ES2745472T3

ES2745472T3 - Receptores de células T anti-virus del papiloma humano 16 E6

Info

Publication number: ES2745472T3
Application number: ES14748353T
Authority: ES
Inventors: Christian S Hinrichs; Steven A Rosenberg
Original assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Current assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2014-07-14
Publication date: 2020-03-02
Anticipated expiration: 2034-07-14
Also published as: US9822162B2; JP2016527230A; WO2015009606A1; JP7223822B2; AU2014290288B2; US10329339B2; CN105452288B; EP3022223A1; US20160152681A1; JP6959970B2; CA2918216C; CN110511960B; CA2918216A1; US20210130433A1; CN105452288A; US20230340066A1; JP2020054359A; US20190309043A1; US10913785B2; CN110511960A

Abstract

Receptor de células T (TCR) que tiene especificidad antigénica por virus del papiloma humano (VPH) 16 E6 y que comprende una región variable humana y una región constante murina, en el que el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8, y opcionalmente en el que: (i) el TCR tiene especificidad antigénica por VPH 16 E629-38 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (ii) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y 16; (iii) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18; y/o (iv) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de células T anti-virus del papiloma humano 16 E6

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de acuerdo con los números de proyecto ZIABC011477 y BC010984-5 por parte de los Institutos nacionales de salud, Instituto nacional del cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos con respecto a la invención.

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente estadounidense provisional n.° 61/846.167, presentada el 15 de julio de 2013.

Incorporación por referencia de material presentado por vía electrónica

En el presente documento se incorpora por referencia en su totalidad una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentada de manera simultánea con el presente documento e identificada de la siguiente manera: un archivo de 45.955 bytes de ASCII (texto) llamado “716827ST25.TXT”, con fecha del 27 de mayo de 2014.

Antecedentes de la invención

La causa primaria de algunos tipos de cáncer tales como, por ejemplo, cáncer de cuello uterino, es la infección por virus del papiloma humano (VPH). A pesar de los avances en tratamientos tales como quimioterapia, el pronóstico para muchos cánceres, incluyendo cánceres asociados con VPH, puede ser malo. Por consiguiente, existe una necesidad no resuelta de tratamientos adicionales para el cáncer, particularmente cánceres asociados con VPH.

Breve sumario de la invención

Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene especificidad antigénica por virus del papiloma humano (VPH) 16 E6 y que comprende una región variable humana y una región constante murina, en el que el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 3-8.

Otra realización de la invención proporciona un TCR aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por VPH 16 E6 y que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.

La invención proporciona además polipéptidos y proteínas relacionados, así como ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinante, células huésped y poblaciones de células. La invención proporciona además anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la invención.

La invención proporciona además métodos de detección de la presencia de un estado en un mamífero, en los que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH. El método de la invención de detección de la presencia de un estado en un mamífero comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del estado con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped, anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento, formando así un complejo, y (ii) detectar el complejo, en el que detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH.

En otra realización de la invención, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped, anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento son para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado en un mamífero, en los que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

La figura 1 es un gráfico de barras que muestra la expresión de VPH 16 E6 (barras blancas), VPH 16 E7 (barras sombreadas sin rayas), VPH 18 E6 (barras no sombreadas con rayas) o VPH 18 E7 (barras sombreadas con rayas) con respecto a la expresión de gliceraldehído 3-fosato deshidrogenasa (GAPDH) por células CaSki, células HeLa, células 624 o células de tumor 3809.

Las figuras 2A y 2B son gráficos de barras que muestran interferón-gamma (IFN-y) (pg/ml) secretado por linfocitos de infiltración tumoral (TIL) a partir de fragmentos (F) 2-14 de tumor 3809 (A), fragmentos 15-24 (B) de tumor 3809, o TIL de melanoma tras el cultivo conjunto con células dendríticas autólogas (DC) que se habían pulsado con VPH 16 E6 solo (barras blancas), VPH 16 E6 en combinación con anticuerpo anti-clase I (barras sombreadas sin rayas), VPH 16 E7 solo (barras no sombreadas con rayas), VPH 16 e7 en combinación con anticuerpo anti-clase I (barras sombreadas con rayas), gp100 (barras negras) u OKT3 (barras con líneas horizontales).

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por números expandidos de TIL seleccionados mediante 4-1BB de 3809 tras el cultivo conjunto con células 293-A2 (células HEK-293 con expresión estable de HLA-A2) transfectadas con proteína verde fluorescente (GFP), células 293-A2 transfectadas con VPH 16 E6, línea celular linfoblastoide (LCL) 3809 (células B que se han transformado usando virus de Epstein-Barr) cultivadas sin péptido, LCL 3809 cultivada conjuntamente con una combinación de péptidos de VPH 16 E6, u OKT3.

La figura 4A es un gráfico de barras que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por linfocitos de sangre periférica (PBL) que no se transdujeron (sin transducir) (barras sin sombrear) o transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica para SEQ ID NO: 17 y 18 (TCR de E6; barras sombreadas) tras el cultivo conjunto con células 293-A2 diana pulsadas con Péptido de VPH 16 E6^29-38, células 293-A2 pulsadas con péptido de VPH 16 E7^11-19, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para GFP, células 293 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células de cáncer de cuello uterino de VPH-18, células de control de melanoma, células de control de colangio, células 624 o células SiHa. La expresión de HLA-A2 y VPH-16 por cada célula diana se indica en la parte inferior de la figura 4A (“+” indica positivo para la expresión y “-” indica negativo para la expresión).

La figura 4B es un gráfico de barras que muestra IFN-^y(pg/ml) secretado por PBL transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica para SEQ ID NO: 17 y 18 tras el cultivo conjunto con células 293-A2 diana transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 293 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células SCC90, células CaSki, células 624, DMF/células 624 o células 4.7.20 pulsadas con péptidos de VPH 16 E7 sin anticuerpo (barras negras), con anticuerpo anti-MHC de clase I (barras grises), o anticuerpo anti-MHC de clase II (barras sin sombrear).

La figura 5 es un gráfico de barras que muestra IFN-^y(pg/ml) secretado por PBL positivos para CD8 sin transducir (barras sin sombrear sin rayas), PBL positivos para CD4 sin transducir (barras sin sombrear con rayas cruzadas) o PBL (positivos para CD8 (TCR de E6; barras sombreadas sin rayas) o positivos para CD4 (TCR de E6; barras sombreadas con rayas cruzadas)) que se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codificaba para SEQ ID NO: 17 y 18 tras el cultivo conjunto con células 293-A2 diana pulsadas con péptido de VPH 16 E6^29-38, células 293-A2 pulsadas con péptido de VPH 16 E7^11-19, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para GFP, células 293-A2, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E7, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células de cáncer de cuello uterino de VPH, células de control de melanoma, células 624 o células SiHa.

La figura 6A es un gráfico de barras que muestra IFN-^y(pg/ml) secretado por PBL positivos para CD8 sin transducir (UT) (barras sin sombrear) o PBL positivos para CD8 transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica para SEQ ID NO: 17 y 18 (barras sombreadas) tras el cultivo conjunto con células T2 diana pulsadas con concentraciones variables de péptido E6^29-38(-log M).

La figura 6B es un gráfico de barras que muestra IFN-^y(pg/ml) secretado por PBL positivos para CD4 sin transducir (barras sin sombrear) o PBL positivos para CD4 transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica para SEQ ID NO: 17 y 18 (TCR de E6; barras sombreadas) tras el cultivo conjunto con células T2 diana pulsadas con concentraciones variables de péptido E6^29-38(-log M).

Descripción detallada de la invención

Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene especificidad antigénica por virus del papiloma humano (VPH) 16 E6 y que comprende una región variable humana y una región constante murina, en el que el TCR de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 8. En una realización de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica por VPH 16 E6^29-38.

El VPH 16 es el subtipo de VPH que está más habitualmente asociado con estados malignos. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que VPH 16 provoca cáncer al menos parcialmente mediante las acciones de la oncoproteína E6, que desregula el control del ciclo celular. VPH 16 E6 se expresa de manera constitutiva en células cancerosas y no se expresa por tejidos humanos normales sin infectar. VPH 16 E6 se expresa en una variedad de cánceres humanos incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, canal anal, anorrecto, vagina, vulva y pene.

El TCR puede tener especificidad antigénica por cualquier proteína, polipéptido o péptido de VPH 16 E6. En una realización de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica por una proteína de VPH 16 E6 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica por un péptido de VPH 16 E6^29-38que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, la secuencia de aminoácidos de TIHDIILECV (SEQ ID NO: 2).

En una realización de la invención, los TCR de la invención pueden reconocer VPH 16 E6 de una manera dependiente de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. “Manera dependiente de MHC de clase I”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR provoca una respuesta inmunitaria tras unirse a VPH 16 E6 dentro del contexto de una molécula de MHC de clase I. La molécula de MHC de clase I puede ser cualquier molécula de MHC de clase I conocida en la técnica, por ejemplo, moléculas de HLA-A. En una realización preferida de la invención, la molécula de MHC de clase I es una molécula de HLA-A2.

Los TCR de la invención proporcionan muchas ventajas, incluyendo cuando se expresan por células usadas para transferencia de células adoptivas. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que dado que VPH 16 E6 se expresa por células infectadas por VPH 16 de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención proporcionan ventajosamente la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cáncer asociado con VPH 16 y, por consiguiente, tratar o prevenir múltiples tipos de cáncer asociado con VPH 16. Adicionalmente, sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que dado que la proteína de VPH 16 E6 se expresa únicamente en células cancerosas, células infectadas por VPH 16 o células de estado premaligno positivo para VPH, los TCR de la invención seleccionan ventajosamente como diana la destrucción de células cancerosas, células infectadas por VPH 16 o células de estado premaligno positivo para VPH, al tiempo que minimizan o eliminan la destrucción de células normales, no cancerosas, no infectadas por VPH y no premalignas positivas para VPH, reduciendo así, por ejemplo, minimizando o eliminando, la toxicidad. Además, los TCR de la invención pueden tratar o prevenir, ventajosamente, de manera satisfactoria, cánceres positivos para VPH que no responden a otros tipos de tratamiento tales como, por ejemplo, quimioterapia sola, cirugía o radiación. Adicionalmente, los tCr de la invención proporcionan un reconocimiento altamente ávido de VPH 16 E6, lo que puede proporcionar, ventajosamente, la capacidad de reconocer células tumorales no manipuladas (por ejemplo, células tumorales que no se han tratado con interferón-gamma, transfectado con un vector que codifica para uno o ambos de VPH 16 E6 y HLA-A2, pulsado con el péptido E6^29-38, o una combinación de los mismos).

La frase “especificidad antigénica”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR puede unirse específicamente a, y reconocer de manera inmunológica, VPH 16 E6 con alta avidez. Por ejemplo, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por VPH 16 E6 si células T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 5.000 pg/ml o más, 7.000 pg/ml o más, 10.000 pg/ml o más, o 20.000 pg/ml o más) de interferón gamma (IFN-^y) tras el cultivo conjunto con células diana HLA-A2+ negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido de VPH 16 E6 (por ejemplo, de aproximadamente 0,05 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, 0,05 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml o 5 ng/ml). Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene “especificidad antigénica” por VPH 16 E6 si células T que expresan el TCR secretan al menos el doble de IFN-^yque el nivel de referencia de linfocitos de sangre periférica (PBL) sin transducir de IFN-y tras el cultivo conjunto con células diana HLA-A2+ negativas para antígeno pulsadas con una baja concentración de péptido de VPH 16 E6. Las células que expresan los TCR de la invención también pueden secretar IFN-y tras el cultivo conjunto con células diana HLA-A2+ negativas para antígeno pulsadas con concentraciones superiores de péptido de VPH 16 E6.

La divulgación proporciona un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas de polipéptido), tales como una cadena alfa (a) de un TCR, una cadena beta (p) de un TCR, una cadena gamma (y) de un TCR, una cadena delta (6) de un TCR, o una combinación de las mismas. Los polipéptidos del TCR pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR tenga especificidad antigénica por VPH 16 E6.

El TCR comprende dos cadenas de polipéptido, cada una de las cuales comprende una región variable humana que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. El TCR comprende una primera cadena de polipéptido que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR2 de cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), y una segunda cadena de polipéptido que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p), una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p).

En una realización de la invención, el TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. El TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a), SEQ ID NO: 10 (la región variable de una cadena p), o ambas de SEQ ID NO: 9 y 10. Preferiblemente, el TCR de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 y 10.

Los TCR pueden comprender además una región constante derivada a partir de cualquier especie adecuada tal como, por ejemplo, ser humano o ratón. Con respecto a esto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena a murina), SEQ ID NO: 16 (la región constante de una cadena p murina), o ambas de SEQ ID NO: 15 y 16.

El TCR quimérico puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. Con respecto a esto, el TCR puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) y SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena a murina), una cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 10 (la región variable de una cadena p humana) y SEQ ID NO: 16 (la región constante de una cadena p murina), o la totalidad de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-10 y 15-16.

Tal como se usa en el presente documento, el término “murino” o “humano”, cuando se refieren a un TCR o a cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (por ejemplo, región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o cadena beta), significan un TCR (o componente del mismo) que se deriva de un ratón o un ser humano, respectivamente, es decir, un TCR (o componente del mismo) que se originó a partir de o se expresó, en un momento, por una célula T de ratón o una célula T humana, respectivamente.

El TCR quimérico puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada una de la cadena a y la cadena p del TCR quimérico pueden comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, la cadena a comprende la región variable humana de una cadena a y la región constante murina de una cadena a tal como se expuso anteriormente. Con respecto a esto, el TCR quimérico puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Una cadena a de este tipo puede aparearse con cualquier cadena p de un TCR. Preferiblemente, la cadena p del TCR quimérico comprende la región variable humana de una cadena p y la región constante murina de una cadena p tal como se expuso anteriormente. Con respecto a esto, el TCR quimérico puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. El TCR quimérico puede comprender, por tanto, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, o ambas de ^sE^qID NO: 17 y 18. Preferiblemente, el TCR quimérico de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 17 y 18.

En una realización de la invención, el TCR es un TCR humano. El TCR humano comprende cualquiera de las regiones CDR tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Con respecto a esto, una realización de la invención proporciona un TCR aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por VPH 16 E6 y que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8. El TCR humano puede comprender cualquiera de las regiones variables descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.

Los TCR humanos de la invención comprenden además una región constante humana. Con respecto a esto, el TCR humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (la región constante de una cadena a humana), SEQ I^dNO: 14 (la región constante de una cadena p humana), o ambas de SEQ ID NO: 13 y 14.

El TCR humano puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. Con respecto a esto, el TCR puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) y SEQ ID NO: 13 (la región constante de una cadena a humana), una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 10 (la región variable de una cadena p humana) y SEQ ID NO: 14 (la región constante de una cadena p humana), o la totalidad de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-10 y 13-14.

El TCR humano puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada una de la cadena a y la cadena p del TCR humano puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, la cadena a comprende la región variable humana de una cadena a y la región constante humana de una cadena a tal como se expuso anteriormente. Con respecto a esto, el TCR humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Una cadena a de este tipo puede aparearse con cualquier cadena p de un TCR. Preferiblemente, la cadena p del TCR humano comprende la región variable humana de una cadena p y la región constante humana de una cadena p tal como se expuso anteriormente. Con respecto a esto, el TCR humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El TCR humano puede comprender, por tanto, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o ambas de SEQ ID NO: 11 y 12. Preferiblemente, el TCR humano de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 11 y 12.

La invención también proporciona un polipéptido que comprende una parte funcional del TCR de la invención, en el que la parte funcional se une específicamente a VPH 16 E6 y comprende la secuencia de aminoácidos de S^eQ ID NO: 3-8, SEQ ID NO: 9 y 10, o SEQ ID NO: 11 y 12. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento incluye oligopéptidos y se refiere a una cadena individual de aminoácidos conectados mediante uno o más enlaces peptídicos.

Una parte funcional puede ser cualquier parte que comprende aminoácidos contiguos del TCR (o variante funcional del mismo) del que forma parte, siempre que la parte funcional se una específicamente a VPH 16 E6. El término “parte funcional” cuando se usa en referencia a un TCR (o variante funcional del mismo) se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR (o variante funcional del mismo), parte o fragmento que conserva la actividad biológica del TCR (o variante funcional del mismo) del que forma parte (el TCR original o variante funcional original del mismo). Las partes funcionales abarcan, por ejemplo, las partes de un TCR (o variante funcional del mismo) que conservan la capacidad de unirse específicamente a VPH 16 E6 (por ejemplo, de una manera dependiente de HLA-A2), o detectar, tratar o prevenir cáncer, hasta un grado similar, el mismo grado o hasta un grado superior, al TCR original (o variante funcional del mismo). En referencia al TCR original (o variante funcional del mismo), la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10%, el 25%, el 30%, el 50%, el 68%, el 80%, el 90%, el 95%, o más, del TCR original (o variante funcional del mismo). La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo-terminal de la parte, o en ambos extremos terminales, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original o variante funcional del mismo. De manera deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, unirse específicamente a VPH 16 E6; y/o tener la capacidad de detectar cáncer, tratar o prevenir cáncer, etc. De manera más deseable, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original o variante funcional del mismo.

El polipéptido puede comprender una parte funcional de cualquiera o ambas de las cadenas a y p de los TCR o variante funcional de los mismos, tal como una parte funcional que comprende una o más de CDR1, CDR2 y CDR3 de la(s) región/regiones variable(s) de la cadena a y/o la cadena p de un TCR o variante funcional del mismo. En una realización de la invención, el polipéptido comprende una parte funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), y 8 (CDR3 de cadena p).

El polipéptido puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR o variante funcional del mismo que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. Con respecto a esto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a), y SEQ ID NO: 10 (la región variable de una cadena p).

El polipéptido puede comprender además una región constante derivada a partir de cualquier especie adecuada tal como, por ejemplo, ser humano o ratón. Con respecto a esto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 14 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena a murina), SEQ ID NO: 16 (la región constante de una cadena p murina), ambas de SEQ ID NO: 13 y 14, o ambas de SEQ ID NO: 15 y 16. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 13 y 14 o ambas de SEQ ID NO: 15 y 16.

El polipéptido puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. Con respecto a esto, el polipéptido puede comprender las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 y 15, ambas de SEQ ID NO: 9 y 13, ambas de SEQ ID NO: 10 y 16, ambas de SEQ ID NO: 10 y 14, la totalidad de SEQ ID NO: 9-10 y 15-16, o la totalidad de SEQ ID NO: 9-10 y 13-14.

El polipéptido puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de uno de los TCR o variante funcional de los mismos descritos en el presente documento. Alternativamente, el polipéptido puede comprender las cadenas a y p de los TCR de la invención o variantes funcionales de los mismos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 11 y 12 o ambas de SEQ ID NO: 17 y 18. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 11 y 12 o ambas de SEQ ID NO: 17 y 18.

La divulgación proporciona además una proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por “proteína” quiere decirse una molécula que comprende una o más cadenas de polipéptido.

En una realización, la proteína de la invención comprende una primera cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8. Alternativa o adicionalmente, la proteína de la invención comprende una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La proteína puede comprender, por ejemplo, una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 y 13 o ambas de SEQ ID NO: 9 y 15, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 10 y 14 o ambas de SEQ ID NO: 10 y 16. La proteína puede comprender, por ejemplo, una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ó 17, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ó 18. En este caso, la proteína puede ser un TCR. Alternativamente, si, por ejemplo, la proteína comprende una única cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12 o SEQ ID NO: 17 y 18, o si las cadenas de polipéptido primera y/o segunda de la proteína comprenden además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica para una inmunoglobulina o una parte de la misma, entonces la proteína de la invención puede ser una proteína de fusión. Con respecto a esto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar para cualquier molécula peptídica o proteica, o una parte de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula de MHC, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido de la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido de la invención y/o del otro polipéptido. En la técnica se conocen métodos adecuados de preparación de proteínas de fusión, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Choi et al., Mol. Biotechnol. 31: 193-202 (2005).

En algunas realizaciones de la invención, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden expresarse como una única proteína que comprende un péptido ligador que une la cadena a y la cadena p. Con respecto a esto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12 o SEQ ID NO: 17 y 18 pueden comprender además un péptido ligador. El péptido ligador puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR recombinante (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales del mismo), polipéptido y/o proteína en una célula huésped. El péptido ligador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Por ejemplo, el péptido ligador puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Tras la expresión del constructo que incluye el péptido ligador por una célula huésped, el péptido ligador puede escindirse, dando como resultado cadenas a y p separadas.

La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo recombinante” se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, modificada por ingeniería genética) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena de polipéptido de un anticuerpo, o una parte del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2' de un anticuerpo, etc. La cadena de polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede existir como polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena de polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede existir como polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento.

Se incluyen variantes funcionales de los TCR de la invención descritos en el presente documento. El término “variante funcional” tal como se usa en el presente documento se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con respecto a un TCR, polipéptido o proteína original, variante funcional que conserva la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína del que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, las variantes del TCR, polipéptido o proteína descrito en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína original) que conservan la capacidad de unirse específicamente a VPH 16 E6 por el que el TCR original tiene especificidad antigénica o al que se une específicamente el polipéptido o proteína original, hasta un grado similar, el mismo grado o hasta un grado superior, al TCR, polipéptido o proteína original. Haciendo referencia al TCR, polipéptido o proteína original, la variante funcional puede ser idéntica, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 30%, el 50%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, al TCR, polipéptido o proteína original.

La variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución de aminoácido conservativa. En la técnica se conocen sustituciones de aminoácido conservativas, e incluyen sustituciones de aminoácido en las que se intercambia un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido conservativa puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución de aminoácido no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácido no conservativa no interfiera con, o inhiba, la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido no conservativa potencia la actividad biológica de la variante funcional, de tal manera que se aumenta la actividad biológica de la variante funcional en comparación con el TCR, polipéptido o proteína original.

El TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de tal manera que otros componentes del TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian sustancialmente la actividad biológica del TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína. Con respecto a esto, el TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína puede consistir, por ejemplo, esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12, 17 ó 18, ambas de SEQ ID NO: 11 y 12, ambas de SEQ ID NO: 17 y 18, ambas de SEQ ID NO: 11 y 18, o ambas de SEQ ID NO: 17 y 12. Además, por ejemplo, los TCR (incluyendo variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas pueden consistir esencialmente en la(s) secuencia(s) de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, o ambas de SEQ ID NO: 9 y 10. Además, los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ⁿO: 3 ( C^dR1 de cadena a), SEQ ID NO: 4 (CDR2 de cadena a), SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p), SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), y SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p).

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a VPH 16 E6; detectar cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH en un mamífero; o tratar o prevenir cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud en el intervalo de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como una longitud de 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos. Con respecto a esto, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que se producen de manera natural. Tales aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano-carboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano-carboxílico, ácido a-aminociclohexano-carboxílico, ácido aaminocicloheptano-carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse, por ejemplo, mediante un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

El TCR, polipéptido y/o proteína de la invención puede obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Se describen métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y patente estadounidense n.° 5.449.752. Además, pueden producirse polipéptidos y proteínas de manera recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véanse, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden aislarse y/o purificarse a partir de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. En la técnica se conocen bien métodos de aislamiento y purificación. Alternativamente, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento (incluyendo variantes funcionales de los mismos) pueden sintetizarse de manera comercial por empresas, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). Con respecto a esto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

Se incluyen conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, de la invención. En la técnica se conocen conjugados, así como métodos de síntesis de conjugados en general (véanse, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).

Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención. Por “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se incluye “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “molécula de ácido nucleico”, y significa de manera general un polímero de ADN o ARN, que puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, sintetizarse u obtenerse (por ejemplo, aislarse y/o purificarse) a partir de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace entre nucleótidos natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido sin modificar. En una realización, el ácido nucleico comprende ADN complementario (ADNc). Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, en algunos casos puede ser adecuado, tal como se comenta en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en el punto (i) anterior. Para los fines en el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Green y Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4- acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina sustituida en N6, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5- metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, pueden adquirirse uno o más de los ácidos nucleicos de la invención a partir de empresas, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas o variantes funcionales de los mismos descritos en el presente documento. La secuencia de nucleótidos puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la totalidad de SEQ ID NO: 31-36 (que codifican para CDR1a, CDR2a, CDR3a, CDR1p, CDR2p, CDR3p, respectivamente); la totalidad de SEQ ID NO: 31-33; la totalidad de SEQ ID NO: 34-36; ambas de SEQ ID NO: 19-20 (que codifican para regiones variables de cadenas a y p, respectivamente); ambas de SEQ ID NO: 23-24 (que codifican para región constante humana de cadenas a y p, respectivamente); ambas de SEQ ID NO: 25-26 (que codifican para región constante murina de cadenas a y p, respectivamente), la totalidad de SEQ ID NO: 19-20 y 23-24, la totalidad de SEQ ID NO: 19-20 y 25-26, ambas de SEQ ID NO: 21-22 (que codifican para cadenas a y p humanas, respectivamente), o ambas de SEQ ID NO: 27-28 (que codifican para cadenas a y p quiméricas, respectivamente). La secuencia de nucleótidos puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, una cualquiera de SEQ ID NO: 19-28 y 31-36.

En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos no natural. Puede considerarse que una secuencia de nucleótidos es “no natural” si la secuencia de nucleótidos no se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede estar optimizada en cuanto a codones. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización en cuanto a codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización en cuanto a codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar sustituir un codón nativo por otro codón que codifica para el mismo aminoácido, pero puede traducirse por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando por tanto la eficiencia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirán con la traducción, aumentando por tanto la eficiencia de traducción. La secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a codones puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, SEQ ID NO: 38 (región variable de cadena a), SEQ ID NO: 39 (región variable de cadena p), o SEQ ID NO: 38 y 39.

También se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por “condiciones de alta rigurosidad” quiere decirse que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es más fuerte de manera detectable que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirán un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que sólo contiene unos pocos apareamientos erróneos dispersados, de una secuencia aleatoria que resultó tener unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, de 3-10 bases) que se apareaban con la secuencia de nucleótidos. Tales regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad hace que puedan distinguirse fácilmente. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirán, por ejemplo, condiciones de bajo contenido en sal y/o alta temperatura, tal como se proporciona mediante NaCl a aproximadamente 0,02-0,1 M o equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si es que toleran algo, de apareamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y la cadena diana o molde, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. Generalmente se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

También se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 70% o más, por ejemplo, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, o aproximadamente el 99%, a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. Con respecto a esto, la invención proporciona vectores de expresión recombinante que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena a, la cadena p y péptido ligador. Por ejemplo, en una realización, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a codones que comprende SEQ ID NO: 29 (que codifica para cadenas a y p quiméricas de SEQ ID NO: 17 y 18 con un ligador posicionado entre las mismas).

Para los fines en el presente documento, el término “vector de expresión recombinante” significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido mediante una célula huésped, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para hacer que se exprese el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. En su conjunto, los vectores de la invención no se producen de manera natural. Sin embargo, partes de los vectores pueden producirse de manera natural. Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, sintetizarse u obtenerse en parte a partir de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinante pueden comprender enlaces entre nucleótidos que se producen de manera natural, que no se producen de manera natural o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces entre nucleótidos que no se producen de manera natural o alterados no dificultan la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie de pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden usarse vectores de bacteriófagos, tales como AGT10, áGt 11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. En una realización especialmente preferida, el vector de expresión recombinante es un vector de MSGV1. En una realización, un vector de MSGV1 que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a codones que codifica para un TCR quimérico que comprende SEQ ID NO: 17 y 18 de la invención comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30.

Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante convencionales descritas, por ejemplo, en Green y Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Pueden prepararse constructos de vectores de expresión, que son circulares o lineales, para contener un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Pueden derivarse sistemas de replicación, por ejemplo, a partir de ColEl, plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.

De manera deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas para el tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en la que va a introducirse el vector, según sea apropiado y teniendo en consideración si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células huésped transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en una célula huésped auxotrófica para proporcionar prototrofía, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo variantes funcionales de los mismos), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a, o que se hibrida con, la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo variantes funcionales de los mismos). La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos del desarrollo, se encuentra dentro de las habilidades habituales del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de VSR, y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murino.

Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse para expresión transitoria, para expresión estable, o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinante pueden realizarse para expresión constitutiva o para expresión inducible. Además, los vectores de expresión recombinante pueden realizarse para incluir un gene suicida.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gene suicida” se refiere a un gen que hace que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad frente a un agente, por ejemplo, un fármaco, en la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando se pone la célula en contacto con el, o se expone al, agente. En la técnica se conocen genes suicida (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, R.U.), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), citosina daminasa, purina nucleósido fosforilasa, y nitrorreductasa.

Otra realización de la invención proporciona además una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante de la invención descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, de planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente a partir de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula en suspensión, es decir, una célula que crece en suspensión. En la técnica se conocen células huésped adecuadas e incluyen, por ejemplo, células E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293, y similares. Para los fines de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los fines de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula huésped es una célula humana. La célula huésped es preferiblemente un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Más preferiblemente, la célula huésped es una célula T.

Para los fines en el presente documento, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T a partir de una línea de células T cultivada, por ejemplo, Jurkat, SupT1, etc., o una célula T obtenida a partir de un mamífero. Si se obtiene a partir de un mamífero, la célula T puede obtenerse a partir de numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o líquidos. Las células T también pueden enriquecerse o purificarse. Preferiblemente, la célula T es una célula T humana. Más preferiblemente, la célula T es una célula T aislada a partir de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, células T doble positivas CD4+/CD8+ , células T cooperadoras CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD4+, células T CD8+ (por ejemplo, células T citotóxicas), linfocitos de infiltración tumoral (TIL), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria centrales y células T de memoria efectoras), células T vírgenes, y similares.

La invención también proporciona una población de células que comprende al menos una célula huésped de la invención descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped (por ejemplo, que consiste esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población de células clonal, en la que todas las células de la población son clones de una única célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante, de tal manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento.

En una realización de la invención, los números de células en la población pueden expandirse rápidamente. La expansión de los números de células T puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos tal como se conoce en la técnica tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.034.334; patente estadounidense 8.383.099; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother., 26:332-42 (2003); y Riddell et al., J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990).

La invención proporciona además un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una parte funcional de cualquiera de los TCR de la invención descritos en el presente documento. La parte funcional se une específicamente al antígeno de cáncer, comprendiendo la parte funcional la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), y 8 (CDR3 de cadena p). En una realización preferida, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo que está formado por las 6 CDR (CDR1-3 de la cadena alfa y CDR1-3 de la cadena beta). El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que se conoce en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que se produce de manera natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado a partir de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado por ingeniería genética, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Además, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la parte funcional del TCR de la invención. De manera deseable, el anticuerpo es específico para la parte funcional del TCR de la invención, de tal manera que hay reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas.

En la técnica se conocen métodos de someter a prueba anticuerpos para detectar la capacidad de unirse a cualquier parte funcional o variante funcional del t Cr de la invención e incluyen cualquier ensayo de unión de anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición de competencia (véanse, por ejemplo, Janeway et al., citado a continuación, y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0197266 A1).

En la técnica se conocen métodos adecuados de producir anticuerpos. Por ejemplo, se describen métodos de hibridoma convencionales, por ejemplo, en Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8a ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2011)). Alternativamente, en la técnica se conocen otros métodos, tales como métodos de hibridoma de VEB (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y sistemas de expresión en vector de bacteriófago (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Además, se describen métodos de producción de anticuerpos en animales no humanos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0197266 A1.

Además puede usarse presentación en fago para generar el anticuerpo de la invención. Con respecto a esto, pueden generarse bibliotecas de fagos que codifican para dominios variables (V) de unión a antígeno de anticuerpos usando técnicas convencionales de biología molecular y ADN recombinante (véase, por ejemplo, Green and Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2012)). Se seleccionan fagos que codifican para una región variable con la especificidad deseada para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Se introducen secuencias de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo reconstituido en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma usada para la producción de hibridoma, de tal manera que la célula secreta anticuerpos que tienen las características de anticuerpos monoclonales (véanse, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente, Huse et al., citado anteriormente, y patente estadounidense 6.265.150).

Pueden producirse anticuerpos mediante ratones transgénicos que son transgénicos para genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera específicos. Tales métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.545.806 y 5.569.825, y Janeway et al., citado anteriormente. En la técnica se conocen bien métodos para generar anticuerpos humanizados y se describen en detalle, por ejemplo, en Janeway et al., citado anteriormente, patentes estadounidenses 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, patente europea n.° 0239400 B1, y patente del Reino Unido n.° 2188638. También pueden generarse anticuerpos humanizados usando la tecnología de renovación de anticuerpos descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

La divulgación también proporciona partes de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. La parte de unión a antígeno puede ser cualquier parte que tiene al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab')², dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

Un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable de cadena sencilla (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unido a un dominio V de una cadena ligera de anticuerpo a través de un péptido sintético, puede generarse usando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente). De manera similar, pueden prepararse fragmentos de región variable estabilizados por disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Sin embargo, los fragmentos de anticuerpo no se limitan a estos tipos de fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo.

Además, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, puede modificarse para comprender una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

Los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas), y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos) de la invención, pueden aislarse y/o purificarse. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento significa que se ha retirado de su entorno natural. El término “purificado” tal como se usa en el presente documento significa que se ha aumentado su pureza, en el que “pureza” es un término relativo, y que no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente el 50%, puede ser de más del 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, o puede ser del 100%. Los TCR, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas), y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos), polipéptidos de la invención, todos los cuales se denominan de manera colectiva “materiales de TCR de la invención” a continuación en el presente documento, pueden formularse para dar una composición, tal como una composición farmacéutica. Con respecto a esto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, partes funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas), y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos) descritos en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otro(s) fármaco(s) o agente(s) farmacéuticamente activo(s), tal como un agente quimioterápico, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el material de TCR de la invención particular en consideración. Tales portadores farmacéuticamente aceptables los conocen bien los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del portador estará determinada en parte por el material de TCR de la invención particular, así como por el método particular usado para administrar el material de TCR de la invención. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o interperitoneal. Puede usarse más de una vía para administrar los materiales de TCR de la invención, y en determinados casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

Preferiblemente, el material de TCR de la invención se administra mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el material de TCR de la invención es una célula huésped que expresa el TCR de la invención, el portador farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente el 0,90% p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), disolución de electrolito NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), dextrosa a aproximadamente el 5% en agua, o lactato de Ringer. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable está complementado con albúmina de suero humana.

La cantidad o dosis (por ejemplo, números de células cuando el material de TCR de la invención es una o más células) del material de ^tC^rde la invención administrado debe ser suficiente para provocar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal a lo largo de un intervalo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe ser suficiente para unirse a un antígeno de cáncer, o detectar, tratar o prevenir cáncer en un periodo de desde aproximadamente 2 horas o más largo, por ejemplo, de 12 a 24 o más horas, desde el momento de la administración. En determinadas realizaciones, el periodo de tiempo puede ser incluso más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del material de TCR de la invención particular y el estado del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.

En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la invención, un ensayo, que comprende comparar el grado en el que se someten células diana a lisis o se secreta IFN-y por células T que expresan el TCR, polipéptido o proteína de la invención tras la administración de una dosis dada de tales células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a cada uno de los cuales se les administra una dosis diferente de las células T, puede usarse para determinar una dosis inicial que va a administrarse a un mamífero. El grado en el que se someten células diana a lisis o se secreta IFN-y tras la administración de una determinada dosis puede someterse a ensayo mediante métodos conocidos en la técnica.

La dosis del material de TCR de la invención también estará determinada por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR de la invención particular. Normalmente, el médico encargado decidirá la dosificación del material de TCR de la invención con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en consideración una variedad de factores, tales como edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de TCR de la invención que va a administrarse, vía de administración, y la intensidad del estado que está tratándose. En una realización en la que el material de TCR de la invención es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 1 x 1012 células o más.

Un experto habitual en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR inventivos de la invención pueden modificarse de cualquiera de varias maneras, de tal modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR de la invención se aumenta mediante la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR de la invención pueden conjugarse o bien directa o bien indirectamente a través de un puente a un resto de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, materiales de TCR de la invención, a restos de direccionamiento se conoce en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y patente estadounidense 5.087.616. El término “resto de direccionamiento” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce específicamente y se une a un receptor de superficie celular, de tal manera que el resto de direccionamiento dirige la administración de los materiales de TCR de la invención a una población de células sobre cuya superficie se expresa el receptor. Los restos de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas y cualquier otro ligando natural o no natural, que se unen a receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR), receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), CD28, receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), etc.). El término “puente” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente o molécula que une los materiales de TCR de la invención al resto de direccionamiento. Un experto habitual en la técnica reconoce que sitios en los materiales de TCR de la invención, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR de la invención, son sitios ideales para acoplar un puente y/o un resto de direccionamiento, siempre que el puente y/o resto de direccionamiento, una vez acoplado a los materiales de TCR de la invención, no interfiera con la función de los materiales de TCR de la invención, es decir, la capacidad de unirse a VPH 16 E6; o de detectar, tratar o prevenir cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped o poblaciones de células de la invención pueden usarse en métodos de tratamiento o prevención de cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH. Sin limitarse a ninguna teoría particular, se cree que los TCR de la invención se unen específicamente a VPH 16 E6, de tal manera que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionado), cuando se expresa por una célula, puede mediar en una respuesta inmunitaria frente a una célula diana que expresa VPH 16 E6. Con respecto a esto, las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, población de células, anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado en un mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH.

Los términos “tratar” y “prevenir” así como términos derivados de los mismos, tal como se usan en el presente documento, no implican necesariamente el tratamiento o la prevención completo o al 100%. En vez de eso, hay diversos grados de tratamiento o prevención que un experto habitual en la técnica reconoce que tienen un posible beneficio o efecto terapéutico. Con respecto a esto, los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de un estado en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionado por el método puede incluir tratamiento o prevención de uno o más estados o síntomas del estado, por ejemplo, cáncer, que está tratándose o previniéndose. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención puede incluir fomentar la regresión de un tumor. Además, para los fines en el presente documento, la “prevención” puede abarcar retrasar la aparición del estado, o un síntoma o estado del mismo.

También se proporciona un método de detección de la presencia de un estado en un mamífero. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células, anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento, formando así un complejo, y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH.

Con respecto al método de detección de la invención de un estado en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de célula completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteínas completas, o una fracción de ácido nucleico.

Para los fines del método de detección de la invención, la puesta en contacto tiene lugar in vitro con respecto al mamífero.

Además, la detección del complejo puede producirse mediante cualquiera de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células, o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, de la invención descritos en el presente documento, pueden marcarse con una etiqueta detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

Para los fines de los métodos, en los que se administran células huésped o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas con respecto al mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas con respecto al mamífero.

Con respecto a los métodos, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de la orofaringe, cáncer de ovarios, cáncer del pene, cáncer pancreático, cáncer de peritoneo, omento y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer del útero, cáncer de uréter, y cáncer de vejiga urinaria. Un cáncer preferido es cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, canal anal, anorrecto, vagina, vulva o pene. Un cáncer particularmente preferido es cáncer positivo para VPH 16. Aunque los cánceres más habitualmente asociados con infección por VPH 16 incluyen cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, canal anal, anorrecto, vagina, vulva y pene, los métodos pueden usarse para tratar cualquier cáncer positivo para VPH 16, incluyendo los que se producen en otras zonas anatómicas.

El mamífero al que se hace referencia en los métodos descritos en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden Artiodactila, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactila, incluyendo equinos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del Primates, Ceboids o Simoids (monos) o del orden Anthropoids (seres humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra el aislamiento de TCR anti-VPH 16 humanos a partir de tumor.

Se obtuvo una muestra de un tumor de cáncer anal metastásico positivo para VPH 16 E6 (tumor 3809) a partir de un paciente. Se analizó la muestra de tumor para determinar la expresión de VPH 16 E6, VPH 16 E7, VPH 18 E6 y VPH 18 E7 con respecto a gliceraldehído 3-fosato deshidrogenasa (GAPDH) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de transcriptasa inversa (RT). Se comparó la expresión relativa de VPH 16 E6, VPH 16 E7, VPH 18 E6 y VPH 18 E7 con la de células CaSki, células HeLa y células 624 (línea celular de melanoma). Los resultados se muestran en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, la muestra de tumor 3809 era positiva para la expresión de VPH 16 E6.

Se dividió la muestra de tumor 3809 en 24 fragmentos y se obtuvieron linfocitos de infiltración tumoral (TIL) a partir de los diversos fragmentos. Se cultivaron conjuntamente los TIL en una placa de 96 pocillos con células dendríticas (DC) inmaduras autólogas que se habían pulsado con VPH 16 E6 solo, VPH 16 E6 en combinación con anticuerpo anti-clase I, VPH 16 E7 solo, VPH 16 E7 en combinación con anticuerpo anti-clase I, gp100, u OKT3. Se midió el interferón-gamma (IFN-y). Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B. Tal como se muestra en las figuras 2A y 2B, los TIL eran reactivos frente a VPH 16 E6 pero no frente a gp100 o E7. La reactividad anti-VPH 16 E6 de los TIL se bloqueó mediante anticuerpo anti-clase I.

Se seleccionaron células a partir de los pocillos de cultivo conjunto reactivos usando perlas magnéticas anti-4-1BB. Se realizó la expansión rápida de los números de células seleccionadas usando el protocolo de expansión rápida (REP) tal como se describió anteriormente (Dudley et al. J. Immunother. 26:332-42 (2003) y Riddell et al. J. Immunol. Methods 128:189-201 (1990)). En resumen, se cultivaron TIL con células “de alimentación” mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (40 Gy) en medio completo (CM) con anticuerpo anti-CD330 ng/ml e IL-26000 UI/ml.

Los números expandidos de células seleccionadas mediante 4-1BB de 3809 se cultivaron conjuntamente con células 293-A2 (células HEK-293 con expresión estable de HLA-A2) transfectadas con proteína verde fluorescente (GFP), células 293-A2 transfectadas con E6, línea celular linfoblastoide (LCL) 3809 (células B que se han transformado usando virus de Epstein-Barr) cultivadas sin péptido, LCL 3809 cultivadas conjuntamente con una combinación de péptidos de v Ph 16 E6, u OKT3. La combinación de péptidos incluyó péptidos de 15 meros con solapamientos de 11 aminoácidos que cubrían la secuencia completa de VPH 16 E6. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 3. Tal como se muestra en la figura 3, los números expandidos de TIL eran reactivos frente a células 293-A2 transfectadas con E6 pero no frente a células 293-A2 transfectadas con GFP. Las células LCL 3809 cultivadas conjuntamente con la combinación de péptidos E6 demostraron reactividad mientras que las células LCL 3809 cultivadas conjuntamente sin péptidos no la demostró. Estudios de citometría de flujo mostraron que los números expandidos de células se unían a tetrámero HLA-A2/E6^29-38. Se seleccionaron adicionalmente células mediante clasificación usando perlas magnéticas anti-4-1BB sin ciclos adicionales de REP o clonación seguido por amplificación rápida de extremos de ADNc en 5' (RACE). En la tabla A se muestra un análisis de genotipo A de los productos de RACE en 5' a partir del aislamiento con perlas magnéticas. Tal como se muestra en la tabla A, se obtuvo una población de células casi clonal.

TABLA A

Se obtuvo una secuencia de nucleótidos que comprendía ADNc (SEQ ID NO: 21) que codificaba para una cadena alfa que comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 a partir de TRAV35*02/TRAJ41*01. Se obtuvo una secuencia de nucleótidos que comprendía ADNc (SEQ ID NO: 22) que codificaba para una cadena beta que comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 a partir de TRBV7-6*01/TRBV2-3*01/TRBD1*01.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra un método de preparación de un TCR anti-VPH 16 quimérico que comprende una región variable humana y una región constante de ratón.

Se prepararon de la siguiente manera una secuencia de nucleótidos que codificaba para un TCR quimérico que incluía una región constante de ratón y una región variable humana. Se escindieron las secuencias de nucleótidos que codificaban para las regiones constantes originales (humanas) de las cadenas alfa y beta del TCR obtenido en el ejemplo 1 (secuencias de aminoácidos de región constante de SEQ ID NO: 23 y 24, respectivamente) y se sustituyeron por secuencias de nucleótidos que codificaban para una región constante murina de las cadenas alfa y beta, respectivamente. Se clonaron las secuencias de nucleótidos resultantes que codificaban para las cadenas alfa y beta quiméricas para dar una única secuencia de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos que codificaba para un péptido de picornavirus 2A posicionado entre las cadenas alfa y beta. Se optimizó en cuanto a codones la secuencia de nucleótidos combinada (opt) para la expresión en tejidos humanos para proporcionar un inserto de vector (SEQ ID NO: 29). Se clonó el inserto de vector en un vector de expresión de MSGV1 dando como resultado la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30 (TCR de E6). El TCR codificado por el vector comprendía una cadena alfa que comprendía una secuencia de aminoácidos que comprendía SEQ ID NO: 17 y una cadena beta que comprendía una secuencia de aminoácidos que comprendía SEQ ID NO: 18.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra que linfocitos de sangre periférica (PBL) transducidos con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 reconocen específicamente líneas celulares de tumor positivo para VPH 16 de una manera restringida mediante HLA-A2.

Se transdujeron linfocitos de sangre periférica (PBL) con el vector de expresión del ejemplo 2 y se cultivaron conjuntamente con células 293-A2 diana pulsadas con péptido de VPH 16 E6^29-38, células 293-A2 pulsadas con péptido de VPH 16 E7^11-19, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para GFP, células 293 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células de cáncer de cuello uterino de VPH-18, células de control de melanoma, células de control de colangio, células 624, o células SiHa. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 4A. Tal como se muestra en la figura 4A, PBMC transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 reconocen específicamente líneas celulares de tumor positivo para VPH 16 y otras dianas HLA-A2⁺VPH16⁺de una manera restringida mediante HLA-A2.

Se cultivaron conjuntamente PBL transducidos con el vector de expresión del ejemplo 2 con células 293-A2 diana transducidas con un plásmido que codifica para E6, células 293 transducidas con un plásmido que codifica para E6, células SCC90, células CaSki, o células 624 (línea celular de melanoma) sin anticuerpo, con anticuerpo anti-MHC de clase I, o anticuerpo anti-MHC de clase II. Se cultivaron conjuntamente DMF5 (células T transducidas para expresar un TCR restringido mediante MHC de clase I frente a MART-1) con una línea celular de melanoma (624) que se reconoce por DMF5 sin anticuerpo, con anticuerpo anti-MHC de clase I, o anticuerpo anti-MHC de clase II. Se cultivaron 4.7.20 (células T transducidas para expresar un TCR restringido mediante MHC de clase II frente a VPH 16 E7) con PBMC pulsadas con la combinación de péptidos E7 “péptidos E7” sin o anticuerpo, con anticuerpo anti-MHC de clase I, o anticuerpo anti-MHC de clase II. Se midió IFN-^y. Los resultados se muestran en la figura 4B. Tal como se muestra en la figura 4B, el anticuerpo anti-MHC de clase I bloqueó la reactividad de las células transducidas frente a dianas HLA-A2⁺VPH16⁺, mientras que el anticuerpo anti-clase II no bloqueó la reactividad.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra que células transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 se unen a tetrámero HLA-A2-E6^29-38de una manera independiente de CD8.

Se clasificaron PBL transducidos con el vector de expresión recombinante del ejemplo 2 en células positivas para CD8 y células negativas para CD8 mediante FACS. Se midió la unión a tetrámero HLA-A2-E6^29-38mediante citometría de flujo. Las células positivas para CD8 y negativas para CD8 se unieron ambas a tetrámero HLA-A2-E6^29-38.

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra que células positivas para CD4 y CD8 transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 reconocen específicamente líneas celulares de tumor positivo para VPH-16.

PBL positivos para CD8 o positivos para CD4 no se transdujeron (sin transducir) o se transdujeron con el vector de expresión del ejemplo 2 y se cultivaron conjuntamente con células 293-A2 diana pulsadas con péptido de VPH 16 E6^29-38, células 293-A2 pulsadas con péptido de VPH 16 E7n^-19, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para VPH 16 E6, células 293-A2 transducidas con un plásmido que codifica para GFP, células 293-A2, células 624 transducidas con retrovirus que expresan de manera estable VPH 16 E7 (624-E7), células 624 transducidas con retrovirus que expresan de manera estable VPH 16 E6 (624-E6), células SCC152, células SCC90, células CaSki, células de cáncer de cuello uterino de VPH-18, células de control de melanoma, células 624 o células SiHa. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 5. Tal como se muestra en la figura 5, las PBMC positivas para CD8 y positivas para CD4 transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 reconocen específicamente, ambas de ellas, líneas celulares de tumor positivo para VPH 16 y otras dianas HLA-A2⁺VPH16⁺de una manera restringida mediante HLA-A2.

EJEMPLO 6

Este ejemplo demuestra que células transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 demuestran un reconocimiento ávido de células T2 pulsadas con VPH 16 E6^29-38.

PBL positivos para CD8 o positivos para CD4 no se transdujeron (sin transducir) o se transdujeron con el vector de expresión del ejemplo 2 y se cultivaron conjuntamente con células T2 diana pulsadas con concentraciones variables de péptido de VPH 16 E6^29-38. Se midió IFN-^y. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. Tal como se muestra en las figuras 6A y 6B, células positivas para CD4 y positivas para CD8 transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18 demostraron un reconocimiento ávido de células T2 pulsadas con VPH 16 E6^29-38.

EJEMPLO 7

Este ejemplo demuestra un método de tratamiento de cáncer VPH 16⁺en un paciente humano, que comprende administrar al paciente células T autólogas transducidas para expresar un TCR anti-VPH 16 E6^29-38que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18.

Los pacientes tendrán cáncer VPH-16⁺recidivante/que no responde al tratamiento o metastásico. Se someterá a prueba una muestra de tejido canceroso para determinar el genotipo de VPH 16 mediante hibridación in situ (ISH) o PCR. También se someterá a los pacientes a prueba para determinar la expresión de HLA-A2. Los pacientes habrán tenido un tratamiento de primera línea previo para enfermedad recidivante/que no responde al tratamiento o metastásica, o el paciente habrá rechazado la terapia convencional.

Se tratará a los pacientes con ciclofosfamida (60 mg/kg/día por vía intravenosa (i.v.)) en los días -7 y -6 y fludarabina (25 mg/m²/día, i.v.) en los días -5 a -1. Se transducirán PBMC autólogas con el vector de expresión de MSGV1 del ejemplo 2. Los números de células transducidas se expandirán rápidamente tal como se describió anteriormente (Dudley et al. J. Immunother. 26:332-42 (2003) y Riddell et al. J. Immunol. Methods 128:189-201 (1990)). En resumen, se cultivarán las células con células “de alimentación” mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (40 Gy) en medio completo (CM) con anticuerpo anti-CD3 30 ng/ml e IL-26000 UI/ml. Se administrarán números expandidos de células transducidas a los pacientes junto con una dosis alta de interleucina (IL)-2 en el día 0.

Se evaluarán las respuestas tumorales objetivas según RECIST (criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos) 1.0. Si al menos tres de 18 pacientes responden al tratamiento a los cuatro meses o más tras el tratamiento, se expandirá la cohorte a 35 pacientes. También se evaluará la toxicidad. También se estudiarán estudios inmunológicos (incluyendo, por ejemplo, expansión, persistencia, fenotipo y función de las administradas por infusión).

Debe interpretarse que el uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y “al menos uno” y referentes similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubre tanto el

Claims

REIVINDICACIONES

i. Receptor de células T (TCR) que tiene especificidad antigénica por virus del papiloma humano (VPH) 16 E6 y que comprende una región variable humana y una región constante murina, en el que el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8, y opcionalmente en el que:

(i) el TCR tiene especificidad antigénica por VPH 16 E629-38 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(ii) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y 16;

(iii) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18; y/o

(iv) el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.
2. TCR aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por VPH 16 E6 y que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8, opcionalmente en el que el TCR comprende:

(i) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10;

(ii) SEQ ID NO: 13 y 14; o

(iii) SEQ ID NO: 11 y 12.
3. Polipéptido aislado o purificado que comprende una parte funcional del TCR según la reivindicación 1 ó 2, en el que la parte funcional se une específicamente a VPH 16 E6 y comprende las secuencias de aminoácidos de

(i) SEQ ID NO: 3-8;

(ii) SEQ ID NO: 9 y 10; o

(iii) SEQ ID NO: 11 y 12.
4. Polipéptido según la reivindicación 3 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18.
5. Proteína aislada o purificada que comprende las secuencias de aminoácidos según la reivindicación 3, opcionalmente en la que la proteína comprende:

(i) una primera cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 5 y una segunda cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8;

(ii) una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o (iii) una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 opcionalmente en la que la proteína es una proteína de fusión y/o un anticuerpo recombinante.
6. Proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína comprende una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, opcionalmente en la que la proteína es una proteína de fusión y/o un anticuerpo recombinante.
7. Ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR según la reivindicación 1 ó 2, el polipéptido según la reivindicación 3 ó 4, o la proteína según la reivindicación 5 ó 6, opcionalmente en el que el ácido nucleico comprende:

(i) las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 31-36 o (b) SEQ ID NO: 19 y 20; o

(ii) las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 21 y 22 o (b) SEQ ID NO: 27 y 28, opcionalmente en el que el ácido nucleico comprende además las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 23 y 24 o (b) SEQ ID NO: 25 y 26, y

opcionalmente en el que la secuencia de nucleótidos está optimizada en cuanto a codones, en el que la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a codones comprende opcionalmente las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y 39.
8. Ácido nucleico según la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico comprende:

(i) las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 31-36 o (b) SEQ ID NO: 19 y 20; o

(ii) las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 21 y 22 o (b) SEQ ID NO: 27 y 28, opcionalmente en el que el ácido nucleico comprende además las secuencias de nucleótidos de (a) SEQ ID NO: 23 y 24 o (b) SEQ ID NO: 25 y 26, y

opcionalmente en el que la secuencia de nucleótidos está optimizada en cuanto a codones, en el que la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a codones comprende opcionalmente las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y 39.
9. Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8, que comprende opcionalmente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30.
10. Célula huésped aislada que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, opcionalmente en la que la célula es humana.
11. Población de células que comprende al menos una célula huésped según la reivindicación 10.
12. Anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una parte funcional del TCR según la reivindicación 1 ó 2, en el que la parte funcional comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.
13. Composición farmacéutica que comprende el TCR según la reivindicación 1 ó 2, el polipéptido según la reivindicación 3 ó 4, la proteína según la reivindicación 5 ó 6, el ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, la célula huésped según la reivindicación 10, la población de células según la reivindicación 11, o el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 12 , y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Método de detección de la presencia de un estado en un mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el TCR según la reivindicación 1 ó 2, el polipéptido según 3 ó 4, la proteína según la reivindicación 5 ó 6, el ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, la célula huésped según la reivindicación 10, la población de células según la reivindicación 11, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 12 , o la composición farmacéutica según la reivindicación 13, formando así un complejo, y

(b) detectar el complejo, en el que detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH, opcionalmente en el que el estado es:

(i) cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, canal anal, anorrecto, vagina, vulva o pene y/o

(ii) un cáncer positivo para VPH 16.
15. TCR según la reivindicación 1 ó 2, polipéptido según la reivindicación 3 ó 4, proteína según la reivindicación 5 ó 6, ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8, vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, célula huésped según la reivindicación 10, población de células según la reivindicación 11, anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 12 , o composición farmacéutica según la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado en un mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por VPH 16 o estado premaligno positivo para VPH,

opcionalmente en el que el estado es:

(i) cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, canal anal, anorrecto, vagina, vulva o pene; y/o

(ii) un cáncer positivo para VPH 16.

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