KR20220053848A - Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도 - Google Patents

Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220053848A
KR20220053848A KR1020200138075A KR20200138075A KR20220053848A KR 20220053848 A KR20220053848 A KR 20220053848A KR 1020200138075 A KR1020200138075 A KR 1020200138075A KR 20200138075 A KR20200138075 A KR 20200138075A KR 20220053848 A KR20220053848 A KR 20220053848A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
ferritin
nanocage
ppnf
present
Prior art date
Application number
KR1020200138075A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102658825B1 (ko
Inventor
김소연
유재도
전인선
김민성
이병헌
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020200138075A priority Critical patent/KR102658825B1/ko
Priority claimed from KR1020200138075A external-priority patent/KR102658825B1/ko
Priority to PCT/KR2021/014261 priority patent/WO2022086058A1/ko
Priority to EP21883129.5A priority patent/EP4234578A1/en
Publication of KR20220053848A publication Critical patent/KR20220053848A/ko
Priority to US18/138,118 priority patent/US20230374113A1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102658825B1 publication Critical patent/KR102658825B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

본 발명은 PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도에 관한 것으로서, 유방암, 대장암, 신장암, 교모세포종 등과 같은 다수의 암에 과발현되는 면역 체크포인트 수용체 PD-L1에 결합하는 펩타이드 1(PD-L1pep1: CLQKTPKQC)를 인간 페리틴 모노머에 융합하여 케이지를 형성시 24개의 PD-L1pep1이 디스플레이되는 나노케이지를 제조하였다. 본 발명의 나노케이지는 대장암 조직에 효과적으로 타겟팅하여 항암효과를 보였으며, 나노케이지 내부에 항암제 독소루비신을 탑재하면, 동량의 PD-L1 항체보다 우수한 항암 효과를 보였다. 이에, 항체를 이용한 면역 체크포인트 블록킹 치료요법의 한계를 극복하는 차세대 약물로서 기대된다.

Description

PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도{The immunotherapeutic nanocage displaying PD-L1 binding peptide 1 and use in anti-cancer immunotherapeutic agent thereof}
본 발명은 PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도에 대한 것으로서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지의 면역 체크포인트 제어 및 약물전달 복합 항암 면역치료 용도에 관한 것이다.
케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수십에서 수백 배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 자연계에서 바이러스 캡시드(capsid) 단백질, 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein), Dps 단백질이 이에 해당되며, 케이지(cage)를 구성하는 각각의 단일체들은 인접 단일체들과 매우 규칙적이고 정밀한 상호작용을 이루고 있고 케이지(cage)의 내부는 비어있는 구조이다. 상기와 같은 케이지 단백질의 용기(container)와 같은 성질에 의해 내부와 외부가 격리되는 특징을 가지고 있어, 약물 전달체로 의학분야에서 활용 빈도가 높다.
케이지 단백질 응용 물질 수송 분야는 바이러스성 수송체 (viral vector)와 비 바이러스성 수송체 (non-viral vector)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 바이러스성 수송체로는 아데노바이러스 (adenovirus) 등이 많이 연구되고 있고, 비 바이러스성 수송체로는 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein) 등에 관하여 연구되고 있다. 그러나 기존의 바이러스성 수송체일 경우에는 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되어 왔다.
페리틴 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 subunit으로 구성되며, subunit은 그 구조에 따라 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)로 구분된다.
한편, 암 면역치료의 발달은 암 치료의 역사에서 중요한 변곡점에 도달했다. 면역 체크포인트 분자의 하나인 프로그램된 세포사멸(Programmed cell death; PD-1)은 여러 암에서 매력적인 치료 표적이 되었다. PD-1은 활성화시 T 세포에서 상향 조절되고, 종양-침윤 림프구에서 일반적으로 나타나는 소진된 T 세포에 많이 존재한다. PD-1과 이의 리간드인 PD-L1의 상호작용을 차단하면, 일부 환자에게서는 우수한 항종양 반응 및 임상 효과를 확인할 수 있었다.
이에, PD-L1에 결합하여, PD-1 및 PD-L1의 상호작용을 차단하는 펩타이드의 면역관문억제 기능 증대 및 안정성을 높이고, 암조직에 효과적으로 수송할 수 있는 약물전달 플랫폼의 개발이 필요한 상황이다.
한국등록특허 제10-1811050호 (2017.12.14 등록)
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드 및 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드 및 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도에 관한 것으로서, 유방암, 대장암, 신장암, 교모세포종 등과 같은 다수의 암에 과발현되는 면역 체크포인트 수용체 PD-L1에 결합하는 펩타이드 1(PD-L1pep1: CLQKTPKQC)를 인간 페리틴 모노머에 융합하여 케이지를 형성시 24개의 PD-L1pep1이 디스플레이되는 나노케이지를 제조하였다. 본 발명의 나노케이지는 대장암 조직에 효과적으로 타겟팅하여 항암효과를 보였으며, 나노케이지 내부에 항암제 독소루비신을 탑재하면, 동량의 PD-L1 항체보다 우수한 항암 효과를 보였다. 이에, 항체를 이용한 면역 체크포인트 블록킹 치료요법의 한계를 극복하는 차세대 약물로서 기대된다.
도 1은 PD-L1 결합 펩타이드 1(PD-L1pep1)을 세 가지 접합점 각각에 삽입한 융합단백질 (PpNF, PpLF, PpCF)을 디자인하고, 제조하여 구조, 생물리적 특성 및 결합력의 차이를 규명한 결과를 나타낸다. A) PpNF, PpLF, PpCF에 대한 유전자 서열 모식도를 나타낸다. B) 대장균에서 PpNF, PpLF, PpCF의 안정적인 발현 및 정제를 검증한 결과를 나타낸다. C) PpNF, PpLF, PpCF의 3차 구조모델링 결과를 나타낸다.
도 2는 제조된 각각의 융합단백질을 TEM과 DLS로 케이지 형성 여부 및 파티클 크기를 관찰한 결과를 나타낸다. A) 투과전자현미경(TEM) 분석 결과를 나타낸다. B) 동적 광 산란(DLS) 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 제조된 각각의 융합단백질에 대한 결합력 비교 분석 결과를 나타낸다. (A) 배양세포 결합 분석 결과를 나타낸다. (B) 표면플라즈몬공명장치를 통한 단백질 결합 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 In vitro에서의 PpNF 면역관문저해기능을 확인한 결과를 나타낸다. A) 암세포와 면역세포를 동시에 배양한 후 PpNF의 활성을 관찰하기 위한 모식도를 나타낸다. B) PpNF의 면역관문억제 효과를 확인하기 위한, 유세포분석기 측정 결과를 나타낸다. C) PpNF의 면역관문억제 효과를 확인하기 위해, 효소결합면역흡착검사법을 이용하여 분리한 T 세포에서 분비되는 인터페론 감마의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 PpNF의 종양 표적 능력 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 면역 체크포인트 블록킹 나노케이지의 교모세포종(Glioblastoma) 타겟팅 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 PpNF의 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 PpNF와 독소루비신 병용 요법에 있어서, 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 혈액 및 혈청 분석을 통한 PpNF의 생독성 확인 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
바람직하게는, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 인간 페리틴 중쇄 단편 및 상기 PD-L1 결합 펩타이드 사이에 링커가 추가로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 3 (GG) 또는 서열번호 4 (GGGSGGGGSG)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage)를 제공한다. 상세하게는, 상기 페리틴 나노케이지는 페리틴 외부 표면에 PD-L1 결합 펩타이드가 융합된 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘페리틴(ferritin)’은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)로 구분된다. 본 발명에서 상기 페리틴 단백질은 이들 각각이 단위체로써 케이지(cage) 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)을 사용하였다.
본 발명에 있어서, ‘PD-L1 결합 펩타이드’는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(CLQKTPKQC)로 이루어진 펩타이드로서, 본 명세서 내에서는 "PD-L1 결합 펩타이드 1" 또는 "PD-L1pep1"으로 표시하였다.
본 발명에 있어서, "나노케이지(nanocage)"는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 캡시드(capsid) 단백질, 페리틴, 열 충격 단백질(heat shock protein), Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 나노케이지(nanocage)는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 상기 나노케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 “자가조립(self-assembly)”이란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도없이, 스스로 알아서 특정한 나노구조를 형성하는 성질을 의미한다.
본 발명의 나노케이지는 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 융합 폴리펩타이드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열하여 형성된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공한다.
본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 약학조성물은 PD-1 및 PD-L1의 결합을 억제하고, 면역관문을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1 ng/kg~10 g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 페리틴 나노케이지는 약물을 암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 페리틴 나노케이지에 종래 공지의 약물을 탑재하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 페리틴 나노케이지에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 페리틴 나노케이지에 탑재될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 1> PD-L1 결합 펩타이드 1을 융합한 면역 체크포인트 ( PpNF , PpLF , PpCF) 단백질 디자인 및 정제
1. 실험방법
(1) PpNF, PpLF, PpCF DNA 제작
인간의 mRNA에서 역전사한 cDNA library에서 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161) 유전자 서열 혹은 인간 페리틴 중쇄(1-183) 유전자 서열을 PCR로 증폭하여 얻었으며, 유전자 재조합 공법을 이용하여 pET-28a 플라스미드에 삽입하였다. PD-L1 결합 펩타이드 1의 유전자 서열은 화학적으로 합성하였고, 제한효소 KpnI과 NheI을 사용하여 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)의 질소 말단에 삽입하거나 제한효소 SpeI과 XhoI을 사용하여 인간 페리틴 중쇄 단편(1-161)의 탄소 말단에 삽입하였다. 펩타이드를 페리틴의 질소 말단에 삽입할 때에는 그 사이에 GG서열의 펩타이드를 삽입하여 자유도의 증가를 꾀했으며, 페리틴의 탄소 말단에 펩타이드를 삽입할 때에는 좀 더 긴 flexible linker(GGGSGGGGSG)를 삽입하여 자유도의 증가와 함께 펩타이드가 페리틴의 내부로 숨겨지는 것을 방지하였다. 또한, 인간 페리틴 중쇄(1-183) 유전자의 4번, 5번 나선에 해당하는 유전자 사이에 제한효소 BamHI과 ApaI을 이용하여서 PD-L1 결합 펩타이드 1의 유전자 서열을 삽입하였다. 페리틴의 질소 말단에 펩타이드를 삽입한 컨스트럭트(construct)는 PpNF, 4번 및 5번 나선 사이에 삽입한 컨스트럭트(construct)는 PpLF, 페리틴의 질소 말단에 펩타이드를 삽입한 컨스트럭트(construct)는 PpCF로 명명하였다.
(2) PpNF, PpLF, PpCF 단백질 정제
PpNF, PpLF, PpCF의 서열이 삽입된 각각의 플라스미드로 형질전환된 대장균(BL21)을 LB 배지에 접종하여 37 ℃ 진탕배양기에서 길렀다. OD600 값이 0.5가 되었을 때, IPTG를 100 uM이 되도록 배지에 첨가하여 단백질이 과발현되도록 유도하였다. PpNF와 PpCF는 대장균에 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가하고 초음파로 분쇄하였다. 원심분리로 모은 용균액(상층액)을 Ni-NTA bead와 4 ℃에서 1시간 동안 섞었다. 크로마토그래피 컬럼으로 비드(bead)와 결합하지 않은 용균액은 걸러내고, 이미다졸이 30 mM 포함된 세척 완충액(wash buffer)으로 비드(bead)를 씻었다. 0.1% Triton X-114가 포함된 세척 완충액(wash buffer)으로 대장균의 내독소를 제거하고 세척 완충액(wash buffer)으로 Triton X-114를 제거하였다. 이미다졸이 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM이 포함된 각각의 용출 완충액(elution buffer)을 사용하여 단백질을 용출, 정제하였다. PpLF는 대장균에 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가하고 초음파로 분쇄한 뒤, 원심분리로 모은 봉입체에서 단백질을 회수하였다. 8 M 우레아가 포함된 추출용 완충액으로 단백질을 단량체로 조각내어서 봉입체로부터 추출하였고, 분리된 단백질(상층액)은 상기와 동일하게 Ni-NTA bead와 4 ℃에서 2시간 동안 섞었다. 이후의 세척 완충액(wash buffer)과 용출 완충액(elution buffer) 등은 단백질이 단량체 상태로 유지되도록 하기 위하여 8 M 우레아를 첨가하였다. 크로마토그래피 컬럼으로 비드(bead)와 결합하지 않은 용균액은 걸러내고, 이미다졸이 30 mM 포함된 세척 완충액(wash buffer)으로 비드(bead)를 씻었다. 0.1% Triton X-114가 포함된 세척 완충액(wash buffer)으로 대장균의 내독소를 제거하고 세척 완충액(wash buffer)으로 Triton X-114를 제거하였다. 이미다졸이 300 mM 포함된 용출 완충액(elution buffer)을 사용하여 단백질을 용출, 정제하였다. 정제된 단량체 단백질은 투석을 통해 8 M 우레아를 천천히 제거하면서 단백질의 접힘이 일어나, 다시 페리틴 나노케이지를 이루도록 유도하였다. PpNF, PpLF, PpCF 각각의 단백질에 대해 SDS PAGE로 95% 이상의 균질한 정제 단백질을 회수하였다.
2. 실험결과
인간의 페리틴 중쇄(heavy chain) 단편은 24개의 모노머가 중합하여 케이지를 형성할 때 표면에 펩타이드 디스플레이가 가능한 세 가지 접합점이 N-말단(N-terminal), 4번, 5번 헬릭스를 연결하는 루프(loop), C-말단(C-terminal)에 존재한다. 본 발명을 통해 PD-L1 결합 펩타이드 1(PD-L1pep1)을 이 세 가지 접합점 각각 삽입한 융합단백질 (PpNF, PpLF, PpCF) 을 디자인하고, 제조하여 구조, 생물리적 특성 및 결합력의 차이를 규명하였다(도 1).
PpNF, PpLF, PpCF에 대한 유전자 서열 모식도는 도 1A와 같다.
SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 PpNF, PpLF, PpCF, 인간 페리틴 중쇄(FTH) 각각의 단백질의 전기영동을 수행하고, 쿠마시 브릴라이언트 블루로 젤을 염색하여 단백질 밴드를 확인하였을 때, 각 단백질의 이론적인 단량체 크기와 같은 위치에서 단백질 밴드를 확인함으로써 대장균에서의 안정적인 발현 및 정제를 검증하였다(도 1B).
모델링 프로그램으로 MODELLAR v12를 사용한 PpNF, PpLF, PpCF의 3차 구조모델을 통해, PpNF는 펩타이드가 자유롭게 표면에 디스플레이되는 반면에 PpLF는 제한된(restricted) 범위에서 펩타이드의 conformation이 구현됨을 알 수 있었다. PpCF는 PpLF보다는 자유도가 있으나 PpNF에는 못미치는 것을 확인하였다(도 1C).
< 실시예 2> 제조된 각각의 융합단백질을 TEM과 DLS로 케이지 형성 여부 및 파티클 크기 관찰
PpNF, PpLF, PpCF가 과발현된 대장균에서 Ni-NTA bead를 이용하여 각각의 단백질을 정제하고, 그 단백질들이 페리틴 나노케이지를 이루는지 확인하기 위하여 투과전자현미경(TEM) 분석을 수행하였다(도 2A). 각각의 단백질이 나노케이지를 이루는 것을 확인하였고, 동적 광 산란(DLS) 분석을 수행함으로써 각각의 케이지 크기가 PpNF는 약 24 ㎚, PpLF는 약 13 ㎚, PpCF는 약 39 ㎚인 것을 확인하였다(도 2B).
< 실시예 3> 제조된 각각의 융합단백질 결합력 비교 분석
1. 배양세포 결합 분석
(1) 실험방법
공초점 레이저 주사 현미경 촬영(Confocal)을 수행하였다. 삼중음성 유방암 세포 (MDA-MB 231) 혹은 대장암 세포를 (CT26) 배양 후, Interferon-γ를 25 ng/ml 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹을 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이 세포들은 PD-L1 수용체를 발현하는 암세포들로서 Interferon-γ 처리시 그 발현이 증가함이 알려져 있다. PD-L1이 발현되지 않는 유방암 세포인 MCF-7을 대조군으로 관찰하였다. PD-L1 단백질의 비특이적인 결합을 막기 위해 PBS에 녹인 1% BSA로 상온에서 1시간 차단한 후, BSA를 제거하고 PpNF, PpLF, PpCF (100 nM)를 4 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 씻어낸 후, anti-human ferritin heavy chain 항체 (1:200 비율)로 1시간 동안 반응시켜 염색하였다(green). 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 고정한 후, 공초점 현미경으로 관찰하였다. 핵을 관찰하기 위해 DAPI를 1:1000 비율로 PBS에 녹여 상온에서 5-10 분간 염색하였다(blue).
(2) 실험결과
PpNF와 PpCF 융합단백질이 PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포와 CT26 세포에서 결합하는 것을 확인하였다. 이에 반하여 PD-L1을 발현하지 않는 MCF-7 세포에서는 결합하지 않았는데, 이는 상기 결합이 PD-L1에 의한 것임을 알 수 있다. PpLF는 케이지(cage)가 잘 형성됨에도 불구하고, PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포와 CT26 세포에서 결합하지 않았다. 구조모델을 통해 PpNF와 PpCF에 디스플레이되는 펩타이드는 PpLF에 비해 자유도가 높은 conformation으로 표면에 존재함을 알 수 있었고 이러한 디스플레이 패턴의 차이에 의해 결합의 여부와 결합력이 결정됨을 알 수 있었다(도 3A).
2. 표면플라즈몬공명장치를 통한 단백질 결합 분석
(1) 실험방법
PD-L1 단백질을 EDC-NHS로 활성화된 표면플라즈몬공명용 금센서칩 표면에 부착시키고, 에탄올라민(Ethanolamine; pH 8.5)으로 차단하였다. 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM DTT 용액에 녹아있는 PpNF, PpCF 단백질을 각각 PD-L1 단백질이 결합된 금센서칩에 흘려서 결합 kinetics를 분석하였다. PD-L1 단백질이 붙어있지 않은 오른쪽 채널을 대조군(reference)으로 사용하여 공명 측정값을 보정하였다.
(2) 실험결과
PpNF 및 PpCF와 PD-L1과의 결합을 직접적으로 측정한 결과, PpNF는 PD-L1에 직접적으로 결합하는 (Kd = 39 nM) 반면에 PpCF는 200 nM의 농도에서도 전혀 결합을 보이지 않았다. 따라서 PpNF가 PD-L1 결합 펩타이드 1을 PD-L1에 결합할 수 있는 구조로 디스플레이함을 밝혔고 이를 향후 실험에 사용하였다(도 3B).
< 실시예 4> In vitro에서의 PpNF 면역관문저해기능 확인을 위해, 암세포와 면역세포를 동시에 배양한 후 PpNF의 활성 관찰
BALB/C 생쥐를 희생하여 얻은 비장에서, CD8+ T 세포를 추출하였다. 추출한 CD8+ T 세포에 인터루킨-2/인터루킨-15와 항CD-3 항체/항CD-28 항체를 각각 24시간씩 처리하여 활성화하였다. 활성화된 CD8+ T 세포에 CFSE를 처리하고, 종양세포(CT26, 생쥐 결장암)를 공생배양하기에 앞서 종양세포에 항PD-L1 항체, PpNF(25 nM 혹은 50 nM), PD-L1pep1(50 nM) 등을 각각 전처리하여 종양세포의 PD-L1과 활성화된 CD8+ T 세포의 PD-1의 상호작용을 저해하였다. 24시간 동안 공생배양한 후, CD8+ T 세포를 분리하였다(도 4A). 분리한 T 세포에 CFSE가 결합된 정도를 유세포 분석기로 측정하였다(도 4B). 또한 효소결합면역흡착검사법을 이용하여 분리한 T 세포에서 분비되는 인터페론 감마의 양을 측정하였다(도 4C).
쥐에서 분리한 CD8+ T cell을 활성화시키고 (IL-2/IL-15 처리와 anti-CD3/anti-CD28 처리) 형광으로 표지한 후 (CFSE 염색) CT26 대장암 세포와 함께 배양하였다. 이때 암세포의 PD-L1과 T-cell의 PD-1이 결합하여 면역억제효과를 보였다. PpNF 혹은 PD-L1 항체를 처리하면 PD-1/PD-L1 결합을 저해함으로써 면역활성효과 즉, T-cell 증식(proliferation)과 IFN-γ 증대가 나타났다.
이를 통해 PpNF가 면역관문억제 효과가 있음을 검증하였고, PD-L1 항체나 PD-L1pep1 (PD-L1 결합 펩타이드 1) 보다 PpNF의 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 종양 타겟팅 능력 분석
PBS 100 ㎕에 담긴 CT26 대장암 세포 1×106개를 6주령이 된 BLAB/c 생쥐의 오른쪽 허벅지에 피하주사 하였다. 종양의 크기가 200 ㎣ 가량 되었을 때, Flamma-675로 표지되어 식염수(Saline)에 녹아 있는 PpNF(10 mg/kg), 페리틴 야생형(Ferritin wildtype; 10 mg/kg) 단백질을 각각 200 ㎕씩 각각의 생쥐에 꼬리정맥으로 주사하였다.
IVIS 형광 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 1, 4, 8, 12, 24시간의 단백질의 생체 내 분포를 조사하였다. 그리고 24시간 후에 생쥐를 희생시키고 종양, 심장, 폐, 간, 신장, 비장을 꺼내어 기관 내 단백질이 얼마나 남아있는지를 조사하였다.
PpNF가 페리틴 야생형(EPR 효과에 의한 종양 표적) 보다 종양 표적 능력이 증가하였음을 알 수 있었다(도 5).
또한, 면역 체크포인트 블록킹 나노케이지의 교모세포종(Glioblastoma) 타겟팅 효과를 확인하였다. 마우스 뇌 좌측에 교모세포종(Glioblastoma) 세포주인 GL26을 주입하여 동소이식(orthotopic) GBM 모델을 만들고 형광 표지한 PBP1-N-FtH을 꼬리정맥으로 주사하였다[대조군: 식염수(saline), 페리틴(ferritin)]. 24시간 후 뇌에서 형광 시그널이 관찰되었으며, PBP1-N-FtH가 뇌 좌측의 종양 사이트에 타겟팅됨을 관찰하였다(도 6).
< 실시예 6> PpNF의 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과 분석
1. 실험방법
CT26 세포를 BALB/c 야생형 생쥐의 오른쪽 허벅지 위쪽에 피하주사하였다. 종양의 크기가 100 ㎣ 가량 되었을 때, 무작위로 4그룹으로 나누었다. 식염수(Saline), 식염수에 녹아있는 PpNF (10 ㎎/㎏), 그리고 야생형 페리틴 (10 ㎎/㎏)을 각각의 생쥐에 꼬리정맥으로 주사하였고, 치료용 항PD-L1 항체 (10 ㎎/㎏)를 복강내로 주사하였다(도 7A). 이틀에 한 번씩 총 10회(항PD-L1 항체는 4일에 한 번씩 6회) 주사하면서 종양의 크기와 생쥐의 몸무게를 측정하였다(도 7B 및 도 7D). 3주가 지난 후 생쥐를 희생하여 종양을 적출하고 종양의 무게를 측정하였다(도 7C). 적출한 종양의 세포외기질을 콜라게나아제로 분해하여 단일 세포로 만들고, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포의 표지 단백질에 대한 항체를 각각 처리하고 유세포 분석기로 각각의 T 세포가 종양에서 얼마나 존재하는지 분석하였다(도 7E 내지 도 7G).
2. 실험결과
PpNF 단독으로도 대조군에 비하여 종양이 유의하게 성장이 저해되었다(p<0.05)(도 7B). 종양의 무게도 훨씬 작았고(도 7C), CD8+ T 세포의 종양 내 비율도 늘림으로써(도 7F), 종양 내에서의 CD8+ T 세포와 조절 T 세포의 비율이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(도 7H). PpNF, 야생형 페리틴 모두 대조군 생쥐에 비해 몸무게의 변화는 없었다(도 7D).
이 결과를 통하여 PpNF가 생체 내에서도 면역 관문을 억제함으로써 CD8+ T 세포를 증가시켜 결국 종양의 성장을 저해하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 7> PpNF와 독소루비신 병용 요법에 있어서 , 생체 내에서의 항암 및 면역 관문 억제 효과 분석
1. 실험방법
CT26 세포를 BALB/c 야생형 생쥐의 오른쪽 허벅지에 위쪽에 피하주사하였다. 종양의 크기가 50 ㎣ 가량 되었을 때, 무작위로 5그룹으로 나누었다. PBS, PBS에 녹아있는 PpNF (10 ㎎/㎏), 독소루비신을 페리틴 내부에 탑재한 PpNF(Dox) (10 ㎎/㎏, 독소루비신은 1.04 ㎎/㎏), 그리고 독소루비신 (1.04 ㎎/㎏)을 각각의 생쥐에 꼬리정맥으로 주사하였고, 치료용 항PD-L1 항체 (10 ㎎/㎏)를 복강내로 주사하였다(도 8A). 일주일에 3회씩 총 10회(항PD-L1 항체는 3일에 한 번씩 6회) 주사하면서 종양의 크기와 생쥐의 몸무게를 측정하였다(도 8B 및 도 8D). 3주가 지난 후 생쥐를 희생하여 종양을 적출하고 종양의 무게를 측정하였다(도 8C). 적출한 종양의 세포외기질을 콜라게나아제로 분해하여 단일 세포로 만들고, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포의 표지단백질에 대한 항체를 각각 처리하고 유세포 분석기로 각각의 T 세포가 종양에서 얼마나 존재하는지 분석하였다(도 8E 내지 도 8G).
2. 실험결과
PpNF에 독소루비신을 탑재하여 병용요법으로 종양에 처리하였을 때, 대조군에 비하여 종양의 유의하게 성장이 저해될 뿐 아니라(p<0.001), 같은 양의 PpNF에 비해서도(p<0.001), 같은 양의 독소루비신에 비해서도(p<0.01), 치료용 항PD-L1 항체에 비해서도(p<0.01) 종양의 성장이 유의하게 저해되었다(도 8B). 종양의 무게도 줄어들었으며(도 8C), 종양 내의 조절 T 세포의 비율을 줄임으로써(도 8G) 종양 내의 CD8+ T 세포와 조절 T 세포의 비율이 대조군에 비해 증가하였다(도 8H).
이 결과를 통하여 PpNF에 독소루비신을 탑재한 병용요법은 생체 내에서 면역 관문을 억제함으로써 종양 내에서 조절 T 세포에 대한 CD8+ T 세포의 비율을 증가시켜 결국 종양의 성장을 저해하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 8> 혈액 및 혈청 분석을 통한 PpNF의 생독성 확인
항종양 동물실험 이후 생쥐를 희생할 때 각 그룹에서 혈액과 혈청을 채취하고, 혈액에 있는 적혈구와 헤모글로빈, 헤마토크릿, 백혈구, 중성구 등과 혈청에 있는 혈액요소질소, 크레아티닌, 알라닌아미노전달효소, 아스파르테이트아미노전달효소의 양을 측정하여 비교하였다.
PpNF와 독소루비신을 탑재한 PpNF를 처리한 생쥐 그룹에서 간독성이나 신장독성은 관측되지 아니하였고, 혈액학적으로도 큰 변화는 독소루비신을 탑재한 PpNF에서 중성구가 증가한 것 외에는 없었다(도 9).
<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> The immunotherapeutic nanocage displaying PD-L1 binding peptide 1 and use in anti-cancer immunotherapeutic agent thereof <130> ADP-2020-0232 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1 binding peptide 1 <400> 2 Cys Leu Gln Lys Thr Pro Lys Gln Cys 1 5 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Gly Gly 1 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 4 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 페리틴 중쇄 단편의 C-말단 또는 N-말단에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1 결합 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 인간 페리틴 중쇄 단편 및 상기 PD-L1 결합 펩타이드 사이에 링커가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 나노케이지(nanocage).
  5. 제4항에 있어서, 상기 페리틴 나노케이지는 페리틴 외부 표면에 PD-L1 결합 펩타이드가 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 페리틴 나노케이지(nanocage).
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터.
  8. 제7항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함).
  9. 제4항의 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 약학조성물은 PD-1 및 PD-L1의 결합을 억제하고, 면역관문을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 제4항의 페리틴 나노케이지 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  15. 제4항의 페리틴 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
KR1020200138075A 2020-10-23 2020-10-23 Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도 KR102658825B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200138075A KR102658825B1 (ko) 2020-10-23 Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도
PCT/KR2021/014261 WO2022086058A1 (ko) 2020-10-23 2021-10-14 Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도
EP21883129.5A EP4234578A1 (en) 2020-10-23 2021-10-14 Ferritin nanocage fused with pd-l1-binding peptide 1 and use thereof as anticancer immunotherapy agent
US18/138,118 US20230374113A1 (en) 2020-10-23 2023-04-23 Ferritin nanocage fused with pd-l1-binding peptide 1 and use thereof as anticancer immunotherapy agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200138075A KR102658825B1 (ko) 2020-10-23 Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220053848A true KR20220053848A (ko) 2022-05-02
KR102658825B1 KR102658825B1 (ko) 2024-04-19

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101811050B1 (ko) 2015-09-02 2017-12-21 경북대학교 산학협력단 항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101811050B1 (ko) 2015-09-02 2017-12-21 경북대학교 산학협력단 항염증성 폴리펩티드와 페리틴 모노머 단편이 접합된 융합폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
EP4234578A1 (en) 2023-08-30
US20230374113A1 (en) 2023-11-23
WO2022086058A1 (ko) 2022-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11466085B2 (en) Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof
US20220000996A1 (en) Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
UA124532C2 (uk) Т-клітинний рецептор для лікування раку
AU2020203434B2 (en) Receptor Targeting Constructs And Uses Thereof
ES2930681T3 (es) Linfocitos T transfectados y receptores de linfocito T para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer
CA3040440A1 (en) A novel nanocage and use thereof
Zhang et al. Functionalized cell nucleus-penetrating peptide combined with doxorubicin for synergistic treatment of glioma
WO2017039382A1 (ko) 인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드
US20160158374A1 (en) Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
KR101286721B1 (ko) 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법
JP2007527206A (ja) がん治療のためのペプタボディ
CN102993314B (zh) 一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途
JP2020501513A (ja) 治療用多標的コンストラクトおよびその使用
CN106957365B (zh) 一种单克隆抗体FnAb8及其应用
US9975942B2 (en) EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
KR102348838B1 (ko) 트레일 트라이머와 암표적 펩타이드를 멀티디스플레이하는 페리틴 나노케이지 및 이의 항암제로서의 용도
KR102658825B1 (ko) Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도
KR20220053848A (ko) Pd-l1 결합 펩타이드 1을 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도
US20220177547A1 (en) Ferritin nanocage for multi-displaying trail trimer and cancer-targeting peptide and use thereof as anticancer agent
KR20220088329A (ko) Pd-l1 결합 펩타이드 2를 융합한 페리틴 나노케이지 및 이의 항암면역치료제로서의 용도
KR101732380B1 (ko) 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 신규 항암제
EP2827908A2 (en) Peptides
CN106957364B (zh) 一种单克隆抗体FnAb12及其应用
KR20220121220A (ko) Her2-gst-이리노테칸 복합체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20220120910A (ko) Egfr-gst-울리서티닙 복합체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant