지클론들을 선택하였으며, 이 파지 클론들은 모두 PCR을 통해 T7 파지 캡시드(phage capsid)에 발현하고 있는 아미노산 시퀀스(sequence)에 상응하는 DNA를 증폭하여 시퀀싱(sequencing)했다. 이렇게 AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에 선택적인 파지 라이브러리 중 무작위로 추출한 160개의 파지 클론에서 높은 빈도로 동일한 시퀀스 또는 유사한 시퀀스를 보이는 7개의 파지클론을 최종 선택하였다 (표 1). 이들 중, CPKQRFWPC (7 identical sequences/160 phage clones: 4.4%), CKRVTGRPC(5/160: 3.1%), CKNMRSSAC (5/160: 3.1%)를 발현하는 파지클론이 전체 무작위로 선택한 파지클론 160개 중 11%를 차지하였다. 또한 이들 7개 파지 클론들은 다시 AQP2항체로 면역분리한 시료(세포막 또는 소포체막)에 플라크 분석을 통해 그 결합이 선택적인 결합임을 확인하였으며, 각각의 결합은 파지입자 (capsid)의 표면에 펩타이드 리간드를 발현하지 않는 T7 미삽입(insertless) 파지클론의 결합능과 비교하였다 (그림 3, 표 2). 일곱개의 파지클론들은 AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에서 T7 미삽입 파지클론들에 비해 약 50배에서 5,600배 높은 결합능을 보였다 (표 2). 또한, AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에 이들 파지클론들이 선택적으로 결합하는지를 다시 확인하기 위해, 또 다른 결합 분석을 실시하였다. 즉, 선택된 일곱개의 파지 클론을 실험쥐의 신장에서 준비한 사이세포(집합관에서 AQP2가 발현하고 있는 주세포가 아닌 다른 종류의 세포)에서만 발현하는 H⁺-ATPase (B1-subunit)를 포함하는 세포막 또는 소포체막 시료에 결합시켜 보았다 (표 3). 선택된 7개의 파지 클론들은 H⁺-ATPase를 포함하는 막 시료에서 AQP2를 발현하는 막시료에서 나타난 결과와는 달리 0.4배에서 3.5배의 낮은 결합능을 보였다(표 3). 따라서 이상의 결과는 본 연구에서 선택한 일곱개의 파지클론이 AQP2를 발현하는 세포막 및 소포체막 시료에서 높은 선택성을 가지고 있음을 나타낸다.

상기 표 1에서는 AQP2를 발현하는 세포막 (PM)과 세포내 소포체막 (ICV)에서 집적된 파지들 중 임의로 160개의 파지클론들을 선택하였으며 이 중 동일한 아미노산 잔기들이 많이 발견되거나, 유사한 시퀀스의 아미노산 잔기들이 많이 발견되는 일곱개의 파지클론들을 선별하였다.

상기 표 2에서는 일곱개의 선별된 파지 클론들과 파지입자 (capsid)의 표면에 펩타이드 리간드를 발현하지 않는 T7 insertless 파지클론의 AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에 대한 결합능 비교하였다. 일곱개의 파지클론들은 AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에서 T7 insertless 파지클론들에 비해 약 50배에서 5,600배 높은 결합능을 보였다.

상기 표 3에서는 일곱개의 선별된 파지 클론들과 파지입자 (capsid)의 표면에 펩타이드 리간드를 발현하지 않는 T7 미삽입 파지클론의 H⁺-ATPase (B1-subunit)를 발현하는 세포막 또는 소포체막에 대한 결합능 비교하였다. 일곱개의 파지클론들은 H⁺-ATPase (B1-subunit)를 발현하는 세포막 또는 소포체막에서 T7 insertless 파지클론들에 비해 AQP2를 발현하는 막시료에서 나타난 결과와는 달리 0.4배에서 3.5배의 낮은 결합능을 보였다.

3. 선택된 파지클론의 펩타이드 시퀀스와 상동성을 가지는 단백질 선별

AQP2가 발현하는 세포막 또는 세포내 소포체막 시료에서 각각 80개씩 임의의 파지클론들을 선택하였으며, 총 160개의 파지클론들은 PCR을 통해 T7 파지표면에 발현하고 있는 아미노산 시퀀스에 상응하는 DNA를 증폭하여 시퀀싱했다. 이렇게 AQP2를 발현하는 세포막 또는 소포체막에 선택적인 파지 라이브러리 중에 무작위로 추출한 160개의 파지클론에서 높은 빈도로 동일한 시퀀스 또는 유사한 시퀀스를 보이는 7개의 파지클론을 선택하였다 (표 1). 이중 3개의 펩타이드 시퀀스는 소포체막 시료에서, 1개의 펩타이드 시퀀스는 세포막 시료에서, 그리고 나머지 3개의 시퀀스는 세포막과 소포체막 모두에서 확인되었다. 각각의 펩타이드 시퀀스와 상동성을 가진 실험쥐의 단백질들을 The National Center for Biotechnology Information에서 이용할 수 있는 BLAST program을 이용하여 검색하였다 (표 4 내지 6).

상기 표 4에서는 세포내 소포체막에서 집적된 파지클론 (높은 빈도를 보인 선택된 파지클론) 및 각각의 파지클론이 디스플레이하는 펩타이드와 시퀀스 상동성을 가지는 단백질을 나타낸다.

상기 표 5에서는 세포막에서 집적된 파지클론 (높은 빈도를 보인 선택된 파지클론) 및 각각의 파지클론이 디스플레이하는 펩타이드와 시퀀스 상동성을 가지는 단백질을 나타낸다.

상기 표 6에서는 세포막과 세포내 소포체막에서 동시에 집적된 파지클론 (높은 빈도를 보인 선택된 파지클론) 및 각각의 파지클론이 디스플레이하는 펩타이드와 시퀀스 상동성을 가지는 단백질을 나타낸다.

4. 일차배양된 속수질 집합관 세포에서 FITC 가 결합된 펩타이드 염색

본 발명자들은 일차배양된 속수질 집합관 세포>에서 항이뇨호르몬 V2-receptor 자극제인 항이뇨호르몬 (dDAVP)를 처리 (10^-11M, 15분)함으로서 AQP2의 세포막으로의 이동이 유의하게 촉진됨을 이전의 연구에서 확인하였다(Lee YJ et al., Am J Physiol Renal Physiol 292: F340-F350, 2007.). 본 연구에서는 선택된 펩타이드 리간드 중에 특히 AQP2를 발현하는 소포체막에서 집적시킨 파지클론 (SRSRNKT와 KNMRSSA)의 세포 내 위치와 짧은 시간동안의 dDAVP 처리에 따른 펩타이드 리간드의 세포 내 위치이동 변화를 확인하고자 하였다. FITC가 결합된 펩타이드들을 일차배양된 속수질 집합관 세포에서 dDAVP (10^-8 M)를 20분간 처리한 군과 그렇지 않은 군에서 각각 세포 염색을 실시하였다 (그림 4). dDAVP처리를 하지 않았을 때, FITC-SRSRNKT 염색은 세포질에서 진하게 발현되는 것을 확인하였고 (그림 4A), FITC-KNMRSSA의 염색은 세포질 내 구조물 (그림 4C)과 세포막 (그림 4C, 화살표로 표시된 부분)에서 모두 발현되는 것을 확인하였다. 또한 짧은 시간동안 dDAVP를 처리하였을 때 (10^-8M, 20 분), FITC-SRSRNKT, FITC-NMRSSA로 염색된 세포 모두에서 세포질 내 염색패턴의 변화를 볼 수 없었다(그림 4B and D). 대조적으로 FITC 와 결합된 대조군 펩티드(FITC-NSSVDK)는 일차배양된 집합관 속수질 세포에서 염색이 되지 않거나 매우 약하게 발현하는 것을 관찰하였다 (그림 4G, H). 추가적으로 AQP2 를 발현하는 세포막과 소포체막 시료 모두에서 찾아낸 FITC-PKQRFWP로 염색해 본 결과 세포질 부분과 세포막 부분 모두에서 염색되는 것을 관찰하였다 (그림 4E). 이것은 이 파지클론이 세포막과 소포체막 모두에서 선택적 결합력을 보인 점과 일관된 결과였다 (표 2). 그러나 짧은 시간의 dDAVP 처리에 의한 염색패턴의 변화는 관찰되지 않았다 (그림 4F).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 신장 집합관 세포에 주로 발현되는 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출, 더 나아가 수분 대사 질환의 진단, 영상화 및 표적 약물전달 등에 다양하게 사용될 수 있다.

도 1은 AQP2에 대한 면역블럿(A) 및 AQP2, AQP1, H⁺-ATPase에 대한 면역블럿(B) 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 T7 파지의 바이오패닝 및 플라크 에세이를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 선별한 파지 클론들을 선택적 결합 확인 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 4는 속수질 집합관(IMCD)세포에 FITC가 결합된 본 발명의 펩타이드의 특이적 결합을 확인한 것이다.

<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Peptides for binding specifically to membrane embedded with aquaporin-2 and uses thereof <130> NP08-0049 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 <400> 1 Cys Pro Lys Gln Arg Phe Trp Pro Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 <400> 2 Cys Lys Arg Val Thr Gly Arg Pro Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 3 <400> 3 Cys Lys Asn Met Arg Ser Ser Ala Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4 <400> 4 Cys Leu Pro Met Arg Ala Lys Cys Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 5 <400> 5 Cys Ser Arg Ser Arg Asn Lys Thr Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 <400> 6 Cys Ser Arg Ser Lys Ala Thr His Cys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 7 <400> 7 Cys Ala Arg Val Lys Gly Thr His Cys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 8 <400> 8 Cys Ser Arg Val Thr Gly Arg Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 9 <400> 9 Cys Lys Arg Val Thr Gly Arg Ala Cys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 10 <400> 10 Cys Lys Arg Val Ile Gly Arg Asn Cys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 11 <400> 11 Cys Gln Asn Met Arg Ser Ser Ala Cys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 12 <400> 12 Cys Gln Asn Met Arg Ser Lys Ala Cys 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 13 <400> 13 Cys Gly Ser Arg Ser Asn Arg Ala Cys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 14 <400> 14 Cys Arg Val Lys Ala Thr His 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 15 <400> 15 Cys Val Arg Ala Lys Ala Thr His Cys 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 16 <400> 16 Cys Ser Arg Ser Lys Ser Val His Cys 1 5 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for KLH conjugation <400> 17 Cys Glu Val Arg Arg Arg Gln Ser Val Glu Leu His Ser Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Pro Arg Gly Ser Lys Ala 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agcggaccag attatcgcta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aacccctcaa gacccgttta 20

Claims (14)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 16로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드.
2. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드.
3. 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
4. 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
5. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막 검출용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포 어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
7. (a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계;

   (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및

   (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 제2형 수분통로단백이 포배된 막의 검출 방법.
8. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 요붕증(diabetes insipidus, DI) 또는 항이뇨호르몬 과다분비 증후군(syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion, SIADH)인 수분 대사 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 요붕증(diabetes insipidus, DI) 또는 항이뇨호르몬 과다분비 증후군(syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion, SIADH)인 수분 대사 질환 제제와 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 수분 대사 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 수분 대사 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 수분 대사 질환 제제는 프로스타글란딘, 인도메타신(indomethacin), 프로스타글란딘 억제제, 포스포다이에스테라제 길항제 (phosphodiesterase inhibitior), 안지오텐신 II 수용체 길항제 (angiotensin II receptor blocker), 알도스테론 수용체 길항제 (aldosterone receptor blocker), 칼슘 채널 억제제 (calcium channel blocker), 아밀로리드(amiloride)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
13. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 수분 대사 질환 부위의 영상화용 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.

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