ES2930681T3 - Linfocitos T transfectados y receptores de linfocito T para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer - Google Patents

Linfocitos T transfectados y receptores de linfocito T para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer Download PDF

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Abstract

La presente descripción se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen a antígenos asociados a tumores (TAA) para dirigirse a células cancerosas, células T que las expresan, métodos para producirlas y métodos para tratar cánceres usando las mismas. En particular, la presente descripción se refiere a TCR y sus variantes que se unen a moléculas HLA de clase I o II con un péptido, como IGF2BP3-001, que tienen la secuencia de aminoácidos de KIQEILTQV (SEQ ID NO: 1). La presente descripción se refiere además a péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y células para uso en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente descripción se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente descripción se refiere además a epítopos peptídicos de células T asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que pueden servir, por ejemplo, como ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales, o para estimular células T ex vivo y transferirlas a pacientes. Los péptidos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), o los péptidos como tales, también pueden ser objetivos de anticuerpos, receptores de células T solubles y otras moléculas de unión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Linfocitos T transfectados y receptores de linfocito T para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer
La invención concierne a un TCR que se une específicamente a un péptido IGF2BP3 y al uso de este TCR como medicamento, en concreto en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes
La inmunoterapia basada en los linfocitos T tiene como diana los epítopos peptídicos derivados de proteínas especí­ ficas o asociadas con los tumores, que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los antígenos asociados a tumores (TAA, por sus siglas en inglés) pueden ser péptidos derivados de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que son expresadas y que, en compa­ ración con células inalteradas del mismo origen, normalmente aparecen reguladas al alza en las células del tumor correspondiente.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocom­ patibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
La IGF2BP3 pertenece a la familia de las proteínas de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide-II, implicada en la localización, el recambio y el control traduccional del ARNm. La presencia de altas concentraciones del transcrito de IGF2BP3 en numerosos tejidos tumorales en comparación con tejidos de control indica que dicha proteína podría desempeñar una función en las células transformadas en proliferación. La expresión de la IGF2BP3 se ha descrito en cierto número de tipos de cáncer, como son el carcinoma de células renales claras (CCR), el melanoma maligno, el carcinoma epidermoide esofágico, el carcinoma de páncreas o los tumores uroteliales. Así pues, los epítopos deriva­ dos de la IGF2BP3 podrían servir como dianas para tratamientos antitumorales dirigidos contra los cánceres que expresan la IGF2BP3.
Existen dos tipos de moléculas MHC: Las MHC de clase I y las MHC de clase II. Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8-positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identi­ ficación y la caracterización de los antígenos asociados a tumor y de los correspondientes receptores de linfocito T es importante para el desarrollo de inmunoterapias contra el cáncer como son vacunas y terapias celulares.
En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos después por linfocitos T portadores de receptores de linfocito T (TCR) específicos. Por consiguiente, los TAA son un punto de partida para el desarrollo de una terapia basada en linfocitos T como, entre otras, las vacunas antitumorales y las terapias celulares.
Si bien ha habido avances en el desarrollo de fármacos dirigidos contra dianas moleculares como tratamiento contra el cáncer, en este campo sigue existiendo la necesidad de nuevos agentes antitumorales que tengan como diana moléculas altamente específicas de las células cancerosas. La presente descripción aborda esa necesidad dando a conocer nuevos TCR, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que se unen específicamente a epítopos de la IGF2BP3 como el péptido KIQEILTQV (IGF2BP3-001; SEQ ID N.° 1) y a variantes del mismo, así como métodos para usar tales moléculas en el tratamiento contra el cáncer.
Resumen
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un TCR que comprende una cadena alfa y una cadena beta, cadena alfa que comprende un dominio variable alfa de TCR que comprende a su vez las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 2, y cadena beta que comprende un dominio variable beta de TCR que comprende a su vez las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 10, y donde el TCR se une específicamente a un complejo formado por el péptido IGF2BP3-001 con una molécula del Mh C, en el cual el péptido IGF2BP3-001 consiste en la SEQ ID N.° 1 y el TCR se le une en las posiciones 1 y 3 a 7 de dicho péptido IGF2BP3-001.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un TCR que comprende una cadena gamma y una cadena delta, cadena gamma que a su vez comprende las regiones determinantes de la complementariedad c DR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 2, y cadena delta que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 10, y donde el TCR se une específicamente a un complejo formado por el péptido IGF2BP3-001 con una molécula del MHC, en el cual el péptido IGF2BP3-001 consiste en la SEQ ID N.° 1 y el TCR se le une en las posiciones 1 y 3 a 7 de dicho péptido IGF2BP3-001.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la cadena alfa y/o la cadena beta del TCR del primer aspecto, o codifica la cadena gamma y/o la cadena delta del TCR del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico del tercer aspecto enlazado funcionalmente con al menos una secuencia promotora.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora transformada con el vector de ex­ presión del cuarto aspecto.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el TCR del primer o del segundo aspecto, un ácido nucleico del tercer aspecto, un vector de expresión del cuarto aspecto y/o una célula hospedadora del quinto aspecto, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, exci­ pientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un TCR acorde con el primer o el segundo aspecto, o un ácido nucleico acorde con el tercer aspecto, o un vector acorde con el cuarto aspecto, o una célula hospedadora acorde con el quinto aspecto, o la composición farmacéutica acorde con el sexto aspecto, para el uso como medica­ mento.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un TCR acorde con el primer o el segundo aspecto, o un ácido nucleico acorde con el tercer aspecto, o un vector acorde con el cuarto aspecto, o una célula hospedadora acorde con el quinto aspecto, o la composición farmacéutica acorde con el sexto aspecto, para el uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un TCR que se una específica­ mente al péptido de la SEQ ID N.° 1 cuando este sea presentado por una molécula del MHC, método que comprende el cultivo de la célula hospedadora del quinto aspecto en las condiciones adecuadas para promover la expresión del TCR.
En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende: (a) la puesta en contacto de la muestra biológica con el TCR del primer o del segundo aspecto, y (b) la detección de la unión del TCR a la muestra biológica.
La invención queda expuesta en el conjunto de reivindicaciones anexo. En la descripción se describen sin que formen parte de la invención:
- Un TCR que se une específicamente a un complejo formado por el péptido IGF2BP3-001 y una molécula de HLA (complejo de péptido IGF2BP3-001-molécula de HLA), sin más limitaciones que la reivindicación 1, en el que el pép­ tido lGF2BP3-00l comprende, o consiste alternativamente en KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1). En una forma de realización la molécula de HLA es HLA-A*02.
- Un TCR que se une específicamente a un complejo formado por una molécula de HLA y un péptido IGF2BP3-001 sin más limitaciones que la reivindicación 1, en el que el péptido IGF2BP3-001 comprende, o consiste alternativamente en una variante del IGF2BP3-001 que es homóloga al menos en un 66%, preferentemente al menos en un 77%, y más preferentemente aún al menos en un 88% (es decir, idéntica preferentemente al menos en un 77% o al menos en un 88%) a la SEQ ID N.° 1, en que dicha variante se une a una molécula HLA de clase I o clase II y/o estimula a linfocitos T a que reaccionen de forma cruzada con dicho péptido, o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en que dicho péptido no es el polipéptido entero del que procede.
- Un TCR que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR que presenta una secuencia idéntica al menos en el 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%, pero preferentemente idéntica en el 90%, a la de un dominio variable de cadena alfa del TCR mostrado en la Tabla 1; y el dominio variable de cadena beta del TCR tiene una secuencia idéntica al menos en el 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%, pero preferentemente idéntica en el 90% a la de un dominio variable de la cadena beta del TCR mostrado en la Tabla 1, sin más limitaciones que la reivindicación 1.
- Cadenas alfa de TCR que comprenden una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena alfa que se dan a conocer en la Tabla 1, así como a variantes de las mismas provistas de una, dos, tres o cuatro sustituciones con respecto a las CDR mostradas en la Tabla 1.
- Cadenas alfa de TCR que comprenden al menos una CDR seleccionada entre a CDR1, la CDR2 y la CDR3 mos­ tradas en la Tabla 1.
- Cadenas alfa de TCR que comprenden una CDR3 de cadena alfa mostrada en la Tabla.
- Cadenas beta de TCR que comprenden una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena beta que se dan a conocer en la Tabla 1, así como a variantes de las mismas provistas de una, dos, tres o cuatro sustituciones con respecto a las CDR mostradas en la Tabla 1.
- Cadenas beta de TCR que comprenden al menos una CDR seleccionada entre las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena beta mostradas en la Tabla 1.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra la presentación del péptido IGF2BP3-001 en tejidos sanos y cancerosos.
Las figuras 2 a 4 muestran la expresión del IGF2BP3-001 en tejidos cancerosos y sanos.
La Fig. 5 muestra la tinción con tetrámeros de MHC/IGF2BP3-001 o con tetrámeros de MHC/NYESO1-001 de linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para introducir en ellos el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R10P1A7 (Tabla 1). A modo de controles se usaron linfocitos T CD8+ transformados con ARN del TCR 1G4 que se une específicamente al complejo MHC/NYESO1-001 y sometidos a una transformación ficticia.
La Fig. 6 muestra la liberación de IFN-y por parte de linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para introducir en ellos el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R10P1A7 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con células diana cargadas con el péptido IGF2BP3-001 (SEQ ID N.° 1) o con células cargadas con el péptido homólogo pero no relacionado CLUA-001 (SEQ ID N.° 26), CHCHD6-001 (SEQ ID N.° 27), CDC42BPG-001 (SEQ ID N.° 28), PARP14-002 (SEQ ID N.° 29), SYNE2-001 (SEQ ID N.° 30), IFT7-001 (SEQ ID N.° 31), DHRS12-001 (SEQ ID N.° 32), STX12-001 (SEQ ID N.° 33), EEA-001 (SEQ ID N.° 34), SENP7-001 (SEQ ID N.° 35), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 36). Los datos de liberación del IFN-y se obtuvieron con linfocitos T Cd 8+ procedentes de dos donantes distintos. Como controles se emplearon linfocitos T CD8+ sometidos a electroporación para absorber ARN, solos o incubados conjuntamente con células diana no cargadas.
La Fig. 7 muestra la liberación de IFN-y por parte de linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para introducir en ellos el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R10P1A7 tras su incubación conjunta con células diana cargadas con el péptido IGF2BP3-001 (SEQ ID N.° 1) o con diversas variantes de la SEQ ID N.° 1 del IGF2BP3-001 con sustitución de alanina en las posiciones 1 a 9. Como controles se emplearon linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para absorber ARN, solos o incubados conjuntamente con células diana cargadas con el péptido de control NYESO1-001 o bien células diana no cargadas. Los datos de liberación del IFN-y se obtu­ vieron con linfocitos T CD8+ procedentes de dos donantes distintos.
La Fig. 8 muestra la liberación de IFN-y por parte de linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para absorber el ARN de las cadenas alfa y beta del TCR R10P1A7 (Tabla 1) tras su incubación conjunta con la estirpe de células de melanoma A-375, la estirpe de células de glioblastoma T98G y la estirpe celular de cáncer de mama SK-BR-3, en ese orden. Como control se utilizaron linfocitos T CD8+ solos que habían sido sometidos a electroporación con ARN.
Descripción detallada
La presente descripción se refiere a receptores de linfocito T (TCR) que comprenden una cadena alfa y una cadena beta («TCR alfa/beta»). La presente descripción también se refiere a ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para expresar los TCR y los péptidos de la presente descripción, así como métodos para el uso de los mismos.
La presente descripción se refiere, además, a TCR, a subunidades individuales de TCR (solas o combinadas), y a subdominios de las mismas, a TCR solubles (TCR), por ejemplo, TCR diméricos alfa/beta solubles provistos como mínimo de un enlace disulfuro intercatenario entre residuos del dominio constante que no están presentes en los TCR nativos, así como a TCR clonados, en que dichos TCR son obtenidos mediante técnicas de ingeniería genética en linfocitos T autólogos o alogénicos o en células progenitoras de linfocitos T, y métodos para fabricarlos, así como otras células provistas de dichos TCR.
Definiciones
En la presente memoria todos los términos corresponden a la definición indicada a continuación, salvo en los casos en que se indique otra cosa.
El término «receptor de linfocito T» (abreviado TCR) se refiere a una molécula heterodimérica que comprende una cadena polipeptídica alfa (cadena alfa) y una cadena polipeptídica beta (cadena beta), en que el receptor heterodimérico es capaz de unirse a un antígeno peptídico presentado por una molécula HLA.
El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibili­ zadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas inducida por el péptido, preferentemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2; la secreción de moléculas efectoras inducida por el péptido, preferentemente granzimas o perforinas; o la desgranulación.
El término «péptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen prefe­ riblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener solo 8 aminoácidos de longitud, pero también hasta 10, 11, 12 o más aminoácidos, y en el caso de los péptidos de MHC de clase II (variantes alargadas de los péptidos de la descripción) pueden tener hasta 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más aminoácidos de longitud.
Además, el término «péptido» incluye sales de una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Preferentemente las sales son sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos, como por ejemplo, sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato). Se ha de destacar que las sales de los péptidos conformes a la presente descripción difieren sustancial­ mente de los péptidos en su estado o estados in vivo, puesto que los péptidos no se hallan en forma de sal en tales condiciones in vivo.
El término «péptido» incluye también «oligopéptido». El término «oligopéptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial para la descripción, siempre que se mantengan el epítopo o epítopos correctos. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 15, aproximadamente.
El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial para la descripción, siempre que se mantengan los epítopos correctos. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifique dicha molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, un «inmunógeno» en la presente descripción), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente descripción, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una res­ puesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un «inmunógeno» sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente descripción, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T. En otro aspecto, el inmunógeno puede ser el péptido, el complejo del péptido con MHC, el oligopéptido y/o la proteína que se utiliza para generar anticuerpos o TCR específicos contra él.
Un «epítopo» de clase I de un linfocito T requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que pueda ser reco­ nocido por un linfocito T provisto de un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y más habitualmente de 9 aminoácidos.
La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteí­ nas se ensamblan con fragmentos de ADNc y oligonucleótidos cortos de enlace, o con una serie de oligonucleótidos, que dan como resultado un gen sintético capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que com­ prende elementos reguladores procedentes de un operón microbiano o vírico.
Tal y como se utiliza en la presente memoria el término «un nucleótido que codifica un péptido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido y que incluye codones artificiales (sintetizados por el hombre) de inicio y terminación compatibles con el sistema biológico en el que la secuencia va a ser expresada, por ejemplo, con una célula dendrítica u otro sistema celular útil para la producción de TCR.
Tal y como se utiliza en la presente memoria el término «un nucleótido que codifica un péptido» se refiere a una o más secuencias de nucleótidos que codifican el TCR y que incluyen codones artificiales (sintetizados por el hombre) de inicio y terminación compatibles con el sistema biológico en el que la secuencia va a ser expresada, por ejemplo, con un linfocito T u otro sistema celular útil para la producción de TCR.
En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye tanto el ácido nucleico monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, en lo que concierne por ejemplo al ADN, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia.
El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.
La región codificante puede derivar de un gen no mutado («normal»), mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos para los exper­ tos en la síntesis de ADN.
El término «producto de expresión» define el polipéptido o la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y de cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifique el mismo aminoácido o aminoácidos.
El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no com­ prende la región codificante entera, cuyo producto de expresión conserva esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante entera.
El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustan­ cialmente pura, es decir, exento de materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que per­ mite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presen­ tes corriente abajo (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.
El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'-OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.
El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la trans­ cripción.
El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural, si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero ese mismo polinucleótido o polipéptido lo estará si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. En un aspecto, tales polinucleótidos podrán formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrán formar parte de una composición, y seguir estando aislados en dicho vector o composición puesto que estos no forman parte de su entorno natural.
Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunogénicos, descritos de acuerdo con la presente descrip­ ción también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo par­ cialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones indivi­ duales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogenei­ dad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.
Los ácidos nucleicos y los productos de expresión polipeptídicos dados a conocer conformes a la presente descripción, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enri­ quecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente descripción pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada. El término «fragmento activo» define un fragmento, normalmente un péptido, polipéptido o secuencia de áci­ dos nucleicos, que genera una respuesta inmunitaria (es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra -solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado o en un vector- a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de esti­ mulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alterna­ tiva, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación con los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoáci­ dos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un trata­ miento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resul­ tantes de dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Utilizados en relación con los polinucleótidos, estos términos se refieren a los productos producidos por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas.
Conforme a la presente descripción, el término «identidad porcentual» o «porcentaje de identidad», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula:
Identidad porcentual = 100 [1 -(C/R)]
donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde
(I) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuen­ cia comparada y
(II) cada hueco (gap) de la secuencia de referencia y
(III) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia; y
(IV) la alineación tiene que comenzar en la posición 1 de las secuencias alineadas;
y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.
En la descripción el término «homólogo» se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha «homo­ logía» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo. Habi­ tualmente las bases de datos públicas proporcionan software para el análisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYX u otras herramientas.
Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido.
Por «variante» de la secuencia de aminoácidos los inventores quieren decir que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos están alteradas (por ejemplo, sustituyéndolas con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural o alguna otra cadena lateral) de modo que el péptido sigue siendo capaz de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma manera que un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID N.° 1. Por ejemplo, un péptido se puede modificar para que mejore o al menos mantenga la capacidad para interaccionar y unirse a la hendidura de unión de una molécula MHC adecuada, como HLA-A*02 o -DR, y de un modo que mejore o al menos mantenga la capacidad para unirse al TCR de los linfocitos T activados. De modo similar, un TCR se puede modificar para que mejore, o al menos mantenga, la capacidad para interaccionar y unirse a un complejo formado por una molécula MHC adecuada/KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1), como HLA-A*02 o -DR, y de un modo que mejore, o al menos mantenga, la capacidad para activar linfocitos T.
Estos linfocitos T pueden después reaccionar con células y matar aquellas que expresen un polipéptido que contenga la secuencia natural de aminoácidos del péptido afín, como la KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1), tal y como se define en los aspectos de la descripción. Como se puede deducir de la bibliografía (Rammensee et al., 1999) y de las bases de datos científicas, ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión. En otro aspecto, una persona versada en la materia que siga las enseñanzas de la descripción puede modificar la secuencia de aminoácidos de un TCR, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y determinar si tales variantes del TCR conservan la capacidad de unirse a complejos formados por moléculas MHC de clase I o II con el KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1). Las variantes de TCR de la descripción conservan la capacidad de unirse a complejos de moléculas MHC de clase I o II con el KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1). Los linfocitos T que expresen las variantes de TCR de la descripción podrán destruir subsiguientemente las células que expresen un polipéptido que contenga la secuencia natural de aminoácidos del péptido afín, como el KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1).
En un aspecto, los péptidos o TCR dados a conocer en la presente memoria se pueden modificar mediante la sustitu­ ción de uno o más residuos en diferentes sitios de la cadena peptídica, posiblemente selectivos, si no se especifica de otra manera. Preferentemente tales sustituciones estarían situadas al final de la cadena de aminoácidos de dicho péptido. En los TCR, preferentemente tales sustituciones están localizadas en los dominios variables de la cadena alfa y de la cadena beta del TCR. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, cuando un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reem­ plazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, el reemplazo de una leucina por una isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».
Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares, pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de alanina por uno de isoleucina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustitu­ ciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.
En un aspecto, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la descripción y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, se pueden usar también otros aminoácidos no convencionales (distintos de los aminoácidos naturales que constituyen las proteínas) con fines de sustitución para producir inmunógenos y polipéptidos inmunogénicos acordes con la pre­ sente descripción.
Si se descubre que las sustituciones en más de una posición dan lugar a un péptido con actividad antigénica sustan­ cialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.
RECEPTORES DE LINFOCITO T (TCR)
En una forma de realización preferida, la descripción se refiere a un TCR que comprende una cadena alfa de TCR mostrada en la Tabla 1, y a variantes de la misma, así como una cadena beta de TCR mostrada en la Tabla 1, y variantes de la misma. Un TCR descrito en la presente memoria tiene la capacidad de unirse o de unirse específica­ mente a un complejo formado por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I y el KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1) o bien a otro complejo formado por una molécula MHC de clase II y el KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1).
Tabla 1: TCR representativo acorde con la presente descripción
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Las cadenas alfa y beta de los TCR alfa/beta, y las cadenas gamma y delta de los TCR gamma/delta, se consideran en general dotadas de dos «dominios», esto es, dominios variable y constante. El dominio variable consiste en la concatenación de la región variable (V) con la región de unión (J). El dominio variable también puede incluir una región líder (L). Las cadenas beta y delta también pueden incluir una región de diversidad (D). Los dominios constantes alfa y beta también pueden incluir dominios transmembrana (TM) C-terminales que anclan las cadenas alfa y beta a la membrana celular.
En la presente descripción, el término «dominio variable de cadena alfa de TCR» se refiere por tanto a la concatena­ ción de la región V alfa del TCR (TRAV) sin la región líder (L), con la región J alfa del TCR (TRAJ), y el término «dominio constante de cadena alfa de TCR» se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC trun­ cada en su extremo C-terminal, y opcionalmente a un dominio trasmembrana alfa (VIGFRILLLKVAGFNLLMTL (SEQ ID N.° 18)).
De modo similar, el término «dominio variable de cadena beta de TCR» se refiere a la concatenación de la región V beta del TCR (TRBV) sin región líder (L) con la región D/J beta del TCR (TRBD/TRBJ), y el término «dominio constante de cadena beta de TCR» se refiere a la región extracelular TRBC, o a una secuencia TRBC truncada en su extremo C-terminal, y opcionalmente a un dominio transmembrana beta (TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (SEQ ID N.° 19)).
Con respecto a los TCR gamma/delta, el término «dominio variable de cadena gamma de TCR» tal y como se emplea en la presente memoria se refiere a la concatenación de la región V de la cadena gamma del TCR sin región líder (L) (TRGV) con la región J de la cadena gamma del TCR (TRGJ), y el término «dominio constante de cadena gamma de TCR» se refiere a la región extracelular TRGC, o a una secuencia TRGC truncada en su extremo C-terminal. De modo similar, el término «dominio variable de cadena delta de TCR» se refiere a la concatenación de la región V de la cadena delta del TCR (TRDV) sin la región líder (L) con la región D/J de la cadena delta del TCR (TRDD/TRDJ), y el término «dominio constante de cadena delta de TCR» se refiere a la región extracelular TRDC, o a una secuencia TRDC truncada en su extremo C-terminal.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en una cadena alfa de TCR que es idéntica al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero idéntica preferentemente en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la cadena alfa de TCR mostrada en la Tabla 1. Las cadenas alfa de TCR mostradas en la Tabla 1 contienen un segmento líder (L), una cadena V, tres regiones determi­ nantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3), una región de unión (J) y una región constante, tal y como se definen en la Tabla 1.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en un dominio variable de cadena alfa de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a un dominio variable de cadena alfa de TCR mostrado en la Tabla 1.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en un dominio constante de cadena alfa de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 75% al dominio constante de cadena alfa de TCR mostrado en la Tabla 1.
Las cadenas alfa de TCR de la presente descripción pueden comprender, además, un dominio transmembrana de cadena alfa o un dominio intracelular alfa de TCR. Las cadenas beta de TCR de la presente descripción pueden comprender, además, un dominio transmembrana beta de TCR o un dominio intracelular beta de TCR.
En una forma de realización especialmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en un dominio variable de cadena alfa de TCR provisto de una secuencia idéntica al menos en un 90% a la del dominio variable de cadena alfa de TCR mostrado en la Tabla 1, y que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 del mismo dominio variable alfa de la citada Tabla.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, una cadena beta de TCR que es idéntica al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero prefe­ rentemente idéntica en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la cadena beta de TCR mostrada en la Tabla 1. Las cadenas beta del TCR mostradas en la Tabla 1 contienen un segmento líder (L), una cadena V, tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3), una región de unión (J) y una región constante, tal y como se definen en la Tabla 1.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en un dominio variable de cadena beta de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% al dominio variable de cadena beta de TCR mostrado en la Tabla 1.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en un dominio constante de cadena beta de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 75% al dominio constante de cadena beta de TCR mostrado en la Tabla 1.
En una forma de realización especialmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio variable de cadena beta de TCR provisto de una secuencia idéntica al menos en un 90% o un 95% a la del dominio variable de cadena beta de TCR de la Tabla 1, y que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 del mismo dominio variable de cadena beta de TCR de la Tabla 1.
La cadena alfa y la cadena beta del TCR pueden estar fusionadas formando un TCR monocatenario. Otra alternativa es que las cadenas alfa y beta del TCR puedan expresarse como proteínas separadas cuyo ensamblaje dé lugar a un heterodímero.
En una forma de realización, cualquier cadena alfa de TCR de la Tabla 1 se empareja con cualquier otra cadena beta de TCR para producir un TCR que se une específicamente a un complejo formado por un péptido IGF2BP3-001 y una molécula HLA. En otra forma de realización, cualquier cadena beta de TCR de la Tabla 1 se empareja con cualquier otra cadena alfa de TCR para producir un TCR que se une específicamente a un complejo formado por un péptido IGF2BP3-001 y una molécula HLA.
TCR R10P1A7
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, la cadena alfa y/o la cadena beta del TCR R10P1A7, correspondientes respectivamente a la SEQ ID N.° 2 y la SEQ ID N.° 10.
El dominio variable de cadena alfa de TCR correspondiente al TCR R10P1A7 comprende, o alternativamente consiste en los aminoácidos 22 a 130 de la SEQ ID N.° 2; el dominio constante de cadena alfa del TCR correspondiente al TCR R10P1A7 comprende, o alternativamente consiste en los aminoácidos 131 a 271 de la SEQ ID N.° 2; el dominio variable de cadena beta del TCR correspondiente al TCR R10P1A7 comprende, o alternativamente consiste en los aminoácidos 26 a 139 de la SEQ ID N.° 10; y el dominio constante de cadena beta del TCR comprende, o alternativa­ mente consiste en los aminoácidos 140 a 318 de la SEQ ID N.° 10.
En una forma de realización concreta, un TCR de la presente descripción comprende una cadena alfa de TCR que es idéntica al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntica en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la cadena alfa de TCR de la SEQ ID N.° 2.
En otra forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de cadena alfa de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% al dominio variable de cadena alfa de TCR de la SEQ ID N.° 2.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de cadena alfa de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 75% al dominio constante de cadena alfa de TCR de la SEQ ID N.° 2.
En una forma de realización especialmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio va­ riable de cadena alfa de TCR provisto de una secuencia idéntica al menos en un 90% a la del dominio variable de cadena alfa de TCR de la SEQ ID N.° 2, y que comprende las CRD1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 2.
En otra forma de realización concreta, un TCR de la presente descripción comprende una cadena beta de TCR que es idéntica al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferente­ mente idéntica en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la cadena beta de TCR de la SEQ ID N.° 10.
En otra forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de cadena beta de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% al dominio variable de cadena beta de TCR de la SEQ ID N.° 10.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de cadena beta de TCR que es idéntico al menos en un 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, pero preferentemente idéntico en un 75% al dominio constante de cadena beta de TCR de la SEQ ID N.° 10.
En una forma de realización especialmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio va­ riable de cadena beta de TCR provisto de una secuencia idéntica al menos en un 90% a la del dominio variable de cadena beta de TCR de la SEQ ID N.° 10, y que comprende las CRD1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 10.
En una forma de realización, la molécula HLA es una molécula MHC de clase I seleccionada del grupo consistente en moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C. En una forma de realización, la molécula HLA es HLA-A*02. En otra forma de realización, la molécula HLA es una molécula MHC de clase II seleccionada del grupo consistente en moléculas HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR.
Los TCR de la presente descripción se unen preferentemente a un complejo formado por un péptido de IGF2BP3-001 y una molécula de HLA con una afinidad de unión (Kd) de aproximadamente 100 jM o menos, aproximadamente 50 |jM o menos, aproximadamente 25 jM o menos, o aproximadamente 10 jM o menos. Se prefieren más los TCR con alta afinidad dotados de una afinidad de unión de aproximadamente 1 jM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos. Algunos ejemplos sin ánimo de limita­ ción de intervalos de afinidad de unión preferidos para los TCR de la presente invención son: aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM; aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20 nM; aproximadamente 20 nM a aproxi­ madamente 30 nM; aproximadamente 30 nM a aproximadamente 40 nM; aproximadamente 40 nM a aproximadamente 50 nM; aproximadamente 50 nM a aproximadamente 60 nM; aproximadamente 60 nM a aproximadamente 70 nM; aproximadamente 70 nM a aproximadamente 80 nM; aproximadamente 80 nM a aproximadamente 90 nM; y aproxi­ madamente 90 nM a aproximadamente 100 nM.
Tal y como se usa en relación con los TCR de la presente descripción, «unión específica» y las variantes gramaticales de dicho término se emplean para designar un TCR dotado de una afinidad de unión (Kd) hacia un complejo formado por un péptido de IGF2BP3-001 y una molécula HLA igual o inferior a 100 pM.
Los TCR heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden incorporar un enlace disulfuro introducido entre sus dominios constantes. Los TCR preferidos de este tipo incluyen aquellos dotados de una secuencia de dominio constante TRAC y de una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2, con la salvedad de que la Thr 48 de TRAC y la Ser 57 de TRBC1 o TRBC2 están sustituidas por residuos de cisteína, y dichas cisteínas forman un enlace disulfuro entre la secuencia de dominio constante TRAC y la secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR.
Con o sin el susodicho enlace intercatenario introducido, los TCR heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden tener una secuencia de dominio constante TRAC y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2, y la secuencia de dominio constante TRAC y la secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR pueden estar conectadas mediante el enlace disulfuro nativo establecido entre la Cys4 del exón 2 de TRAC y la Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
Los TCR de la presente descripción pueden comprender un marcador detectable seleccionado del grupo consistente en radionúclidos, fluoróforos y biotina. Los TCR de la presente descripción pueden estar conjugados con un principio terapéuticamente activo, como un radionúclido, un agente quimioterápico o una toxina.
En una forma de realización, el dominio variable de cadena alfa de TCR tiene al menos una mutación con respecto a un dominio de cadena alfa de TCR mostrado en la Tabla 1; y/o el dominio variable de cadena beta de TCR tiene al menos un mutación con respecto a un dominio de cadena beta de TCR mostrado en la Tabla 1. En una forma de realización, un TCR que comprende al menos una mutación en el dominio variable de cadena alfa de TCR y/o en un dominio variable de cadena beta de TCR presenta una afinidad de unión hacia y/o una semivida de unión a un complejo de péptido IGF2BP3-001-molécula HLA, que al menos duplica la de un TCR que comprende un dominio variable alfa de TCR no mutado y/o un dominio variable beta de TCR no mutado.
En una forma de realización, un TCR de la presente descripción portador de al menos una mutación de la cadena alfa y/o de al menos una mutación de la cadena beta presenta una glucosilación modificada en comparación con el TCR no mutado.
En una forma de realización, un TCR que comprende al menos una mutación en su cadena alfa y/o en su cadena beta posee una afinidad de unión y/o una semivida de unión con un complejo de péptido de IGF2BP3-001-molécula HLA, que como mínimo duplica la de un TCR cuya cadena alfa y/o beta no está(n) mutada(s). La potenciación de la afinidad de los TCR específicos de tumor, y su aprovechamiento, depende de la existencia de una franja de afinidades óptimas de tales receptores. La existencia de tal franja se basa en las observaciones de que los TCR específicos para patóge­ nos restringidos a HLA-A2 presentan valores de Kd que en general son unas 10 veces menores que los TCR especí­ ficos para los autoantígenos asociados a tumor restringidos a HLA-A2 (Aleksic et al. 2012; Kunert et al. 2013). Ahora sabemos que a pesar de que los antígenos tumorales tienen el potencial de ser inmunogénicos, puesto que los tumo­ res se originan a partir de las propias células del individuo, solo las proteínas mutadas o las proteínas con un proce­ samiento traduccional alterado serán detectadas como extrañas por el sistema inmunitario. Los antígenos que están regulados al alza o sobreexpresados (llamados autoantígenos) no inducen necesariamente una respuesta inmunitaria funcional contra el tumor: Los linfocitos T que expresan TCR que son altamente reactivos contra dichos antígenos son seleccionados negativamente en el timo en un proceso conocido como tolerancia central (Xing et al. 2012; Ruella et al. 2014; Sharpe et al. 2015), lo que significa que solo pervivirán los linfocitos T cuyos TCR presenten una baja afinidad hacia los autoantígenos. Así pues, la afinidad de los TCR o de las variantes de la presente descripción hacia la IGF2BP3-001 puede ser potenciada mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Una «composición farmacéutica» es una composición apta para la administración a un ser humano en un contexto médico. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica es estéril y se fabrica conforme a las directrices de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF).
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen asimismo al menos una célula hospedadora que expresa un TCR de la presente descripción, contenida en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción también pueden incluir excipientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.
Esta composición está destinada a la administración parenteral, como por vía subcutánea, intradérmica o intramuscu­ lar, o bien para la administración oral. Para ello, los péptidos y opcionalmente otras moléculas se disuelven o se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como tampones, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes, lubricantes, etc. En una composición tal se puede usar una amplia lista de excipientes, como por ejemplo, los tomados de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000). La composición se puede utilizar para la prevención, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas. Formulaciones a título de ejemplo se hallarán, por ejemplo, en EP2112253, que a modo de referencia se incorpora íntegramente a la presente memoria.
Otro aspecto más de la descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos) que codifican un péptido, variantes de péptido, TCR y variantes de TCR de la descripción. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contengan residuos de aminoácidos natu­ rales unidos por enlaces peptídicos naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Otro aspecto más de la descripción proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido conforme a la descripción.
La descripción se refiere, además, a un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR de la presente descripción. En una forma de realización los ácidos nucleicos de la descripción codifican una cadena alfa de TCR y/o una cadena beta de TCR como las mostradas en la Tabla 1. La descripción concierne, además, a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, o ambas, tal y como se describen en la presente memoria.
Se han desarrollado diversos métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación por medio de puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar mo­ léculas de ADN recombinante.
Otro método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen ligadores sintéticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restricción que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE. UU.
Un método deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la descripción se sirve de la reacción en cadena de la polimerasa tal y como exponen Saiki RK y cols. (Saiki et al., 1988)). Este método puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, diseñando las dianas de restricción adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.
En un aspecto, con el fin de obtener los linfocitos que expresan los TCR de la presente descripción, los ácidos nuclei­ cos que codifican las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta de la presente descripción se clonan en vectores de expresión, como retrovirus gamma o lentivirus. Se crean los virus recombinantes y se analiza su funcionalidad, como la especifi­ cidad hacia el antígeno y la avidez funcional. A continuación se toma una parte alícuota del producto final para transducir a la población destinataria de linfocitos T (generalmente purificada a partir de las PBMC del paciente), que se expande antes de administrarla vía infusión al paciente.
En otro aspecto, para obtener linfocitos T que expresen TCR de la presente descripción, los ARN del TCR se sintetizan con técnicas conocidas en la técnica, como por ejemplo, sistemas de transcripción in vitro. A continuación los ARN del TCR sintetizados in vitro se introducen mediante electroporación en linfocitos T CD8+ primarios procedentes de do­ nantes sanos para reexpresar las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor.
Las cadenas del TCR introducidas en un linfocito T de sangre periférica pueden competir con cadenas de TCR endó­ genas por su asociación con el complejo CD3, que es necesario para la expresión del TCR en la superficie celular. Puesto que la expresión profusa del t Cr en la superficie celular es esencial para conferir la sensibilidad adecuada para la activación por las células que expresan el antígeno tumoral diana (Cooper et al., 2000; Labrecque et al., 2001), las estrategias que potencian la expresión de los genes de las cadenas alfa y beta del TCR son importantes en la terapia génica con TCR.
Con el fin de aumentar la expresión, los ácidos nucleicos que codifican los TCR de la presente descripción pueden enlazarse funcionalmente con promotores potentes, como repeticiones terminales largas de retrovirus (LTR), citomegalovirus (CMV), virus de citoblastos murino (MSCV) U3, fosfoglicerato-cinasa (PGK), p-actina, ubiquitina y un promo­ tor compuesto de virus símico 40 (SV40)/CD43, el factor de elongación (EF)-1a y el promotor del virus formador de focos en el bazo (SFFV) (Joseph et al., 2008). En una forma de realización preferida, el promotor es heterólogo con respecto al ácido nucleico que se expresa.
Además de promotores potentes, los casetes de expresión del TCR de la presente descripción pueden contener otros elementos adicionales para potenciar la expresión del transgén, como un tracto central polipurínico (cPPT), el cual promueve la traslocación nuclear de los contructos lentivíricos (Follenzi et al., 2000), o el elemento regulador postrancripcional del virus de la marmota (wPRE), que aumenta el nivel de expresión del transgén al reforzar la estabilidad del ARN (Zufferey et al., 1999).
Las cadenas alfa y beta de un TCR de la presente invención pueden ser codificadas por ácidos nucleicos insertados en vectores separados, o pueden serlo por polinucleótidos insertados en un mismo vector.
Alcanzar un alto nivel de expresión del TCR en la superficie celular exige que tanto las cadenas TCR-alfa como TCR-beta del TCR introducido se transcriban en abundancia. Con ese fin, las cadenas TCR-alfa y TCR-beta de la presente descripción se pueden clonar en constructos bicistrónicos en un mismo vector, los cuales han demostrado ser capaces de superar ese obstáculo. La inserción de un sitio de entrada intrarribosómico del virus (IRES) entre las cadenas TCR-alfa y TCR-beta da pie a la expresión coordinada de ambas cadenas, porque ambas son generadas a partir de un único transcrito que se escinde en dos proteínas durante la traducción, asegurando así la producción equimolar de ambas (Schmitt et al. 2009).
Los codones de los ácidos nucleicos que codifican los TCR de la presente descripción pueden ser optimizados para potenciar la expresión en la célula hospedadora. La redundancia del código genético permite que algunos aminoácidos sean codificados por más de un codón, pero ciertos codones son menos «idóneos» que otros por la disponibilidad relativa de los ARNt correspondientes, entre otros factores (Gustafsson et al., 2004). Se ha demostrado que la modi­ ficación de las secuencias génicas de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta de modo tal que cada aminoácido sea codi­ ficado por el codón más idóneo para la expresión génica en mamíferos, así como la supresión de los motivos que provocan inestabilidad en el ARNm o de los sitios de escisión ocultos mejora notablemente la expresión génica de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta (Scholten et al., 2006).
Además, el emparejamiento erróneo entre las cadenas de TCR introducidas y las endógenas puede derivar en la adquisición de especificidades que supongan un riesgo significativo para la autoinmunidad. Por ejemplo, la formación de dímeros mixtos de las cadenas del TCR puede reducir el número de moléculas disponibles para formar complejos TCR correctamente aparejados, y por tanto reducir notablemente la avidez funcional de las células que expresan el TCR introducido (Kuball et al., 2007).
A fin de reducir el emparejamiento erróneo se puede modificar el dominio C-terminal de las cadenas del TCR introdu­ cidas que forman parte de la presente descripción para promover la afinidad entre las cadenas, al tiempo que reducir las posibilidades de que esas cadenas introducidas se emparejen con los TCR endógenos. Tales estrategias pueden consistir en: La sustitución de los dominios C-terminales de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta humanas con sus con­ trapartidas murinos (dominio C-terminal murinizado); la creación de un segundo enlace disulfuro entre las cadenas en el dominio C-terminal mediante la introducción de un segundo residuo de cisteína tanto en las cadenas TCR-alfa como TCR-beta del TCR introducido (modificación con cisteína); intercambiar los residuos que interactúan de los dominios C-terminales de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta («knob-in-hole»); y la fusión directa de los dominios variables de ambas cadenas con el CD3Z (fusión con CD3Z). (Schmitt et al. 2009).
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido o variante de la descripción. Así pues, el ADN que codifica el péptido o variante de la descripción puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para trans­ formar una célula hospedadora adecuada a fin de que exprese y produzca el polipéptido de la descripción. Tales técnicas incluyen las dadas a conocer en las patentes de EE. u U. N.° 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751,4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648, que se incorporan a la presente memoria a modo de referencia.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la descripción se puede unir con una amplia variedad de secuencias distintas de ADN para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.
En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el a Dn se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de se­ lección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesa­ rios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como, por ejemplo, de resistencia a antibióticos.
Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la célula hospedadora.
La descripción se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante que permite la expresión de un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de TCR, la cadena beta de TCR, o ambas, tal y como se describen en la presente memoria.
Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la descripción se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas reveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.
Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente, el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.
En una forma de realización, se modifica con técnicas de ingeniería genética una célula hospedadora para que exprese un TCR de la presente descripción. En formas de realización preferidas, la célula hospedadora es un linfocito T hu­ mano o una célula progenitora de linfocito T humana. En algunas formas de realización el linfocito T o la célula progenitora de linfocito T se obtienen de un paciente con cáncer. En otras formas de realización el linfocito T o la célula progenitora de linfocito T se obtienen de un donante sano. Las células hospedadoras de la presente descripción pue­ den ser alogénicas o autólogas con respecto al paciente que va a ser tratado. En una forma de realización, la célula hospedadora es un linfocito T gamma/delta transformado para expresar un TCR alfa/beta.
Un típico vector plasmídico de expresión constitutiva para células de mamífero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola de poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Algunos vectores plasmídicos de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HiS3, TRP1, l EU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión tran­ sitoria o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.
La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, poliA de hGH, y el origen del f1. Los vectores que contienen la se­ cuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos anti-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.
En otra forma de realización dos o más péptidos o variantes peptídicas de la descripción se codifican y se expresan en orden sucesivo (similar a constructos de «collar de cuentas»). Al hacerlo, los péptidos o las variantes peptídicas se pueden enlazar o fusionar juntas mediante segmentos de aminoácidos enlazantes, como, por ejemplo, LLLLLL, o se pueden unir sin ningún otro péptido adicional entre ellos. Estos constructos también pueden ser utilizados para la terapia contra el cáncer, y podrían inducir respuestas inmunitarias en las que intervengan tanto el MHC I como el MHC II.
La presente descripción también se refiere a una célula hospedadora transformada con un constructo de vector polinucleotídico de la presente descripción. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacte­ rianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normal­ mente son cepas de E. coli, como, por ejemplo, las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, Maryland, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, Maryland, EE. UU. (N.° ATCC 31343). Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamí­ fero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9, que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,” Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.
La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente descripción se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la trans­ formación de células hospedadoras procariotas, véase, por ejemplo, Cohen y cols. (Cohen et al., 1972) y (Green and Sambrook, 2012). La transformación de células de levadura se describe en Sherman et al. (Sherman et al., 1986). El método de Beggs (Beggs, 1978) también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o la transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.
Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente descripción, se pueden identificar con técnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.
Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la descripción son útiles para la preparación de péptidos de la descripción, por ejemplo, las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la descripción de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la descripción.
En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene ácido prostático fosfatasa (PAP) fueron aprobadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE. UU. (FDA) el 29 de abril de 2010 para tratar el cáncer de próstata hormonorrefractario metastásico asintomático o mínimamente sintomático (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
La descripción se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico acorde con la des­ cripción o un vector de expresión tal y como se ha descrito antes.
La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora acorde con la descripción que es una célula presentadora de antígeno, y preferiblemente es una célula dendrítica.
La descripción se refiere, además, a una célula hospedadora aislada que comprende un vector de expresión recom­ binante acorde con la presente descripción, preferentemente en el que la célula es una célula humana, preferente­ mente un linfocito de sangre periférica (LSF), y más preferentemente un linfocito T CD4-positivo o CD8-positivo.
La descripción concierne, además, a un linfocito de sangre periférica (LSF) aislado que comprende el vector de ex­ presión recombinante de la descripción, en que el LSF es un linfocito T CD8+ o CD4+.
La descripción se refiere, además, a una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en la presente memoria.
La descripción concierne, además, a linfocitos T activados, producidos con el método acorde con la descripción, en que el linfocito T reconoce selectivamente una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos acorde con la descripción.
La descripción concierne, además, a un método para la producción de un péptido o de su variante, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.
En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la descripción se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido o su variante pueden ser preparados para la inyección por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos para la inyec­ ción del péptido incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Según el péptido o a Dn de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 |jg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 jg a 500 jg de péptido o a Dn . Dosis en esos intervalos se han empleado con éxito en varios ensayos (Walter et al., 2012).
El polinucleótido usado para la vacunación activa puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, APN, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Una perspectiva general se puede consultar, por ejemplo, en Teufel y cols. (Teufel et al., 2005). Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o híbridos que con­ tienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. Los métodos de introducción físicos, como la «pistola génica», también pueden utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo, con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto, tal y como se ha indicado antes.
Además se describen aptámeros. Los aptámeros (véase, por ejemplo, WO 2014/191359 y la bibliografía citada en ella) son moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios cortas, que se pueden plegar hasta adoptar estructuras tridi­ mensionales definidas y que reconocen estructuras diana específicas. Parecen ser alternativas adecuadas para el desarrollo de terapias dirigidas. Los aptámeros han demostrado su unión selectiva a una gama de dianas complejas con elevada afinidad y especificidad.
En la pasada década han sido descubiertos aptámeros que reconocen moléculas situadas en la superficie celular que constituyen un medio para el desarrollo de estrategias diagnósticas y terapéuticas. La toxicidad y la inmunogenicidad de los aptámeros es, hasta donde se sabe, prácticamente nula, por lo que son candidatos prometedores para aplica­ ciones biomédicas. Y son aptámeros, por ejemplo, aptámeros que reconocen el antígeno de membrana específico de la próstata, los que han sido empleados con éxito en terapias dirigidas y han demostrado su funcionalidad en modelos de xenoinjerto in vivo. Además, se han descubierto aptámeros que reconocen estirpes de células tumorales específi­ cas.
Es posible seleccionar aptámeros de ADN para desvelar propiedades de reconocimiento de amplio espectro contra varias células cancerosas, y particularmente las derivadas de tumores sólidos, en tanto que las células sanas primarias y no oncogénicas no son reconocidas. Si los aptámeros descubiertos reconocieran no solo un subtipo de tumor con­ creto sino que interaccionaran con una serie de tumores, se convertirían en una herramienta aplicable para el diag­ nóstico y la terapéutica de amplio espectro.
Además, las investigaciones de su unión a células mediante la citometría de flujo han demostrado que los aptámeros presentan una excelente afinidad aparente en la escala nanomolar.
Los aptámeros resultan útiles para fines diagnósticos y terapéuticos. En un aspecto, al menos uno o más aptámeros son captados por las células tumorales y pueden actuar así como vehículos moleculares para la administración dirigida de agentes antineoplásicos como ARNsi en las células tumorales.
Se pueden seleccionar aptámeros que vayan dirigidos contra dianas complejas tales como células y tejidos y comple­ jos de los péptidos o los TCR que comprendan, y que preferiblemente consistan en, una secuencia acorde con cual­ quiera de las SEQ ID N.° 14 a SEQ ID N.° 15, conforme con la presente descripción con la molécula MHC, mediante la técnica cell-SELEX (acrónimo de Systematic Evolution o f Ligands by Exponential enrichment, Evolución sistemática de los ligandos mediante enriquecimiento exponencial).
En una forma de realización la descripción proporciona un método para producir un TCR como el descrito en la pre­ sente memoria, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora capaz de expresar el TCR en las condiciones idóneas para promover la expresión de dicho receptor.
La descripción concierne, además, a métodos acordes con la descripción, en que el antígeno se carga en moléculas del MHC de clase I o II que se expresan en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o en una célula presentadora de antígeno artificial mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente del antígeno con la célula presentadora de antígeno o bien el antígeno se carga en tetrámeros de MHC de clase I o II mediante la tetramerización de monómeros del complejo de antígeno con moléculas MHC de clase I o II.
La descripción se refiere, además, al método acorde con la descripción, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar o que expresa dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 1 o una variante del mismo.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR acorde con la presente descripción, comprendiendo dicho método: La incubación de PBMC procedentes de donantes sanos negativos para HLA-A*02 con monómeros de A2/IGF2BP3; la incubación de las PBMC con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T dotados de gran avidez mediante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR acorde con la presente descripción, comprendiendo dicho método: La incubación de PBMC procedentes de donantes sanos negativos para HLA-A*02 con monómeros de A2/p286-1Y2L; la incubación de las PBMC con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T dotados de gran avidez mediante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR acorde con la presente descripción, comprendiendo dicho método: La incubación de PBMC procedentes de donantes sanos negativos para HLA-A*02 con monómeros de A2/p286-1Y2L9L; la incubación de las PBMC con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T dotados de gran avidez mediante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR conforme a la presente descripción, comprendiendo dicho método: La obtención de un ratón transgénico con los locus enteros del gen TCRap humano (1,1 y 0,7 Mb), cuyos linfocitos T expresen un repertorio diverso de TCR humanos que compense la deficiencia de TCR murinos; la inmunización del ratón con el IGF2BP3-001; la incubación de las PBMC obtenidas de los ratones transgénicos con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T con gran avidez me­ diante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR conforme a la presente descripción, comprendiendo dicho método: La obtención de un ratón transgénico con los locus enteros del gen TCRap humano (1,1 y 0,7 Mb), cuyos linfocitos T expresen un repertorio diverso de TCR humanos que compense la deficiencia de TCR murinos; la inmunización del ratón con el p286-1Y2L; la incubación de las PBMC obtenidas de los ratones transgénicos con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T con gran avidez me­ diante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, a un método para identificar y aislar un TCR conforme a la presente descripción, comprendiendo dicho método: La obtención de un ratón transgénico con los locus enteros del gen TCRap humano (1,1 y 0,7 Mb), cuyos linfocitos T expresen un repertorio diverso de TCR humanos que compense la deficiencia de TCR murinos; la inmunización del ratón con el p286-1Y2L9L; la incubación de las PBMC obtenidas de los ratones transgénicos con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T con gran avidez me­ diante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.
La presente descripción se refiere, además, al método acorde con la descripción, en el que el linfocito T comprende un vector de expresión capaz de expresar un TCR acorde con la presente descripción.
La presente descripción se refiere, además, a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante el IGF2BP3, método que comprende la administración al paciente de un número efectivo de TCR, TCR solubles y/o linfocitos T de acuerdo con la presente descripción.
La descripción concierne, además, a métodos para destruir o reducir el número de cálulas cancerosas, los cuales comprenden la puesta en contacto de las células canderosas con un TCR, un ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora como los descritos en la presente memoria. También se describen método para tratar el cáncer que comprenden la administración a un sujeto que lo necesita del TCR, el ácido nucleico, el vector o la célula hospedadora como los descritos en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a métodos para destruir células y/o suprimir células en un paciente cuyas células cancerosas expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de ami­ noácidos acordes con la descripción, métodos que comprenden la administración al paciente de una cantidad eficaz de linfocitos T producidos de acuerdo con la descripción.
La descripción se refiere, además, a un ácido nucleico que codifica un TCR acorde con la descripción, y un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico acorde con la descripción.
La descripción concierne, además, con un TCR acorde con la descripción, un ácido nucleico acorde con la descripción o un vector de expresión acorde con la descripción para el uso en el tratamiento de enfermedades y en medicina, en concreto en el tratamiento del cáncer. La descripción concierne, además, a TCR y a células hospedadoras de la presente descripción para el uso como tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer cerebral (glioblastoma, neuroblastoma, etc.), cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar o de vías biliares y cáncer de esófago.
En un aspecto, la célula hospedadora es un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+ transfectado con un ácido nucleico que codifica al menos un TCR acorde con la descripción, TCR que comprende al menos un secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1. En otro aspecto tales células hospedadoras se usan en la inmunoterapia contra el cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer cerebral (glioblastoma, neuro­ blastoma, etc.), cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pán­ creas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar o de vías biliares y cáncer de esófago
La presente descripción se refiere, además, al uso de cualquier TCR descrito, un ácido nucleico acorde con la presente descripción, un vector de expresión acorde con la presente descripción, una célula acorde con la presente descripción, o un linfocito T citotóxico activado acorde con la presente descripción como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La presente descripción se refiere, además, a un uso conforme a la presente descripción en el que el medicamento es activo contra el cáncer.
La presente descripción se refiere, además, al uso acorde con la descripción, en el que las células cancerosas son células de cáncer de pulmón amicrocítico u otras células de tumores sólidos o hematológicos, como el cáncer de pulmón amicrocítico, el cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carci­ noma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y vías biliares y cáncer de esófago.
La presente descripción se refiere, además, a un método para destruir células cancerosas que comprende la puesta en contacto de las células cancerosas con una célula hospedadora de la presente descripción. En una forma de rea­ lización, la célula hospedadora expresa un TCR de la presente descripción. En una forma de realización, la célula hospedadora es un linfocito T o una célula progenitora de linfocito T. En una forma de realización, En una forma de realización preferida, las células cancerosas se seleccionan entre células de cáncer de pulmón amicrocítico u otras células de tumores sólidos o hematológicos, como el cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y vías biliares y cáncer de esófago. En algunas formas de realización, el TCR se conjuga con un agente terapéuticamente activo. En ciertas formas de reali­ zación, el agente terapéuticamente activo se selecciona de un grupo consistente en radionúclidos, agentes quimioterápicos y toxinas.
La presente descripción se refiere, además, a un método de tratamiento contra el cáncer que comprende la adminis­ tración a un sujeto que lo necesita de una célula hospedadora de la presente invención. En una forma de realización, la célula hospedadora expresa un TCR de la presente descripción. En una forma de realización, la célula hospedadora es un linfocito T o una célula progenitora de linfocito T. En una forma de realización, la célula hospedadora es autóloga con respecto al sujeto a tratar. En otra forma de realización, la célula hospedadora es alogénica con respecto al sujeto a tratar. En una forma de realización preferida, las células cancerosas se seleccionan entre células de cáncer de pulmón amicrocítico u otras células de tumores sólidos o hematológicos, como el cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y vías biliares y cáncer de esófago.
En algunas formas de realización, el TCR se conjuga con un agente terapéuticamente activo. En la presente memoria, el término «agente terapéuticamente activo» designa un compuesto usado para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno médico indeseable. En una forma de realización, el agente terapéuticamente activo se usa para tratar a prevenir el cáncer. En ciertas formas de realización, el agente terapéuticamente activo se selecciona de un grupo consistente en radionúclidos, agentes quimioterápicos y toxinas.
Los TCR, los ácidos nucleicos y las células hospedadoras de la presente descripción, así como las composiciones farmacéuticas de los mismos, pueden ser administrados a un sujeto que los necesite a través de vías conocidas en la técnica, y que pueden variar dependiendo del tipo de cáncer que se va a tratar. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, la administración local (como la intratumoral) y la administración parenteral como la subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intraportal o intrahepática. En una forma de realización preferida, los TCR, los ácidos nucleicos o las células hospedadoras de la presente descripción, o las composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran a un sujeto por medio de infusión local, por ejemplo, con una bomba de infusión y/o un sistema de catéter, en un sitio que se va a tratar, como un tumor sólido. En una forma de realización, una composición de la presente descripción se infunde en un tumor sólido, en un vaso sanguíneo que irriga el tumor sólido, y/o en una zona circundante al tumor sólido.
En formas de realización preferidas, las composiciones de la presente descripción se administran a un sujeto con una pauta posológica de al menos dos administraciones separadas por un lapso mínimo de 24 horas. Las pautas posológicas adecuadas para la administración de composiciones de la presente descripción incluyen, por ejemplo, una vez al día, una vez cada dos días y una vez cada tres días. Son aún más preferibles pautas posológicas del orden de una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada 15 días, una vez al mes y dos veces al mes. En formas de realización concretas se emplea una pauta escalonada de la dosis, en la que el sujeto recibe progresivamente dosis crecientes a lo largo de varios días, semanas o meses.
Las dosis efectivas de las células hospedadoras que expresan los TCR de la presente invención incluyen, por ejemplo, al menos unas 104, al menos unas 105, al menos unas 106, al menos unas 107, al menos unas 108, al menos unas 109, y al menos unas 1010 células hospedadoras por dosis. En una forma de realización, las células hospedadoras de la presente descripción se administran en dosis aproximadas de entre 104 y 1010 células por dosis, preferentemente en dosis aproximadas de entre 105 y 109 células por dosis. En formas de realización preferidas, las dosis se administran en una pauta posológica a lo largo de al menos dos o más ciclos de administración.
La presente descripción se refiere, además, a un método para tratar el cáncer que comprende la administración de un TCR, un ácido nucleico o una célula hospedadora de la presente descripción en combinación con al menos un agente quimioterápico y/o radioterapia.
Se da a conocer un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, el cual comprende:
a) Aislamiento de una célula de dicho sujeto
b) Transformación de la célula con al menos un vector que codifique un TCR de la presente descripción para produ­ cir una célula transformada
c) Expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) Administración de la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
Se da a conocer un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, el cual comprende:
a) Aislamiento de una célula procedente de un donante sano
b) Transformación de la célula con un vector que codifique un TCR de la presente descripción para producir una célula transformada
c) Expansión de la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) Administración de la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se proporciona un método para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende:
a) Puesta en contacto de la muestra biológica con un TCR de la presente descripción
b) Detección de la unión del TCR a la muestra biológica.
En ciertas formas de realización, el método para la detección del cáncer se lleva a cabo en condiciones in vitro, in vivo o in situ.
La presente descripción se refiere, además, a proteínas marcadoras y a biomarcadores concretos basados en los péptidos acordes con la presente descripción, aquí denominados «dianas» que pueden ser utilizados para el diagnós­ tico y/o el pronóstico del cáncer de pulmón amicrocítico. La presente descripción también se refiere al uso de esas novedosas dianas para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto más de la descripción proporciona un método para producir un receptor de linfocito T soluble (sTCR) que reconozca un complejo de péptido-MHC específico. Dichos receptores de linfocitos T solubles se pueden generar a partir de clones de linfocitos T específicos, cuya afinidad se puede incrementar por mutagénesis dirigida a las regiones determinantes de complementariedad. Para la selección del receptor de linfocito T se puede utilizar una fagoteca (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). A fin de estabilizar los receptores de linfocito T en la fagoteca y en caso de uso práctico como fármaco, las cadenas alfa y beta se pueden enlazar, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro no nativos, otros enlaces covalentes (receptor de linfocito T monocatenario), o mediante dominios de dimerización (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). El receptor de linfocito T se puede enlazar con toxinas, fármacos, citocinas (véase, por ejemplo, US 2013/0115191), dominios que recluten células efectoras como un dominio anti-CD3, etc., con el fin de ejecutar funciones particulares en células diana. En otro aspecto, éste se expresa en linfocitos T usados para la trasferencia adoptiva. Véanse, por ejemplo, WO 2004/033685A1, WO 2004/074322A1 y WO 2013/057586A1, cuyo contenido se incorpora íntegramente a modo de referencia.
Además, los péptidos y/o los TCR o anticuerpos u otras moléculas de unión de la presente descripción se pueden utilizar para confirmar el diagnóstico histopatológico de cáncer a partir de una muestra de biopsia.
Los anticuerpos o los TCR también se pueden utilizar para ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo o el TCR se marcan con un radionúclido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor pueda ser localizado con inmunogammagrafía. En una forma de realización, anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas de una proteína seleccionada del grupo consistente en las susodichas proteínas, y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 pM.
Los anticuerpos o los TCR para uso diagnóstico pueden ser marcados con sondas adecuadas para posibilitar la de­ tección con diferentes métodos de diagnóstico por la imagen. Los métodos para la detección de sondas incluyen, entre otros, microscopía de fluorescencia, óptica convencional, confocal y electrónica; resonancia magnética y espectroscopía; radioscopia, tomografía computadorizada y tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas in­ cluyen, entre otras, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Además, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos enumerados. Los anticuerpos y/o TCR pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La fijación de sondas a los anticuerpos y/o TCR incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda en el anticuerpo o el TCR, y la unión covalente de un compuesto quelante para unir la sonda, entre otros métodos consabidos en la técnica. Para las técnicas de inmunohistoquímica, la muestra de tejido patológico puede ser reciente o congelada, o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante como el formol. El corte fijado o incluido que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, de modo que el anticuerpo se emplea para detectar la expresión in situ de las proteínas.
Asimismo se dan a conocer péptidos IGF2BP3-001 capaces de unirse a TCR y a anticuerpos cuando son presentados por una molécula del MHC.
La descripción concierne, además, al uso como medicamento o para la fabricación de un medicamento de cualquier péptido descrito en la presente memoria, de los ácidos nucleicos acordes con los descritos en la presente memoria, de los vectores de expresión descritos en la presente memoria, de las células descritas en la presente memoria, del linfocito T activado descrito en la presente memoria, de los receptores de linfocito T, de los anticuerpos o de otras moléculas que se unan a péptidos o a complejos de péptido-MHC acordes con la presente descripción. En un aspecto, el medicamento es activo contra el cáncer.
Preferentemente, dicho medicamento es una terapia celular, un TCR, un TCR soluble o un anticuerpo.
La presente descripción concierne, además, con el uso acorde con la presente descripción, en el que las células cancerosas son células de cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer cerebral (glioblastoma, neuroblastoma, etc.), cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar o de vías biliares y cáncer de esófago, pero preferentemente de cáncer de pulmón amicrocítico.
La presente descripción concierne, además, a biomarcadores basados en los péptidos acordes con la presente des­ cripción, llamados en la presente diana “dianas”, que pueden servir para el diagnóstico del cáncer, preferentemente del cáncer de pulmón amicrocítico. El marcador puede ser la sobrepresentación del péptido o péptidos en sí, o la sobreexpresión del gen o de los genes correspondientes. Los biomarcadores también pueden servir para predecir la probabilidad de éxito de un tratamiento, preferentemente de una inmunoterapia, y más preferentemente aún una inmunoterapia dirigida específicamente contra la misma diana identificada por el biomarcador. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo o un TCR soluble para teñir cortes del tumor a fin de detectar la presencia de un péptido de interés que esté formando complejos con moléculas del MHC. Opcionalmente, el anticuerpo o el TCR soluble pueden llevar incorporada una función efectora como un dominio inmunoestimulador o una toxina.
La presente descripción concierne, además, al uso de esas novedosas dianas para la identificación de TCR que reco­ nozcan al menos una de dichas dianas, y preferentemente la identificación entre esos TCR de los que activen a los linfocitos T.
La presente descripción también concierne al uso de estas nuevas dianas en el contexto del tratamiento del cáncer.
La presente descripción se refiere, además, a un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID N.° 1 o una variante de la misma, que es homóloga en al menos un 66%, preferentemente al menos en un 77%, y más preferentemente aún en al menos un 88% (idéntica preferentemente en al menos un 77% o al menos en un 88%) a la SEQ ID N.° 1, en que dicho péptido o variante del mismo tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferentemente de entre 8 y 30, y más preferentemente aún de entre 8 y 14 aminoácidos.
Ejemplos
La utilización de las condiciones alorreactivas permite La utilización de las condiciones alorreactivas permite eludir la autotolerancia y obtener linfocitos T provistos de elevada avidez en comparación con los linfocitos T derivados de «montajes» autólogos, esto es, de los propios pacientes. Ejemplos de tales condiciones incluyen la generación in vitro de linfocitos T específicos de péptido y reactivos a HLA alogénicos (Sadovnikova et al. 1998; Savage et al. 2004; Wilde et al. 2012), y la inmunización de ratones transgénicos para moléculas de MHC humanas o TCR humanos (Stanislawski et al. 2001; Li et al. 2010).
Ejemplo 1
Generación in vitro de linfocitos T específicos de péptido y reactivos a HLA alogénicos (Savage et al. 2004)
Se emplearon PBMC procedentes de donantes sanos, tanto positivos como negativos para HLA-A*02, que concedie­ ron su consentimiento informado. Se adquirieron monómeros HLA-A2 de clase I biotinilados y recombinantes y tetrá­ meros A2 fluorescentes que contenían el IGF2BP3-001 de MBLI (Woburn, MA, EE. UU.). Las PBMC se incubaron con anti-CD20SA diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente, se la­ varon y se incubaron con los monómeros A2/IGF2BP3-001 biotinilados durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron y se sembraron a razón de 3x106 células/pocillo en placas de 24 pocillos en RPMI con suero AB humano al 10%. El primer día se añadió interleucina 7 a razón de 10 ng/ml (IL-7; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) y el cuarto día IL-2 a razón de 10 U/ml (Chiron, Harefield, Reino Unido). Durante un período de 5 semanas a las células se las reestimuló semanalmente con PBMC recién extraídas, se mezclaron con células que habían respondido en una proporción 1:1 y se sembraron a razón de 3x106/pocillo en placas de 24 pocillos.
Para obtener los linfocitos T de gran avidez, se incubaron unas 106 PBMC con el tetrámero HLA-A2/IGF2BP3-001 conjugado con ficoeritrina (PE) (obtenidas de MBLI) durante 30 minutos a 37 °C, y acto seguido con anticuerpo anti-CD8 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC)/aloficocianina (APC) durante 20 minutos a 4 °C antes de proceder al análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur. La selección se efectuó con un citómetro de flujo FACS-Vantage (Becton Dickinson, Cowley, Oxford, Reino Unido). Las células tetrámero-positivas seleccionadas se expandieron en placas de 24 pocillos sembrando en cada pocillo 2x105 células, acompañadas a modo de nodrizas por 2x106 PBMC A2-negativas irradiadas, junto con 2x104 microperlas CD3/CD28 /ml (Dynal, Oslo, Noruega) e IL-2 (1000 U/ml). Los linfocitos T de gran avidez así obtenidos se usaron a continuación para identificar y aislar los TCR con técnicas conocidas en la materia, como la 5'-RACE monocelular (Amplificación rápida de los extre­ mos de ADNc). Acto seguido, los ADN de TCR no redundantes se analizaron para determinar las secuencias de aminoácidos/ADN y se los clonó en vectores de expresión con métodos consabidos en la técnica.
Ejemplo 2: Clonación de los TCR
Los métodos para la clonación de TCR son conocidos en la técnica, como por ejemplo, los descritos en la patente de EE. UU. 8.519.100, que se incorpora íntegramente a la presente memoria como referencia sobre dichos métodos. Para amplificar la región variable de la cadena alfa se usan el oligonucleótido A1, específico de la secuencia de la región variable de la cadena alfa (ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc, SEQ ID N.° 22) que codifica la diana de restricción para Ndel, una metionina introducida para lograr el inicio eficiente de la expresión en bacterias, y el oligonucleótido A2, específico de la secuencia de la región constante de la cadena alfa (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg, SEQ ID N.° 23) que codifica la diana de restricción para Salí. En el caso de la cadena beta, la región variable de la misma se amplifica mediante el oligonucleótido B1, específico de la secuencia de la región variable de la cadena beta (tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa, SEQ ID N.° 24) que codifica la diana de restricción para Ndeí, una metionina introducida para lograr el inicio eficiente de la expresión en bacterias, y el oligonucleótido B2, específico de la secuencia de la región constante de la cadena beta (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc, SEQ ID N.° 25) que codifica la diana de restricción para AgeI.
Las secuencias de ADN codificantes de la cadena alfa del TCR cortadas con Ndel y con Sall se ligan en el vector pGMT7+Ca, previamente cortado con Ndel y Xhol. Las secuencias de ADN codificantes de la cadena beta del TCR cortadas con Ndel y Agel se ligan en otro vector pGMT7+Cp distinto, también previamente cortado con Ndel y Agel. Los plásmidos ligados se introducen por transformación en células competentes de la cepa de Escherichia coli deno­ minada XL1-Blue que a continuación se siembran en placas de LB/agar con ampicilina 100 pg/ml. Tras permanecer en incubación hasta el día siguiente a 37° C, se repican colonias aisladas que se cultivan hasta el día siguiente en 10 ml de LB con ampicilina 100 pg/ml a 37° C y en agitación. Los plásmidos clonados se purifican con un kit Miniprep (Qiagen) y el inserto se secuencia con un secuenciador automático de ADN (Lark Technologies).
Los TCR R10P1A7, codificantes de las cadenas alfa y beta de TCR específicas del tumor, se aislaron y se amplificaron a partir de linfocitos T procedentes de donantes sanos. Las células de los donantes sanos se estimularon en condicio­ nes in vitro siguiendo el método descrito por Walter et. al. 2003. Las células específicas de la diana se seleccionaron una a una con multímeros específicos de la diana antes de proceder al aislamiento de los TCR. Las secuencias de TCR se aislaron con la 5'-RACe mediante métodos ordinarios como los descritos, por ejemplo, en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 4a edición, de Green y Sambrook. El TCR R10P1A7 se aisló de un donante HLA-A2 negativo. Se secuenciaron las regiones variables de las cadenas alfa y beta de los TCR R20P1H7, R7P1D5 y R10P2G12.
Se descubrió que el dominio variable alfa del TCR R10P1A7 tenía una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 22 a 130 de la SEQ ID N.° 2. Se descubrió que el dominio variable beta del TCR R10P1A7 tenía una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 26 a 139 de la SEQ ID N.° 10.
Se pueden usar fagotecas para crear archivos de variantes de TCR con los que identificar mutantes provistos de alta afinidad. La fagoteca de t Cr y los métodos de cribado descritos en (Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) se pueden aplicar a un TCR de referencia seleccionado entre los TCR descritos en la Tabla 1.
Por ejemplo, las tres regiones CDR de la secuencia de la cadena alfa de la SEQ ID N.° 2 y las tres regiones CDR de la secuencia de la cadena beta de la SEQ ID N.° 10 pueden ser sometidas a mutagénesis, y buscar y cribar en cada biblioteca de CDR por separado.
En consecuencia, se pueden identificar aquellos TCR cuyas afinidades y/o semividas de unión dupliquen como mínimo las del TCR de referencia (y, por tanto, implícitamente dupliquen como mínimo la del TCR nativo).
Los heterodímeros de TCR se vuelven a replegar con el método que incluye la introducción de cisteínas en las regiones constantes para crear un puente disulfuro artificial entre las cadenas. De esa forma se preparan los TCR siguientes, a saber: (a) la cadena beta del TCR de referencia junto con cadenas alfa mutadas; (b) la cadena alfa del TCR de refe­ rencia junto con cadenas beta mutadas; y (c) combinaciones diversas de cadenas alfa y beta que incluyen dominios variables mutantes.
La interacción entre los TCR solubles de alta afinidad unidos por puentes disulfuro, y las variantes de estos TCR, con el complejo formado por el péptido nativo KIQEILTQV (SEQ ID N.° 1) y la molécula HLA se puede analizar con el método BIAcore.
Las variantes de los TCR provistas de alta avidez también se pueden seleccionar a partir de una biblioteca de CDR mutantes introducida en levaduras o en linfocitos T (Holler et al. 2003; Chervin et al. 2008). Las variantes de TCR que sean candidatas brindan de ese modo orientación acerca de las mutaciones inducidas que es preciso conseguir en las CDR de los TCR para obtener las variantes de TCR de gran avidez (Robbins et al. 2008; Zoete et al. 2007).
Ejemplo 3: Genomanipulación de linfocitos T autólogos
Los linfocitos T se pueden genomanipular para que expresen TCR de gran avidez (para las llamadas terapias con TCR) o receptores quiméricos de antígeno derivados de la fusión de proteínas (CAR) provistos de una especificidad de antígeno reforzada hacia el complejo MHC I/IGF2BP3-001 o el complejo MHC II/Ig F2b P3-001. En un aspecto, esta estrategia solventa algunas de las limitaciones que acarrean la tolerancia central y periférica, y genera linfocitos T que serán más eficientes a la hora de reconocer y atacar los tumores sin necesidad de la activación de novo de los linfocitos T en el paciente.
En un aspecto, con el fin de obtener linfocitos T que expresen los TCR de la presente descripción, los ácidos nucleicos codificantes de las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta identificadas y aisladas, como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2, se clonan en vectores de expresión, como retrovirus gamma o lentivirus. Se crean los virus recombinantes y se analiza su funcionalidad, como la especificidad antigénica y la avidez funcional. A continuación se toma una parte alícuota del producto final para transducir a la población destinataria de linfocitos T (generalmente purificada a partir de las PBMC del paciente), que se expande antes de administrarla vía infusión al paciente.
En otro aspecto, para obtener linfocitos T que expresen los TCR de la presente descripción, los ARN del TCR se sintetizan con técnicas conocidas en la materia, como por ejemplo, sistemas de transcripción in vitro. A continuación los ARN de TCR que han sido sintetizados in vitro se introducen mediante electroporación en linfocitos T CD8+ prima­ rios procedentes de donantes sanos para reexpresar las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor.
Para probar si los TCR exógenos se expresan funcionalmente en la superficie celular de los linfocitos T transformados, se usó una técnica de tinción por tetrámeros para detectar los linfocitos T que se unían a complejos MHC/IGF2BP3-001. Como se aprecia en la FIG. 5 y la Tabla 2, el porcentaje observado de linfocitos T específicos CD3-positivos fue mayor entre los linfocitos T CD8+ que expresaban el TCR revelados por la tinción fluorescente con tetrámeros de MHC/IGF2BP3-001 que con los tetrámeros de MHC/péptido no relacionado (p. ej., NYESO1-001) o en los controles no transformados, con valores del 6,78%, 1,53% y 1,73%, en ese mismo orden. A modo de control, se trasformaron linfocitos T CD8+ primarios con un TCR de control, el TCR 1G4, del que es sabido que se une específicamente al complejo MHC/NYESO1-001, el cual fue detectado sin dificultad con los tetrámeros MHC/NYESO1-001, con un por­ centaje del 17,69%. Estos resultados indican que el TCR R10P1A7 se expresa en la superficie de los linfocitos T y que se une específicamente al complejo MHC/IGF2BP3-001. Las cadenas alfa y beta del TCR 1G4 se exponen en las Se Q ID N.° 20 y la SEQ ID N.° 21, respectivamente.
Cadena alfa del 1G4 (SEQ ID N.° 20):
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAI-YNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCA-VRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCL-FTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPE-DTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
Cadena beta del 1G4 (SEQ ID N.° 21):
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMN-HEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLL-SAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVA-VFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPL-KEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDE-WTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
A fin de determinar la especificidad y la afinidad de los TCR, los linfocitos T CD8+ transformados se incubaron con­ juntamente con células diana cargadas con el IGF2BP3-001 o con células diana cargadas con el péptido homólogo pero no relacionado CLUA-001 (SEQ ID N.° 26), CHCHD6-001 (SEQ ID N.° 27), CDC42BPG-001 (SEQ ID N.° 28), PARP14-002 (SEQ ID N.° 29), SYNE2-001 (SEQ ID N.° 30), IFT7-001 (SEQ ID N.° 31), DHRS12-001 (SEQ ID N.° 32), STX12-001 (SEQ ID N.° 33), EEA-001 (SEQ ID N.° 34), SENP7-001 (SEQ ID N.° 35), o con el péptido de control NYESO1-001 (SEQ ID N.° 36), seguido por un ensayo de liberación de IFN-y. Como controles se utilizaron células diana no cargadas y linfocitos T CD8+ solos. La secreción de IFN-y por parte de los linfocitos T CD8+ indica la activa­ ción de los linfocitos T con actividad citotóxica.
Tabla 2
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Tal y como se aprecia en la FIG. 6, los linfocitos T CD8+ primarios sometidos a la electroporación para introducir el ARN codificante del TCR R10P1A7 de la presente descripción que fueron incubados conjuntamente con células diana cargadas con el IGF2BP3-00, segregaron niveles mucho mayores de IFN-y que los estimulados con las células diana cargadas con el péptido de control y que los linfocitos de control. El análisis de la titulación del péptido diana reveló una CE50 en torno a 1 nM (Tabla 2). Estos resultados sugieren que el TCR R10P1A7 de la presente invención puede estimular la actividad de los linfocitos T citotóxicos, como, por ejemplo, la secreción de IFN-y, mediante su interacción específica con el complejo de MHC/IGF2BP3-001.
Con el fin de determinar el motivo de unión del TCR R10P1A7 con el complejo de MHC/IGF2BP3-001, se llevó a cabo un análisis de barrido posicional con alanina en cada uno de los 9 aminoácidos que conforman el péptido IGF2BP3-001. La Tabla 3 muestra los péptidos IGF2BP3-001 con las correspondientes sustituciones por alanina.
Tabla 3
Figure imgf000024_0002
En resumen, los linfocitos T CD8+ transformados con el TCR R10P1A7 se incubaron conjuntamente con células diana cargadas con el IGF2BP3-001 y con los IGF2BP3-001-A1 a IGF2BP3-001-A9, o bien con el péptido de control NYESO1-001, para después ser sometidos al ensayo de liberación de IFN-y que se ha descrito antes.
Los resultados del análisis de barrido posicional con alanina sobre el TCR R10P1A7 se muestran en la FIG. 7 y se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000024_0003
El cribado del genoma entero en busca de péptidos que se unieran a A*02 provistos de un motivo idéntico no reveló ningún péptido con posible reactividad cruzada para el TCR R10P1A7. Tales resultados sugieren que el TCR descrito en la presente memoria exhibe un patrón de reconocimiento sumamente específico que comporta un riesgo reducido de efectos fuera de su diana.
Con el fin de determinar la eficacia de los linfocitos T que expresan los TCR descritos en la presente memoria, linfocitos T CD8+ que habían sido sometidos a electroporación para introducir en ellos el ARN del TCR R10P1A7 se incubaron conjuntamente con distintas estirpes de células cancerosas humanas, entre ellas la A-375 (estirpe celular de melanoma humano) y la T98G (estirpe celular de glioblastoma humano), ambas positivas para HLA-A2 y positivas para el IGF2BP3-001 (diana), así como con la SK-BR-3 (estirpe celular de cáncer de mama humano), que es negativa para el HLA-A2 y para el IGF2BP3-001, tras lo cual se los sometió al ensayo de liberación del IFN-y.
Como se observa en la FIG. 8, la secreción de IFN-y tuvo lugar tanto con las células A-375 como con las T98G, ambas positivas para el HLA-A2 y el IGF2BP3-001, pero no así con las células SK-BR-3, cuyos niveles basales de liberación de IFN-y resultaron comparables a los del control constituido por células efectoras solas. Estos resultados indican que los linfocitos T que expresan el TCR R10P1A7 pueden desplegar específicamente actividad citotóxica dirigida contra las células cancerosas por la interacción del HLA-A2 con el IGF2BP3-001.
La presente descripción proporciona diversos TCR que son útiles para el tratamiento de cánceres y tumores, prefe­ rentemente el melanoma y el glioblastoma que sobrepresentan o que presentan exclusivamente el IGF2BP3-001.
Ejemplo 5: Genomanipulación de linfocitos T alogénicos
Los linfocitos T gamma-delta (y§), que son linfocitos T efectores no convencionales implicados en la primera línea de defensa contra los patógenos, pueden interactuar con las células tumorales y erradicarlas sin el concurso del MHC a través de receptores activadores, entre otros, las cadenas gamma y delta del TCR. Estos linfocitos T y§ muestran un fenotipo preactivado que permite la rápida producción de citocinas (IFN-y y TNF-a) y una potente respuesta citotóxica tras la activación. Estos linfocitos T poseen actividad antitumoral contra muchos tipos de cáncer y sugieren que la inmunoterapia mediada por linfocitos T y§ es factible y puede propiciar respuestas objetivas del tumor (Braza et al.
2013) .
Los avances recientes con antígenos inmovilizados, anticuerpos monoclonales agonistas (AcM), células presentado­ ras de antígenos artificiales derivadas de tumor (aAPC), o combinaciones de AcM activadores y aAPC han logrado expandir con éxito linfocitos T gamma-delta con repertorios oligoclonales o policlonales de TCR. Por ejemplo, la pro­ teína A relacionada con la cadena del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo I (MICA) inmovilizada ha resultado ser un estímulo para linfocitos T que expresaban isotipos TCR81, y anticuerpos activadores fijados sobre placa han expandido a linfocitos V81 y V82 en condiciones ex vivo. Se han producido cantidades clínicamente suficientes de TCR81, TCR82 y TCR81negTCR82neg mediante el cultivo conjunto con aAPC, y estas subpoblaciones mostraron dife­ rencias en el fenotipo de memoria y en la reactividad hacia los tumores en condiciones in vitro e in vivo (Deniger et al.
2014) .
Asimismo, los linfocitos T y§ son susceptibles de ser modificados genéticamente, tal y como pone de manifiesto la introducción en ellos de cadenas alfa y beta de TCR (Hiasa et al. 2009). Otro aspecto de la presente descripción se refiere a la producción de linfocitos T y§ que expresan cadenas alfa y beta de TCR que se unen al IGF2BP3-001. Para ello, los linfocitos T y§ se expanden mediante los métodos descritos por Deniger et al. 2014 y después a dichos linfocitos expandidos se los somete a transducción mediante virus recombinantes para que expresen los TCR que se unen al IGF2BP3-001 (como se describe en el ejemplo 3). Por último, los linfocitos T y§ transducidos con el virus se le infunden al paciente.
Ejemplo 6: Constructos lentivíricos y análisis de la expresión
En breve, se fabricaron dos constructos de prueba («R10»). A continuación se usaron para producir suspensiones lentivíricas dotadas de una titulación y una productividad satisfactorias. Con las suspensiones lentivíricas se transdujeron linfocitos T primarios (de 2 donantes) y los que expresaron el TCR en su superficie fueron seleccionados me­ diante citometría de flujo con tinción con tetrámeros.
Tabla 5A: Constructos lentivíricos y control - donantes analizados (las filas de las tablas corresponden a los constructos).
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. TCR que comprende una cadena alfa y una cadena beta, cadena alfa que comprende un dominio variable alfa de TCR que comprende a su vez las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 2, y cadena beta que comprende un dominio variable beta de TCR que comprende a su vez las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 10, y donde el TCR se une específi­ camente a un complejo formado por el péptido IGF2BP3-001 con una molécula del MHC, en el cual el péptido IGF2BP3-001 consiste en la SEQ ID N.° 1 y el TCR se le une en las posiciones 1 y 3 a 7 de dicho péptido IGF2BP3-001.
2. El TCR de la reivindicación 1, en el cual la cadena alfa comprende un dominio variable alfa de TCR que es idéntico en al menos un 90% al dominio variable alfa de la SEQ ID N.° 2 y en el que la cadena alfa de TCR comprende la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la SEQ ID N.° 2, y en el cual la cadena beta comprende un dominio variable beta de TCR que es idéntico en al menos un 90% al dominio variable beta de TCR de la SEQ ID N.° 10 y en el que la cadena beta de TCR comprende la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la SEQ ID N.° 10.
3. El TCR de la reivindicación 1 o 2, que además comprende un dominio constante alfa de TCR y un dominio cons­ tante beta de TCR, en que el dominio constante alfa de TCR es idéntico al menos en un 70% al dominio constante alfa de TCR de la SEQ ID N.° 2, y el dominio constante beta es idéntico al menos en un 70% al dominio constante beta de TCR de la SEQ ID N.° 10.
4. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que el dominio constante alfa comprende el dominio trans­ membrana alfa VIGFRILLLKVAGFNLLMTL (SEQ ID N.° 18) y el dominio constante beta comprende el dominio trans­ membrana beta TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (SEQ ID N.° 19).
5. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que la cadena alfa y la cadena beta están fusionadas formando un TCR monocatenario.
6. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que la cadena alfa y/o beta comprende un marcador detectable.
7. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que la cadena alfa y/o beta está conjugada con un agente terapéuticamente activo.
8. TCR que comprende una cadena gamma y una cadena delta, cadena gamma que comprende las regiones deter­ minantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID N.° 2, y cadena delta que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la SEQ ID N.° 10, y este TCR se une específicamente a un complejo formado por el péptido IGF2BP3-001 con una molécula del MHC, péptido IGF2BP3-001 que consiste en la SEQ ID N.° 1 y al que el Tc R se le une en las posiciones 1 y 3 a 7 de dicho péptido IGF2BP3-001.
9. Ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la cadena alfa y la cadena beta del TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la cadena gamma y la cadena delta del TCR de la reivindicación 8.
10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 enlazado funcionalmente con al menos una secuencia promotora.
11. Célula hospedadora transformada con el vector de expresión de la reivindicación 10.
12. La célula hospedadora de la reivindicación 11 que es un linfocito T o una progenitora de linfocito T.
13. Composición farmacéutica que comprende el TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un ácido nucleico de la reivindicación 9, un vector de expresión de la reivindicación 10, y/o una célula hospedadora de las reivindicacio­ nes 11 o 12; así como un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, excipientes y/o estabilizantes far­ macéuticamente aceptables.
14. El TCR acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un ácido nucleico acorde con la reivindicación 9, o un vector acorde con la reivindicación 10, o una célula hospedadora acorde con la reivindicación 11 o 12, o la composición farmacéutica acorde con la reivindicación 13, para el uso como medicamento.
15. El TCR acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un ácido nucleico acorde con la reivindicación 9, o un vector acorde con la reivindicación 10, o una célula hospedadora acorde con la reivindicación 11 o 12, o la compo­ sición farmacéutica acorde con la reivindicación 13, para el uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
16. Método para producir un TCR que se una específicamente al péptido de la SEQ ID N.° 1 cuando sea presentado por una molécula del MHC, método que comprende el cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 11 o 12 en las condiciones adecuadas para promover la expresión del TCR.
17. Método para detectar el cáncer en una muestra biológica, el cual comprende:
a) Puesta en contacto de la muestra biológica con el TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y b) Detección de la unión del TCR a la muestra biológica.
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